Manual Laboratorio de Bacteriología

Manual de Laboratorio de Bacteriologa
PROLOGO
En Mxico y en los pases denominados del 3er. Mundo, la mortalidad por enfermedades infecciosas alcanzan cifras alarmantes, comparables a las que presentaban los pases desarrollados a fines del siglo XIX y principios de este. Los agentes etiolgicos son bacterias, virus, parsitos y hongos, y aunque todos ellos muy importantes, son sin embargo las bacterias las causantes del mayor nmero de plagas que han diezmado a la humanidad, tanto en pandemias, epidemias como en enfermedades establecidas en forma endmica. La especificidad de los diagnsticos clnico y radiolgico es difcil y es el bacterilogo el que generalmente lo determina con precisin. Lo anterior habla de por s, de la necesidad de contar con el profesional especializado en manejar eficiente y eficazmente este diagnstico, es decir el Qumico Farmacutico Bilogo. La Facultad de Q.F.B. prepara a estos profesionales cuyo ttulo es Licenciado en Qumico Farmacutico Bilogo, los cuales cursan la materia denominada Bacteriologa. El curriculum de sta tiene un programa amplio sobre el tema, que considera prcticamente todas las bacterias de inters mdico. Identificar este extenso y variado nmero de microorganismos, resulta complicado y difcil sin contar con las tcnicas: metdicas, especficas y accesibles. Este conjunto de caractersticas deben estar al alcance de los estudiantes. El Manual se ha diseado, siguiendo el orden sistemtico del programa de la experiencia educativa del laboratorio de bacteriologa. Es de esperar que este material llenara la demanda de los jvenes en formacin y an, que ser de gran utilidad a los egresados, y a todos aquellos que se dedican al diagnstico bacterio1gico.
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

1. No se permitir la entrada al laboratorio al alumno que llegue 15 minutos despus de la hora de entrada. 2. No se permitir la entrada al laboratorio a ningn alumno si no trae puesta y abrochada debidamente la bata. 3. Todos los objetos personales debern ser guardados en sus gavetas de las mesas de trabajo. 4. El alumno deber estar provisto del material personal asignado o de lo contrario no podr permanecer en el laboratorio. 5. Queda ESTRICTAMENTE PROHIBIDO comer, beber, fumar y en general, llevarse cosas a la boca dentro del laboratorio. 6. Debe evitarse entablar conversaciones, as como comunicarse a voces con los vecinos de otras mesas. 7. Todo el material no contaminado tal como: algodn, papeles, cerillos, etc., deben ser depositados en los botes de basura destinados para este uso. No se debe tirar basura al suelo ni guardarla en los cajones, ni tirarla en los vertederos. 8. Debe limpiarse con solucin de fenol o benzal, la mesa de trabajo ANTES de empezar y al TERMINAR la prctica. 9. En caso de romper o derramar material contaminado debe verterse fenol o benzal sobre l y djelo cuando menos10 minutos antes de limpiar. AVISE AL PROFESOR. 10. El material que se rompa o extrave debe ser pagado en la siguiente prctica en el cubiculo de preparadores. 11. Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario, ste ser desechado. 12. No almacenar material en el refrigerador. 13. Al finalizar cada prctica, guardar el material empleado debidamente separado: material sucio para esterilizar, quitarle las etiquetas; material sucio para lavar, colocarlo en otro sitio; reactivos debidamente ordenados y cerrados. 14. Los bancos deben dejarse en su sitio. 15. Los informes de las prcticas debern ser revisados por el profesor y ayudarn a mejorar o a bajar la calificacin al final del curso. 16. Colocar los microscopios limpios (sobretodo la lente de inmersin en su lugar correspondiente). Informar al Profesor si observa alguna descompostura o desajuste.
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MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO PARA EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

INCUBADORA REFRIGERADOR BAOS MARIA ELECTRICO HORNO DE SECADO AUTOCLAVE MICROSCOPIO COMPUESTO MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA CONTADOR DE COLONIAS BALANZA ANALITICA BALANZA GRANATARIA PARRILLA DE CALENTAMIENTO AGUA GAS ASA DE PLATINO GUANTES DE ASBESTO MECHERO MATRACES E.M. 1000, 500, 250 TUBOS DE ENSAYO DE 13X100 CON TAPON DE ROSCA TUBOS DE ENSAYO DE 15X150 CON TAPON DE ROSCA PIPETAS DE 10, 5, 1 ml CAJAS PETRI DESECHABLES UNA Y DOS Y TRES DIVISIONES PORTA OBJETOS CUBREOBJETOS GRADILLA JERINGA DE 10 ml LIGADURA ALCOHOL DESINFECTANTE BENZAL
INDICE
INDICE................................................................................................................................4 INTRODUCCION................................................................................................................6 OBJETIVOS........................................................................................................................7
Objetivos Particulares...............................................................................................................7
Unidad I Aspectos administrativos y legislativos relacionados con el laboratorio clnico ..............................................................................................................................................8 Unidad II anatomia y fisiologa de las bacterias...............................................................9
Prctica No. 2 Tinciones de Gram, Ziehl-Neelsen. ...............................................................11 TINCIN DE ZHIEL NEELSEN...........................................................................................14
Prctica No. 3 Clasificacin y Preparacin de medios de cultivos..................................15 UNIDAD III. INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS SUPERIORES.....18
Prctica No. 4 CULTIVO DE EXUDADO FARNGEO.....................................................19 Prctica No. 5 Deteccin directa de antgenos microbianos...............................................21
Practica No. 6 CULTIVO DE EXUDADO OTICO.......................................................24 Unidad IV Infecciones del ojo..........................................................................................27

PRACTICA No. 7 CULTIVO DE EXUDADO CONJUNTIVAL...................................28 Prctica No. 8 Determinacin de Chlamydia trachomatis....................................................29
...........................................................................................................................................33 ............................................................................................................................................33 ............................................................................................................................................34 Unidad V Infecciones de las vias respiratorias inferiores...............................................35

Prctica No. 9 Cultivo de expectoracin.................................................................................36 PRACTICA No. 10 Mycoplasma pneumoniae......................................................................38
............................................................................................................................................42 ............................................................................................................................................43 Unidad V1. INFECCIONES DE LAS VAS URINARIAS............................................44

PRACTICA No. 11 UROCULTIVO.......................................................................................44
Unidad VII ENFERMEDADES DE TRANSMISIN SEXUAL...................................46

CULTIVO DE EXUDADO CERVICO-VAGINAL EXUDADO URETRAL.................48
Unidad VIII INFECCIONES DEL TRACTO GASTROINTESTINAL........................51

Prctica No. 14 Coprocultivo..................................................................................................51 Determinacin de Helicobacter pylori (Mtodo de ELISA)..................................................53
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Unidad IX INFECCIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL.........................56

Prctica No. 16 Cultivo de lquido cefalorraqudeo...............................................................56
Unidad X sistema hematopoyetico....................................................................................60

PRCTICA NO. 17 HEMOCULTIVO..................................................................................61 Prctica No. 18 Reacciones febriles........................................................................................64
Unidad XI Control de Calidad en el Laboratorio de bacteriologia
.............................65
Sistema de Evaluacin.......................................................................................................66 BIBLIOGRAFIA ...............................................................................................................67 APENDICE A: MEDIOS DE CULTIVOS.....................................................................70 NORMA Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos.....................................................................91
INTRODUCCION
El presente Manual constituye una gua para que el alumno conozca los elementos temticos en que se sustenta el curso de Laboratorio de Bacteriologa, aprecie la profundidad y los alcances del conocimiento que ira adquiriendo a lo largo del periodo escolar.
La Bacteriologa es una de las disciplinas que ms ha apoyado el rea diagnstico en los ltimos tiempos. La cantidad de informacin que se publica diariamente, se puede decir sin exagerar, se est incrementando en forma vertiginosa. Ahora no existe especialidad o actividad mdica en la que la participacin de bacteriologa no est presente; de ah la importancia de seguir incorporando el estudio del laboratorio de Bacteriologa como una materia formal en el plan de estudios de la carrera de Qumico Farmacutico Bilogo.
En este Manual se ha aadido una breve introduccin a cada tema, con el propsito de que el alumno tenga una visin general del panorama que ofrece cada uno de los temas, sin tener la pretensin, puesto que no es la idea, de ofrecer un texto de consulta.
Este Manual incluye un apndice el cual esta constituido por tcnicas representativas de algunos medios de cultivo.
OBJETIVOS
Objetivo general Que el alumno adquiera los conocimientos y desarrolle las habilidades necesarias para su incorporacin al trabajo en el rea de bacteriologa de un laboratorio clnico, asegurando la calidad de los resultados obtenidos mediante la operacin de un programa de control de calidad, adems de que desarrolle las actitudes que le permitan el trabajo responsable en equipo y la adecuada atencin al paciente.
Objetivos Particulares
Que el alumno: Seleccione, realice e interprete adecuadamente las pruebas bsicas del laboratorio de bacteriologa Aplique adecuadamente los programas de control de calidad en el laboratorio clnico Maneje la legislacin bsica relacionada con el laboratorio clnico Aplique los aspectos administrativos bsicos del laboratorio clnico Desarrolle aprendizaje autnomo, trabajo en equipo, trabajo de indagacin, as como actitudes profesionales de apertura, autocrtica, compromiso y responsabilidad social.
Unidad I Aspectos administrativos y legislativos relacionados con el laboratorio clnico

OBJETIVO: Que el alumno ponga en prctica las principales medidas de seguridad que se requieren en un laboratorio de bacteriologa as como el manejo adecuado de los residuos biolgicos infecciosos, de acuerdo a la normatividad vigente, desarrollando actitudes de compromiso con la preservacin de la salud y del medio ambiente. PRCTICA NO. 1 Medidas de seguridad y manejo de residuos biolgico-infecciosos 1. Hacer un anlisis de las medidas de seguridad en el laboratorio asi como de la normatividad vigente, NORMA Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos. la cual se encuentra en el apndice 3. 2. Revizar e investigar la normatividad NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos. 3. Hacer una presentacin.
Unidad II anatomia y fisiologa de las bacterias

OBJETIVO: Que el alumno adquiera habilidad en la realizacin de los principales mtodos de tincin y preparacin de medios de cultivo que se utilizan para identificar la morfologa y fisiologa de las bacterias. Las cubiertas que rodean la clula bacteriana se han identificado por medio de tcnicas de tincin en microscopa ptica y electrnica, y tcnicas de aislamiento y caracterizacin bioqumica de los componentes celulares. Las principales cubiertas son: cpsulas y limos, la pared celular de las bacterias Gram-positivas, la pared celular de las bacterias Gramnegativas, la membrana plasmtica, los mesosomas (invaginacin de la membrana plasmtica). Tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas poseen una pared celular de peptidoglicanos que les confieren su forma caracterstica y les provee de proteccin mecnica. La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tincin de Gram (1884). La propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta coloracin es un criterio de clasificacin importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Unos pocos organismos son Gram-variables. Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma cantidad de cristal violeta (CV) e iodo (I). El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la deshidratacin y la reduccin del tamao de los poros de la pared resultante del proceso de lavado con solvente. En contraste en las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no impide la extraccin por el solvente del complejo.
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Avala lo antedicho el hecho que, si despus de su tincin se tratan con lisozima bacterias Gram positivas, se ve que los protoplastos siguen teidos, pero pierden el colorante si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas es la que impide la extraccin del colorante. Corroborando esta suposicin se observa que cuando Bacillus subtilis emerge de su espora su pared celular esta "inmadura" y se comporta como Gram negativa. Cuando la pared celular adquiere su estructura final pasa a ser Gram positiva.
La pared bacteriana: Estructura Qumica

El esqueleto de la pared celular bacteriana est constituido por un heteropolmero, el peptidoglicano murena. El mismo, y las enzimas que intervienen en su sntesis, son una caracterstica general de todas las eubacterias. Las arqueobacterias no poseen murena.
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PRCTICA NO. 2 Tinciones de Gram, Ziehl-Neelsen.

TINCIN DE GRAM Gram, bacteriolgo dinamarqus, descubri en 1884, que algunos grmenes (Gram positivos) contienen ciertos elementos qumicos en gran cantidad, peptidoglicano, en su membrana dispuestos estructuralmente en forma muy diferente a la de otros (Gram negativos) y forman con los colorantes derivados de la rosanilina (violeta de genciana, cristal violeta) ms el yodo, un compuesto que resiste la accin de decolorantes (alcohol absoluto, alcohol acetona). En consecuencia aplicando ste mtodo de coloracin diferencial los grmenes que contienen esos elementos qumicos quedan coloreados violeta y se denominan Gram positivos, aquellos que los contienen en pequea cantidad se decoloran y para observarlos es necesario teirlos nuevamente, para este fin se utilizan colorantes como la fucsina y la safranina y se denominan Gram negativos.
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MATERIAL: Porta objetos Asa de platino Cultivo de Staphylococcus aureus y epidermides, E. Coli Equipo de tincin de Gram
TECNICA:
1. Se toma una asada de la colonia, o una pequea alicuota del cultivo liquido. 4. Colocar en una varilla de tincin; y agregar Cristal Violeta y dejar actuar por 1 a 2 minutos.
2. Se realiza una extensin en un portaobjetos limpio y desengrasado.
5. Enjuagar al chorro de agua.
3. Dejar secar el frotis. Y fijarlo por calor.
6. Agregar la solucin de YodoLugo. Y dejar actuar por 1 a 2 minutos.
7. Enjuagar al chorro de agua. Decolorar con alcohol-cetona durante 5 segundos.
9. Enjuagar al chorro de agua.
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8. Agregar safranina y dejar por 15 a 20 segundos.
10. Dejar secar al aire libre, o colocar el frotis en un papel absorbente.
11. Agregar una gota de aceite de inmersin.
12. Observar al microscopio en objetivo de 100x.
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TINCIN DE ZHIEL NEELSEN

