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Título de la práctica:
Determinación cuantitativa de urea
Fundamento:
La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, presente en la muestra, en amoníaco (NH3)
y anhídrido carbónico (CO2). El amoníaco formado se incorporan al -cetoglutarato
por acción de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidación paralela de NADH
a NAD+ :
Ureasa
Urea + H2O + 2 H+ 2 NH3 + CO2
2 NH3 + α-Cetoglutarato + NADH H2O + NAD+ + L-Glutamato
GLDH
La disminución de la concentración de NAD+ en el medio es proporcional a la
concentración de urea de la muestra ensayada.
Material:
- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 340 nm.
-Micropipeta de 1000 μl.
-Micropipeta de 10 μl.
- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.
- Equipamiento habitual de laboratorio.
MUESTRAS
- Suero o plasma heparinizado1: No usar sales de amonio o
fluoruro como anticoagulantes.
Procedimiento:
1
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
.1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 37ºC / 15-25ºC
3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
4. Pipetear en una cubeta:
Resultados:
Dos días después se volvió a realizar la técnica pero con una muestra distinta los
resultados fueron:
2
Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en dietas con exceso de proteínas,
enfermedades renales, insuficiencia cardiaca, hemorragias gástricas, hipovolemia y
obstrucciones renales.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de
laboratorio.
3
03/04/08
Título de la práctica:
Determinación cuantitativa de Ácido Úrico
Fundamento:
El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno (2H2O2)
que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol
Sulfonato (DCPS) forma un compuesto rosáceo:
Uricasa
Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoína + CO2 + 2H2O2
Materiales:
Procedimiento:
1. Reactivo de trabajo
(RT): Disolver el
contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Tampón. Tapar y
4
mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad: 1 mes en
nevera (2-8ºC) o 10 días a temperatura ambiente.
2. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . .520 nm (490-550) Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC / 15-25ºC
3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
4. Pipetear en una cubeta:
Blanco Patrón Muestra
Muestra (L) -- -- 25
Resultados:
Suero o plasma
Orina 24 h
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Suero o plasma:
Mujeres 2,5 - 6,8 mg/dL 149 – 405 mol/L
Hombres 3,6 - 7,7 mg/dL 214 – 458 mol/L
Orina: 250 - 750 mg/24 h 1,49 - 4,5
mmol/24 h
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca
sus propios valores de referencia.
06/05/08
Título de la práctica:
Esterilización en autoclave
Fundamento:
Acción del vapor húmedo sobre el material
queremos esterilizar
Procedimientos:
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1. Se condiciona en paquetes las placas Petri que queremos esterilizar, se
envuelven en papel de filtro.
2. El interior de autoclave se llena de agua hasta la rejilla.
3. Se colocan encima de está regido una pota y en su interior se introducen los
paquetes de placas Petri, se cierra la autoclave girando la manibela.
4. Se introducen los datos que ha de procesar y realiza en autoclave, 15 minutos,
120ºC, 11 atm.. Se cierran adornos de salida del vapor y bravo.
5. Una vez que sea terminado sobre la válvula del vapor para que sal, previamente
sea para autoclave
Material:
• Autoclave
• Papel de filtro
• Tira adhesiva
• Pota
11/04/08
Título de la práctica:
Realización de un cultivo faringeo
Fundamento:
Investigación de procesos infecciosos a través
de cultivos en placa en garganta.
Materiales:
• Placa Petri con agar o agar sangre
• Hisopo
• Mechero
• Asa de siembra
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• Depresor lingual
Procedimiento:
1. Con una luz colocada de forma que enfoque la cavidad oral del paciente
dirigimos un hisopo hacia la porte posterior de la faringe, se le indica al
paciente que respire profundamente y se deprime la lengua con un
depresor, luego se extiende ese hisopo por los pilares de las amígdalas,
pero con cuidado de no tocar los laterales de la boca, se debe pedir al
paciente que diga “A” para que levante la úvula.
2. El hisopo debe moverse de atrás hacia delante para que la muestra sea
idónea.
3. Inoculamos en un extremo del medio de cultivo con el hisopo que está
impregnado con la muestra faringea y lo colocamos en un medio de
transporte y lo reservamos.
4. Se esteriliza un asa de siembra en la llama y se deja enfriar. Con el asa en
posición ligeramente horizontal hacemos unas estrías, haciendo oscilar
esa asa sobre una porción del agar moviendo suavemente y rápido la
muñeca.
