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Introducción a las Proteínas
Introducción En los capítulos precedentes se discutió el contraste entre la complejidad del sistema vivo y la relativa simplicidad de los monómeros que los componen. De la misma manera, se dio cuenta de la trascendencia del enlace covalente y sus implicaciones en la construcción de las macromoléculas. A partir del presente capítulo, se discutirá a profundidad la relación entre ESTRUCTURA Y FUNCION (E-F) de las biomoléculas proteicas, comenzando por reconocer que la relación entre la secuencia del polímero y la función biológica tiende a ser univoca. La relación E-F se puede enunciar a partir de tres premisas básicas: 1) Una estructura única de una macromolécula determina una función. 2) Las interacciones no covalentes juegan un papel definitivo en la función de una macromolécula. 3) La secuencia de monómeros en macromoléculas es específica y da cuenta de una información biológica que denota el orden biológico, siendo las proteínas una relación típica entre E-F. Clasificación Por convención, una proteína es un polímero que posee al menos 100 residuos* de aminoácidos. Cuando esta primera condición se cumple, generalmente se adoptan los siguientes criterios para completar la clasificación: 1) Solubilidad. En este caso se destacan dos grupos de proteínas: Albúminas que son aquellas proteínas solubles en agua y en soluciones salinas moderadamente concentradas (Por ejemplo en sulfato de amonio a la “mitad de la concentración saturante”). Globulinas grupo que corresponde a proteínas solubles en soluciones salinas diluidas pero insolubles en agua y sulfato de amonio “a la mitad de la concentración saturante”. 2) Por su composición. Se denominan Proteínas simples, a aquellas que poseen secuencias de aminoácidos, como único elemento estructural. Las Proteínas conjugadas contienen además de los aminoácidos, uno o más grupos prostéticos** que pueden ser glúcidos, lípidos, ácidos nucleicos, ácido fosfórico y metales, entre otros. 3) Por su estructura. Se pueden denominar fibrosas o globulares. 4) Por su función biológica. Esta es la clasificación más usual para las proteínas y en este caso se tiene: Enzimas, Proteínas de transporte, Proteínas nutrientes y de almacenamiento, Proteínas contráctiles o motrices, Proteínas estructurales, Proteínas de defensa, Proteínas reguladoras y un pequeño grupo de proteínas con actividades “exóticas”, con funciones no conocidas, que se denominan: otras proteínas.

*Aquí residuo significa parte. En consecuencia, 100 residuos de aminoácidos se entienden como 100 unidades monomericas unidas. **Corresponde al componente no aminoacídico que hace parte de la estructura de algunas proteínas.

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Tabla 7-1. Generalidades sobre proteínas
Proteina Citocromo Ribonucleasa A Lisosima Mioglobina Quimotripsina Quimotripsinogeno Hemoglobina Albumina serica Hexoquinasa ARN polimerasa Apolipoproteina Glutamina Sintetasa Titin Fuente Humano Pancreas bovino Huevo Equino Pancreas bovino bovino Humano Humano Levadura E coli Humano E coli Humano Peso Molecular 13000 13700 13930 16890 21600 22000 64500 68500 102000 450000 513000 619000 2993000 No de residuos de aminoacidos 104 124 129 153 241 245 574 609 972 4158 4536 5628 26926 Relación entre el peso molecular y el No de residuos 125 110.5 108.0 110.4 89.6 89.8 112.4 112.5 104.9 108.2 113.1 110.0 111.2 No de Cadenas Polipetídicas 1 1 1 1 3 1 4 1 2 5 1 12 1

El tamaño molecular varía mucho entre las diferentes proteínas. En la tabla 7-1 se presenta un resumen de diferentes proteínas, sus pesos moleculares, el número de residuos de aminoácidos y el número de cadenas polipeptídicas asociadas. El cálculo aproximado de los residuos de aminoácidos a partir del peso molecular de la proteína, es relativamente simple. En promedio un aminoácido pesa 128 g/mol, si se considera que en el enlace peptídico se tiene una pérdida de una molécula de agua por enlace, y si este valor se descuenta del peso promedio calculado para el aminoácido; entonces al dividir el peso molecular (calculado por diferentes métodos fisicoquímicos) por el valor del aminoácido promedio -que considera el enlace peptídico- se obtiene un valor razonablemente cercano al del número de residuos existentes en las proteínas. La clase de aminoácidos varía sustancialmente de proteína a proteína. En la tabla 7-2 se presenta la composición comparativa de dos proteínas: La citocromo C y la quimiotripsina de bovinos. Estas dos proteínas son significativamente diferentes en cuanto su función biológica y al realizar la hidrólisis total se observa que también se presentan diferencias cualitativas y cuantitativas de los residuos. Un hecho significativo deducido de estudios de las diferentes proteínas, tiene que ver con que la distribución de los diferentes aminoácidos no es equitativa en las proteínas. Igualmente se tiene que una proteína activa en algunos casos posee grupos diferentes a la cadena peptídica. Estas proteínas se denominan proteínas conjugadas y la parte no proteica es usualmente denominada grupo prostético. Algunas proteínas poseen más de un grupo prostético y en muchos casos estos grupos juegan un papel importante en la función biológica de la proteína que lo contiene. En la tabla 7-3 se presentan algunos ejemplos. Tabla 7-2 Comparación de proteínas
Bovino Aminoacido/Proteina Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Citocromo c 6 2 5 3 2 3 9 14 3 6 6 18 2 4 4 1 8 1 4 Quimotripsinogeno 22 4 15 8 10 10 5 23 2 10 19 14 2 6 9 28 23 8 4