La tincin de Ziehl-Neelsen demuestra la capacidad que tienen algunas bacterias teidas de resistir a la decoloracin por cidos y alcoholes. Esta propiedad de algunas micobacterias y actinomicetos se correlaciona con el alto contenido en lpidos de su envoltura celular, que confiere un ambiente muy hidrfobo. Adems, estos grupos poseen unos lpidos caractersticos llamados cidos miclicos que aumentan este carcter hidrfobo. MATERIAL: Porta objetos Asa de platino Muestra de Espectoracin Equipo de tincin de Ziehl-Neelsen La tincin Ziehl-Neelsen requiere tres colorantes: 1. Mezcla de fucsina-fenol: capaz de teir las clulas en caliente. El fenol facilita la penetracin de la fucsina en la envoltura celular. 2. Decolorante orgnico: mezcla de cido y alcohol. 3. Colorante de contraste: azul de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes, tras la unin de la fucsina, resisten el tratamiento orgnico y se vern teidas de rosa. El resto de las bacterias se decolorarn y se contrastarn con el azul de metileno. 1. Prepara un frotis con la muestra. 2. Cubrir completamente con carbolfucsina la preparacin. 3. Calentar la preparacin cuidadosamente en un mechero Bunsen (puede ser a bao mara, o bien en plancha electrica), sin que hierva la muestra durante 5 min. Tambin puede utilizarse una parrilla electrica, o calentar en vapores de bao mara. Nota: aadir ms carbolfucsina conforme sta se evapora; la preparacin no debe quedar seca en ningn momento. 4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 5. Decolorar con la solucin cido-alcohol hasta que la muestra adopte un color rosa claro (unos 30 seg.) 6. Lavar con agua para detener la decoloracin. 7. Teir con azul de metileno 1 min. 8. Lavar con agua el exceso de colorante. 9. Secar la preparacin. 10. Examinar al microscopio. Anotar las diferencias existentes entre los dos grupos bacterianos.
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PRCTICA NO. 3 Clasificacin y Preparacin de medios de cultivos

OBJETIVO:
Identificar los medios de cultivo empleados en los laboratorios de microbiologa y Clasificarlos de acuerdo a su contenido y funcin en medios de enriquecimiento, selectivos y diferenciales. GENERALIDADES: Actualmente casi todos los grmenes patgenos, con pocas excepciones, pueden cultivarse en medios artificiales fuera de su hbitat natural siempre y cuando estos proporcionen al microorganismo los requerimientos nutricionales. La calidad de los medios nutritivos puede aumentarse con otras sustancias promotoras del crecimiento como sangre, extractos, etc., empleadas en bacterias hetertrofas comnmente en laboratorio. Dependiendo especifcamele del microorganismo que se pretende aislar. Existen muchos medios de cultivo elaborados para propsitos especiales que facilitan la identificacin, aislamiento y cuantificacin de ciertos tipos de bacterias. Para conocer estas necesidades, el bacterilogo cuenta con numerosos medios de cultivo, a los cuales de acuerdo con su funcin o aplicacin, se les puede clasificar de la manera siguiente: MEDIOS ENRIQUECIDOS: La adicin de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos animales y plantas al caldo nutritivo o agar, les proporciona sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de los hetertrofos exigentes. Ejemplos de ste tipo de medios son: Caldo Todd Hewirt, caldo de tetrationato de sodio, agua peptonada, caldo selenito de sodio, etc. MEDIOS SELECTIVOS.- La adicin del agar nutritivo de ciertas sustancias qumicas especficas, no permitir el desarrollo de un grupo de bacterias sin inhibir al mismo tiempo el crecimiento de otros grupos. Por ejemplo, el cristal violeta en concentraciones
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especficas previene el crecimiento de bacterias Gram positivas sin afectar el desarrollo de bacterias Gram negativas. De manera similar, un medio en el cual la nica fuente de carbono sea la maltosa, permite seleccionar las bacterias que pueden asimilarlas. En principio, se puede seleccionar las bacterias que slo se desarrollan en presencia de compuestos orgnicos poco comunes, agregando dichos compuestos al medio de cultivo y omitiendo todos los dems compuestos del carbono. Algunos ejemplos son: Agar sangre, para aislar y diferenciar los organismos Gram positivos; agar Nickerson, selectivo para el cultivo de Cndida albicans; agar MacConkey, selectivo para salmonella, shigella y bacterias coniformes; agar VoguelJohnson, selectivo para identificar microorganismos como estafilococos manitolpositivos; etc. MEDIOS DIFERENCIALES.- La adicin de ciertos reactivos o sustancias qumicas a los medios de cultivo trae como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano o de cambios, despus de la siembra e incubacin del medio, lo cual permite al observador diferenciar distintos tipos de bacterias. por ejemplo. si se siembra una mezcla de bacteria en un medio agar-sangre, algunas de las bacterias pueden hemolizar (destruir) los glbulos rojos mientras que otras no lo hacen. Cuando crece una zona clara al rededor de la colonia bacteriana es !imitativo de que ocurre la hemlisis. As es posible distinguir entre bacterias hemoliticas y no hemoliticas que proliferan en el mismo medio. De hecho, el medio agar-sangre sirve simultneamente como medio de enriquecimiento y diferencial. Entre este tipo de medios tenemos: Agar hierro y triple azcar, para diferenciar Escherichia, klebsiella, enterobacter, salmonella y varios de acuerdo con la capacidad del organismo de atacar un hidrato de carbono con produccin o no de gases y SH2; agar citrato de simons, ayuda a la diferenciacin entre bacterias entericas Gram negativas de acuerdo con su capacidad de emplear citrato como nica fuente de carbono, como escherichia. klebsiella, serratia, citrobacter y otros; agar urea de christensen, para diferenciar microorganismos de acuerdo con su capacidad de hidrolizar la urea formando dos molculas de amonaco por accin de la ureasa, bacilos entricos.
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Tambin existen medios de cultivo que son ligeramente selectivos como EMB. XLD. Y otros ms que son medios de transporte, como por ejemplo el medio de transporte de Stuart. Los materiales en su forma natural, no presentan ningn problema para tomarlos como medio de cultivo, ya que simplemente se depositan dentro de envases previamente esterilizados. Los medios que se preparan del tipo agar o caldo nutritivo, se hacen mezclando productos deshidratados que contienen todos los ingredientes. En el comercio podemos encontrar prcticamente todos los medios de cultivo en su forma deshidratada. En la preparacin de medios de cultivo se deben seguir los siguientes pasos: -Cada ingrediente o el medio deshidratado completo, se debe disolver un volumen adecuado de agua destilada. - Se determinar el pH del medio y se ajustar de ser necesario. Lo anterior se realiza por medio de indicadores o potencimetros. - El medio se pondr en recipientes adecuados, como tubos, matraces, botellas, cuyas bocas se cierran con tapones de algodn, plsticos o cubiertas de metal. - Los medios generalmente se esterilizan en autoclave. Los medios de cultivo utilizados con ms frecuencia en el Laboratorio de Bacteriologa, inc1uyendo sus ingredientes y forma de preparacin se muestran en el Apndice. Preparar los medios que su maestro le indique.
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UNIDAD III. INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS SUPERIORES

Existen muchas infecciones de las vas respiratorias altas que requieren el cuidado clnico de un mdico o de otro profesional del cuidado para la salud. La faringitis y la amigdalitis son infecciones de la garganta que causan inflamacin. Si afecta principalmente a las amgdalas, se denomina amigdalitis. Si afecta principalmente a la garganta, se denomina faringitis. Existen muchas causas de las infecciones de la garganta. Algunas de ellas son las siguientes: Las bacterias; Estreptococos beta-hemolticos del grupo A (su sigla en ingls es GABHS), Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae del tipo B, Micoplasma. En la mayora de los casos, resulta difcil distinguir entre una infeccin vrica y una infeccin por estreptococos slo con el examen fsico. Sin embargo, es importante saber si la infeccin de garganta es debida al GABHS, ya que en este caso es necesario un tratamiento con antibiticos para evitar las complicaciones que puede producir dicha bacteria. Se pueden realizar los llamados "quick test" que detectan rpidamente los estreptococos. Si el resultado es positivo, se pueden empezar a tomar inmediatamente antibiticos contra el GABHS. Si es negativo, parte de la muestra de la garganta se utilizar para realizar un cultivo de faringe. El cultivo identificar, a los dos o tres das, si el GABHS est presente. Su mdico decidir el plan del tratamiento dependiendo de los resultados.
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PRCTICA NO. 4 CULTIVO DE EXUDADO FARNGEO OBJETIVO:

El alumno analizar la flora normal y patgena de las vas respiratorias altas a partir de una muestra de exudado farngeo.
FUNDAMENTO:
El anlisis del exudado farngeo se basa en la diferenciacin entre las bacterias patgenas y flora normal de las vas respiratorias del individuo, apoyndose en medios de cultivo selectivos y de enriquecimiento, as como en el anlisis microscpico de las colonias.
GENERALIDADES:
El estudio de exudado farngeo y nasofarngeo es importante para el diagnstico de ciertas infecciones, entre ellas estn lasa estreptoccicas, la difteria la tosferina y la candidiasis; as como para establecer el foco de infecciones de enfermedades como: fiebre escarlatina, fiebre reumtica y glomerulonefritis hemorrgica aguda y en la deteccin de portadores de Estreptococos -hemoliticos, Neisseria meningitidis o Corynebacterium diphteriae. Entre los patgenos se encuentran: Estreptococos -hemolticos del grupo A y ocasionalmente de los grupos B, C, y G; Corynebacterium diphtheriae, Streptococus pneumoniae. Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Haemophylus influenzae capsulado, Mycobacterium tuberculosis, y otras especies de Mycobacterium, Cndida aIbicans, Klebsiella pneumoniae, rara vez, Borrelia Vicentii, Fusobacterium Fusiforme, Mycoplasma pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Histoplasma capsulatum y Coccidioides inmitis. En sta prctica destaca la importancia que tiene el estudio de Streptococcus pyogenes en encuestas epidemiologicas para prevenir la fiebre reumtica y la glomerulonefritis, en cuyo caso se debe tipificar tanto el grupo como los tipos M y T ya sea por precipitacin en capilar, o inmunodifusin, o bien, por aglutinacin en placa o factor de opacidad.
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MATERIAL: Cajas Petri con Agar sangre. Cajas Petri con Voguel Jonhson. Cajas petri con Agar Chocolate. Cajas Petri con medio EMB Discos de Bacitracina. 1 Caldo Todd Hewitt. 1 Matraz con solucin salina estril. Hisopos estriles de alambre frgil o madera. Equipo para tincin de Gram. Puente de coloracin. Frasco con benzal. TECNICA: OBTENCION DE LA MUESTRA:
1.- Exudado faringeo.- por medio de un abatelengua exponer los rganos orofarngeos y con hisopo estril raspar ligeramente las amgdalas y faringe, escogiendo preferentemente las zonas inflamadas o membranosas, con movimientos semi circulares de derecha a izquierda. 2.- Exudado nasofarngeo.- Con un hisopo de alambre largo a travs de las fosas nasales, tocar la pared posterior de la nasofaringe haciendo girar el hisopo. La muestra se toma con dos hisopos: uno sirve para hacer el frotis, el otro debe introducirse en d caldo de Todd Hewitt para resiembra. PROCEDIMIENTO: 1.- Resembrar a partir del caldo de Todd Hewitt en cajas de agar sangre, agar Chocolate, agar EMB, agar Voguel Johnson. 2.- Teir el frotis con Gram. 3.- Incubar las cajas a 37C durante 24 hrs. 4.- Realizar pruebas bioqumicas para identificar las colonias. 5.- Despus de la incubacin, leer morfologa colonial y microscpica e identificar con pruebas bioqumicas o serologa. Si se asla un microorganismo patgeno, se debe hacer sensibilidad a los antibiticos. 6.- Si se interesa identificar Estreptococos -hemolticos del grupo A en forma rpida, se puede utilizar la inmunofluorescencia como sigue: a) Se descarga el hisopo con el exudado en 1 ml de caldo Todd Hewitt, incubar a 37C durante 2 horas. b) Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min. lavar una vez con solucin salina estril. Centrifugar nuevamente. Separar el sobrenadante mezclar perfectamente el paquete celular con la solucin salina residual durante 2 o 3 mino
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e) Se hace 1 o 2 frotes con cubre objetos nuevos, dejar secar a temperatura ambiente, fijar con alcohol etlico de 96C dejar evaporar. d) Cubrir el frotis con suero antiestreptococo grupo A fluorescente. e) Dejar reaccionar por 30 min, a temperatura ambiente en cmara hmeda. t) Lavar dos veces sin solucin salina en vasos Koplin en agitacin durante 10 min. g) Observar en un microscopio para fluorescencia y conservar los frotis en refrigeracin. Cadenas de cocos de color verde amarillento en la periferia celular y en el centro sin color indica una prueba positiva.. 7. - En menores de dos aos, investigue la presencia de Haemophilus influenzae. 8.- En caso de aislar otros microorganismos seguir instrucciones de acuerdo con la morfologa microscpica que presente. BIBLIOGRA.FIA Bailey, W.R. y E.G. Scott, 1974. DIAGNOSTIC MICROBIOLGY, 48. Edicin Mosby Co. E.U.A. p.p 54-64
PRCTICA NO. 5 Deteccin directa de antgenos microbianos.

(Antiestreptolisina O)
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ANTIESTREPTOLISINA. O. Test de aglutinacin en porta.

