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03/04/08

Título de la práctica:
Determinación cuantitativa de urea

Fundamento:
La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en amoníaco (NH3)
y anhídrido carbónico (CO2). El amoníaco formado se incorporan al -cetoglutarato
por acción de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidación paralela de NADH
a NAD+ :

Ureasa
Urea + H2O + 2 H+ 2 NH3 + CO2
2 NH3 + α-Cetoglutarato + NADH H2O + NAD+ + L-Glutamato
GLDH
La disminución de la concentración de NAD+ en el medio es proporcional a la
concentración de urea de la muestra ensayada.

Material:
- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm.
-Micropipeta de 1000 μl.
-Micropipeta de 10 μl.
- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.
- Equipamiento habitual de laboratorio.
MUESTRAS
- Suero o plasma heparinizado1: No usar sales de amonio o
fluoruro como anticoagulantes.

- Orina: Diluir la muestra al 1/50 con


agua destilada. Mezclar. Multiplicar el
resultado obtenido por 50 (factor de dilución); Evitar el crecimiento bacteriano,
manteniendo el pH < 4.

La urea es estable 5 días a 2-8ºC.


REACTIVOS
R 1 Tampón TRIS pH 7,8 -Cetoglutarato 80 mmol/L 6 mmol/L
R 2 Enzimas Ureasa Glutamato 3750 U/L 6000 U/L 0,32
deshidrogenasa (GLDH) mmol/L
NADH
UREA CAL Patrón primario acuoso de Urea 50 mg/dL

Procedimiento:

1. 1. Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en


un frasco de R 1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su
contenido. Estabilidad: 1 mes en nevera (2-8ºC) o 10 días a temperatura
ambiente.
2. Condiciones del ensayo:

1
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
.1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 37ºC / 15-25ºC
3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
4. Pipetear en una cubeta:

Blanco Patrón Muestra


RT (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón (Nota2- -- 10 --
3) (L)
Muestra (L) -- -- 10

5. Mezclar y leer las absorbancias a los 30 s (A1)


y a los 90 s (A2).
6. Calcular: A= A1 – A2.

Resultados:

(ΔA Muestra) x 50 (Conc. Patrón) = mg/dL de urea en


la muestra
(ΔA Patrón)

10 mg/L urea BUN dividido por 0,466 = 21 mg/L de


urea = 0,36 mmol/L urea.
Factor de conversión: mg/dL x 0,1665 = mmol/L

Realizada la práctica los resultados son los siguientes:

(0,894-0,890) x 50 (Conc. Patrón) =50 mg/dL de urea en la muestra


(0,883-0,879)

Dos días después se volvió a realizar la técnica pero con una muestra distinta los
resultados fueron:

(0,957-0,945) x 50 (Conc. Patrón) =15 mg/dL de urea en la muestra


(0,965-0,961)

Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L) Orina: de 20 a 35 gr/24 horas Estos


valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios
valores de referencia.
Por lo tanto los resultados están el primero un poco por encima y el segundo un poco
por debajo de los rangos normales.

Interpretación clínica de los resultados:


La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas; se forma en el hígado a
partir de su destrucción.

2
Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en dietas con exceso de proteínas,
enfermedades renales, insuficiencia cardiaca, hemorragias gástricas, hipovolemia y
obstrucciones renales.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de
laboratorio.

3
03/04/08

Título de la práctica:
Determinación cuantitativa de Ácido Úrico

Fundamento:
El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno (2H2O2)
que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol
Sulfonato (DCPS) forma un compuesto rosáceo:

Uricasa
Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoína + CO2 + 2H2O2

2H2O2 + 4-AF + DCPS Quinonaimina + 4H2O


POD
La intensidad de quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración de
ácido úrico presente en la muestra ensayada

Materiales:

- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 520 nm.


- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.
- Equipamiento habitual de laboratorio.
-Micropipeta
MUESTRAS
- Suero o plasma: Estabilidad 3-5 días a 2-8ºC y 6 meses a –20ºC.
- Orina (24 h): Estabilidad 3 días a
temperatura ambiente a pH > 8.
Diluir la muestra al 1/50 en agua
destilada. Mezclar. Multiplicar el
resultado obtenido por 50 (factor
de dilución); Si la muestra es
turbia, calentarla a 60ºC 10 min
para disolver los precipitados de
urato y ácido úrico. No refrigerar.
REACTIVOS
R 1 Tampón Fosfatos pH 7,4 2-4 50 mmol/L 4 mmol/L
Diclorofenol Sulfonato
(DCPS)
R 2 Enzimas Uricasa Peroxidasa (POD) 60 U/L 660 U/L 200 U/L 1
Ascorbato oxidasa 4 - mmol/L
Aminofenazona (4-AF)
URIC ACID CAL Patrón primario acuoso de Ácido úrico 6
mg/dL

Procedimiento:
1. Reactivo de trabajo
(RT): Disolver el
contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Tampón. Tapar y

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mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 1 mes en
nevera (2-8ºC) o 10 días a temperatura ambiente.
2. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . .520 nm (490-550) Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC / 15-25ºC
3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
4. Pipetear en una cubeta:
Blanco Patrón Muestra

RT (mL) 1,0 1,0 1,0

Patrón (Nota1-2) (L) -- 25 --

Muestra (L) -- -- 25

5. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC ó 10 min. 15-25ºC.


6. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
El color es estable como mínimo 30 minutos.

Interpretación clínica de los resultados:


El ácido úrico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En una
insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de urea, creatinina y ácido
úrico. Niveles altos de ácido úrico son
indicativos de patología renal y
generalmente se asocia con la gota.
El diagnóstico clínico debe realizarse
teniendo en cuenta todos los datos
clínicos y de laboratorio.

Resultados:
Suero o plasma

A(Muestra) x 6 (Conc. Patrón) = mg/dL de ácido úrico en la muestra


A (Patrón)

Orina 24 h

(A)Muestra x 50 (dilución) x 6 x vol. (dL) orina/24h = mg/24 h de ácido úrico


(A) Patrón

Factor de conversión: mg/dL x 59,5= mol/L.

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Suero o plasma:
Mujeres 2,5 - 6,8 mg/dL 149 – 405 mol/L
Hombres 3,6 - 7,7 mg/dL 214 – 458 mol/L
Orina: 250 - 750 mg/24 h 1,49 - 4,5
mmol/24 h
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca
sus propios valores de referencia.

06/05/08

Título de la práctica:
Esterilización en autoclave

Fundamento:
Acción del vapor húmedo sobre el material
queremos esterilizar

Procedimientos:

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1. Se condiciona en paquetes las placas Petri que queremos esterilizar, se
envuelven en papel de filtro.
2. El interior de autoclave se llena de agua hasta la rejilla.
3. Se colocan encima de está regido una pota y en su interior se introducen los
paquetes de placas Petri, se cierra la autoclave girando la manibela.
4. Se introducen los datos que ha de procesar y realiza en autoclave, 15 minutos,
120ºC, 11 atm.. Se cierran adornos de salida del vapor y bravo.
5. Una vez que sea terminado sobre la válvula del vapor para que sal, previamente
sea para autoclave

Material:
• Autoclave
• Papel de filtro
• Tira adhesiva
• Pota

11/04/08

Título de la práctica:
Realización de un cultivo faringeo

Fundamento:
Investigación de procesos infecciosos a través
de cultivos en placa en garganta.