5. Volvemos a esterilizar el asa, la dejamos enfriar y rozamos el asa con las
estrías sembradas y sobre otra porción virgen de agar hacemos otra tanda
de estrías procurando que no toque con la primera. No se debe hacer
mucha presión sobre el agar, y el asa no debe estar rota.
6. Se lleva la placa a la estufa de cultivo de 24-48 horas en posición
invertida, y observamos. Se deben ver colonias aisladas.
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Los estreptococos β- hemolítico es
importante porque produce
infecciones que al ser repetitivas
puede llegar a producir secuelas, las
3 secuelas más importantes son: las
glomerulonefritis, endocarditis y
fiebres reumáticas.
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15/04/08
Título de la práctica:
Obtención de un cultivo puro
Fundamento:
Al diseminar sobre un medio de
cultivo sólido una muestra de
bacterias, diluida
convenientemente, las células
individuales quedarán lo
suficientemente separadas unas de
otras y crecerán en forma de
colonias aisladas, a partir de las
cuales se puede obtener un cultivo
puro.
Materiales:
• Placa de cultivo agar sangre en la que se observe una colonia que haya podido
provocar hemólisis
• Placa de cultivo agar sangre virgen
• Asa de siembra
• Mechero
• SSF
• Pipeta Pasteur
• Portaobjetos
Procedimiento:
1. Se parte de un cultivo en agar-sangre en el que cogemos la muestra de
una colonia sospechosa de haber producido hemólisis.
2. Se esteriliza un asa de siembra en el mechero, se pincha en la colonia
sospechosa.
3. Se emulsiona en un portaobjetos con 2 gotas de Solución Salina
Fisiológica.
4. Se vuelve a esterilizar el asa de siembra y se procede a extender la placa
en tres segmentos.
5. Se realizan las
estrías separadas en
la placa y se mete
en la estufa de
cultivos unas 24
horas.
Resultados:
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08/05/08
Título de la práctica:
Preparación de un medio de cultivo
Instrucciones generales:
Ya que se van a elaborar 3 medios de cultivo distintos hay que tener una serie de
pautas de procedimiento comunes a todos ellos que son las siguientes:
Hacer 250 ml. De un medio de cultivo, seguir las instrucciones del bote,
esterilizar, colocar en Placa Petri, abrir la caja lo mínimo posible, no se puede llenar
la placa Petri según sale del autoclave ya que hay que esperar a que alcance los
40ºC.
Composición:
• Mezcla de Peptonas 20.0
• Cloruro de Sodio 5.0
• Lactosa 10.0
• Tiosulfato de Sodio 0.5
• Dextrosa 1.0
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• Citrato de Hierro y Amonio 0.5
• Rojo de Fenol 0.025
• Agar Bacteriológico 15.0
pH 7.4 ± 0.2
Procedimiento:
Preparación:
1. Suspender 52 g. en 1 litro de agua destilada
2. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto
3. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.
4. Echar en la placa Petri.
El Agar nutritivo:
Fundamento:
El Agar Nutritivo es utilizado
para el cultivo de una amplia variedad de
microorganismos.
A principios de 1900 la APHA
(American Public Health Association)
sugirió esta formulación como un medio
de cultivo estándar para el análisis de
agua. El Agar Nutritivo se encuentra
descrito en los Métodos
Estándar de la APHA y de la AOAC
(Association of Oficial Analytical
Chemists) para el análisis de agua, leche
y sus derivados, alimentos y otros
materiales.
El Agar Nutritivo sigue siendo un medio
ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no fastidiosos.
En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrógeno,
vitaminas y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.
Composición:
• Peptona de Gelatina 5.0
• Extracto de Carne 3.0
• Agar Bacteriológico 15.0
pH 6.8 ± 0.2
Procedimiento:
Preparación:
5. Suspender 23 g. en 1 litro de agua destilada
6. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto
7. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.
8. Echar en la placa Petri.
El Agar CLED
Fundamento:
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Agar CLED (por sus siglas en inglés Cystine Lactose-Electrolyte-Deficient) es
utilizado para el cultivo, diferenciación y enumeración de bacterias en orina.
