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Estructura Tridimensional de las Proteínas.
Introducción El capítulo anterior se constituye en la introducción al concepto de estructura en las proteínas, mencionando brevemente los niveles de organización espacial. En el presente, se exploran las características e implicaciones que la ubicación tridimensional tiene sobre el concepto de proteína. En primera instancia, se revisa la relación entre la secuencia de aminoácidos y orden tridimensional de las proteínas. En segundo lugar se estudia la relación entre estructura tridimensional y función proteica mientras que en el tercer apartado se analiza como la estructura tridimensional activa en una proteína es única (o está cerca de serlo) y, finalmente se da cuenta de la explicación de como las fuerzas que son responsables de preservar la estructura tridimensional, son no covalentes. La estructura nativa La columna vertebral de las proteínas está formada por miles de enlaces. Estos enlaces tienen en puntos específicos, rotaciones libres que se traducen en un ilimitado número de organizaciones que se denominan CONFORMACIONES y que corresponden al arreglo espacial de los átomos en las proteínas. La CONFORMACIÓN químicamente se refiere a un estado estructural que puede interconvertirse en otro estado estructural sin romper enlaces covalentes en el proceso de transformación.1 Dentro de las miles de conformaciones posibles solo una (o muy pocas) predominan en las condiciones biológicas. Generalmente esta conformación es la más estable desde la perspectiva termodinámica (dado que posee la más baja energía de Gibbs) y su organización tridimensional (o plegamiento) es la que da cuenta de la forma funcional, a la que se denomina estructura NATIVA. Conceptualmente la estructura de las proteínas se considera a cuatro niveles (recordar figura 7-1), donde los tres niveles superiores se refieren a aspectos tridimensionales. La estructura secundaria se relaciona con los arreglos espaciales que ocurren entre residuos de aminoácidos adyacentes. La 3ria interpreta la estructura espacial de toda la cadena polipeptídica; y para proteínas con más de una cadena polipeptídica, aparece un cuarto nivel de organización que se denomina estructura cuaternaria y que hace relación a las interacciones entre subunidades. En general la conformación de las proteínas se estabiliza por un gran número de interacciones débiles, considerándose que la estabilidad es la “tendencia” de una proteína a preservar la conformación nativa. En estos estudios conformacionales se denomina DOMINIO a una región compacta de entre 40 y 400 aminoacidos que se distinguen como una unidad estructural a lo largo de una cadena polipeptídica. Para una cadena se pueden encontrar muchos dominios independientes y en conjunto dan origen a una estructura termodinámicamente estable. (ver figura 8-1)

1 Carey, F.A. and Sundberg R. (2000) Advanced Organic Chemistry. Fourth Edition ED. Kluwer Academic

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Figura 8-1 Dominios en una cadena polipeptídica Es importante tener en cuenta que la conformación NATIVA (conformación biológicamente activa en una macromolécula) es un estado marginal, dado que la diferencia de energía libre entre una proteína plegada o no plegada para una proteína típica (y en condiciones fisiológicas) es solo de entre 20-65 kj/mol. Teóricamente una cadena polipeptídica puede asumir incontables conformaciones y en condiciones desplegadas, las proteínas se caracterizan por poseer un alto grado de "entropía conformacional". Esta alta entropía además de otras interacciones entre sustrato-disolvente (proteína-agua) mantienen la condición desplegada. La formación de enlaces está acompañada de cambios favorables (negativos) en la energía libre. En general, la conformación de una proteína que tiene la menor energía libre (más estable) es aquella donde se da el máximo de interacciones débiles (puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas e iónicas) más los puentes disulfuro. Sin embargo la estabilidad proteica no es solo la sumatoria simple de interacciones débiles. En este punto es importante recordar que para romper un enlace simple se requiere entre 200-460 kJ/mol, mientras que el rompimiento de una interacción débil supone el empleo de entre 4-30 kJ/mol. En las proteínas, la importancia de las interacciones débiles está en su número y por esto, se sostiene que la conformación con más baja energía libre (normalmente la nativa) es la que posee el mayor número de interacciones. Tal y como se planteó anteriormente, la sumatoria de las energías libres de las interacciones débiles no explica la estabilidad de una proteína ya que al considerar los estados PLEGADO y NO PLEGADO se dan diferencias de energía libre cercanas a cero. Para poder entender porqué a pesar de que la diferencia entre estructura plegada y no plegada es tan baja, se tiene en cuenta que en condiciones fisiológicas la estructura nativa es dependiente de las interacciones con el agua. Cuando una molécula hidrofóbica interacciona con el agua, promueve la formación de una ‘concha’ o capa de solvatación, que implica un aumento en el orden y por consiguiente una disminución de la entropía; si se incrementa significativamente el número de moléculas hidrofóbicas en un seno acuoso el rumbo hacia la agrupación (micelas) minimiza el numero de interacciones (polar-no polar) lo que es coherente con la condición de espontaneidad. En una molécula proteica la evolución ha marcado un comportamiento en donde los grupos no polares establecen interacciones que conducen a la disminución en la capa de solvatación, que a su vez conduce a una disminución del orden y por tanto un aumento de la entropía. Esto establece un arreglo típico: Hidrofóbicos dentro e Hidrofílicos fuera.

