República Bolivariana de Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis Cátedra: Análisis Instrumental

Técnicas Cromatográficas

Maracaibo, 24 de Julio de 2008

4.  Eluyente  Resolución  Tiempo muerto  Números de platos teóricos 2. Como es normalmente un Cromatógrama en Gases.Cromatografía de Gases: 1. 7. Enumere los tipos de Detectores usados en HPLC 5. Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatógrafo líquido. Establezca diferencia entre separación isocrática y separación con gradiente 6. Enumere las aplicaciones de la HPLC . Establezca diferencias entre los métodos de Cromatografía de Gases  Cromatografía de Gases  Cromatografía de Líquidos 3. 4. Describa el fundamento de HPLC 2. Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de Gas y estudie la función de cada una de ellas.  Enumere las características de la Fase Estacionaria  Enumere las características de la Fase Móvil  Establezca las características del soporte ideal en la fase est5acionria de HPLC. Clasifique los diferentes detectores utilizados en Cromatografía de Gases. Como afecta los siguientes parámetros en la Resolución de la columna: 7. 5. Estudie las definiciones y términos siguientes  Cromatografía  Cromatograma  Elusión  Fase Móvil  Tiempo de Retención  Ancho de base  Fase Estacionaria  Altura del plato teórico. Establezca la clasificación de los tipos de HPLC 3. Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografía de Gases Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) 1. Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía de Gases 6. y estudie la función de cada uno de ellos.

Fase Móvil: Puede ser un líquido o un gas que recorre la columna cromatográfica transportando los componentes de la mezcla a través de dicho sistema.Elución: Es el procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta..Cromatografía: Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composición.6. frente al volumen de efluente o al tiempo. Los tiempos de retención no son reproducibles. la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente.3.5. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa.Tiempo de Retención: Es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. Es también una medida del funcionamiento del instrumento. la cual puede ser sólida o líquida. este directamente relacionado con la . generalmente sólidas.. 1.7. 1. 1..8. 1. Registro producido por el cromatógrafo de gas / líquido. 1. 1.. de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. interiormente sin desplazarse..1.4..1.Ancho de Base: Es la separación de la longitud de las bases interceptado por agentes delongados en el detector.Altura del Plato Teórico: Se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna.-Estudie las definiciones y términos siguientes: 1. La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria. La fase estacionaria consiste en partículas.2. ni siquiera en una misma columna cromatográfica.. 1. como una pequeña cantidad en un tiempo breve.Fase Estacionaria: Es la que recubre la columna cromatográfica..Cromatograma: Es una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector. pequeñas y con una superficie microporosa.

varianza..9.12. 3.   La cromatografía gas-sólido (CGS): Tiene una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos debido a la adsorción física sobre la superficie del sólido. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes... 1. 1. 1. 1.11.10. Se define como: Donde Rs es la resolución. Esta técnica ha tenido una aplicación limitada debido a la tendencia de los picos de elución a formar colas y a la retención semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria. siendo la fase estacionaria un líquido (CGL) o un sólido (CGS). si ésta es capilar. tRA y tRB son los tiempos de retención de los componentes A y B.. y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes.Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de Gas.. 2. La cromatografia gas-líquido (CGL): Se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte (soporte) o en las paredes interiores de la columna.Número de Platos Teóricos: Se utiliza como una medida eficiente de la columna.Establezca las diferencias Cromatografía de Gases. entre los métodos de En cromotografía de gases se incluyen todos los métodos cromatográficos en los que la fase móvil es un gas (gas portador).Eluyente: Es aquella sustancia que se pone en contacto con la fase estacionaria y permite que se desplace la muestra.Tiempo Muerto: Es el tiempo de retención del componente inerte o gas portador.Resolución: Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la columna en los términos de varianza y longitud de la columna. y estudie la función de cada una de ellas: .