El Agar Cled es una modificación de la fórmula desarrollada por Sandys, quien
desarrolló un medio deficiente en electrolitos, lo que ayudaba a evitar la formación
de swarming por el género Proteus. Mackey y Sandys modificaron la fórmula
original sustituyendo la lactosa y sacarosa por manitol y aumentando la cantidad de
indicador y agar. Una nueva fórmula revisada omite la sacarosa e incluye cistina
(Cystine Lactose – Electrolite-Deficient).
El Agar Cled es un medio recomendado para siembra en placa por estría para la
determinación de bacterias en orina. Este medio favorece el crecimiento de
patógenos urinarios y hace distinción en la morfología de las colonias. El Agar Cled
carece de electrolitos (sales) necesarios para el
crecimiento de cierto tipo de bacterias que crecen en el
tracto urinario. Las peptonas contenidas en el medio
proporcionan el nitrógeno, vitaminas y aminoácidos.
La L-Cistina es añadida como suplemento para el
crecimiento de coniformes cistina dependientes. La
lactosa se incluye como fuente de carbón. Los
organismos capaces de fermentar la lactosa bajarán el
pH y cambian el color del medio (de verde a amarillo).
El azul de bromotimol es empleado como indicador del
pH. El Agar bacteriológico se usa como agente
gelificante.
Composición:
• Lactosa 10.0
• Peptona Bacteriológica 4.0
• Triptona 4.0
• Extracto de carne 3.0
• L-Cistina 0.128
• Azul de Bromotimol 0.02
• Agar Bacteriológico 15.0
pH 7.3 ± 0.2
Procedimiento:
Preparación:
9. Suspender 36 g. en 1 litro de agua destilada
10. Calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto
11. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.
12. Echar en la placa Petri.
Resultados:
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05/06/08
Título de la práctica:
Control de calidad de un pipeteo
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Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante la preparación de la disolución de una
sustancia, cuya absorbancia es teóricamente conocida, y la posterior medida
repetitiva de su absorbancia con el espectro-fotómetro sometido a control. Con ello
se obtienen una serie de valores que, al ser procesados estadísticamente, indican el
grado de calidad de la medición.
Fundamento:
Tras la preparación repetitiva de la misma dilución de paranitrofenol, se puede
evaluar la calidad del pipeteo necesario para esta preparación, mediante la medición
espectrofotométrica de la absorbancia de cada una de las diluciones de
paranitrofenol elaboradas a 400 nm.
Además, también se puede evaluar la calidad de la medición espectrofotométrica
mediante la medida repetitiva de la absorbancia de una sola de las diluciones de
paranitrofenol, previamente preparadas.
Material:
• Una piepeta de vidrio graduada y
capaz de dispensar 1ml.
• Una pipeta automática capaz de
dispensar 50 μl.
• Una punta de pipeta automática de
color amarillo.
• Una cubeta de espectrofotometria,
desechable y de tipo semimicro.
• Un espectrofotómetro capaz de hacer
lecturas de absorbancia a 400 nm.
• Agua destilada.
• Solución de paranitrofenol (p-
nitrofenol) en sosa (hidróxido sódico o NaOH). Esta solución se puede
preparar, por ejemplo, de la siguiente forma:
•Disolver 800 mg de sosa en 1 litro de agua destilada (solución de sosa a 20
mmol/l).
Disolver 50 mg de paranitrofenol en 1 litro de la solución de sosa preparada
previamente (solución de paranitrofenol a 0,36 mmol/l).
Procedimiento:
1. Depositar, con la pipeta de vidrio graduada, 1 ml de agua destilada en el interior
de una cubeta de espectrofotometría de tipo semimicro.
2. Añadir 50 μl de la solución de paranitrofenol a 0,36 mmol/l al agua destilada
mediante la pipeta automática.
3. Mezclar ambos líquidos mediante sucesivas aspiraciones y eyecciones,
ejecutadas con la pipeta automática.
4. Seleccionar la longitud de onda de 400 nm en el espectrofotómetro.
5. Medir la absorbancia de la dilución de paranitrofenol preparada, frente a un
blanco de agua destilada.
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6. Repetir la preparación de la dilución de paranitrofenol y la lectura de su
absorbancia con el mismo material al menos 15 veces.
7. Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de la serie
de valores así obtenidos.
8. Con el blanco y con la última dilución de paranitrofenol preparada, realizar al
menos 20 mediciones repetidas de la absorbancia de esta dilución.
Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de esta segunda
serie de valores.
Resultados:
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30/05/08
Título de la práctica:
Realización de un antibiograma
Fundamento:
Existen diferentes técnicas para estudiar la actividad de los antibióticos frente a
distintos microorganismos, utilizándose en clínica pruebas esencialmente
cualitativas, aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas. En
estas prácticas vamos a efectuar
ensayos de ambos tipos. Las
pruebas cualitativas o
antibiograma se van a efectuar
con la bacteria problema mientras
que las cuantitativas las haremos
con una bacteria conocida
(E.coli ). Cada pareja deberá pues
inocular el día anterior al del
ensayo su bacteria problema E.
coli en sendos tubos de caldo
común, procurando evitar
contaminaciones.
Procedimiento:
1. Funda el medio de cultivo y déjelo enfriar a 45-50°C.
18
2. Vierta asépticamente
suficiente cantidad de
medio de cultivo en
una placa de Petri,
para obtener una capa
de 4 mm de espesor.
Para una placa de 10
cm. de diámetro se
requieren 30 mL de
medio y para una de
15 cm se requieren 70
mL.
3. Deje solidificar el
medio de cultivo y luego seque las placas durante 30 minutos antes de
usarlas para la inoculación.
4. Inocule la placa mediante un hisopo estéril utilizando una suspensión del
germen de 18 a 24 horas .Frote el hisopo sobre la superficie del medio de
cultivo.
5. Repita esta operación por tres veces sucesivas, rotando la placa para obtener
una dispersión uniforme del inóculo en toda la superficie.
6. Coloque la tapa a la placa y deje secar el inóculo por 3 a 5 minutos.
7. Coloque los discos con los antibióticos sobre el agar mediante pinzas
estériles o usando un aplicador de discos. Oprima los discos suavemente con
una pinza para asegurar un buen contacto con el medio de cultivo. Los
discos deben estar espaciados de manera que su distancia a la pared de la
placa sea de 15 mm y entre ellos de 30 mm.
8. Incube a 35 – 37°C hasta el siguiente día (aproximadamente 18-19 horas). Si
se requieren los resultados con rapidez se pueden leer las zonas de inhibición
después de 6-8 horas de incubación, pero estos resultados deben ser
confirmados mediante una nueva lectura después de la incubación por las 18
-19 horas.
Resultados:
En el caso del antibiograma, se hará un cuadro de sensibilidad (S) o
resistencia (R) para cada uno de los antibióticos frente a esta estirpe, y
posteriormente serán utilizados como criterio para la determinación de la bacteria
problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido, será:
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Interpretación clínica de los resultados:
Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se
inscriben en el DNA
bacteriano. Su expresión
en el organìsmo, en
donde las condiciones
en cuanto a medios son
diferentes, expondría al
riesgo de fracaso
terapéutico. Para evitar
esto, el antibiograma
debe ser interpretado de
manera global a fin de
descubrir, a través de la
comparación de las
respuestas para cada antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso débilmente
expresado. Así, gracias a la interpretación, una cepa que aparece como falsamente
sensible será categorizada como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella
pneumoniae productora de BLSE puede aparecer sensible in vitro a las
cefalosporìnas de 3" generación. El resultado de Sensible debe ser corregido a
Intermedio o Resistente, ya que la utilización de estos antibióticos correría el riesgo
de provocar un fracaso terapéutico).
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02/06/08
Título de la práctica:
Realización de una gráfica de control de calidad a partir de datos sobre glucosa
hexokinasa.
Procedimiento:
1. Se necesita una serie considerable de datos para realizar la gráfica (unos 20).
2. Se realizan las medidas de las 20 preparaciones de la misma muestra a través
de fotocolorímetro.
3. Una vez obtenidas las absorvancias se calculan las concentraciones en
mg./dl.
4. Se haya la media y la desviación estandar que no debe ser superior al 5%.
Resultados:
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02/06/08
Título de la práctica:
Elaboración de una gráfica de Levey- Jennings
Fundamento:
La desviación estándar es el parámetro para crear la gráfica en la cual se indican los
valores diarios de los controles.
Esta gráfica se crea para cada prueba y para cada nivel de control
Los límites de la gráfica son ±1SD,±2SD,±3SD, respecto al promedio aritmético.
Procedimiento:
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30/05/08
Título de la práctica:
Realización de un antibiograma
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