Guardar a 2-8C. Slo para uso en diagnstico
7.-Colocar el porta en el agitador rotatorio (80-100 RPM) Y

n vtro. observar la aparicin o ausencia de aglutinacin exactamente al cabo de 2 minutos. El exceso del tiempo de reaccin podra dar lugar a falsos resultados.
FUNDAMENTO
El mtodo se fundamenta en una reaccin de aglutinacin de una suspensin de partculas de ltex poliestireno sensibilizadas con estreptolisina O estabilizada. La aglutinacin es visible en una concentracion de ASO en suero igual o superior a 200 UI/mL
REACTIVOS
Mtodo semicuantitativo: Siguiendo la metdica cualitativa, se proceder con diluciones del suero muestra con solucin salina (NaCI 9 g/L)
Diluciones Suero muestra 1/2 1/4 1/8
...
1 00 /lL 100 /lL
-1 00 /lL
100 /lL
-100 /lL
Sol.salina
- ->100/lL Dosificar en porta 50 /lL 50 /lL 50 /lL
Concentracin si es la ltima dilucin que da aglutinacin: 200 x nQ dilucin 200x2 200x4 200x8
...
UVmL
400
800
1600
...
MUESTRA Utilizar suero. Los sueros, conservados a 2-8C, mantienen su actividad durante 2 das. No utilizar sueros hemolizados. No utilizar sueros altamente lipmicos pues podran dar una aglutinacin no especfica.
Bibliografa
Normausell, D. Immunochemistry 9, (1072). Assimeh, S.N., Johnson, P.M. J.lmmunnol. Methods 34,(1980). Badin, J. and Barillec, A. J.Lab. Clin. Med. 75,(1970). Adams, L.E., Hesa, E.J. Amer. Tec!Jpol. 48,(1978).
3.- Comprobar la funcionalidad del reactivo mediante los controles positivo y negativo (ver procedimiento a continuacin). 4.-Dosificar 50 l!L (1 gota) de suero muestra a analizar en un crculo del porta, SIN DILUIR. 5.-Aadir, aliado de la anterior, una gota de R1 ASO-ltex 5.-Mezclar las dos gotas mediante agitacin y extenderlas por todo el crculo.
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Reactlvo 1
Tapn blanco Reactlvo 2 Tapn rojo Reactivo 3 Tapn azul
Ltex ASO en suspensin. Contiene azida sdica 0.1 %. Control positivo *. Concentracin superior a 200 Ul/mL Suero humano. Contiene azida sdica 0.1 %. Control negativo *. Concentracin inferior a 200 Ul/mL
Suero humano. Contiene azida sdica 0.1 %.
* Los controles son sueros humanos. Aunque no se ha detectado la presencia de antgeno HBs, ni anticuerpos anti-HIV, deben ser manipulados con la misma precaucin que un suero muestra. PREPARACIONYESTABIUDAD El reactivo 1 es una suspensin de partculas de ltex, debe homogeneizarse, con una suave agitacin, antes de ser utilizado. Los goteado res dispensan una gota de volumen aproximado de 50 l!L que es el idneo para una buena sensibilidad. Los reactivos se deben conservar a 2-8C, no deben congelarse. En estas condiciones los componentes mantendrn su funcionalidad hasta la fecha de expiracin sealada en la etiqueta
INTERPRETACION.: -La presencia de aglutinacin indica un nivel de ASO igual o superior a 200 UI/mL en la muestra. -La ausencia de aglutinacin indica un nivel de ASO inferior a 200 UI/mL en la muestra.
V ALORESNORMALES Adultos
< 200 UI/mL
TECNICA Mtodo cualitativo 1.-Atemperar el re activo y los controles a temperatura ambiente.
Los valores superiores a 200 UI/mL se encuentran en pacientes con recientes enfermedades debidas a Streptococcus del grupo A, -hemolticos.
2.-Homogeneizar el reactivo 1 ASO-ltex, con agitacin suave.
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Practica No. 6 CULTIVO DE EXUDADO OTICO

OBJETIVO:
Realizar el estudio microbiolgico de la secrecin tica, incluyendo la identificacin de hongos posiblemente presentes.
GENERALIDADES
La otitis media frecuentemente es causada por Pseudornonas o especies de Proteus. Las otitis agudas o subagudas externas son causadas casi siempre por cocos patgenos. Los siguientes microorganismos se encuentran con mayor frecuencia en cultivo tico. Patgenos o Patgenos potenciales: Pseudomonas aeruginosa, Sthaphyloccus Aureus, especies de Proteus, estreptococos y -hemolticos,Streptococcus pneurnoniae, Haemophilus int1uenzae, Coliformes y otros bacilos entricos, Aspergillus fumigatus, Candidaa albicans y otros hongos, Bacteroides, fusobacterium y cocos anaerbicos. No patgenos u oportunistas: Estafilococos y micrococos coagulasa-negativos, Difteroides, Especies de Bacillus. Hongos saprfitos. Microorganismos patgenos que rara vez aparecen en esos cultivos: Corynebacterium diphtheriae, Especies de Actinomyces, Mycobacterium tuberculosis y otras microbacterias, Micoplasma pneumoniae. Los medios de cultivo selectivo empleados son: agar sangre, EMB. Vogel-Johnson. Czapeck-Dox (para hongos). El material sptico de odo, sobre todo una tcnica especial y condiciones de esterilidad. La otitis externa, suele ser consecuencia de P. aeruginosa; la natacin representa un riesgo significativo (odo del nadador). Esta infeccin localizada puede tratarse con antibiticos tpicos y agentes desecantes, existe una forma ms virulenta de la enfermedad (otitis externa maligna), que se asocia a invasin de los tejidos subyacentes potencialmente mortal. Por eso se requiere un tratamiento antimicrobiano agresivo con limpieza quirrgica.
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obtenido en
perforacin del tmpano. Se recomienda que sea tomado por el otorrinolaringlogo con
PARTE EXPERIMENTAL: Material:

Placa de agar sangre. Placa de Vogel Johnson. Placa de EMB. Placa de Czapeck-Dox. Hispos estriles. Benzal acuoso diluido 1: 1 000 Procedimiento: Antes de hacer la toma del producto debe limpiarse cuidadosamente el odo externo con solucin acuosa de cloruro de Benzal diluido, para eliminar hasta donde sea posible la flora bacteriana contaminante, sin embargo, es frecuente observar el desarrollo de bacterias no patgenas y hongos saprofitos debe eliminarse el exceso de antisptico antes de la toma propiamente dicha. Sembrar en agar sangre, agar Vogel-Johnson, EMB, e incubar a 37C durante 24 hrs. Sembrar en agar selectivo para hongos Czapeck-Dox e incubar a 25C (durante dos a tres semanas la identificacin de los microorganismos aislados se realizar segn las normas bioqumicas y seroirununolgicas de cada problema en particular. Valores normal: Flora no patgena constituida principalmente por Staphylococus coagulasa negativa, difteriodes Garrkya tetragena Bacillus. Esta valoracin debe hacerse se acuerdo a las condiciones clnicas del caso.
Diagrama de trabajo: Muestra Agar sangre Agar Vogel Johnson Identificacin EMB Czapeck-Dox
BIBLIOGRAFIA: P. Murray y Col. Microbiologia Mdica.. Ira. Edicin. Ed. Mosby Year Book (Times Mirror de Espaa). 1992 Bailey-Scott. Diagnstico Microbigico. 6ta. Edicin. Ed. Mdico Panamericana Argentina. 1983. Matthew. J. Lynch. _Mtodos de Laboratorio. 23. Edicin. Ed. Interamericana. Mxico, 1969. Maxtec, W.R, J.P.Widdowson y C.A.M. Fraser, 1974. ANTIBODY TO STREPTOCOCCAL SERUM OPACITY FACTOR IN STREPTOCOCCAL DISEASE AND THE COUMUNITY. ed.m.h. Haverkom. Exc. Med. New York. E.U.A. p.p 132-136 Moody, NLD. 1970 STREPTOCOCCAL INFECTIONS IN DIAGNOSTIC PROCEDURES .Ed. H.L. Bodily, 5 edicin amer. pub. Health 3$5. E.U.A. p.p 77 Sheehe, P.R. Y H.A. Feldman., 1971 STREPTOCOCCAL EPIDEMICS IN TWO POPlJLATIONS OF "NORMAL FAMILIES. J. Infect. Dis 124: 1-8
Unidad IV Infecciones del ojo

Las enfermedades infecciosas del ojo se clasifican segn sus agentes provocadores. En la mayora de casos se trata de bacterias, chlamidias o virus. En algunos casos slo una parte del ojo es afectado, pero la mayora de veces se presentan infecciones de la conjuntiva y de la crnea junta. A veces los grmenes pueden propagarse y causar infecciones en el interior de los ojos que son muy difciles de tratar. Bacterias Los grmenes ms frecuentes son neumococos, estafilococos y estreptococos. Estos causan la conjuntivitis que se presentan comnmente en ambos ojos y que se caracteriza por los sntomas de ojos amarillentos y purulentos. Si las bacterias atacan la crnea, stas pueden causar ulceraciones. Chlamidias La queratoconjuntivitis por Chlamidias (ataque de la crnea y conjuntiva) es causada por el germen Chlamydia trachomatis. Este agente patgeno es el responsable ms frecuente de ceguera en India, frica y los pases mediterrneos. El recorrido de la infeccin es directo desde la va urogenital al ojo o se adquiere en las piscinas insuficientemente desinfectadas (Conjuntivitis de piscina). En los adultos es caracterstico la aparicin de ampollas localizadas en el prpado superior. La prueba del contagio se realiza con un examen de inmunofluorescencia.
PRACTICA No. 7 CULTIVO DE EXUDADO CONJUNTIVAL OBJETIVO:

Identificar los microorganismos patgenos y de La flora normal en una maestra de muestra de exudado conjuntival de ambos ojos en una paciente.
FUNDAMENTO:
EI agar Brolacin debido a la amplia disponibilidad de sustancias nutritivas que ofrece, a su carencia de sustancias inhibidoras y la posibilidad de lograr una cierta diferenciacin de las colonias, se utiliza para cultivar el exudado conjuntival Como sustancia reaccionante, este medio contiene lactosa, la degradacin a cido de esta ltima origina un viaje de color hacia el amarillo, de azul de bromotimol. La alcalinizacin provoca un viraje a azul intenso. El agar Chapman es una agar selectivo para estafilococos, sobre l crecen solamente microorganismos que posean una elevada tolerancia a la sal comn; las colonias de Estafilococos son diferenciables utilizando como criterios la degradacin de manitol, la gelatinolisis y la formacin de pigmento.
MATERIAL:
Caja Petri con agar Brolacin. Caja Petri con agar Chapman. Equipo para tincin de Gram. Frotes de raspado de conjuntiva.
TECNICA:
Tomar la muestra de ambos ojos e inoculada en agar Brolacin y Chapman al mismo tiempo que se preparan 2 frotes para realizar las diferentes tinciones: Gram y Giemsa.
PRCTICA NO. 8 Determinacin de Chlamydia trachomatis FUNDAMENTO:

El examen est basado en la investigacin de Chlamydia trachomatis como agente patgeno en el raspado conjuntival por lo que se emplea inmunofluorescencia directa y tincin de Giemsa.
GENERALIDADES:
Durante mucho tiempo se consider que las clamidias eran virus, ya que son parsitos intracelulares obligados de las clulas eucariticas debido a su incapacidad de sintetizar el adenosn trifosfato (A TP), aunque s pueden sintetizar DNA, RNA Y protenas. El estudio de este microorganismo, nos ha permitido conocer que son bacterias ya que contiene DNA y RNA, son susceptibles a algunos antibiticos, entre otros a las tetraciclinas y a la eritromicina; tienen una pared trilaminar parecida a la que presenta las bacterias Gram negativas, poseer ribosomas 70 S, tiene diversas enzimas y se multiplican por fisin binaria. Las clamydias son bacterias INTRACELULARES OBLIGADAS que se diferencian de otras bacterias por su morfologa y por presentar un ciclo de desarrollo nico durante el cual se pueden observar dos formas, una adaptada a vivir extracelularmente llamada CUERPO ELEMENTAL que mide entre 200 y 400 nm de dimetro, es inefectivo, es antignico, resistente a la tripsina y til cuando es inoculado intravenosa mente en ratones y otra que se aplica intracelularmente dentro de vacuolas citoplsmicas de las clulas que estn infectando y es llamada CUERPO RETIClJLAR o CUERPO DE INFUSIN, que mide entre 600 y 1500 nm de dimetro. no es inefectivo, es lisado por la tripsina y no es letal para el ratn. El gnero chlamydia est constituido por tres especies: C. trachomatis, C. Psittaci y C. Pneumoniae que pueden diferenciarse en base a su susceptibilidad a las sulfonamidas a la morfologa de los cuerpos elementales y de los cuerpos reticulares, a la presencia de g1ucgeno en las inclusiones, al husped que infectan, a la homologa de su DNA y a la presencia de DNA plasmdico.
C. trachomatis es un patgeno exclusivo del hombre, se han descritos tres biovares con 15 serovares, que estn relacionados como enfermedades en el humano. El biovar linfogranuloma venereum es el agente de linfogranuloma venreo que es una enfermedad que se transmite por contacto sexual y se caracteriza por presentar una inflamacin granulomatosa de los cambios linfticos en las regiones inguinal y rectal.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL:
Equipo para tcnica de Inmunofluorescencia. Equipo para tincin de Gram. Frotes de raspado de conjuntiva.
TECNICA:
Tomar la muestra de ambos ojos e inoculada en agar Brolacin y Chapman al mismo tiempo que se preparan 2 frotes para realizar las diferentes tinciones: Gram y Giemsa.
Demostracin de C. trachomatis: Tincin de Inmunofluerescencia.

a. Fijar un frote con acetona durante 15 minutos. b. Marcar un crculo de aproximadamente 0-5 cm2 en la parte inferior del portaobjetos donde se encuentra la muestra. c. Colocar 30 microlitros del conjugado (gamaglobulina marcada con isotiocianato de fluoresceina, reactivo comercial). d. Dejar actuar el conjugado durante 15 minutos, manteniendo la preparacin en cmara hmeda. e. Lavar el portaobjetos con solucin amortiguadora a pH = 7.2. f. Dejar secar al aire, montar la preparacin. g. Observar en microscopio de fluorescencia INTERPRET'ACION: La formacin de cuerpos elementales fluorescentes indica que la muestra tiene C. trachomatis.
DEMOSTRACION DE Chlamydia trachomatis POR TINCION DE GIEMSA
a) Fijar un frotis con metanol durante 5 minutos. b) Dejar secar c) Cubrir la preparacin con giemsa 60 minutos. d) Decolorar con etanol al 95%. e) Dejar secar. f) Observar al microscopio. INTERPRETACION: La presencia de inclusiones intracelulares en las clulas epiteliales, preferentemente cerca del ncleo, hace sospechar C. trachomatis.
Unidad V Infecciones de las vias respiratorias inferiores

Cerca del 30% de las infecciones del paciente con EPOC son debidas a virus. Los virus respiratorios suelen tener una relacin muy clara con la estacin del ao. No siempre son ellos la causa directa de la infeccin. Qu quiere decir esto?. Los virus pueden daar la mucosa bronquial y favorecer as el asentamiento de bacterias causantes del cuadro infeccioso. El virus es, por una parte, difcil de diagnosticar, y, por otra, carece de tratamiento especfico. VIRUS: Virus respiratorio sincivial, Virus influenzae, Virus parainfluenzae, Coronavirus, Rhinovirus, Adenovirus. BACTERIAS: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Pseudomona aeruginosa, Enterobacterias, Staphilococcus aureus, Streptococcus spp., Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae El papel de las bacterias ha sido muy estudiado. Por desgracia, tampoco resulta sencillo su diagnstico. Esto se debe a que como ya hemos comentado anteriormente, en estos pacientes se produce con mucha frecuencia una colonizacin de la mucosa por bacterias. La obtencin de esputo para hacer un anlisis microbiolgico del mismo no es sencillo porque no siempre el paciente puede expectorar. Adems los resultados pueden ser confusos al obtener en ocasiones diferentes tipos de bacterias. El examen de la expectoracin se complica por el hecho de que contiene muchos grmenes potencialmente patgenos, como comensales en la garganta normal.
PRCTICA NO. 9 Cultivo de expectoracin