3 En condiciones fisiológicas los puentes de hidrógeno y las interacciones iónicas rigen los efectos entrópicos en las proteínas. El agua “pura” posee un mayor número de puentes de hidrógeno que una solución cuando se estima sobre la siguiente premisa: # de puentes/unidad de masa. La organización promovida por la interacción con el agua (interior-exterior) incide en las interacciones polares, que ahora se dan al interior de la proteína, contribuyéndose en gran medida a una forma plegada (nativa). En resumen se tienen dos reglas generales: 1) Los residuos hidrofóbicos están fuertemente enterrados al interior de la proteína. 2) El número de puentes de hidrógeno al interior de la proteína se maximiza. Características de los enlaces peptídicos.

Los carbonos α adyacentes en un enlace peptídico están distanciados por 3 enlaces covalentes: La difracción de rayos X mostró que el enlace C-N es más corto en péptidos que en aminas, hecho que se ajusta adecuadamente con dos atributos orgánicos: Resonancia y planaridad. En la figura 8-2 se da cuenta clara de que los 6 átomos involucrados en el enlace peptídico están en el mismo plano y además el oxígeno y el hidrógeno se encuentran en posición trans. Por tanto, la columna vertebral de los péptidos es una estructura rígida. Pauling y Corey concluyeron que el enlace peptídico está imposibilitado para rotar

Cα C

N

Figura 8-3 gráfico de Ramachandran para las rotaciones de los enlaces  y 

Figura 8-2 El enlace peptídico

4 libremente por la existencia de la resonancia, siendo la rotación libre restringida a los enlaces: N-Cα y Cα-C. Esto puede resumirse en una sentencia simple: La rigidez del enlace peptídico limita la cantidad de conformaciones que puede asumir la cadena polipeptídica. En 1951 y a partir de todas estas evidencias experimentales, Pauling y Corey propusieron la existencia de una estructura secundaria en las proteínas, siendo la α hélice y la conformación β las dos más importantes. Estas predicciones fueron posteriormente ratificadas con la elucidación estructural de las proteínas. Al considerar la estructura secundaria, las proteínas se pueden clasificar en dos grandes grupos: Proteínas globulares y fibrosas. Las fibrosas están normalmente relacionadas con aspectos estructurales, mientras que las globulares casi siempre son de carácter funcional. En los péptidos cada enlace peptídico presenta resonancia, lo que impide la rotación y además, posibilita la generación de un pequeño dipolo soportado sobre los átomos de oxígeno y nitrógeno. Otra característica importante de este tipo de enlace es que los átomos de oxígeno e hidrógeno se encuentran en posición trans. Los enlaces denominados  y  presentan rotaciones que se pueden incluir en el intervalo -180° + 180°. La figura 8-3 muestra, mediante las gráficos tipo "Ramanchandran" las conformaciones para la mayor parte de los residuos aminoacídicos involucrados en los enlaces  y . Pauling y Corey igualmente mostraron que los puentes de hidrógeno eran una consecuencia de la orientación de los grupos polares -C=O y -N-H presentes en los enlaces peptídicos.