Val

3

23

55

Tabla 7-3 Proteínas conjugadas
Clase Lipoproteina Glicoproteina Fosfoproteina Hemoproteina Flavoproteina Grupo Prostético Lípido Carbohidrato Grupo Fosfato Heme Flavin Nucleotido Hierro Cinc Metaloproteina Calcio Molibdeno Cobre Ejemplo Lipoproteina de sangre Inmunoglobulina G Caseina Hemoglobina Succinato deshidrogenasa Ferritina Alcohol deshidrogenasa Calmodulina Dinitrogenasa Plastocianina

En la tabla 7-4 se presenta un resumen del esquema general de organización molecular que tienen las proteínas y la figura 7-1 ilustra las organizaciones descritas.
Grado de organización Secuencia de aminoácidos Tabla 7-4 Esquema general de la organización de las proteínas Nivel de estructuración Posibilidades Estructura primaria Prácticamente ilimitadas Al azar Estructura secundaria  hélice Hoja plegada Fibrosa Estructura terciaria Globular Monómeros iguales Monómeros diferentes Muy variadas Enlaces implicados Peptídicos Puentes de hidrógeno Puentes disulfuro, fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, atracciones hidrofóbicas y atracciones polares. Normalmente fuerzas no covalentes Normalmente fuerzas no covalentes

Conformación

Estructura cuaternaria Asociación Asociaciones

Figura 7-1 Organización de las proteínas

56 En el trabajo con proteínas, el estudio de la estructura y su función pasa necesariamente por el aislamiento. Una célula posee miles de proteínas y en consecuencia ha sido necesario el desarrollo de métodos que permitan separar y purificar una proteína que es objeto de un estudio particular. La fuente de las proteínas normalmente es un tejido o un cultivo microbiano. Cuando las células son “fracturadas”, se obtiene un material rico en proteínas en solución que se denomina extracto crudo. Si es necesario, se utiliza centrifugación diferencial para separar restos celulares u organelas, para posteriormente emplear la cromatografía de intercambio iónico cuyo objeto es separar proteínas de diferente carga. Otros métodos cromatográficos aprovechan las diferencias de tamaño, afinidad en la unión con otros tipos de moléculas y la solubilidad para lograr la separación. También se recurre en la separación y purificación a métodos no cromatográficos tales como precipitación selectiva con sales, ácidos o altas temperaturas. En general el protocolo para obtener una proteína pura supone la combinación de métodos cromatográficos y no cromatográficos, partiendo del principio de que se emplean solo los métodos cromatográficos cuando se posee una concentración adecuada de la proteína objeto de análisis. La purificación de proteínas está ligada a la identificación de una serie de propiedades importantes tales como: Unidad de actividad enzimática que está definida como la cantidad de enzima que causa la transformación de 1 mol de sustrato por minuto a 25°C bajo condiciones óptimas de medida. El término actividad enzimática se refiere al total de unidades enzimáticas que se tiene en una solución, mientras que la actividad específica hace referencia al número de unidades enzimáticas por miligramo de proteína. La actividad específica es una medida de la pureza enzimática y se incrementa durante el proceso de purificación y se hace máxima y constante cuando se tiene el enzima puro. En la tabla 7-5 se presenta un esquema hipotético de purificación de una proteína. Tabla 7-5 Purificación de proteína hipotética
Etapa Extracto Celular crudo Precipitación con sulfato de amonio Cromatografia de Intercambio Ionico Cromatografia de exclusión Cromatografia de afinidad Volumen (mL) 1400 280 90 80 6 Proteína Total (mg) 10000 3000 400 100 3 Actividad (unidades) 100000 96000 80000 60000 45000 Actividad específica (unidades/mg) 10 32 200 600 15000

Tres de los métodos cromatográficos más empleados en la purificación de proteínas son: a) Cromatografía de intercambio catiónico, b) Cromatografía de tamaño-exclusión y c) Cromatografía de afinidad. En el primer caso la fase estacionaria se caracteriza por poseer carga negativa y las proteínas se desplazan a través de la columna interactuando con la fase estacionaria. La separación se da porque dependiendo del pH que posea la fase móvil, las