MATERIAL Cajas Petri Con: Agar Sangre, Agar Gelosa Chocolate, Agar Macconkey, Agar Sal Y Manitol, Agar De Biggy. Equipo de tincin de Gram Equipo de tincin de Gram TECNICA 1. Debe instruirse al cuerpo de enfermeras a que enseen a los enfermos a recoger esputo y no saliva. 2. Se describe el aspecto macroscpico del esputo: purulento, sanguinolento, con sangre digerida y su cantidad. 3. Se prepara un frotis que se examina al microscopio despus de teido por el mtodo de Gram. Pueden encontrarse Candida, Actinomyces o Blastomyces, o sospecharse angina de Vincent. 4. Suele prepararse el cultivo directamente en agar sangre, de preferencia sembrando varias asas de esputo en distintas zonas de la placa. Un disco impregnado de bacitracina y factor V permite inhibir muchos microorganismos, y facilita el desarrollo de Haemophilus sp. Tambin es til para distinguir entre varios microorganismos una placa con agar de MacConkey. 5. Si existe la solicitud correspondiente o si est indicado, se examina el esputo por la tcnica de Ziehl Neelsen y se preparan cultivos para bacilos de la tuberculosis u hongos. 6. En vista de la naturaleza mixta de la flora de casi todos los esputos, y de la posible duda en cuanto a poder patgeno, es prudente buscar un desarrollo predominante de cualquier germen particular y anotarlo en caso de que sea intenso. Se menciona a continuacin una lista de los microorganismos que se encuentran en el esputo. El estudiante debe recordar que algunas colonias de estos microorganismos representan comensales normales, pero que un desarrollo intenso o predominante es muchas veces significativo. Algunos microorganismos como Corynebacterium diphtheriae y M. tuberculosis siempre significan enfermedad, Streptococcus pneumoniae Staph. aureus N eisseria sp, Escherichia Corynebacterium diphtheriae Candida sp
Difteroides, Klebsiella, Haemophilus sp, Actinomyces Mycobacteria, B. anitratum Tratamiento del esputo con pancreatina Algunos esputos son muy viscosos, y es difcil obtener cultivos representativos. Para resolver este problema, se utiliza pancreatina amortiguada al 1 por 100. La enzima digiere el moco viscoso y la muestra es ms fcil de manejar. Se encuentra en el comercio t pancreatina amortiguada bajo forma de comprimidos que se disuelven en agua destilada para el uso. La enzima no acta sobre las bacterias en el tiempo que requiere la prueba; no afecta a los hongos en el esputo, aun despus de varios das. TECNICA (Tratamiento del esputo con pancreatina)
1. Se mezclan cinco volmenes de suero fisiolgico estril y un volumen de esputo y se agita. El suero fisiolgico sobrenadante, con la mayor parte de la saliva, se remueve con una pipeta de Pasteur. 2. A la muestra lavada se aade un volumen igual de pancreatina amortiguada al 1 por 100 recientemente preparado y se agita. 3. Se pone en bao tibio a 37C y se incuba, agitando de cuando en cuando hasta que la licuacin sea completa. Casi todos los esputos se licuan en menos de 90 minutos. La velocidad con que ascienden las burbujas en el lquido, despus de agitarlo, permite apreciar el grado de licuacin. 4. Cuando la licuacin es completa, se centrifuga, se desecha el lquido sobrenadante y se siembra el sedimento en el medio de eleccin.
PRACTICA No. 10 Mycoplasma pneumoniae.

Causas, incidencia y factores de riesgo La neumona es una enfermedad comn que afecta a 1 de cada 100 personas anualmente y es producida por muchos tipos diferentes de virus, bacterias y otros organismos infecciosos. Se estima que cada ao se presentan 2 millones de casos en los Estados Unidos. La mayora de los casos de neumona son leves y se tratan fcilmente, mientras que otros casos son ms serios y pueden ocasionar una enfermedad severa o incluso la muerte. El Mycoplasma pneumoniae es una causa comn de neumona leve y afecta, por lo general, a las personas menores de 40 aos. Varios estudios sugieren que esta enfermedad produce entre el 15 y el 50% de todas las neumonas en adultos e incluso un porcentaje ms alto en los nios de edad escolar. Las personas que se encuentran en mayor riesgo de adquirir neumona por micoplasma incluyen aquellos que viven o trabajan en reas concurridas como escuelas y hogares de personas abandonadas, aunque muchas personas que contraen la condicin no presentan un factor de riesgo que se pueda identificar. Los pneumoniae del mycoplasma son un miembro de la clase Mollicutes, significando la piel suave. Junto con los otros miembros de este mycoplasma de la clase (Acholeplasma, Anaeroplasma, Asteroleplasma, Spiroplasma, y Ureaplasma) son caracterizados por su genome inusualmente pequeo as como su carencia completa de una pared bacteriana de la clula. Los pneumoniae del M. primero fueron ligados a las infecciones respiratorias en 1898 en que los roux y Nocard aislaron los organismos de especmenes del pleuropneumonia de los bvidos. Los pneumoniae del M. se piensan actualmente para ser responsables de tracheobronchitis y la pulmona anormal primaria , sin embargo, mucha de la investigacin con respecto a esta bacteria est estando en conflicto. Aunque los pneumoniae del M. tienen uno de los genomes sabidos ms pequeos , todava hay mucho que se aprender sobre este insecto del misterio. Estructura: Los pneumoniae del mycoplasma carecen una pared de la clula que conduzca a la inestabilidad osmtica. Para crear una cierta ayuda estructural, los pneumoniae del M. utilizan los esteroles, como las clulas eukaryotic, en su membrana triple-acodada (fig. 17-83 del atlas, Ronald M. Principles de la microbiologa, 2da edicin. Editores De Wm.C.Brown, Dubuqe, IA. 1997. la pgina 1046). la bacteria puede poder
sobrevivir sin una pared porque vive en un ambiente osmticamente estable, el anfitrin (humano) animal de la clula, as como su red de la protena que se asemeje a un citoesqueleto ancestral. La combinacin de estas caractersticas nicas crea un diverso panorama para el tratamiento de una infeccin mycoplasmal que otras bacterias. La carencia de una pared de la clula previene la utilizacin de un antibitico del B-b-lactam, tal como penicilina y cycloserine, porque actan especficamente para interrumpir la pared de la clula. El uso del colesterol en pneumoniae del M. , sin embargo, permite una diversa avenida para las terapias antibiticas generalmente ineficaces en bacterias, tales como el uso de polyenes. La ausencia de una pared de la clula es probable facilitar una bacteria para recibir la interaccin con la cual los compuestos pueden ser intercambiados. Esta transferencia puede incluir no solamente los alimentos y los aminocidos suplementarios, el etc. que es necesario para la ayuda del crecimiento bacteriano, pero tambin compuestos metablicos txicos. Se piensa que este parasitismo superficial bacteriano causa dao severo a la clula huesped, sin embargo, no una toxina se haya identificado como el culpable.
La morfologa de las colonias del mycoplasma se compara a menudo a un "frei'r-huevo" porque forman una base central densa, que penetra hacia abajo en el agar, rodeado por un rea que se separa circular que sea ms ligera en color. Muchas de la especie patgena del mycoplasma expresan los organelles especializados de la extremidad usados para hacer el contacto directo con las clulas eukaryotic. Estos organelles son supremos en la virulencia asociada a pneumoniae del M. Transmisin e infeccin a travs del mundo: Los pneumoniae del mycoplasma se pueden comunicar a travs de contacto personal cercano va gotitas respiratorias. Algunos investigadores han notado un predominio de las infecciones que ocurran en la cada y el invierno. Mientras que esta teora no se reconoce extensamente
para ser verdad, hay mucha evidencia para sugerir que la pulmona causada por una infeccin de los pneumoniae del M. completa un ciclo con poblaciones cada 4 a 5 aos. El ciclo vital de los pneumoniae del M. puede seguir dos trayectorias. Se reproduce o con la fisin binaria o el alargamiento de la clula follwed por divisiones mltiples de la clula para formar las clulas del coccoid.
Atlas, Ronald M. Principles de la microbiologa, 2da edicin. Editores De Wm.C.Brown, Dubuqe, IA. 1997. pgina 1046 La investigacin reciente ha encontrado un receptor en la superficie de los pneumoniae del M. pensados para ser integral en el accesorio a la superficie de la clula huesped. Este receptor puede unir a un nmero de diversos tipos de la clula tales como epithelia de la zona respiratoria y clulas de sangre rojas. En las altas concentraciones, los pneumoniae del M. pueden inhibir la accin ciliary dentro de la zona respiratoria as como necrosis de la clula de la causa. Esta daos es causada por los cytotoxins de pneumoniae del M. as como indirectamente de la inmunorespuesta del anfitrin. Atlas, Ronald M. Principles de la microbiologa, 2da edicin. Editores De Wm.C.Brown, Dubuqe, IA. 1997. pgina 1046
Sntomas Los sntomas generalmente son leves y aparecen en un perodo de 1 a 3 semanas y, en algunas personas, pueden progresar a un estado ms severo.
Entre los sntomas comunes se incluyen los siguientes:

Dolor de cabeza Fiebre que puede ser alta Escalofro Sudoracin excesiva Tos o con frecuencia seca o generalmente sin flema ni sangre Dolor en el trax Irritacin de la garganta
Otros sntomas observados con menos frecuencia son:

Lesiones de la piel o erupcin cutnea Irritacin o dolor en los ojos Dolor muscular y rigidez articular Tumoracin en el cuello Frecuencia respiratoria rpida Dolor de odo
Signos y exmenes Un examen fsico puede mostrar agrandamiento de los ganglios linfticos e inflamacin del tmpano. El examen de trax con el estetoscopio (auscultacin) permite escuchar las crepitaciones. Estos exmenes ayudan a confirmar el diagnstico:

Exmenes de sangre para anticuerpos contra micoplasma Cultivo de esputo Radiografa de trax
Unidad V1. INFECCIONES DE LAS VAS URINARIAS

La orina secretada en el rin es estril salvo que dicho rgano este afectado. La orina sin contaminar de la vejiga es normalmente estril. Sin embargo, en la uretra se halla un flora normal, de modo que la orina expulsada en forma normal contiene una pequea cantidad de bacterias. Debido a que es necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los de importancia etiolgica, solo el examen cualitativo de la orina puede producir resultados significativos.
PRACTICA No. 11 UROCULTIVO OBJETIVO:

El alumno conocer la metodologa para el diagnostico vas urinarias.
Para un examen urinario apropiado es estril. A. Recoleccin apropiada del espcimen: Es el paso mas importante en un urocultivo se utiliza la orina de la maana. En varones por lo general se obtienen especimenes satisfactorios, aseando el meato con jabn y agua y recolectando en un envase estril la porcin media de la orina expulsada: en mujeres pueden conseguirse especmenes equivalentes despus de haber separado los labios y aseando la vulva. Debido a que muchas especies de microorganismos se multiplican con rapidez en la orina a la temperatura ambiente o a la temperatura corporal, los especimenes deben enviarse pronto al laboratorio o refrigerarse por un tiempo no mayor que una noche. B. Examen microscpico: Es un mtodo rpido para el diagnostico de las infecciones de vas urinarias. Se analiza una gota de orina fresca sin centrifugar para revelar leucocitos, clulas epiteliales y tambin bacterias, si hay mas de 105 por mililitro. El hallazgo de 105 microorganismos sobre mililitro en un espcimen de orina recolectada en forma apropiada es una fuerte prueba de infeccin activa de las vas urinarias (de la vejiga o de las porciones superiores del aparato urinario. Cuentas menores de 10,000 microorganismos por ml se toman como contaminantes. Un frotis teido con Gram sin centrifugar, que muestra bacilos Gram negativos es diagnstico de infeccin urinaria. La centrifugacin breve de la orina sedimenta con facilidad las clulas de pus, que pueden arrastrar consigo bacterias y por lo tanto ayudar al diagnstico microscpico de la infeccin. Puede haber clulas de pus sin bacterias y a la inversa, puede haber bacteriuria sin piuria. La presencia de numerosas clulas epiteliales escamosas, lacto bacilos
o flora mixta sugiere una recoleccin incorrecta de la orina. El examen bacteriolgico de la orina se hace principalmente cuando los signos y sntomas son sugestivos de infeccin de las vas urinarias, insuficiencia renal o hipertensin. Siempre deber hacerse en quien se sospeche una infeccin generalizada y en los que presenten fiebre de origen desconocido. Es conveniente en mujeres durante el primer trimestre del embarazo. El presente examen se basa en la cuantificacin de unidades formadoras de colonias desarrolladas en los diferentes medios inoculados: Brolacin, EMB y Agar Sangre de carnero.
PARTE EXPERIMENTAL:
MATERIAL: Pipetas de l y 10ml. Tubos de 16 x 150 con tapn de rosca. Placas de Agar Brolacin, Sal y Manitol, EMB y Agar sangre. Asa calibrada en 0.001 ml. Portaobjetos y cubreobjetos Equipo de Gram. Pipeta Pasteur. TECNICA 1. Agitar el frasco y colocar una gota entre porta y cubreobjetos. Observar al microscopio Utilizando el objetivo seco-fuerte. Contar el promedio de leucocitos por campo.
2. Colocar una gota sin extender, dejar secar fijar y teir con Gram, observar con inmersin. Contar las bacterias u los leucocitos por campo microscpico.
3. Agitar el frasco y colocar 0.1 mI. en 9.9 mI. de solucin salina estril. Homogeneizar y agregar0.1 mI de esta dilucin sobre la caja estril de Agar Brolacin, sembrar masivamente al inoculo. 4. Tomar una asada de orina con el asa calibrada y descargar en lnea recta en el centro de la placa de Agar sangre, Sal y Manitol y EMB y estriar masivamente. 5. Incubar las cajas a 37C por 24-72 hrs. 6. Contar el nmero de colonias que desarrollan en la placa. De acuerdo al volumen
que tome el asa calibrada y la (s) dilucin (es), determinar el numero de bacterias por ml de orina. 7. Si de acuerdo con el criterio de Kass y Sanford el nmero de bacterias es mayor de 100,000 UFC por ml se procede a identificar el microorganismo por los mtodos usuales y realizar antibiograma. 8. Informar el nmero de bacterias por ml, as como que microorganismo se identifico y su comportamiento frente a los antimicrobianos probados.
RESULTADOS
1. Realizar un diagrama de trabajo. 2. Hacer las observaciones correspondientes, del crecimiento de cada una de las cajas. 3. Dibujar los campos observados en el microscopio. 4. Identificar las colonias. 5. Hacer un reporte del resultado del paciente. 6. Sacar sus conclusiones 7. Bibliografa.
BIBLIOGRAFA:
IOVINE -SELVA El Laboratorio en la Clnica Tercera Edicin Editorial Mdica Panamericana. Pag. 992 y 993 Jawetz Ernest, ET., AL. Microbiologa Mdica 13 Edicin. 1990.
Editorial El Manual Moderno, S. A. de C.V. Pag. 568 y 569.
Unidad VII ENFERMEDADES DE TRANSMISIN SEXUAL