Figura 8-4 La α hélice en las proteínas

Con los estudios realizados sobre proteínas estructurales, se observaron eventos que se repetían cada 0.54 nm (que corresponde a 3.6 aminoacídos) y al resolver toda esta información, propusieron una estructura helicoidal que denominaron α hélice que se puede ver en las figuras 8-4 y 8-5 No todos los polipéptidos pueden formar una α hélice estable. Por ejemplo, la carga negativa del grupo carboxílico del Glu reduce la estabilidad de los

8-5 Vista superior de la hélice

5 puentes de hidrógenos e igualmente, la carga positiva también puede afectar la estabilidad. Otro hecho que también afecta la hélice es la interacción entre los aminoácidos Pro que se encuentran espaciados a 3 (o 4) residuos; finalmente los dipolos que aparecen como consecuencia de los enlaces peptídicos. En la figura 8-6 se ilustran los dipolos y la interacción entre aminoácidos espaciados. En sus trabajos sobre estructura de proteínas, Pauling y Corey, tal y como se planteó anteriormente, dedujeron un segundo tipo de organización estructural denominada conformación β. La conformación β es el tipo de organización tridimensional más común en las proteínas fibrosas tales como la queratina. La organización se clasifica a dos niveles según sean las partes involucradas y se denominan Intracadena e Intercadenas. En el caso de las interacciones entre cadenas (intercatenarias) los puentes de hidrógeno permiten el ensamblaje de

Figura 8-6 Perturbaciones de la α helica varias cadenas polipeptídicas.

En la figura 8-7 se presentan los modelos de conformaciones β antiparalelas (amino terminal y carboxilo terminal con orientaciones inversas en cadenas adyacentes) y paralelas.

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Figura 8-7 Conformaciones tipo . Antiparalela y paralela Los grupos R en los residuos de aminoácidos juegan un papel crítico en las conformaciones β dado que cuando son voluminosos disminuyen la estabilidad, siendo los aminoácidos Gly y Ala los que generan menor impedimento estérico y por tanto favorecen esta organización tridimensional. Existen otros tipos de estructuras secundarias que también son comunes en las proteínas tales como "β bend" o "β turn" que se asocian principalmente a cambios abruptos en la dirección de la organización secundaria de una cadena polipeptídica. En la figura 8-8 se presentan los valores de los enlaces  y  de los diferentes tipos de conformaciones secundarias de proteínas. Nótese que en lo que respecta a la α hélice se dan dos orientaciones (izquierda Figura 8.8 Valores de  y  para diferentes y derecha). estructuras secundarias de proteínas

7 La organización tridimensional que considera el arreglo de todos los átomos en una proteína se denomina ESTRUCTURA TERCIARIA. Se estima que la estructura terciaria es una consecuencia de las interacciones de la secuencia polipeptídica y de los efectos a "larga distancia". La formación de torsiones en la cadena polipeptídica durante el plegamiento así como la dirección y los ángulos correspondientes, están determinados por la presencia de diferentes aminoácidos tales como Pro, The, Ser y Gly. Por difracción de rayos X se ha establecido que, por ejemplo, en la mioglobina el eje central de la proteína es un conjunto de α hélices interrumpidas por abruptas curvaturas. A medida que se profundiza en el estudio de la estructura terciaria de proteínas, se ha establecido que existen muchos tipos de organizaciones y para los cuales la posición de los sustituyentes R puede conferir un ambiente hidrofóbico o hidrofílico. Se puede plantear que el extremo contrario a la alta organización observada en la estructura nativa lo constituye el proceso denominado DESNATURALIZACIÓN. Cuando se llega a este estado se obtiene una estructura tridimensional azarosa y que se caracteriza por haber perdido su actividad funcional. El incremento de la temperatura, el cambio en el pH óptimo, el uso de disolventes orgánicos o cambios abruptos en las concentraciones salinas, pueden ocasionar este fenómeno de desnaturalización. El proceso contrario a la desnaturalización se conoce con el nombre de renaturalización y a pesar de no ser un proceso generalizado, se ha observado en una gran cantidad de proteínas. Es precisamente el estudio en detalle de este último proceso lo que a permitido plantear que la estructura funcional en un polipétido está íntimamente relacionado con la secuencia de aminoácidos.