no medible directamente. donde se accede mediante una jeringa adecuada o con una válvula de inyección.000-2. o Las columnas capilares: Tienen un diámetro interior inferior a 1 mm (320-250 μm) y una longitud de 5 a 50 m. También se encarga de vaporizar las muestras cuando éstas no son gaseosas. nitrógeno o argón. La fase estacionaria se depositada sobre las paredes interiores del tubo capilar. con un diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. de elevado grado de pureza. en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. vidrio y teflón. Un sistema de Integración: para cuantificar la señal generada por cada componente en el Detector. Las columnas semicapilares tienen un diámetro interior de 530 μm que admiten cantidades de muestra similares a las columnas de relleno. Alcanzan una eficacia hasta de 4. la temperatura del inyector ha de ser superior a la del punto de ebullición del componente de la mezcla menos volátil. Suelen emplearse para muestras poco complejas. El caudal del mismo que pasa por la columna. . Existen dos tipos: o Las columnas de relleno: Suelen ser de cobre. Es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física. y crear una matriz adecuada para el detector. y proporcionan mayor eficacia que éstas. acero inoxidable. El sistema de detección genera una señal cuando un componente de la mezcla completa el recorrido del sistema de separación. Así. Detector: Es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica.000 (platos teóricos/m) y se usan para muestras complejas. Suelen construirse con sílice fundida que le dan gran resistencia física y flexibilidad. aluminio. generalmente helio.     Gas Portador: es un gas inerte. El Inyector es el lugar por donde se introduce una pequeña cantidad de muestra (del orden de 1 cm3 de gas o 1 micro-litro de líquido) en medio de la corriente de gas. Cada columna se diseña para aprovechar alguna propiedad de los diferentes componentes que resulte adecuada para generar distinta velocidades de avance para cada uno de ellos durante el recorrido de la columna. La eficacia está en torno a 1. Inyector: Es sólo una pequeña cámara colocada inmediatamente antes de la(s) columna(s) de separación. Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un cromatógrafo. ha de ser conocido y controlado.000 (platos teóricos/m). Cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra. máximo 10 componentes. Columnas: El sistema de columnas cromatográficas constituyen el corazón de todo cromatógrafo.

Detectores según su Modo de Respuesta: o Dependientes del Flujo Másico: Producen una señal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a través de él en la unidad de tiempo pero es independiente del volúmen de gas portador requerido para la elución.Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía de Gases: . Detectores según el proceso de detección Ionización.   • 5. Detectores Destructivos y No destructivos.4. Ópticoespectroscópico. etc. es en referencia a si la muestra es destruída o no. Esta clasificación..Clasifique los diferentes detectores utilizados en la cromatografía de Gases: Estos pueden ser clasificados:  Detectores según su Grado de Selectividad : o Universales: Responde a la mayoría de los solutos que pasan por él. obviamente. Electroquímico. o Específicos ó Selectivos: Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mínimo de respuesta a otras. o Dependiente de la Concentración: Dan una señal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volúmen de gas portador que pasa a través de él..

-Finalmente.. se introducen en la cámara de inyección. La separación de los compuestos de una mezcla se realiza en las siguientes etapas: 1. RMN . y son arrastradas hasta cabeza de columna.-Los componentes se fijan en una pequeña zona de la columna. así como el caudal de gas portador. los solutos que salen de la columna. donde se vaporizan.. 7.Como es normalmente una Cromatografía de Gases. por equilibrios sucesivos entre fase móvil y estacionaria cada componente se desplaza por la columna a velocidades diferentes. 2.Fase Estacionaria:    Es la forma más habitual La fase estacionaria es no polar y la móvil es polar Utiliza disolventes no polares Fase Móvil    Es habitual Utiliza una fase estacionaria polar y una móvil no polar Utiliza disolventes polares 6. se ajustan las temperaturas de la cámara de inyección.-Una vez elegida la columna y fase estacionaria.-Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 µl cuando son líquidas y sobre 1 ml si son gaseosas. columna y detector. 3. Cuando la señal del detector es constante (sin ruidos la línea base) se hace la inyección de la muestra. 4. IR. pasan al detector y se obtiene el cromatograma.Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografía de Gases: CUALITATIVAS  Identificación Cromatográfica: o Por Datos de Retención o Por Serie Homólogas (Indices de Retención de Kovacs)  Identificación No Cromatográfica: o Análisis Clásicos o Identificación por: • Adición de Estándar • Formación de Derivados • Sustracción de un Componente  Identificación con Técnicas Auxiliares: UV. MS.