Comprenden varios tipos de enfermedades que normalmente se transmiten o contagian durante las relaciones sexuales con penetracin. Las principales vas de transmisin son las
mucosas de la boca, los rganos genitales y el ano durante la relacin coital. Estn causadas por virus, microbios, grmenes microscpicos, y bacterias. El aparato genital masculino y femenino contienen epitelio transicional, columnar y escamoso; tales caractersticas lo hacen adecuado para la colonizacin de bacterias, levaduras y protozoarios; algunos de estos pasan a formar parte de lo que se considera biotanormal. En la uretra se encuentra los estafilococos coagulosa negativos, las corinebactrias y bacterias anaerobias. La vulva y el pene, especialmente el rea que cubre el prepucio pueden tener micobacterium smegmatis adems de otras bacterias Gram positivas. La biota de los genitales femeninos varia con el pH y la concentracin de estrgenos que a su vez depende de la edad. En mujeres prepberes y posmenopusicas predominan los microorganismos que tienen su asiento en piel como los estafilococos y corinebacterias, mientras que, las mujeres con edad reproductiva pueden albergar grandes cantidades de enterobacterias estreptococos y estafilococos: as como bacterias anaerobias esporuladas y no esporuladas, lactobacilos y cocos. Muchas mujeres son portadoras de estreptococos betahemo1ticos del grupo B. el cual en determinadas circunstancias infecta el neonato durante el paso por el canal del parto, dando origen a una enfermedad sistemtica.
Prctica No. 12 y 13
CULTIVO DE EXUDADO CERVICO-VAGINAL EXUDADO URETRAL
Aislar e identificar los gneros y especies bacterianas responsables de procesos infecciosos en genitales, mediante la utilizacin de medios enriquecidos, selectivos diferenciales, as como el uso de pruebas bioqumicas, fisiolgicas y serolgicas cuando sean necesarios. El examen se basa en el cultivo del exudado vaginal y uretral con el fin de identificar la flora normal y patgena, pudiendo de esta manera detectar diferentes infecciones en el aparato genital de ambos pacientes. Con el fin de apoyar el diagnstico del mdico y siguiendo el cuadro clnico que presenta el paciente.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL:
Placas con medios de Thayer-Martn, Agar Casman, E.M.B., Sal y manitol S-110 Chapman y Nickerson o Biggy. Tubos de ensaye con medios de transporte de Stuart. Tubos de ensaye con medios de transporte de tioglicolato. Material para tincin de Gram.
TECNICA: EXUDADO CERVICO VAGINAL 1. Aunque es mejor la toma directa de la muestra por el alumno, por necesidad de los exudados se proporciona en tubos con 1-2 ml. de solucin salina estril y deben procesarse de inmediato. 2. Medir el pH de la muestra aunque se recomienda hacerlo "in sitio". 3. Poner una gota entre un portaobjeto y cubreobjeto y observar la preparacin en fresco. 4. Hacer un frotis, teir por Gram y observar al microscopio. 5. Sembrar en los medios e incubar a 37C durante 48 hrs. las placas de Thayer Martn y Casman incubarlas en tensin parcial de CO2. 6. Al terminar la incubacin de los medios observar la morfologa colonial y microscpica identificar la flora aislada de acuerdo a la metodologa de la prctica
del grupo microbiano que corresponda y determinar la sensibilidad a loa antibiticos, cuando sea necesario. TECNICA: EXUDADO URETRAL 1. La muestra se proporcionar en tubos de caldo tioglicolato. 2. Hacer frotis, teir por Gram y observar el microscopio. 3. Sembrar en medios e incubar a 37C durante 48 hrs. en los medios de cultivo de GC y Casman, incubar en atmsfera parcial de C02 (2-10%). 4. Al terminar la incubacin de los medios utilizado, observar la morfologa colonial: microscpica, identificar la flora aislada y sensibilidad a lo antibiticos. 5. Hacer las observaciones correspondientes, del crecimiento de cada una de las ajas. Dibujar los campos observados en el microscopio. 6. Identificar las colonias. 7. Hacer un reporte del resultado del paciente. 8. Sacar sus conclusiones 9. Bibliografa.
Diagrama de trabajo para el Cultivo de exudado Vaginal y Uretral.

Thayer-Martin (Selectivo N. gonorrheae) Casman (Para Gardnerella Vaginalis) EMB (Escherichia coli) Chapman (selectivo para S. Aureus) N ickerson (Selectivo Cndida albicans)
Observar colonias pequeas. Frotis con Gram Observar diplococos Gram negativos. Hacer prueba de oxidasa con disco. (positiva)
colonias muy pequeas Frotis con T. Gram: Cocobacilos Gram negativos.
Frotis con T. Gram (Bacilos Gram neg.) Enterobacterias
Frotis con Gram (Gram neg.) Prueba de coagulasa
Tincin de Gram.
(Levaduras Gram Positivas) Prueba de filamento En suero. 0.1 ml de suero + suficiente colonias, incubar 3 hrs. 37C, observar a en microscopio en objetivo seco, fuerte.
Unidad VIII INFECCIONES DEL TRACTO
GASTROINTESTINAL
Prctica No. 14 Coprocultivo
MATERIAL: Placas de EMB MacConkey, SS, agar sulfito de bismuto, bilis-lactosa, Agar Verde brillante, Agar TCBS, XLD Tubos con Caldo de tetrationato y caldo de selenita F Tubos con agua peptonada pH 9.0 para enriquecimiento de vibrio cholarea Juego de Pruebas Bioqumicas. Material habitual para laboratorio de bacteriologa. Equipo de Tincin de Gram Suero fisiolgico Yodo parasicolgico. Reactivo de oxidasa Reactivo de kovac Antisueros polivalentes Se realiza el examen macroscpico de las heces, anotando su color, consistencia, la presencia de sangre, o el exceso de moco. La disentera bacilar produce tpicamente una evacuacin formada casi nicamente de moco, pus y sangre con muy pocas materias fecales. Pueden encontrarse fragmentos de tenia o lombrices. Los cambios de color pueden hacer pensar en melena, ictericia obstructiva, etc. Debe examinarse al microscopio una emulsin poco espesa en suero fisiolgico, buscando sangre, pus, huevos o quistes. (Para los estudios parasitolgicos, vase la seccin correspondiente.) Primer da: a) Se siembra en un medio de MacConkey, XLD, Sulfito bismuto, TCBS. b) Se siembra un fragmento pequeo ( del tamao de un guijarro) en medio de Caldo De Tetrationato y selenito F. c) con un hisopo o asa de platino pasar a un tubo con agua peptonada pH 9, 6.8 hrs. A 37C, posteriormente resembrar en una caja de TCBS e incubar 24 horas a 37C
observar y bucar las siguientes Vibrio cholareae, V. parahemolyticus Segundo da: e) Despus de incubar toda la noche a 37C, se observa las colonias en crecimiento y se identifican , etc. Las colonias que no fermentan la lactosa se pasan del medio SS., se seleccionan las colonias negras caractersticas de Salmonella typhi a un conjunto de cinco tubos para pruebas bioqumicas. Estos contienen, respectivamente, medio SIM, citrato de simmons, agar con urea, y agar de Kliger; el quinto tubo, pequeo, contiene un disco de gelatina con carbn en 1 mI de agua peptonada. d) Se resiembra el caldo con selenita F en medio de cultivo de Verde brillante, XLD y sulfito bismuto. Tercer da: e) Ntese el tipo de reaccin en los cinco tubos. Muchos microorganismos se pueden identificar en esta etapa. Si las reacciones hacen pensar en Salmonella o Shigella, se lleva a cabo una prueba de aglutinacin en portaobjetos, empleando antisueros polivalentes. Las reacciones positivas se deben reportar por telfono, para aplicar medidas de aislamiento. Entre tanto, se resiembran los microorganismos en un conjunto de pruebas bioqumicas. f) Los microorganismos del paso d, que no fermentan la lactosa, se siembran en un conjunto de cinco tubos. Cuarto da: g) Se leen las reacciones de carbohidratos en los tubos preparados en e. Es posible ahora una identificacin completa. En el caso de Salmonella, las reacciones tpicas de azcares confirman las sospechas despertadas por las reacciones serolgicas del da anterior, y es posible llevar a cabo una identificacin antigni ca completa. Si las reacciones eon azcares no permiten establecer el diagnstico, se vuelven a incubar estos tubos y se siembra otro conjunto de tubos con lisina, arginina y omitina, buscando descarboxilasa. Debe inocularse tambin en tubo inclinado con fenilalanina; pueden ser tiles estudios auxiliares como las pruebas de oxidasa, del rojo de metilo y de VogesProskauer. h) Se leen los cinco tubos del paso f. De ser necesario, se siembra en un conjunto de tubos con azcares, como en e, y se contina como en g. PRCTICA NO. 15
Determinacin de Helicobacter pylori (Mtodo de ELISA)
Unidad IX INFECCIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

PRCTICA NO. 16 Cultivo de lquido cefalorraqudeo
En las meningitis purulentas el diagnstico microbiolgico se realiza, demostrando el agente etiolgico en la muestra del lquido cefalorraqudeo la que debe ser tomada por el personal mdico. El lquido cefalorraqudeo se recoge en dos tubos de preferencia con tapn de hule, uno de ellos contendr citrato de sodio 0.01 g. por cada 5 mI. de la muestra y de ste se har el estudio citoqumico, mientras que el otro sin anticoagulante se emplea para hacer pruebas bacteriolgicas.
El diagnstico especfico rpido, cuando se trata de H. influenzae o S.pneumoniae, se realiza con las reacciones de Quellung o por las pruebas de contrainmunoeletroforesis de inrnunofluorescencia directa o coaglutinacin. La observacin directa del frotis teido por Gram o Giemsa permite dar un diagnstico presuntivo.
MATERIAL:
Placas con agar chocolate, placas con agar EMB. Placas con agar sangre de carnero. Portaobjetos.
Equipo para tincin de Gram. Equipo para tincin de ZiehI-Nielsen.
TCNICA: 1. El lquido cefaloraquideo (LCR) debe ser manejado en condiciones de e sterilidad, enviando la porcin correspondiente al laboratorio clnico para el estudio citoqumico. 2. Centrifugar el LCR a 2500 rpm durante 15 minutos y descartar el sobrenadante.
1. Hacer tres frotis: uno teirlo por la tcnica de Gram, el segundo por Ziehl Neelsen y el ltimo por tincin negativa (para investigar la posible presencia de Criptococcus neoformans encapsulado, observarlos en objetivo de inmersin. El resultado se debe informar de inmediato. 2. Realizar las pruebas de coaglutinacin para H. intluenzae y S. pneumoniae (si se cuenta con el equipo). 3. Inocular en agar sangre, en agar chocolate enriquecido con los factores V y X para Haemophilus, en EMB; si hay sospecha clnica o los frotis indican la presencia de hongos, usar el medio Sabouraud y medio Lowestein-Jensen en caso de Mycobacterium tuberculosis. Incubar a 48 a 72 horas en atmsfera parcial de CO2. 4. Observar a las 24 horas ( y diariamente a partir de entonces) en busca de crecimiento; si lo hay, hacer tincin de Gram y subcultivar en los medios apropiados despus de interpretar el frotis. Es importante incluir en estas placas de sensibilidad a los antibiticos. 5. Conservar en incubacin los cultivos negativos de 72 a 96 horas antes de desecharlos. 6. Inocular en medio de tioglicolato. Los cultivos anaerbicos debern mantenerse por lo menos de 7 a 10 das. 7. La identificacin final de los microorganismos aislados se hace empleando las pruebas bioqumicas o serolgicas indicadas en cada caso. 8. El lquido cefalorraqudeo normal es estril.
La toma de muestra es llevada a cabo por mdico especialista o Q.F.B. especialista en la columna vertebral (Con anestesia de Xilocana local).
LCR es como agua de roca (transparente y cristalino). Cuando es anormal puede ser de aspecto: turbio, amarillento, algunas veces con eritrocitos.
Enviara al laboratorio Frasco estril de 10 mI.
Centrifugar a 2500 rpm- Durante 15 minutos. Del sedimento:
Preparar dos frotis, teir uno con Gram y otro con Ziehl Neelsen. Sembrar con asas en los medios. de GC, agar sangre y EMB.
Observar, anotar la morfologa de las colonias.
Hacer frotis de las colonias y teir con Gram. Anotar morfologa.
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Unidad X sistema hematopoyetico

GENERALIDADES La sangre es un tejido estril, por lo que la identificacin de microorganismos contenidos en ella puede indicar tanto una bacteriemia transitoria como una septicemia. Infecciones de la Sangre: Muestras: Sangre perifrica Diagnstico bacteriolgico: Los patrones clnicos de la bacteremia pueden ser pasajeros, intermitentes o crnicos. La bacteremia pasajera ocurre despus de manipulacin de tejidos infectados (abscesos, fornculos, y celulitis). Instrumentacin de superficies mucosas contaminadas POR: procedimientos dentales, cistoscopa, dilatacin uretral , cateterizacin, aborto, y sigmoidoscopa. Bacteremia tambin puede ocurrir en forma temprana en procesos infecciosos localizados y sistmicos , ha sido reportada en casos de meningitis, artritis piognica, osteomielitis e infecciones gonoccicas y meningoccicas. Bacteremia intermitente asociada con abscesos no drenados de localizacin intraabdominal, pelvicos, hepticos, prostticos, etc. Bacteremia crnica es un signo importante de endocarditis infecciosa y otros focos de infeccin intravascular. Este ocurre en las semanas de infeccin aguda de fiebre tifoidea y brucelosis. Bacteremia pasajera, Bacteremia intermitente, Septicemia.
Signos y Sntomas: Malestar, Fiebre, Taquicardia, Hipotensin, Shock sptico.
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PRCTICA NO. 17 HEMOCULTIVO