Materiales:
• Placa Petri con agar o agar sangre
• Hisopo
• Mechero
• Asa de siembra

7
• Depresor lingual

Procedimiento:
1. Con una luz colocada de forma que enfoque la cavidad oral del paciente
dirigimos un hisopo hacia la porte posterior de la faringe, se le indica al
paciente que respire profundamente y se deprime la lengua con un
depresor, luego se extiende ese hisopo por los pilares de las amígdalas,
pero con cuidado de no tocar los laterales de la boca, se debe pedir al
paciente que diga “A” para que levante la úvula.
2. El hisopo debe moverse de atrás hacia delante para que la muestra sea
idónea.
3. Inoculamos en un extremo del medio de cultivo con el hisopo que está
impregnado con la muestra faringea y lo colocamos en un medio de
transporte y lo reservamos.
4. Se esteriliza un asa de siembra en la llama y se deja enfriar. Con el asa en
posición ligeramente horizontal hacemos unas estrías, haciendo oscilar
esa asa sobre una porción del agar moviendo suavemente y rápido la
muñeca.
5. Volvemos a esterilizar el asa, la dejamos enfriar y rozamos el asa con las
estrías sembradas y sobre otra porción virgen de agar hacemos otra tanda
de estrías procurando que no toque con la primera. No se debe hacer
mucha presión sobre el agar, y el asa no debe estar rota.
6. Se lleva la placa a la estufa de cultivo de 24-48 horas en posición
invertida, y observamos. Se deben ver colonias aisladas.

Interpretación clínica de los resultados:


Los cultivos de garganta se obtienen sobre todo para poder
detectar estreptococos β- hemolíticos del grupo A. Clínicamente se
puede sospechar de una faringitis estreptocócica si se observa una
mucosa enrojecida en una paciente que además presenta dolor y
dificultad para deglutir. Existe una flora comensal que está formada
por un grupo de bacterias y algunas levaduras, así que normalmente
en la zona de la oroforinge hay combinaciones y concentraciones
de estreptococos α- hemolíticos, algunas especies de Neisserias,
estafilococos y algunas enterobacterias.

8
Los estreptococos β- hemolítico es
importante porque produce
infecciones que al ser repetitivas
puede llegar a producir secuelas, las
3 secuelas más importantes son: las
glomerulonefritis, endocarditis y
fiebres reumáticas.

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15/04/08

Título de la práctica:
Obtención de un cultivo puro

Fundamento:
Al diseminar sobre un medio de
cultivo sólido una muestra de
bacterias, diluida
convenientemente, las células
individuales quedarán lo
suficientemente separadas unas de
otras y crecerán en forma de
colonias aisladas, a partir de las
cuales se puede obtener un cultivo
puro.

Materiales:
• Placa de cultivo agar sangre en la que se observe una colonia que haya podido
provocar hemólisis
• Placa de cultivo agar sangre virgen
• Asa de siembra
• Mechero
• SSF
• Pipeta Pasteur
• Portaobjetos

Procedimiento:
1. Se parte de un cultivo en agar-sangre en el que cogemos la muestra de
una colonia sospechosa de haber producido hemólisis.
2. Se esteriliza un asa de siembra en el mechero, se pincha en la colonia
sospechosa.
3. Se emulsiona en un portaobjetos con 2 gotas de Solución Salina
Fisiológica.
4. Se vuelve a esterilizar el asa de siembra y se procede a extender la placa
en tres segmentos.
5. Se realizan las
estrías separadas en
la placa y se mete
en la estufa de
cultivos unas 24
horas.

Resultados:

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08/05/08

Título de la práctica:
Preparación de un medio de cultivo

Instrucciones generales:
Ya que se van a elaborar 3 medios de cultivo distintos hay que tener una serie de
pautas de procedimiento comunes a todos ellos que son las siguientes:
Hacer 250 ml. De un medio de cultivo, seguir las instrucciones del bote,
esterilizar, colocar en Placa Petri, abrir la caja lo mínimo posible, no se puede llenar
la placa Petri según sale del autoclave ya que hay que esperar a que alcance los
40ºC.