57 proteínas en solución presentarán una carga neta que permitirá la interacción fase estacionaria-proteína que en último término es el mecanismo que opera en la separación. La cromatografía tamaño-exclusión o gel-permeación opera a través de las diferencias de tamaño de las proteínas en solución. La fase estacionaria posee una serie de poros que son atravesados por las moléculas pequeñas haciendo que su salida sea posterior a las proteínas de mayor tamaño, que pasan libremente por la periferia dado su impedimento para atravesar los poros. La cromatografía de afinidad separa las proteínas por uniones específicas entre fase estacionaria y proteína. En este caso la fase estacionaria posee ligandos específicos para una proteína. Al ser adicionada una solución que posee la proteína afín, esta es retenida en la columna, mientras que el resto de los componentes son “lavados” de la columna mediante la aplicación de una porción importante de fase móvil. Finalmente se adiciona al sistema una solución del ligando, que al interactuar con la proteína, permite que sea separada de la fase estacionaria y pueda entonces fluir a través de la columna. En la figura 7-2 se presenta el esquema de los tres tipos de separación cromatográfica.

Figura 7-2 Sistemas de separación cromatográficas Otra de las técnicas empleadas en el estudio de las proteínas es la electroforesis. Esta técnica está basada en la migración diferencial de moléculas cargadas por la presencia de un campo. Usualmente no se emplea para la purificación, dada su tendencia a inactivar las proteínas y es normalmente empleada como herramienta analítica de identificación.

58 En la electroforesis, la fuerza de movimiento de las macromoléculas es promovida por un potencial eléctrico (E). La movilidad electroforética de una molécula, , es la razón entre la velocidad de la partícula (V) y el potencial eléctrico. La movilidad electroforética es igual a la carga neta de la molécula (Z) dividida por el coeficiente de fricción.

59 En electroforesis se usa comúnmente el Sodio Dodecil Sulfato (SDS). El SDS se une, probablemente a través de interacciones hidrofóbicas, de manera proporcional al peso molecular de la proteína contribuyendo a aumentar la carga neta de la proteína. La electroforesis en presencia del SDS separa proteínas casi exclusivamente por el peso molecular, donde los polipéptidos pequeños migran más rápidamente. La movilidad electroforética de la proteína en un gel de poliacrilamida-SDS está relacionada con el peso molecular. Cuando se corre una solución estándar de proteínas con peso molecular conocido, paralelamente a una proteína de peso desconocido se puede establecer por la comparación de la migración, el peso molecular de la proteína problema. Ver figura 7-3 Finalmente, la técnica denominada Isoelectroenfoque separa mezclas al recurrir adicionalmente al punto isoeléctrico de las proteínas. Se considera que esta es analíticamente más sensible que la electroforesis convencional. En la figura 7-4 se presenta el correspondiente esquema.
Figura 7-4 Isoelectroenfoque

El estudio a profundidad de las proteínas comienza con la determinación estructural, que a su vez parte del reconocimiento de los monómeros involucrados. La estructura primaria de una proteína, que también se le suele denominar estructura covalente, depende de esta secuencia lineal de aminoácidos y es evidente que tiene una relación directa con la función biológica que cumplen las proteínas. Un resumen de las técnicas empleadas para la identificación de la secuencia de aminoácidos se presentará en el apartado secuenciamiento de proteínas.

60 Una vez se logra aislar la proteína se requiere establecer la secuencia del polímero. Actualmente las técnicas del secuenciamiento de polipéptidos están basadas en la degradación de Edman, protocolo que se discutirá más adelante y que actualmente se realiza de manera automatizada mediante un equipo denominado secuenciador. El estudio de la secuencia de aminoácidos ha tenido trascendental importancia en estudios básicos de genética evolutiva, mecanismos de reacciones enzimáticas e ingeniería de proteínas. En la figura 7-6 se presenta la secuencia de aminoácidos del citocromo c humano y la comparación con esta misma proteína aislada de otras especies. Al comparar las secuencias de más de 60 especies se tiene que: 1) 27 posiciones de la cadena son invariantes. 2) Se presenta una porción importante de sustituciones conservativas ( cambio de aminoácidos similares). 3) Se da un tipo de sustitución que se denomina no conservativa, en la cual los cambios en la secuencia se asume que son al azar. Con el estudio a profundidad de estas tres premisas se tienen evidencias contundentes tanto de la actividad como de la evolución.

Figura 7-6. Secuencia comparativa de la proteína citocromo C

Complementando el argumento anterior, en la figura 7-7 se presenta un ejemplo del empleo de la secuencia de aminoácidos como herramienta para estudios evolutivos. Las ramificaciones aparecen por las diferencias en las secuencias entre las especies y los números representan la cantidad de aminoácidos diferentes entre una especie y su ancestro.