Figura 8-9 Proceso de renaturalización de la ribonucleasa

8 Un ejemplo clásico es el que sufre la ribonucleasa al ser expuesta a un agente reductor en una solución de urea concentrada, tal y como se ilustra en la figura 8-9

9 Un hecho de capital importancia para el entendimiento de los denominados sistemas complejos ha sido el estudio de "la ruta" de renaturalización de las proteínas y todo apunta a que el proceso es termodinámicamente muy bien definido. En la figura 8-10 se da cuenta de los pasos generales del proceso de renaturalización. En una primera fase se alcanza una organización secundaria localizada en diferentes puntos de la proteína. Para la segunda fase, el orden local alcanzado induce interacciones de "larga distancia" que aumentan la estabilidad hasta completar el proceso de plegamiento. La condición final alcanzada es tal que generalmente representa la conformación termodinámicamente más estable.

Figura 8-10 Posible ruta de plegamiento de una proteína Algunas proteínas poseen 2 o más cadenas polipeptídicas o subunidades. Al arreglo tridimensional que es consecuencia de la interacción de las subunidades se denomina ESTRUCTURA CUATERNARIA. Las interacciones que se observan entre las subunidades son las mismas que en gran medida estabilizan la estructura terciaria: Múltiples Interacciones no Covalentes. En la figura 8-11 se presenta la estructura cuaternaria de la proteína tetramérica deoxihemoglobina.

Figura 8-12 termodinámicos plegamiento de

Aspectos del proteínas

Figura 8-11 Estructura de la Deoxihemoglobina

10 El plegamiento o desnaturalización de una proteína se representa en la figura 8-12 en donde se reconoce el proceso general conformacional de una proteína: Proteína desplegada→proteína nativa→proteína desnaturalizada. El estado desplegado de la proteína se caracteriza por: • • • Alto grado de entropía conformacional Alta energía libre. Un bajo porcentaje de residuos en conformación nativa.

La estructura nativa representa el estado opuesto: • • • Baja entropía conformacional. Baja energía libre. La totalidad de los residuos en la conformación nativa.

En algunos casos la estructura tridimensional de una proteína no se adquiere bajo condiciones ambientales controladas y el proceso de plegamiento requiere de la contribución de un complejo proteico denominado chaperonas. Estas herramientas de organización han sido descritas en todos los tipos de organismos. En la figura 8-13 se presenta un modelo del plegamiento de proteínas mediado por chaperonas, que son proteínas que a costa de gasto energético, promueven la aparición de una estructura tridimensional específica.

Figura 8-13 Plegamiento por chaperonas

11 La figura 8-14 resume las organizaciones tridimensionales que dan origen a la clasificación estructural de las proteínas, mientras que en la figura 8-15 se presenta la clasificación de proteínas basada en la estructura tridimensional.

Figura 8-14 Plegamiento parcial en proteínas.

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13 TALLER 8
1. Para el péptido propuesto en el punto 5 del taller 6, señale los enlaces  y  para la tirosina 2. Clasifique los siguiente aminoácidos como constituyentes principales de hélices α u hojas β, además ubíquelos en los diagramas de Ramachandran

Glutamato, metionina, leucina, valina, isoleucina, fenilalanina
3. ¿Cuál es la diferencia entre coagulación y precipitación de proteínas?, establezca parámetros físicos y químicos que favorezcan cada una de ellas y explique el motivo 4. Explique los procesos de desnaturalización y adquisición de la estructura nativa, en términos termodinámicos 5. Realice un resumen de la clasificación estructural de las proteínas, ¿cuáles son los principales elemetnos tridimensionales utilizados para dicha clasificación? 6. Identifique las interacciones químicas responsables de cada uno de los niveles de organización estructural (estructuras 1ª, 2ª, 3ª y 4ª) de las proteínas y explique cómo cada uno de ellos influye en la estructura tridimensional y función de las mismas 7. Defina los siguientes términos: a. Estructura primaria b. Estructura secundaria c. Motivo d. Estructura terciaria e. Dominio f. Proteína filamentosa o fibrosa g. Proteína fibrosa h. Estructura cuaternaria i. Unión cooperativa

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