El hemocultivo complementa urocultivos y cultivos de LCR en la evaluacin de neonatos con sospecha de sepsis. Uno de los medios ms utilizados es el Medio Bifsico de Ruiz Castaeda. Las botellas deben observarse macroscpicamente a diario en busca de evidencia de desarrollo bacteriano por un total de 7 das. HEMOCULTIVO POSITIVO El desarrollo bacteriano se detecta por turbidez del medio de cultivo; colonias visibles en la capa sedimentada de sangre, o sobre sta, hemlisis de la sangre , produccin de gas. Cuando se obtiene un cultivo positivo se debe efectuar una tincin de Gram, que es particularmente til para distinguir Streptococcus de Staphylococcus, o detectar la presencia de Bacilos Gram Negativos. De los subcultivos se debe aislar e identificar la cepa con medios y pruebas diferenciales. Pruebas diferenciales de Genro y especie, como son la catalasa y la coagulasa, para cocos Gram Positivos; o Sistema Bioqumico, para identificacin de Enterobacterias, Prueba de Oxidasa, para diferenciar Bacilos Gram Negativos, etc. ANTIBIOGRAMA Subcultivos: una alcuota del caldo con desarrollo se siembra en un medio slido, con incubacin de 7 hrs ya hay crecimiento suficiente para ser utilizado como inculo para las pruebas de sensibilidad. Los organismos aislados de hemocultivos deben guardarse por algunas semanas en caso que se necesiten mayores estudios diagnsticos. PRINCIPALES PATGENOS CAUSANTES DE BACTEREMIA La bacteremia normalmente es causada por: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli.
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La Sepsis se presenta principalmente en pacientes hospitalizados, y comunmente se desarrolla a partir de un sitio de infeccin primaria; a)CULTIVOS NEGATIVOS. Si todos los cultivos, subcultivos y frotis teidos por Gram fueran Negativos, el cultivo de sangre puede informarse as: No hubo desarrollo, ni aerobio, ni anaerobio, despus de tres das de incubacin. Informe Final: No hubo desarrollo despus de 7 a 14 das de incubacin. b) CULTIVOS POSITIVOS. Los patgenos encontrados ms comnmente en cultivos de sangre incluyen los siguientes: Especies de Bacteroides, Especies de Brucilla, Bacilos Coniformes, Filarias, Francisella tularensis, Haemophillus influenzae, Especies de Leptospira, Listeria monocytogenes, Paludismo, Meningococo, Gonococo, Rickettsias, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Salmonella especies, Tripanosomas, Bacilos Gram negativos: E. coli, especies de Enterobacter, especies de Klebsiella, etc. MATERIAL Medio Bifsico de Ruiz Castaeda. JERINGA DE 10 ml GASA ESTERIL SOLUCION DE YODO ALCOHOL 70% PLACAS DE GELOSA SANGRE, EMB, AGAR CHOCOLATE, SAL Y MANITOL. MATERIAL HABITUAL PARA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA. TCNICA: 1. Interrogar al paciente si se encuentra bajo tratamiento con antibiticos. Consignar esta informacin. 2. Seleccionar la zona que ser puncionada para la extraccin de sangre (Vena palpable). 3. Desinfectar alrededor la zona seleccionada. 4. Lavar cuidadosamente la regin, con agua y jabn (remover el desinfectante).
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5. Aplicar con gasa o algodn, una solucin de yodo sobre el rea seleccionada en forma concntrica del centro hacia la periferia, y desechar el algodn o gasa utilizados. 6. Permitir la accin del yodo durante tres (3) a cinco (5) minutos. Remover completamente la solucin de yodo con gasa o algodn estriles impregnados en alcohol de 70. Realizar el procedimiento en forma concntrica descartando siempre la torunda o gasa una vez se llega a la periferia de la zona de puncin. Repetir este procedimiento cinco (5) veces. 7. No se debe tocar la piel con la mano una vez que el rea ha sido desinfectada. Antes de hacer la puncin venosa con aguja y jeringa de 10 mL striles, palpar la vena utilizando guantes desechables y estriles, para proceder con seguridad. 8. En caso de utilizar recipientes comerciales de hemocultivos, seguir cuidadosamente las instrucciones de utilizacin del equipo de venoclisis que usualmente se incluye. 9. Una vez concluida la toma, debe reemplazarse la aguja con la cual se hizo la puncin, por una aguja nueva estril desechable con la cual se inyectar la muestra de sangre obtenida en los recipientes. Colocar las cantidades necesarias de sangre en los recipientes de hemocultivo, previa limpieza y desinfeccin de la zona de puncin en la tapa de los mismos. 10. Mezclar suavemente los recipientes de hemocultivo. No agitarlos bruscamente y procurar que la sangre se impregne en todas las superficies de los medios de cultivo de los frascos. 11. Proceder con actividades propias del estudio (Rotulacin, incubacin 37C, revisin diaria de cultivos, resiembras, interpretacin de resultados, etc.).
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PRCTICA NO. 18 Reacciones febriles
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Unidad XI Control de Calidad en el Laboratorio de bacteriologia PRCTICA NO. 19 Control de calidad en el laboratorio mediante la identificacin de un organismo problema, a nivel de gnero y especie.
OBJETIVO:
Que el alumno aprenda a realizar control de calidad del laboratorio de bacteriologa, as como la identificacin de microorganismos, como parte importante de las etapa analtica del programa de control de calidad.
1. Para sta evaluacin se les proporcionar un microorganismo en las condiciones apropiadas para su transporte u otro material problema. 2. Se proporcionan los datos clnicos del paciente del cual fue aislado y se sealan los datos a informar para la evaluacin. 3. Se llevara a cabo un sistema de evaluacin de la calidad Se solicita la identificacin del organismo problema, a nivel de gnero y especie, si hay cambios estos se sealan oportunamente y junto con los resultados se sealan los criterios para la evaluacin.
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Sistema de Evaluacin
Para acreditar el laboratorio de Bacteriologa, los alumnos debern cubrir los siguientes requisitos: 1) Realizar el 100 % de las prcticas de acuerdo al programa, siendo evaluado el trabajo individual de cada prctica mediante observacin. 2) Participar en las discusiones grupales sobre las prcticas. 3) Entregar los reportes correspondientes a todas las prcticas, con la aclaracin de que si alguna prctica, por falta de reactivos, no llegara a realizarse deber ser reportada. Los reportes incluirn los siguientes puntos: * Nmero y Nombre de la Prctica * Resolucin de Gua de Estudio: Que se encuentra en cada prctica, pudiendo ser modificada por el alumno. * Resultado: En este punto se incluir solamente el resultado obtenido, sin comentarios ni observaciones, las cuales se considerarn en otro punto. Se refiere a observaciones durante el desarrollo de la prctica, tales como fuentes de error, precauciones, comentarios, aclaraciones a la tcnica, etc. No repetir la descripcin de los pasos de la tcnica. En ellas se describirn las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos. Despus de obtener el resultado se hara un formato de reporte para entregar al paciente. Incluir la bibliografa consultada, proporcionando sus datos completos.
* Observaciones:
* Conclusiones:
*REPORTE PARA PACIENTE
* Bibliografa:
Estos reportes debern ser entregados cada 15 das, de acuerdo a las prcticas realizadas. 4) Aprobar los exmenes tericos que se aplicarn, los cuales versarn sobre las discusiones grupales y las investigaciones bibliogrficas sobre las prcticas. Se aplicarn 3 exmenes. La calificacin final del laboratorio se obtendr de acuerdo a los siguientes porcentajes: Punto 1 . . . . . 30 % Punto 2 . . . . . 20 % Punto 3 . . . . . 20 % Punto 4 . . . . . 30 % La calificacin final de la experiencia educativa incluir el desempeo del alumno tanto en el curso terico como en el laboratorio de acuerdo a los siguientes porcentajes: Teora 60 % Laboratorio 40 % 65
Siendo requisito indispensable obtener calificacin aprobatoria en ambos.
BIBLIOGRAFIA
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12) Murray P., Microbiologa Medica Edit. Interamericana, Mxico 1995 13) Jawetz E. Microbiologa, Edit. Manual Moderno, Mexico 1998 Koneman, Atlas de Microbiologa, Edit. Interamericana, Mxico 1998 14) Manual Bergey
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APENDICE A: MEDIOS DE CULTIVOS
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Preparacin:
Agar Cled
(Cistina-Lactosa-Deficiente en electrolitros)
Suspender 36.0 g en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar lentamente agitando con frecuencia. Hervir durante un minuto y esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Vaciar en cajas de Petri. Una vez solidificado. invertir las placas para evitar el exceso de humedad. Usos: En el medio CLED (Cistina-Lactosadeficiente en electrolitos) crecen profusa mente la gran mayora de las bacterias que provocan infecciones urinarias pudindose diferenciar o identificar sus colonias respectivas. Tiene adems la ventaja de impedir la difusin del Proteus en la superficie del medio. lo que echara a perder la prueba. La presencia de bacterias contaminantes como difteroides, lactobacilos y otros microbios. nos indica con qu tanto cuidado fue tomada la muestra de orina en estudio. Los cultivos urinarios debern realizarse con la primera muestra matutina y previo aseo escrupuloso de las zonas genital es. Utilicese el volumen medio de la misma para que la primera porcin del chorro arrastre a los microorganismos estacionados normalmente en la uretra. Los microorganismos que provocan infecciones en las vas urinarias son por lo general abundantes y de una sola especie. El col ibacilo es el germen que se aisla con mayol frecuencia.
La siembra de la muestra puede hacerse por el mtodo de las diluciones o por estra sobre la superficie del agar con asa calibrada. Efectuar los recuentos de colonias despus de 18 horas de incubacin a 35C. Reportar el nmero de ellas como colonias o bacterias por mi de orina. Recordar que un nmero de 100,000 (10)5 o ms ya tiene un gran significado clnico para considerarse como un? infeccin en vas urinarias.
Bibliografa: Bebis T.D.J. Med. Lab. Technol. 26:38-41, 1968. Mackey, J.P. y Sandys, G.H" 1965 8.M.H. 1 1173. Mackey, J.P. y Sandys. GH.. 1966 8.M.J. 1 1173. Guttman, D y Nayler G.R.E. 1967 8.M.J. 2 343-345.
Cal. 232.1
450 g
Para cultivar grmenes Gram positivos y Gram negativos en infecciones urinarias. Para el desarrollo y el recuento en bacteriologa urinaria de grmenes Gram positivos y Gram negativos. Impide el swarming ael Proteus.
Agar de Czapek Dox

