Está en la página 1de 6

PCR en Tiempo Real

Introduccin

Pgina 1 de 6

PCR en Tiempo Real

Introduccin general
La reaccin en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en ingls son PCR ("polymerase chain reaction"), es una tcnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los aos 80. Con esta metodologa se pueden producir en el laboratorio mltiples copias de un fragmento de ADN especfico, incluso en presencia de millones de otras molculas de ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus nicos requerimientos son que existan nucletidos en el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucletidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una pequea cadena de ADN que pueda unirse a la molcula que queremos copiar para que sirva como cebadora (el cebador, en ingls "primer"). La sensibilidad de la tcnica de PCR es muy alta pero presenta algunos inconvenientes, como son que no es una tcnica cuantitativa y una relativamente alta probabilidad de obtener falsos positivos por contaminacin. Para solventar este ltimo problema se ha de optimizar la secuencia de los cebadores, as como la temperatura precisa para que estos se unan al ADN en la localizacin correcta y realizar una adecuada manipulacin de los reactivos. Por otra parte para solventar el problema de la cuantificacin se han generado unas variaciones sobre el esquema inicial de la PCR, dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa o PCR en tiempo real. La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real la amplificacin de nuestro genoma de inters. Para llevar a cabo esta deteccin existen varios mtodos pero casi todos basados en la utilizacin de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su sitio por accin de la ADN polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser. La cuantificacin de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR ser proporcional a la cantidad de ADN que se est amplificando. En general para que sea vlida esta tcnica requiere realizar en paralelo una curva patrn en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se est amplificando.

Pgina 2 de 6

PCR en Tiempo Real

A continuacin desarrollamos un programa monogrfico sobre la PCR Cuantitativa en los siguientes apartados:

Consideraciones generales
Debido a la elevada sensibilidad de la tcnica, uno de los puntos ms importantes a la hora de realizar una PCR en Tiempo Real, es la calidad del material de partida. Por ello, la extraccin de los cidos nucleicos de la muestra toma un papel crtico y fundamental. Aunque en los ltimos aos se han hecho grandes progresos en la simplificacin de la extraccin y purificacin de los cidos nucleicos bacterianos y virales de muestras clnicas, todava no se ha encontrado un mtodo automtico universal que se pueda utilizar con cualquier tipo de muestra. En esta parte vamos a revisar algunos de los principios bsicos que pueden ayudar a desarrollar tanto protocolos nuevos de extraccin como a mejorar los ya existentes eliminando el uso de soluciones peligrosas, centrifugaciones y mltiples pasos.

Pgina 3 de 6

PCR en Tiempo Real

Tabla I. Consideraciones necesarias para seleccionar el mtodo de preparacin de la muestra ms adecuado.


Consideraciones para desarrollar un mtodo de preparacin de la muestra

Consideraciones de la muestra
; ;

Tipo de muestra: sangre, plasma, suero, esputo, orina, LCR, etc. Procesamiento de la muestra durante o despus de la recogida (recogida de sangre en tubos con EDTA, citrato, heparina; licuefaccin del esputo; etc.) Volumen de muestra a procesar Nivel de cido nucleico extrao (fluido seroso versus purulento; sangre completa versus plasma o suero) Propiedades fsicas de la muestra (torunda de algodn, fluido, tejido, viscosidad, etc.) Presencia o ausencia de inhibidores de la amplificacin Carga bacteriana dentro de la muestra (nmero de organismos patgenos por volumen de muestra) Resistencia de la pared celular frente a la lisis (dificultad de lisar hongos y especies de Mycobacterium) Tendencia del microorganismo a lisar espontneamente (Mycoplasma) Deseo de esterilizar la muestra durante la preparacin de la misma (Mycobacterium spp., HCV, HIV, etc) RNA versus DNA Doble cadena versus cadena sencilla Requerimiento de aislar el RNA sin contaminaciones de DNA (pe, cuantificacin de la carga viral de HIV sin amplificar el provirus)

; ;

; ;

Consideraciones del organismo


;

; ;

Caractersticas de los cidos nucleicos


; ;

Criterios para optimizar el mtodo de preparacin de la muestra Eleccin de la muestra ms apropiada Sensibilidad deseada del ensayo Volumen requerido de muestra para procesar Nmero de tests diferentes a realizar sobre la misma muestra procesada Estabilidad de la diana durante la recogida y procesamiento de la muestra (inactivacin de nucleasas)

Pgina 4 de 6

PCR en Tiempo Real

Evitar el uso de soluciones txicas Evitar la centrifugacin excesiva Eliminacin de los inhibidores de la amplificacin mediante diluciones Cantidad mnima de muestra a manejar Robustez del protocolo Ausencia de equipamiento muy especfico