El Agar Hierro de Kligler


Fundamento:
El Agar Hierro de Kligler es un medio empleado para la diferenciación de cultivos
puros de bacilos Gram negativos en base a su capacidad para fermentar la dextrosa y la
lactosa y a la producción de sulfuro de hidrógeno.
El Agar Hierro de Kligler es una modificación de la fórmula original de Kligler que era
un medio con bajos nutrientes, dextrosa, indicador de Andrade y acetato de plomo.
Russell trabajó con un medio con
dextrosa, lactosa y un indicador de pH
para la diferenciación de bacilos Gram
negativos fermentadores y no
fermentadores de lactosa. Kligler
encontró que el acetato de plomo usado
para la detección del sulfuro de
hidrógeno, podrìa dar mejores
resultados combinado con el medio de
dos azucares de Russell para la
diferenciación de los grupos tifoídico,
paratifoídico y disentérico. Bailey y
Lacy simplificaron la fórmula usando
rojo de fenol como indicador. Un
medio similar conteniendo sacarosa,
triptofano, sulfato férrico y tiosulfato
fue desarrollado por Sulkin y Willett.
El extracto de levadura y las peptonas proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas y
minerales, el sulfato férrico y el tiosulfato son indicadores de la producción de sulfuro
de hidrógeno. El cloruro de sodio mantiene la presión osmótica y el agar es adicionado
como agente solidificante.

Composición:
• Mezcla de Peptonas 20.0
• Cloruro de Sodio 5.0
• Lactosa 10.0
• Tiosulfato de Sodio 0.5
• Dextrosa 1.0

12
• Citrato de Hierro y Amonio 0.5
• Rojo de Fenol 0.025
• Agar Bacteriológico 15.0
pH 7.4 ± 0.2

Procedimiento:
Preparación:
1. Suspender 52 g. en 1 litro de agua destilada
2. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto
3. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.
4. Echar en la placa Petri.

El Agar nutritivo:
Fundamento:
El Agar Nutritivo es utilizado
para el cultivo de una amplia variedad de
microorganismos.
A principios de 1900 la APHA
(American Public Health Association)
sugirió esta formulación como un medio
de cultivo estándar para el análisis de
agua. El Agar Nutritivo se encuentra
descrito en los Métodos
Estándar de la APHA y de la AOAC
(Association of Oficial Analytical
Chemists) para el análisis de agua, leche
y sus derivados, alimentos y otros
materiales.
El Agar Nutritivo sigue siendo un medio
ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no fastidiosos.
En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrógeno,
vitaminas y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.

Composición:
• Peptona de Gelatina 5.0
• Extracto de Carne 3.0
• Agar Bacteriológico 15.0
pH 6.8 ± 0.2

Procedimiento:
Preparación:
5. Suspender 23 g. en 1 litro de agua destilada
6. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto
7. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.
8. Echar en la placa Petri.

El Agar CLED
Fundamento:

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Agar CLED (por sus siglas en inglés Cystine Lactose-Electrolyte-Deficient) es
utilizado para el cultivo, diferenciación y enumeración de bacterias en orina.
El Agar Cled es una modificación de la fórmula desarrollada por Sandys, quien
desarrolló un medio deficiente en electrolitos, lo que ayudaba a evitar la formación
de swarming por el género Proteus. Mackey y Sandys modificaron la fórmula
original sustituyendo la lactosa y sacarosa por manitol y aumentando la cantidad de
indicador y agar. Una nueva fórmula revisada omite la sacarosa e incluye cistina
(Cystine Lactose – Electrolite-Deficient).
El Agar Cled es un medio recomendado para siembra en placa por estría para la
determinación de bacterias en orina. Este medio favorece el crecimiento de
patógenos urinarios y hace distinción en la morfología de las colonias. El Agar Cled
carece de electrolitos (sales) necesarios para el
crecimiento de cierto tipo de bacterias que crecen en el
tracto urinario. Las peptonas contenidas en el medio
proporcionan el nitrógeno, vitaminas y aminoácidos.
La L-Cistina es añadida como suplemento para el
crecimiento de coniformes cistina dependientes. La
lactosa se incluye como fuente de carbón. Los
organismos capaces de fermentar la lactosa bajarán el
pH y cambian el color del medio (de verde a amarillo).
El azul de bromotimol es empleado como indicador del
pH. El Agar bacteriológico se usa como agente
gelificante.