Cal. 251-1 450 g
Para cultivar hongos y promover la formacin de Clamidosporas. Ampliamente usado en Microbiologa de suelos para cultivar hongos y bacterias del mismo, as como en la formacin de Clamidosparas por Candida albicans.
Frmula aproximada en gramos por lilro: Sacarosa Nitrato de Sodio Fosfato Dipotsico Sulfato de Magnesio Cloruro de Potasio Sulfato Ferroso Agar 30.0 3.0 1.0 0.50 0.50 0.01 15.00
Frmula aproximada en gramos por litro: Peptona de Casena Extracto de Carne Peplona de Gelatina Lactosa L-Cistina Azul de Bromotimol Agar pH tinal 7.3 I.. 0.2 4.0 3.0 4.0 10.0 0.128 0.02 15.0
MICROORGANISMOS Escherichia coli
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS Grandes, amarillas elevadas, opacas, con el centro ligeramente ms obscuro. Agar amarillo
pH final 7.3 I.. 0.2
Enterobacter
Semejantes a E. coli pero mucosas y de mayor tamao. Agar amarillo. Grandes amarillas o blanco amarillentas. Sumamente mucosas y elevadas. Pueden presentar una ligera tonalidad azulada. Agar amarillo. Azules, translcidas con bordes irregulares. Poco elevadas. Verde azuladas plidas. Con superficie mate tpica y contornos irregulares. Olor "dulzn". Agar azul verdoso. Desde azules hasta azul intenso. Muy pequeas, de 0.4 mm. amarillas, opacas. Agar amarillo. Pequeas de color amarillo intenso, opacas. Agar amarillo. Muy pequeas, grises.
:>reparacin: Suspender 50 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir hasta disolucin completa del material (aproximadamente un minuto). Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Mezcle muy bien antes de vaciarlo en tubos o en cajas de Petri, (12 mi por caja). Deje que los tubos solidifiquen en posicin inclinada. Si se requiere bajar el pH a 3.5, agregue 10 mi de cido lctico al 10% por litro de medio despus de la esterilizacin. El Agar de Czapek Dox es un medio semisinttico que contiene nitrato de sodio como la nica fuente de nitrgeno y es uno de los medios slidos ms tiles (Jara el cultivo de hongos en general, especialmente saprfitos y fitopatgenos. Tcnica general para el cultivo de hongos:
Klebsiellas
Proteus
Pseudomonas Salmonella, Shigella. Serratia, Providencia. Streptococcus fecalis.
Estafilococos Corinebacterias
Evitar la humedad excesiva del medio. Para ello vaciar el agar fundido enfriado entre 45 50C, un volumen de ms o menos 12 mi por caja de Petri desechable de 9 cm de
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vente (agua peptonada, solucin amortiguadora de fosfatos), durante 10 minutos entre 70 y 80C. Una vez fra la suspensin, inocular 2 placas de Agar Anaerbico e incubar una de ellas en anaerobiosis y atmsfera de CO2 a 35C durante 18 a 48 horas y la otra tambin en anaerobiosis pero sin CO2. Se obtienen mejores resultados utilizando "jarras anaerbicas" ms CO2 que con la sola anaerobiosis sin di xido de Carbono. Las placas de Agar Anaerbico tambin pueden incubarse en atmsfera normal cubriendo la superficie del medio de cultivo con las tapas de Brewer. En este caso, dejar sin sembrar la franja circular externa del medio, como de 1.5 cm de ancho. Sobre esta franja estril se aplicar con ms o menos firmeza, el reborde interno de la tapa Brewer para obtener un sello hermtico. La parte central de la tapa no deber tocar ningn punto del medio de cultivo a fin de dejar una pequea cmara de aire como de 5 a 2 mm de altura. Cuando se observe crecimiento, abrir las placas para seleccionar las colonias, pudiendo incubarlas despus ms tiempo, si es preciso. halos de inhibicin son bastante grandes y pueden entrecruzarse.
3.
Agar Anaerbico
Cal. 270.1 450 9
Recubrir cuidadosamente el inculo y los discos con otra capa (capa superior) del mismo medio de cultivo (Agar Anaerbico, Bioxon 270-1).
4.
Para cultivar anaerobios y efectuar pruebas de sensibilidad a los mismos. Medio de cultivo desarrollado por Brewer para cultivar microorganismos anaerbicos, como Clostridium, sin necesidad de recurrir a recipientes (jarras) para anaerobiosis. Tambin se usa para pruebas de sensibilidad de los mismos.
Frmula aproximada en gramos por litro: Peptona de Casena Peptona de Soya Cloruro de Sodio L.Cislina Dextrosa Agar Tioglicolato de Sodio Formaldehdo Sulloxilato de Sodio Azul de Metileno pH tinal 7.2 iO.2
Una vez solidificado el medio, colocar la tapa anaerbica de Brewer (sobre la capa superior) e incubar aerbicamente, o bien, en anaerobiosis si se emplea la tapa normal de la caja Petri.
Bibliografia: Brewer. SClence. 95:587. 1942.
Agar Biggy
Para aislamiento e identificacin de Candida.
Cato 205-1
450 9
17.5 2.5 2.5 0.4 10.0 15.0 2.0 1.0 0.002
El Agar de Glicina, Glucosa, Levadura y Sulfito de Bismuto es til para el aislamiento y la identificacion presuntiva de Candida por medio de la reaccin de sulfuro.
Frmula aproximada en gramos por litro:
Preparacin: Suspender 51 g de polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien y calentar agitando continuamente. Hervir por un minuto o hasta que el medio se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Vaciar en -cajas de Petri a las 3/4 partes de su capacidad, para obtener as capas ms gruesas que las usuales. Una vez que el medio haya sOldificado, depositar sobre l, la tapa de Brewer especial para anaerobiosis. La tapa de Brewer permite el desarrollo en la superficie de grmenes anaerobios estrictos y microaeroflicos, en atmsfera normal.
A los medios de cultivo para anaerobios, si no han sido preparados poco antes de su uso, es muy conveniente calentarlos y fundirlos para expulsarles el oxgeno disuelto. Si por alguna circunstancia no es posible hacer la siembra del material en estudio en el Agar Anaerbico, sembrar la muestra en Medio de Tioglicolato sin Indicador (Bioxon 2451), previamente calentado y enfriado. Incubar hasta el da siguiente y resembrar en el Agar Anaerbico. El Medio de Tioglicolato sin indicador es un excelente caldo de en riquecimiento y con frecuencia da mejor re sultado que la siembra directa en placas. Si la muestra en estudio contiene una mezcla de grmenes diferentes para aislar anaerobios, colocar un disco de papel filtro impregnado con 30 mcg de kanamicina en el rea de inoculacin masiva de una placa de Agar Anaerbico adicionada con un 5 % de sangre desfibrinada estril de borrego o de conejo, y un disco de 10 unidades de bacitracina en otra placa de Agar Sangre. Dichos antibiticos inhibirn a los grmenes aerobios en la zona inmediata a su alrededor pero no a los microorganismos anaerobios. Para llevar a cabo pruebas de sensibilidad (con grmenes anaerbicos), proceder de la siguiente manera: 1. 2.
Inocular el cultivo puro sobre la superficie del agar (capa inferior).
Citrato de Amonio y Bismuto Sullito de Sodio Dextrosa Glicina Extracto de Levadura Agar
5.0 3.0 10.0 10.0 1.0 16.0
pH final 6.8 i 0.2 Preparacin:
Usos:
Los tres agentes reductores provocan un descenso marcado y bastante estable del potencial del xido-reduccin, asegurando as buenas condiciones de anaerobiosis. El azul de metileno funciona como indicador Redox. La siembra de la muestra (clnica o alimento) puede practicarse por estra superficial o por vaciado, es decir, inoculando y mezclando el producto eQ estudio con el medio fundido y enfriado entre 45 y 50C. Casi nunca deber calentarse la muestra para destruir las formas vegetativas porque seran destruidos los anaerobios no esporgenos. Sin embargo, a veces es conveniente hacerlo cuando se trata de microorganismos formadores de esporas como Clostridium, menos con Clostridium perfringes que muy pocas veces las forma. Cuando est indicado el calentamiento, calentar la muestra suspendida en lquido dilu
Suspender 45 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante no ms de un minuto. Dejar enfriar a 45 - 50C. Agitar circularmente y vaciar en placas de Petri estriles, utilizando aproximadamente 20 mi para cada placa. No esterilizar en autoclave. Usos:
El Agar Biggy es til para aislar C. albicans y C. tropicalis y para la diferenciacin de especies en la forma siguiente segn Nickerson:
C. albicans
Colonias lisas, hemisfricas o circulares, ca
Depositar de 4 a 5 discos de papel impregnado con los antibiticos en estudio. No probar ms discos porque los
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El medio es sensible a la luz lo que le provoca una disminucin en la efectividad y en el color del mismo, pasando del azul fuerte al prpura o al rosado. Se recomienda que el medio se prepare inmediatamente antes de usarlo, y en caso necesario, almacenarlo en la obscuridad y durante el menor tiempo posible.
Bibliografa: Methods lor the Examination ot Water and Waste Waters. 10th Ed. APHA. tne. New York, 1960. Reeomended Methods lor the Mieroblologleal Examinations 01 Foods. APHA, Ine. New York, 1958.
Agar de Bilis Verde Brillante
con Fucsina bsica al 1: 25,000 y tionina 1: 30,000. Incubar ambos medios a 35C durante 5 das: Brucella abortus crece en Biotriptasa con fucsina pero no con tionina y requiere CO2, B. suis no desarrolla frente a fucsina pero s en tionina y tampoco requiere CO2
Cal. 124.1
450 9
Bibliografa: Weed A.J. Clin, Path. 27:482, 1957. APHA' Diagnostie Proeedures and Reagents 3a. Edilion, 1951.
Para determinar el grado de contaminacin causada por grmenes del grupo coliforme en aguas de uso comn, potables y de drenaje.
Agar Brucella Agar Biotriptasa

Aislamiento de Brucella.
Cal. 271-1 450 9
Frmula aproximada:
Peplona de Gelafna
Laetosa Agar Especial Sulfito de Sodio Fuseina Bsica Erioglaueina Cloruro Frrieo Fosla!o Monopotsieo Bilis de Buey Verde Brillante
8.250 9 1.900 9 10.150 9 0.205 9 77.6 mg 64.9 mg 29.5 mg 15.3 mg 2.95 mg 29.5 meg
Cal. 140-1
450 9
Para cultivar Brucellas de diversos productos clnicos, alimentos y otros materiales de inters sanitario.
Es un medio muy empleado en bacteriologa sanitaria, y en el cual desarrollan adecuadamente los gneros Brucella y Listeria.
El medio se prepara de acuerdo a la frmula del APHA.

Frmula aproximada en gramos por litro: Peplona especial No 2..................................................20 Dextrosa 1 Cloruro de Sodio 5 Agar 15 pH fnal 7.2 i 0.2
Es un medio de cultivo rico en nutrientes y factores accesorios de crecimiento, muy adecuado para aislar y desarrollar microorganismos exigentes. Se usa extensamente para aislar bacterias del gnero Brucella a partir de materiales contaminados con otros tipos de grmenes, y para la produccin de toxinas clostridianas.
Frmula aproximada en gramos por lilro: Peptona de Carne Peptona de Caseina Dextrosa Extracto de Levadura Cloruro de Sodio Bisulfito de Sodio Agar 10.0 10.0 1.0 2.0 5.0 0.1 15.0
pH linal 6.9 i 0.2
Preparacin:
Suspender 20.6 g del polvo deshidratado en un litro de agua destilada de buena calidad. Dejar en reposo de 5 a 10 minutos para que el agar se hidrate correctamente. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin durante 15 minutos. Dejar enfriar entre 45 a 50C y distribuir en cajas de Petri o en otros recipientes apropiados.
Preparacin:
Suspender 41 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar bien. Remojar de 10 a 15 minutos. Si el medio se va a emplear para aislar Brucella de la leche o de otros especmenes se aaden 1.4 mi de solucin acuosa de cristal violeta al 0.1 % Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos. Usos:
Se usa para el aislamiento y desarrollo de Brucella y en algunos procedimientos estndar de la APHA para el exmen de productos lcteos. Cuando se sospecha la presencia de Brucella en algun material de flora mixta se puede aadir al medio cristal violeta al 0.1 %. Las colonias aisladas de este medio deben transferirse al medio de CTA o Agar de Soya Tripticasena donde es posible conservarlas adecuadamente.
pH linal 7.0 i 0.2
Preparacin: Suspender 43 g del polvo en un litro de agua destilada de buena calidad. Mezclar bien y calentar agitando continuamente y hervir ms o menos un minuto hasta que se disuelva el material. Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin (121 ~C) durante 15 minutos. Vaciar en cajas de Petri. Una vez soldificado el medio invertir las placas para evitar que se les deposite un exceso de humedad.
Usos: Puede emplearse para apreciar el grado de ontaminacin de muestras de aguas, de diversos alimentos as como de otros materiales. Para el recuento de bacterias coliformes debern emplearse diluciones de la muestra, que den cuando menos un nmero de 10 a 50 colonias por placa, utilizando la tcnica del vaciado. Es decir, practicar siembras de varias diluciones del material en estudio en el medio fundido, mezclar y vaciar en sus placas respectivas. Una vez sembradas stas, incubarlas entre 35 a 37 C de 17 a 19 horas.
Las colonias de coliformes presentan una zona central roja intensa rodeadas de un borde de color rosa, destacndose ntidamente del fondo azul obscuro del medio de cultivo.
Usos:
Se emplea con buen xito para aislar BrucelIas de diversos especmenes contaminados con una microflora, saprfita o comensal, tanto de muestras clnicas como de alimentos, as como medio bsico en bacteriologa anaerbica, animal o humana.
Para diferenciar las 3 principales especies de Brucellas, se debern preparar por separado y a partir del Agar Biotriptasa, placas
Las muestras en estudio (leches, cremas, natas, carnes, vsceras) podrn sembrarse directamente en las placas de Agar Brucella, o bien, a partir de suspensiones y/o maceradas en solucin salina
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estril de rganos, heces, raspados de mucosa vaginal, etc. Una buena medida es practicar siembras por duplicado e incubar una placa en ambiente normal y la otra en una atmsfera enriquecida con CO2.
Frmula en gramos por litro: . Fostato (5ihidrogenado de Amonio Fostato Dipotaslco Cloruro de Sodio Citrato de Sodio Sulfato de Magnesio Agar Azul de Bromotimol pH tinal 6.9 :!:.. 0.2

1.00 1.00 5.00 2.00 0.20 15.00 0.08
Agar para Clamidosporas

Cal. 273-1 450 9
El Agar Brucella Bioxon puede hacerse ms selectivo y dar un mayor nmero de aislamientos positivos, si se le agrega a cada 1000 mi del medio esterilizado y enfriado entre 45 y 50C, 1.4 mg de violeta de etilo y la siguiente mezcla antimicrobiana:
Sulfato de Polimixina B Bacitracina. Cicloheximida (actidiona) 6000 unidades 100 mg 100 mg
Preparacin:
Medio especial que promueve y favorece la formacin de Clamidosporas por Candida al-
bicans. .
Si se desea restringir notablemente la difusin (swarming) de los Proteus, agregar de 2 a 3 gramos de agar bacteriolgico (Bioxon 150-1 ), por cada litro de medio.
Suspender 24.2 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y calentar agitando frecuentemente hasta ebullicin y completa disolucin. Distribuir volmenes de 3 mi en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos. Los tubos se dejan enfriar en posicin inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1.0 a 1.5 cm. Se puede emplear tambin como medio en placas. Usos: Este medio se puede emplear de la misma manera que el citrato de Koser para hacer la prueba de utilizacin de citrato como una de las reacciones delIMViC. Pueden hacerse cultivos en placa, o si se prefiere el medio inclinado, se inocula estriando la superficie y puncionando el fondo. Los cultivos se incuban durante 4 das de 35 a 37C. Si no se obtienen resultados precisos, lo cual puede suceder con cepas de Providencia, es necesario hacer nuevas pruebas incubando a temperatura ambiente durante 7 das. Solamente los microorganismos que utilizan el citrato como nica fuente de carbono, crecen en el Agar Citrato de Simmons. La aparicin de un crecimiento visible generalmente va acompaado de un cambio alcalina (azul) del indicador.
Este medio puede ser utilizado especialmente en la diferenciacin de bacilos entricos como se indica a continuacin:
Frmula aproximada en gramos por litro: Agar Sulfato de Amorlio. Fosfato Monopotasico Azul de Tripan Polisacaridos purificados Blotina pH final 5.1 .:!:.. 0.2 15.00 . 1.00 1.00 0.10 20.0 5.0 mcg.
Preparacin: Suspender 37 g del polvo en un litro de agua destilada de buena calidad. Dejar remojando el medio deshidratado (agitndolo de cuando en cuando), un lapso de 10 minutos para que se hidraten bien las partculas de Agar. Calentar con agitacin continua y hervir un minuto. Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin durante 20 minutos. Vaciar en cajas de Petri (12 mi por caja de 9-1 O cm de dimetro). Si se desea preparar este medio an ms selectivo: Dejarlo enfriar entre 45 - 50C Y agrguele 40 unidades de Penicilina. 40 microgramos de Estreptomicina y de 0.1 a 0.5 mg de Cicloheximida por mi de medio de Agar para Clamidosporas. Hay que tener en cuenta que un cierto nmero de especies de Candida son inhibidas por 0.5 mg de Cicloheximida. Sin embargo. la mayor parte de las cepas de Candida Albicans son resistentes a 5 mg/ml de dicha droga. Pueden utilizarse otras mezclas antimicrobianas como Polimixina B 6000 unidades + Bacitracina 1 00 mg + 100 mg de Cicloheximida en un litro de medio de cultivo; o bien, 50 mg de Cloranfenicol en 1000 mi de medio.
Nota: Si al medio de Agar Brucella se le agregan 5% de sangre desfibrinada estril de borrego, ms 5 mcg/ml de hemina y 10 mcg/ml de menadiona (vitamina K1), se prepara una excelente base enriquecida no selectiva, de uso general, para cultivar grmenes anaerobias, incubando naturalmente en anaerobiosiso Es ms, esta base enriquecida de Agar Brucella sangre puede transformrsele en un medio selectivo adicionndole los antibiticos apropiados o algunos otros inhibido res tales como 20 mi de bilis (2.0 g en polvo) por litro de medio (Bioxon 182-2).
Bibliogratia: Kzudas y Mor~e. J. Backt 66:502, 1953. Renoux G. Ann. Inst. Pasteur, 87:325, 1954. Standard Methods for the Examination 01 Dairy Products. 10th. Ed. APHA, Inc. New York. 1960. Ed. London.Boston 1977. Smith Louis Os. The Pathogenic Anaerobic Bacteria. Charles C. Thomas Pub. Sprinlield. lIIinois. 1975. Koneman. Allen, Dowell y Sommers. Color Atlas and Text. book 01 Diagnostic Microbiology, J.B. Lippinocotl Company.Philadelphia 1979.
Negativos Escherichia Shigella Mima (- 0+) Listeria
Positivos Enterobacter Arizona Klebsiella Citrobacter Salmonella Serratia Herella
Agar Citrato de Simmons