basándose en las diferentes retenciones que experimentan los componentes de la misma al pasar a través de una fase estacionaria. ..Describa el fundamento de la HPLC: La cromatografía líquida es una técnica cuyo objetivo es la separación de los distintos componentes de una mezcla de sustancias.CUANTITATIVAS  Normalización de Área  Normalización de Área con Factores de Respuesta  Estandarización Externa  Estandarización Interna 1.

contenida en una columna cromatográfica. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar. La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés. o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía liquido . que pueden ser muy pequeñas.químicas frente a un sistema cromatográfico dado. . y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. Deben cumplirse las condiciones siguientes: .liquido. la separación de los componentes de la muestra se produce debido a sus interacciones entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida. Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico . Por tanto. se basa la separación cromatográfica.. . La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades.Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos). reactividad química o bioquímica. uno remoto y otro próximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad. Para explicar el fenómeno cromatorgráfico es necesario establecer dos tipos de fundamento. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención. Así. volatilidad.El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible.Establezca la Clasificación de los tipos de HPLC:  Cromatografía de fase normal: Fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química. y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. en estas diferencias. 2. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. tamaño. sino también en factores estericos de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. carga.cuando la muestra es eluida por una fase móvil líquida. etc.

En general. por ejemplo. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl. Estos tampones controlan el pH. la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención. la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH. un compuesto relativamente apolar. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Aun así. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto. dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Por este motivo.Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuestodisolvente polar. mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial. Aparte de la hidrofobicidad de la fase móvil. y una fase estacionaria apolar. las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar. pero también . Cromatografía de fase reversa: Consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. y como que la entropía de la interfase compuestodisolvente está controlada precisamente por la tensión superficial.

Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Cromatografía de exclusión molecular  También conocida como cromatografía por filtración en gel. separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente. estas partículas son porosas. En consecuencia. lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta. Aun así. Cromatografía de intercambio iónico:  En la cromatografía de intercambio iónico. muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente.neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. Los poros quedan conectados formando una malla o red. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar. la retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. según su radio de Stokes. o más precisamente. la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. También es muy útil para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de . y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular. pero en general mejoran la separación cromatográfica. A los fines prácticos. En esta cromatografía. la columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC.

La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals. específicos y reversibles. Un incremento en la concentración del contraión (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retención.1 a 10 ml/min(con control del 0. 3. Generación de presiones por encima de 6000 psi(~410 atmósferas) Flujo libre de pulsaciones Intervalo de caudales de 0.1-100μL) - Columna: Se produce la separación de los componentes.Válvula Inyectora: Consiste en una válvula de seis vías que permite introducir en el flujo de solvente.Bomba: Envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño. En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones elevada carga y radio pequeño. con una longitud de 10-30 . la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. 2. 5. generalmente de acero inoxidable. interacciones dipolo-dipolo. El sistema de bombeo debe seguir los siguientes requerimientos: 1. interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria. y estudie la función de cada uno de ellos. Se producen pequeñas cantidades de muestra (0.5%) Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o Teflón) Reproducible Tipos de Bombas: • Bombas reciprocas • Bombas de desplazamiento • Bombas neumáticas .  Cromatografía basada en bioafinidad Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables. 4. 3. interacciones electrostáticas. Un equipo para cromatografía líquida de alta resolución puede representarse por el siguiente esquema: . Son.poliestireno. generalmente de Acero inoxidable. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio catiònico mientras que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio aniònic.. ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado.Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatógrafo líquido.