Composición:
• Lactosa 10.0
• Peptona Bacteriológica 4.0
• Triptona 4.0
• Extracto de carne 3.0
• L-Cistina 0.128
• Azul de Bromotimol 0.02
• Agar Bacteriológico 15.0
pH 7.3 ± 0.2

Procedimiento:
Preparación:
9. Suspender 36 g. en 1 litro de agua destilada
10. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto
11. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.
12. Echar en la placa Petri.

Resultados:

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05/06/08

Título de la práctica:
Control de calidad de un pipeteo

Para asegurar el buen estado de los instrumentos de medida utilizados en un


laboratorio de análisis clínicos, en primer lugar, se deben seguir las instrucciones de
mantenimiento recomendadas por los fabricantes de dichos instrumentos, pero,
además, es necesario aplicar sobre ellos unos mecanismos de control, encaminados a
comprobar su buen funcionamiento.
El control de las pipetas dispensadoras de líquidos incluye el estudio de la exactitud
y de la precisión de la dispensación. Esto se
puede realizar con un método gravimétrico o
mediante un método espectrofotométrico.
El método gravimétrico consiste en dispensar
repetidamente el mismo volumen de agua en el
interior de un recipiente previamente dispuesto
en una balanza debidamente tarada y anotar los
resultados de las sucesivas pesadas que se
efectúan. Con el cálculo de la diferencia entre
los resultados de cada pesada y la
inmediatamente anterior, se obtiene el peso de
cada uno de los volúmenes de agua dispensa-
dos. A partir de estos resultados, se puede
efectuar una evaluación de la calidad de la
dispensación a través del cálculo del coeficiente
de variación de la serie de valores y de la
exactitud de su valor medio con respectosl que teóricamente se ha de obtener. El
coeficiente de variación permite evaluar la precisión de la dispensación y la
exactitud del valor medio con respecto al valor teóricamente real indica el grado de
error sistemático que existe en ella.
El método espectrofotométrico consiste en preparar repetidamente la misma
disolución de una sustancia, cuya absorbancia es conocida, y, después, medir
espectrofotométricamente la absorbancia obtenida con cada una de las disoluciones
preparadas. Con los resultados así obtenidos, se puede efectuar una evaluación de la
calidad de la dispensación mediante el cálculo de su coeficiente de variación y de la
exactitud de la absorbancia media con respecto a la absorbancia teórica de la
disolución.
El control de los espectrofotómetros de absorción
molecular ultravioleta-visible abarca numerosos
aspectos, uno de ellos es la verificación de la
exactitud y de la precisión en la medida de las
absorbancias.

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Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante la preparación de la disolución de una
sustancia, cuya absorbancia es teóricamente conocida, y la posterior medida
repetitiva de su absorbancia con el espectro-fotómetro sometido a control. Con ello
se obtienen una serie de valores que, al ser procesados estadísticamente, indican el
grado de calidad de la medición.

Fundamento:
Tras la preparación repetitiva de la misma dilución de paranitrofenol, se puede
evaluar la calidad del pipeteo necesario para esta preparación, mediante la medición
espectrofotométrica de la absorbancia de cada una de las diluciones de
paranitrofenol elaboradas a 400 nm.
Además, también se puede evaluar la calidad de la medición espectrofotométrica
mediante la medida repetitiva de la absorbancia de una sola de las diluciones de
paranitrofenol, previamente preparadas.

Material:
• Una piepeta de vidrio graduada y
capaz de dispensar 1ml.
• Una pipeta automática capaz de
dispensar 50 μl.
• Una punta de pipeta automática de
color amarillo.
• Una cubeta de espectrofotometria,
desechable y de tipo semimicro.
• Un espectrofotómetro capaz de hacer
lecturas de absorbancia a 400 nm.
• Agua destilada.
• Solución de paranitrofenol (p-
nitrofenol) en sosa (hidróxido sódico o NaOH). Esta solución se puede
preparar, por ejemplo, de la siguiente forma:
•Disolver 800 mg de sosa en 1 litro de agua destilada (solución de sosa a 20
mmol/l).
Disolver 50 mg de paranitrofenol en 1 litro de la solución de sosa preparada
previamente (solución de paranitrofenol a 0,36 mmol/l).