El mtodo ideal de preparacin de la muestra representa un equilibrio entre los requerimientos de la muestra y el microorganismo diana a detectar. Una vez que se ha elegido el microorganismo, la patognesis de la infeccin generalmente dicta la muestra ms adecuada y el nmero de microorganismos que probablemente estn en dicha muestra. Por otro lado, la determinacin de la sensibilidad deseada del ensayo y el nmero de tests a realizar en la muestra procesada, dictan el volumen requerido de muestra para procesar. Tomando el cultivo microbiolgico como tcnica de referencia, ste ha dirigido la seleccin de la muestra ms adecuada en muchas de las enfermedades infecciosas, pe, sangre o plasma para el VIH y HCV, torundas de algodn endocervicales para Chlamydia, etc. Para maximizar la probabilidad de diagnosticar una infeccin, debera muestrearse el mayor volumen de muestra posible. Sin embargo, ya que los volmenes de reaccin habituales son de 100L o menos, hay que llegar a un equilibrio entre los complicados y tediosos pasos de concentracin de la muestra (precipitacin con etanol, captura de cidos nucleicos, centrifugacin) y la sensibilidad del ensayo. El tamao de la muestra se hace crtico cuando el nmero de agentes infecciosos por volumen de test es muy pequeo. Si el mtodo de amplificacin es lo suficientemente sensible como para detectar el producto generado por una sola molcula diana, la probabilidad de un falso negativo, es decir, de ausencia de la seal especfica de amplificacin cuando la diana se encuentra presente en la muestra, puede estimarse con la ecuacin:
PN = CN N! eC

donde "C" es el nmero medio de copias de molcula diana en solucin, "N" es el nmero de copias en la muestra y PN es la probabilidad de detectar N copias.
Tabla II. Probabilidad de obtener un resultado negativo por el bajo nmero de copias de la diana Nmero de copias (C) 1 5 10 % de falso negativo 36,7880 0,6738 0,0045

Pgina 5 de 6

PCR en Tiempo Real

20

2,06 10-7

Los mtodos de preparacin de la muestra pueden contribuir de muchas formas a la fiabilidad de la deteccin de la diana en muestras clnicas. Si la eficiencia de recuperacin de la diana de un mtodo de preparacin es baja, puede ocasionar un elevado nmero de falsos negativos. Hay un gran nmero de compuestos en las muestras clnicas que pueden inhibir los sistemas de deteccin al interaccionar con compuestos de la reaccin enzimtica. Por otro lado, si la concentracin de dianas en la muestra es suficientemente elevada, la dilucin de la muestra puede eliminar los inhibidores al mismo tiempo que mantiene los cidos nucleicos a niveles a los cuales la probabilidad de alicuotar cero copias es baja. Hasta la fecha se ha realizado muy poca investigacin y hay pocos datos sobre las substancias presentes en fluidos biolgicos que pueden inhibir las enzimas utilizadas en las reacciones de amplificacin. Se sabe que los pigmentos (0,8M) y sus derivados metablicos son inhibidores de las DNA polimerasas, El lquido cefalorraqudeo (LCR), la orina y los esputos pueden tambin contener inhibidores de la Taq polimerasa aunque no han sido caracterizados. Los polisacridos cidos, componentes de las glicoprotenas presentes en los esputos son inhibidores de las polimerasas. Muchos de los reactivos utilizados tradicionalmente en la purificacin de los cidos nucleicos, como el EDTA, el SDS, el cloruro de guanidinio son inhibidores de las enzimas de amplificacin, por lo que su uso para solubilizar las membranas celulares o inactivar las nucleasas, requiere pasos adicionales de eliminacin o neutralizacin. Un problema adicional aparece cuando se utilizan mtodos como la lisis alcalina, el hervido y el secado que pueden producir parcialmente DNAs de cadena sencilla, los cuales pueden servir ms fcilmente como substratos inespecficos para el annealing de sondas en condiciones no muy estrictas y, por lo tanto, disminuir la especificidad del sistema de amplificacin. Los patgenos que poseen RNA y DNA a lo largo de su ciclo vital (como el VIH) presentan una cuestin adicional si se desea detectar solamente el RNA viral. La RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) detecta tanto el DNA proviral como el RNA viral a menos que se aadan pasos de eliminacin de dicho DNA proviral. Los mtodos de amplificacin que en teora son capaces de utilizar solamente moldes de RNA (como la 3SR) no amplifican el DNA proviral a menos que se incluya un paso de desnaturalizacin en el protocolo de extraccin de la muestra. Otro punto importante en la preparacin de la muestra hace referencia a la diferenciacin entre microorganismos viables y no viables, ya que los mtodos que amplifican los cidos nucleicos pueden detectar microorganismos muertos, inactivos o en replicacin. Esto puede ser una ventaja cuando la viabilidad del microorganismo se pierde rpidamente durante la recogida o el transporte de la muestra o cuando el microorganismo no se puede cultivar. Por otro lado, la discriminacin entre microorganismos viables y no viables presenta un grave problema si los no viables permanecen en la muestra una vez que la infeccin ha desaparecido.

Pgina 6 de 6

PCR en Tiempo Real

También podría gustarte