Características de la Fase Estacionaria:   Puede ser alúmina.cm y un diámetro interno de 4-10mm. PRECOLUMNAS  Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y contaminantes de las disolvente. densidad etc. fluorescencia etc. Deben de tener un volumen interno pequeño para reducir el ensanchamiento de pico.000-60. sílice o resinas de intercambio iónico.000 platos/metro. Para que el líquido inmovilizado sea útil debe poseer diferentes coeficient5es de participación con los solutos.) Registrador Integrador: Realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma) que idealmente.. Este que El integrador calcula además el área correspondiente a cada pico. . Basados en una propiedad de la fase móvil (refracción.1. De 1-10μm tamaño particula-40.  La composición del relleno debe ser semejante a la columna analítica - Detector: Produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa señal es enviada al registrador. la cual es proporcional a la cantidad de sustancia - 3.) y en una propiedad del soluto (absorbancia en UV. se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original.

pero solamente existen ahora dos tipos: o Tipo Deflexión o Tipo Fresnel .Características de la Fase Móvil: Es un solvente líquido. el cual puede ser puro o una mezcla de solventes.Enumere los tipos de detectores utilizados en HPLC: Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: • Detectores basados en una propiedad de la fase móvil .3. Detector Ultravioleta Los detectores más utillizados en HPLC son: • Detector UV.  3. 4.Para que un soluto presente un tiempo de residencia razonable en la columna. Ejemplo: Detector de Indice de Refracción • Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. debe poseer por lo menos. pero de diferentes polaridades.2.. Hay básicamente tres tipos: o Detector de Longitud de Onda Fija o Detector de Longitud de Onda Variable o Detector de Arreglo de Diodos • Detector de Indice de Refracción.. retener) la fase estacionaria  La mayoría d elos soportes cromatográficos está hecha de diatomita. con algunas impurezas.  Entre solutos de polaridad similar.. Existen muchos diseños de estos detectores. por efecto de la gravedad. cuando éstos difieren suficientemente son factibles separaciones limpias.Características estacionaria de HPLC  del soporte ideal en la fase La función básica del soporte es la de “mantener” (sotener. se obliga a pasar a través del sólido bajo presión o bien se deja percolar a través de él. el orden de elusión generalmente sigue al orden de puntos de ebullición. retendrán selectivamente uno o más de los componentes por interacción dipolo o por formaciones de abducto  3.  Los solutos con puntos de ebullición casi idénticos. Ejemplo: Detector de Fluorescencia. una cierta compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria.  El líquido. Químicamente es casi todo sílice.  El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos.

La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. o compuestos como el ácido trifluoroacético. el metanol y el acetonitrilo. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis. Los disolventes más utilizados son el agua. Detector de Fluorescencia Inducida por Laser o Según la Fuente de Excitanción o Según el sistema óptico Detectores Electroquímicos. El agua puede contener tampones. En el ejemplo. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria.Establezca diferencia entre una separación isocrática y separación con gradiente: En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatogràfica a través de la fase estacionaria (normalmente. un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. mientras que los compuestos más .• • • Detector de Fluorescencia. conocida como elución en gradiente. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto. sales. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización . Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. que ayudan a la separación de los compuestos. Pueden ser clasificados en tres tipos: o Detector Amperométrico o Detector Conductimétrico o Detector Potenciométrico 5.. de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.

. En cambio.Enumere las aplicaciones de la HPLC  Compuestos iónicos. 7. pesticidas.  Compuestos de alto peso molecular. Aparte. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a un detector UV-VIS..Cómo afectan los siguientes parámetros en la Resolución de la columna:  Diámetro de la partícula: La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. utilizadas principalmente en espectrometría de masas.  Compuestos termolábiles y no volátiles. plastificantes. como las de tipo capilar. hace falta realizar una serie de pruebas previas por tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos. como polímeros. con un diámetro inferior a 0. etc. pero a la vez.hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. A menudo. esteroides. aumentaría la resolución de la columna. las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras. 6. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad. como aminoácidos. pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. hidrocarburos polinucleares. siendo las de 5\mum de diámetro las más utilizadas. etc. existen otros tipos de columnas.  Longitud de la columna: Es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. drogas y un producto muy grande de otros productos farmacéuticos. sales inorgánicas. como vitaminas. aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.3 mm..  Análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo. Estas partículas pueden tener diferentes medidas. Las columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación. productos naturales. ácidos orgánicos.

análisis de barbitúricos.  En separaciones según el tipo químico.  El análisis de medicamentos (determinación de los componentes activos de una tableta analgésica. anticonceptivos. Determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos. ya que su finalidad no es la separación de compuestos individuales.  Determinación de esteroides. . nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico. etc). sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla.

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