Procedimiento:
1. Depositar, con la pipeta de vidrio graduada, 1 ml de agua destilada en el interior
de una cubeta de espectrofotometría de tipo semimicro.
2. Añadir 50 μl de la solución de paranitrofenol a 0,36 mmol/l al agua destilada
mediante la pipeta automática.
3. Mezclar ambos líquidos mediante sucesivas aspiraciones y eyecciones,
ejecutadas con la pipeta automática.
4. Seleccionar la longitud de onda de 400 nm en el espectrofotómetro.
5. Medir la absorbancia de la dilución de paranitrofenol preparada, frente a un
blanco de agua destilada.

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6. Repetir la preparación de la dilución de paranitrofenol y la lectura de su
absorbancia con el mismo material al menos 15 veces.
7. Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de la serie
de valores así obtenidos.
8. Con el blanco y con la última dilución de paranitrofenol preparada, realizar al
menos 20 mediciones repetidas de la absorbancia de esta dilución.
Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de esta segunda
serie de valores.

Interpretación clínica de los resultados:


El coeficiente de variación de la primera serie de valores de absorbancia, obtenidos
a partir de las múltiples diluciones de paranitrofenol preparadas, nos indica el grado
de precisión con el que se han preparado las diluciones y, por lo tanto, nos expresa el
nivel de repetibilidad del pipeteo. La repetibilidad del pipeteo sólo es aceptable si el
coeficiente de variación obtenido no supera el 1%.
El coeficiente de variación de la segunda serie de valores, obtenida a partir de las
repetidas lecturas ele absorbancia efectuadas sobre una sola dilución de
paranitrofenol, nos indica el nivel de repetibilidad de la medición
espectrofotométrica y, por lo tanto, el estado de funcionamiento del es-
pectrofotómetro.

Resultados:

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30/05/08

Título de la práctica:
Realización de un antibiograma

Fundamento:
Existen diferentes técnicas para estudiar la actividad de los antibióticos frente a
distintos microorganismos, utilizándose en clínica pruebas esencialmente
cualitativas, aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas. En
estas prácticas vamos a efectuar
ensayos de ambos tipos. Las
pruebas cualitativas o
antibiograma se van a efectuar
con la bacteria problema mientras
que las cuantitativas las haremos
con una bacteria conocida
(E.coli ). Cada pareja deberá pues
inocular el día anterior al del
ensayo su bacteria problema E.
coli en sendos tubos de caldo
común, procurando evitar
contaminaciones.

Las pruebas que vamos a


realizar se basan en la difusión
del antibiótico sobre una placa de medio a partir de un punto central. En este caso,
una cantidad concreta del antibiótico se encuentra incluido en un disco de papel que
se deposita sobre una placa de agar común, que ha sido previamente inoculada con
una fuerte dosis de la bacteria a ensayar. Así, el disco de papel absorbe agua de la
placa, se disuelve el antibiótico y se inicia el proceso de difusión de éste hacia las
zonas que lo rodean, generándose un gradiente de concentración cuyo nivel máximo
se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se inocularon crecerán durante su
incubación allí donde la concentración del antibiótico sea lo suficientemente baja
como para no impedírselo (normalmente alejado del disco), mientras que no podrán
hacerlo en las proximidades del disco donde las concentraciones del antibiótico son
elevadas. Puesto que los límites de concentración de antibiótico que afectan al
cultivo son por regla general muy estrechos, se suelen formar halos de inhibición,
esto es, zonas sin bacterias alrededor de los discos, de bordes bastantes definidos y
cuyo diámetro tiene que ver con la concentración de antibiótico que había en el
disco y con la sensibilidad a éste de las bacterias ensayadas.

Procedimiento:
1. Funda el medio de cultivo y déjelo enfriar a 45-50°C.