Figura 7-7. Diferencias evolutivas de las secuencias del citocromo c en diferentes especies.

61 Secuenciamiento de Proteínas (No leer esta parte) En 1953 se dan dos hechos definitivos para la Bioquímica. El primero y más publicitado involucra la determinación del modelo de la doble alfa hélice del DNA por parte de Watson y Crick. El segundo de igual trascendencia Bioquímica (pero no tan publicitado) fue protagonizado por el grupo de F. Sanger al presentar la secuencia completa e inequívoca de la hormona insulina. Contrariamente a lo expresado por algunos investigadores que planteaban que secuenciar representa un esfuerzo estéril, rápidamente se encontró una relación directa entre las secuencias de ADN y proteínas, lo que justificó con creces el esfuerzo de química experimental realizado. La identificación de la estructura de una proteína parte del principio químico de que la asignación estructural requiere de la separación y aislamiento de la sustancia problema. A continuación se resume el protocolo general: 1. Selección de la muestra de interés. 2. Preparación de extracto crudo (muestra + sln extractante). 3. Concentración por métodos químicos ( precipitación). 4. Separación cromatográfica. 5. Verificación por electroforesis. 6. Según tamaño: a. Proteínas pequeñas. Programa de secuenciamiento b. Proteínas grandes. Eliminación de puentes disulfuro. Hidrólisis enzimática. Programa de secuenciamiento. Identificación de puentes disulfuro

En la figura 7-8 se resume el protocolo general que se emplea para realizar el secuenciamiento de polipéptidos o proteínas relativamente pequeñas.

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Figura 7-8. Etapas en el secuenciamiento de polipéptidos

Cuando se requiere dar cuenta de la secuencia en una proteína de peso considerable, es necesario establecer las estrategias planteadas en la página anterior. Dentro de estas estrategias se incluyen los protocolos de eliminación de puentes disulfuros y la hidrólisis enzimática que se plantean en la figura 7-9

Tratamiento Tripsina Proteasa Submaxillarus Quimotripsina Staphylococcus ureus V8 Asp-N-proteasa Pepsina Endoproteinasa Lys C Bromuro de Cianogeno

Punto de corte Lys, Arg ( C ) Arg ( C ) Phe, Trp, Tyr ( C ) Asp, Glu ( C ) Asp, Glu ( N ) Asp, Glu ( N ) Lys ( C ) Met ( C )

Figura 7-9 Puentes disulfuros e hidrólisis enzimática en protocolos de secuenciamiento

63 Finalmente, en la figura 7-10 se resume el procedimiento general para establecer la secuencia de los aminoácidos presentes en proteínas de alto peso molecular.

Figura 7-10 Protocolo en secuenciamiento de proteínas El paso final implica la identificación de la existencia de puentes disulfuros. Para esto se hacen los procedimientos anotados en la figura 7-10 con excepción de la reducción de los puentes. El resultado según el ejemplo se traduce en la desaparición de los fragmentos correspondientes a T-4 y T-3 y que se deberían obtener por la hidrólisis enzimática, dando paso a un nuevo fragmento de mayor peso molecular, que se identifica por electroforesis y que solo puede ser explicado por la presencia de un enlace covalente entre T-3 y T-4 que a su vez es producto de la presencia en ambos fragmentos de un residuo de cisteina.

64 TALLER 7
1. Realice un resumen de la clasificación de las proteínas por solubilidad, composición, estructura y función biológica. 2. En la siguiente tabla aparecen dos proteínas, para ellas se detallan loa aminoácidos que las conforman y cuantos hay de cada uno, utilice dos vías para determinar el peso de la proteína, primero realice el cálculo exacto utilizando los pesos correspondientes para cada aa y posteriormente utilice la aproximación del peso promedio de los aa, cuál es el porcentaje de error para cada una de las proteínas?

3. Utilizando los datos de la siguiente tabla obtenga

a. Determine la actividad específica después de cada procedimiento de purificación b. Qué procedimiento de purificación fue más efectivo 4. Busque la secuencia de la proteína mioglobina humana, y con dicha secuencia realice lo siguiente. a. Proponga un procedimiento de purificación de la misma a partir de las células musculares b. Suponga que uno de los procedimientos de purificación anteriores fuese más efectivo, cuál considera usted que sería y por qué? c. De acuerdo con la estructura de la proteína identifique qué aminoácido sería identificado con el reactivo de Sanger d. Si tiene puentes disulfuro, indique como los reduciría e. Proponga al menos dos proteasas que utilizaría para secuenciar la mioglobina f. ¿Cuál sería el patrón de fraccionamiento con cada una de las proteasas? Los puntos c, d, e y f no se hacen

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