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2. Vierta asépticamente
suficiente cantidad de
medio de cultivo en
una placa de Petri,
para obtener una capa
de 4 mm de espesor.
Para una placa de 10
cm. de diámetro se
requieren 30 mL de
medio y para una de
15 cm se requieren 70
mL.
3. Deje solidificar el
medio de cultivo y luego seque las placas durante 30 minutos antes de
usarlas para la inoculación.
4. Inocule la placa mediante un hisopo estéril utilizando una suspensión del
germen de 18 a 24 horas .Frote el hisopo sobre la superficie del medio de
cultivo.
5. Repita esta operación por tres veces sucesivas, rotando la placa para obtener
una dispersión uniforme del inóculo en toda la superficie.
6. Coloque la tapa a la placa y deje secar el inóculo por 3 a 5 minutos.
7. Coloque los discos con los antibióticos sobre el agar mediante pinzas
estériles o usando un aplicador de discos. Oprima los discos suavemente con
una pinza para asegurar un buen contacto con el medio de cultivo. Los
discos deben estar espaciados de manera que su distancia a la pared de la
placa sea de 15 mm y entre ellos de 30 mm.
8. Incube a 35 – 37°C hasta el siguiente día (aproximadamente 18-19 horas). Si
se requieren los resultados con rapidez se pueden leer las zonas de inhibición
después de 6-8 horas de incubación, pero estos resultados deben ser
confirmados mediante una nueva lectura después de la incubación por las 18
-19 horas.

Resultados:
En el caso del antibiograma, se hará un cuadro de sensibilidad (S) o
resistencia (R) para cada uno de los antibióticos frente a esta estirpe, y
posteriormente serán utilizados como criterio para la determinación de la bacteria
problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido, será:

Sensible (S) si el diámetro del halo es mayor de 15 mm


Resistente (R) si el diámetro del halo es menor de 13 mm (Las dos placas
hechas no han producido halo, por lo tanto se dice que el microorganismo es
resistente al antibiótico)
Intermedio (R/S) si el diámetro del halo está comprendido entre 13 y 15 mm

En el caso del ensayo cuantitativo se representará el diámetro del halo frente


al logaritmo de la concentración correspondiente. Los puntos obtenidos entonces se
ajustarán a una recta, de la que se extrapolará la concentración necesaria para
generar un halo de 15 mm, que será considerada como la concentración mínima
inhibitoria (CMI) de este antibiótico frente a la bacteria ensayada.

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Interpretación clínica de los resultados:
Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se
inscriben en el DNA
bacteriano. Su expresión
en el organìsmo, en
donde las condiciones
en cuanto a medios son
diferentes, expondría al
riesgo de fracaso
terapéutico. Para evitar
esto, el antibiograma
debe ser interpretado de
manera global a fin de
descubrir, a través de la
comparación de las
respuestas para cada antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso débilmente
expresado. Así, gracias a la interpretación, una cepa que aparece como falsamente
sensible será categorizada como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella
pneumoniae productora de BLSE puede aparecer sensible in vitro a las
cefalosporìnas de 3" generación. El resultado de Sensible debe ser corregido a
Intermedio o Resistente, ya que la utilización de estos antibióticos correría el riesgo
de provocar un fracaso terapéutico).

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02/06/08

Título de la práctica:
Realización de una gráfica de control de calidad a partir de datos sobre glucosa
hexokinasa.

Procedimiento:
1. Se necesita una serie considerable de datos para realizar la gráfica (unos 20).
2. Se realizan las medidas de las 20 preparaciones de la misma muestra a través
de fotocolorímetro.
3. Una vez obtenidas las absorvancias se calculan las concentraciones en
mg./dl.
4. Se haya la media y la desviación estandar que no debe ser superior al 5%.

Resultados:

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02/06/08

Título de la práctica:
Elaboración de una gráfica de Levey- Jennings

Fundamento:
La desviación estándar es el parámetro para crear la gráfica en la cual se indican los
valores diarios de los controles.
Esta gráfica se crea para cada prueba y para cada nivel de control
Los límites de la gráfica son ±1SD,±2SD,±3SD, respecto al promedio aritmético.

Procedimiento:

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30/05/08

Título de la práctica:
Realización de un antibiograma

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