Prueba de utilizacin de citrato de entero bacterias.
Cal. 216.1
450 9 Bibliografa: Simmons J. Int. Dis. 39:209. 1926. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater . 11 Th Edition. APHA Inc. New York. 1960. Edwards & Ewing. Enterobacteriacease. USPHS. Publications 743. Washington. 1972. Torrp.qrosa and Ortiz. Pediatrics 59:35. 1961.
La adicin de antibiticos al medio de cultivo permite aislar directamente la Candida al bicans a partir de la muestra clnica en estudio e identificar la formacin de Clamidosparas; simultneamente incubar por duplicado. a 28 y 35C de 24 a 76 horas. Obtencin de Clamidosporas por Candida albicans.
Una tensin ligeramente baja de oxgeno favorece la formacin de Clamidosporas por lo que la resiembra deber hacerse por incisin profunda. Vase en este mismo manual, Agar de Czapek Dox (Bioxon 251-1). Las Clamidosporas son formas-de resistencia, globulosas, redondas u ovales que presentan una pared doble y gruesa, siendo de ma
El Agar Citrato de Simmons se usa para diferenciar las bacterias entricas Gramnegativas, basndose en la utilizacin del citrato. Recomendable para la diferenciacin de coliformes aislados del agua.
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yor tamao que las blastosporas. Retienen el colorante azul de tripn. Se presentan tanto en la punta del filamento (terminales) o intercaladas dentro de la hifa (Clamidosporas intercalares). Preparacin:
Bibliografa: Nickerson y Mankowsky J. Inl. Dis.. 92:20. 1953.
Suspender 36.0 g en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar lentamente agitando con frecuencia. Hervir durante un minuto y esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Vaciar en cajas de Petri. Una vez solidificado, invertir las placas para evitar el exceso de humedad. Usos: En el medio CLED (Cistina-Lactosadeficiente en electrolitos) crecen profusamente la gran mayora de las bacterias que provocan infecciones urinarias pudindose diferenciar o identificar sus colonias respectivas. Tiene adems la ventaja de impedir la difusin del Proteus en la superticie del medio, lo que echara a perder la prueba. La presencia de bacterias contaminantes como difteroides, lactobacilos y otros microbios, nos indica con qu tanto cuidado fue tomada la muestra de orina en estudio. Los cultivos urinarios debern realizarse con la primera muestra matutina y previo aseo escrupuloso de las zonas genitales. Utilicese el volumen medio de la misma para que la primera porcin del chorro arrastre a los microorganismos estacionados normalmente en la uretra. Los microorganismos que provocan infecciones en las vas urinarias son por lo general abundantes y de una sola especie. El col ibacilo es el germen que se aisla con mayol frecuencia.
La siembra de la muestra puede hacerse por el mtodo de las diluciones o por estra sobre la superficie del agar con asa calibrada. Efectuar los recuentos de colonias despus de 18 horas de incubacin a 35C. Reportar el nmero de ellas como colonias o bacterias por mi de orina. Recordar que un nmero de 100,000 (10)5 o ms ya tiene un gran significado clnico para considerarse como una infeccin en vas urinarias.
Agar Cled
(Cisti na-Lactosa-Deficiente en electrolitros)
Cal. 232.1
450 g
Bibliografa: Bebis T.D.J. Med. Lab. Technol. 26:38-41,1968. Mackey. J.P. y Sandys. G.H., 1965 B.M.H. 1 1173. Mackey. J.P. y Sandys. GH., 1966 B.M.J. 1 1173. Guttman, D y Nayler G.R.E. 1967 B.M.J. 2 343-345.
Para cultivar grmenes Gram positivos y Gram negativos en infecciones urinarias. Para el desarrollo y el recuento en bacteriologa urinaria de grmenes Gram positivos y Gram negativos. Impide el swarming ael Proteus.
Frmula aproximada en gramos por litro: Peptona de Caseina Extracto de Carne Peptona de Gelatina Lactosa L.Cistina Azul de Bromotimol Agar pH linal 7.3 I. 0.2 ~O 10 4~ IQO Q128 Q~ 1~0
Agar de Czapek Dox

Cal. 251-1 450 g
Para cultivar hongos y promover la formacin de Clamidosporas. Ampliamente usado en Microbiologa de suelos para cultivar hongos y bacterias del mismo, as como en la formacin de Clamidosparas por Candida albicans.
Frmula aproximada en gramos por litro: Sacarosa Nitrato de Sodio Fosfato Dipotsico Sulfato de Magnesio Cloruro de Potasio Sulfato Ferroso Agar pH final 7.3 I. 0.2 30.0 3.0 1.0 0.50 0.50 0.01 15.00
MICROORGANISMOS Escherichia coli Enterobacter
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS Grandes, amarillas elevadas, opacas, con el centro ligeramente ms obscuro. Agar amarillo Semejantes a E. coli pero mucosas y de mayor tamao. Agar amarillo. Grandes amarillas o blanco amarillentas. Sumamente mucosas y elevadas. Pueden presentar una ligera tonalidad azulada. Agar amarillo. Azules, translcidas con bordes irregulares. Poco elevadas. Verde azuladas plidas. Con superficie mate tpica y contornos irregulares. Olor "dulzn". Agar azul. verdoso. Desde azules hasta azul intenso. Muy pequeas, de 0.4 mm. amarillas, opacas. Agar amarillo. Pequeas de color amarillo intenso, opacas. Agar amarillo. Muy pequeas, grises.
"reparacin: Suspender 50 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir hasta disolucin completa del material (aproximadamente un minuto). Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Mezcle muy bien antes de vaciarlo en tubos o en cajas de Petri, (12 mi por caja). Deje que los tubos solidifiquen en posicin inclinada. Si se requiere bajar el pH a 3.5, agregue 10 mi de cido lctico al 10% por litro de medio despus de la esterilizacin. El Agar de Czapek Dox es un medio semisinttico que contiene nitrato de sodio como la nica fuente de nitrgeno y es uno de los medios slidos ms tiles IJara el cultivo de hongos en general, especialmente saprfitos y fitopatgenos. Tcnica general para el cultivo de hongos:
Klebsiellas
Proteus
Pseudomonas Salmonella, Shigella. Serratia, Providencia. Streptococcus fecalis. Estafilococos Corinebacterias
Evitar la humedad excesiva del medio. Para ello vaciar el agar fundido enfriado entre 45 50C, un volumen de ms o menos 12 mi por caja de Petri desechable de 9 cm de
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Agar de Chapman Stone
Cal. 297.1
450 g
Para aislar y diferenciar Estafilococos patgenos de la leche, productos lcteos y de otros alimentos.
te por estra superficial y se incuban de 30 dePreparacin: Manual Laboratorio de Bacteriologa a 32G-durante 48 horas. Cualquier colonia productora de pigmentos (amarillas o dbil- Suspender 43 g del medio deshidratado en mente anaranjadas), que esten rodeadas por un litro de agua destilada. Remojar de 10 a una zona clara, probablemente sern de es- 15 minutos. Calentar agitando tafilococos patgenos causantes de intoxi- frecuentemente y hervir durante un minuto, caciones por alimentos contaminados. Se re- Esterilizar a 121C (15 lb de presin) comienda repicar dichas colonias y emulsio- durante 15 minutos. narlas en 0.1 a 0.2 mi de Caldo Infusin de Una vez esterilizado enfriar a 40 - 45C, Y vaciar Cerebro Corazn (Bioxon 112) y efectuar en cajas de Petri estriles. pruebas de coagulasa. As mismo, es conveniente agregar una gota de solucin de Usos: prpura de bromocresol al sitio de donde se tomaron las colonias para determinar si hubo Se puede emplear en anlisis microbiolgifermentacin del manito!. Un color amarillo cos de productos congelados. para lo.cual indica reaccin positiva. Las zonas o halos es necesario acidificar el medio con 7.1 mi claros que se observan alrededor de la de solucin de cido tartrico al 10% por colonia indican degradacin (protelisis de la cada litro de medio, despus de que ste ha gelatina) por la enzima gelatinasa. sido esterilizado, fundido y enfriado a unos 45C. Las colonias de Estafilococos tpicamente productoras de intoxicaciones alimentarias Nunca se vuelva a fu!,,\dir despus de acidificar el (por ingestin de la enterotoxina) son amari- medio ya que el agar sufre una hidrlisis que lo llas, amarillo-doradas o de color naranja; fer- vuelve incoagulable. Es un me. dio de uso general mentan el manitol, son coagulasa positivas, pero no es apto para reacciones de hemlisis por producen beta hemlisis en medios como su alto contenido en dextrosa. Base de Agar Sangre (Bioxon 201) Y son gelatinasa positiva (reaccin de Stone Bibliografia: positiva).
Las colonias plidas, prcticamente desprovistas de color, no productoras de pigmentos, a pesar de que estn rodeadas por zonas claras no debern de tomarse en cuenta.
Bibliografia: Chapman J. Bacl. 1945. 50: 201. Recomended Methods lor the Microbiological Examination 01 Foods A.P.HA Inc. New York, 1958. Standard Methods lor Examination 01 Dairy Products. la. Ed., A.P HA Inc. New York, 1960. Recomended Methods lor the Mlcrobiological Examination 01 Foods APHA, Inc. New York, 1958.
Extracto de Levadura Peptona de Casena Gelatina D.Manitol Sulfato de Amonio Cloruro de Sodio Foslato Dipotsico Agar
2.0 10.0 30.0 10.0 75.0 55.0 5.0 15.0
Agar de Eosina y Azul de Metileno

Para el aislamiento y diferenciacin de coliformes de otras enterobacterias de inters mdico y sanitario.
pH linal 7.0 :t. 0.2
Preparacin:
Agar de Dextrosa
Suspender 202 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar correctamente. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir ms o menos un minuto hasta disolucin del medio. Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin durante 10 minutos. Vaciar en cajas de Petri aproximadamente 25 mi por placa. Recuento y aislamiento de bacterias. Cal. 125.1 450 g
Peptona de Gelatina Laclosa Sacarosa Fosfato Dipotsico Eosina Y Azul de Melileno Agar
10.000 5.000 5.000 2.000 0.065 13.5
pH final 7.2.:1:..0.2
Usos:
El Agar de Chapman Stone se usa igual que el Agar para Estafilococos No. 110 (Bioxon 105), distinguindose de ste en que ya contiene sulfato de amonio, por lo que se puede apreciar directamente la actividad de la gelatinasa (reaccin de Stone). El medio tiene un color blanco y aspecto opaco. Las muestras sospechosas de contener estafilococos patgenos (alimentos diversos, especmenes clnicos), se siembran masivamen
Es un medio de cultivo rico, que se recomienda para el recuento de microorganismos presentes en los concentrados de jugos de frutas. Al agregrsele sangre se mejoran las caractersticas nutritivas, pudiendo aislarse varios grmenes como Neisserias patgenas, Neumococos y otros.
Preparacin:
Frmula aproximada en gramos por litro: Extracto de Carne Mezcla de Peptonas Cal. 106-1 Dextrosa Cloruro de Sodio Agar 3 10 10 5 15
450 g
Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada de buena calidad. Mezclar y remojar unos 10 minutos para que se hidrate correctamente el Agar. Calentar agitando con frecuencia. Hervir un minuto. Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin durante 15 minutos. Dejar que se enfre la solucin a unos 50C. Agitar suavemente, evitando la formacin de burbujas, para que la composicin del medio se uniformice y vaciar en cajas de Petri estriles, Dejar que el medio se solidifique y luego invertir las placas para que no se deposite demasiada humedad sobre la superficie del mismo. USOS:
pH linal 6.9 :t. 0.2
Este es el medio clsico, que al igual que el Agar con Eosina y Azul de Metileno de Levine (Bioxon 223), se utiliza para el estudio de las enterobacterias. La morfologa, aspecto y color de las colonias e la misma en ambos medios.
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Agar para Estafilococos No. 110

Medio selectivo para aislamiento de estafilococos.
Adems de emplearse ampliamente en Bacteriologa Mdica, se utiliza en las tcnicas recomendadas por la American Public Health Association y la Sociedad Americana de Bacterilogos, para la deteccin y recuento de microorganismos coliformes, que pueden estar contaminando diversos alimentos yaguas de bebida de diversa ndote, destinadas al consumo humano.
La microflora acompaante, que entOrpece el aislamiento de los grmenes de inters mdico, es ampliamente inhibida por los colorantes de la frmula, sobre todo la flora Gram positiva.
Cal. 105.'
450 9
Es un medio altamente selectivo para el aislamiento e investigacin de estafilococos. El medio contiene gelatina y manitol facilitando as el aislamiento de estafilococos que atacan y degradan dichas sustancias.
Frmula aproximada en gramos por litros:
Extracto de Levadura Peptona de Casena Gelatina Lactosa O.Manitol Cloruro de Sodio Foslato dipotsico Agar 2.5 10.0 30.0 2.0 10.0 75.0 5.0 15.0
En este medio tambin es posible la identificacin rpida de Candida albicans (incubado en CO2) y a veces se logra aislar a Nocardia.
Por su contenido en lactosa y sacarosa es posible diferenciar en el primocultivo: Salmonellas y Shigellas, Lactosa y Sacarosa negativas de otras enterobacterias lactosa negativas pero sacarosa positivas, tales como Proteus vulgaris, Citrobacter y Aeromonas.
Bibliografa: American Public Heallh Association. Oiagnostic Procedures and Reagents. 2nd Ed. APHA Inc. New York. 1950. American Public Heallh Association. Examination ot Oairy Products. 10th Ed. APHA, Inc. New York. 1953. Society 01 American Bacteriologists. Manual of Microbiological Methods McGraw.HiII New York. 1957.
pH final 7.0:t. 0.2
Preparacin: Suspender 149 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 10 y 15 minutos. Homogenizar y calentar agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto. Esterilizar a 15 lb durante 15 minutos. Una vez esterilizado homogenizar para suspender el precipitado y vaciar en cajas de Petri.
M ICROORGAN ISMOS
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS Elevadas o ligeramente convexas. De 2 a 3 mm. de dimetro. Presentan a la luz transmitida un centro azul-negro, rodeado de un borde angosto y claro; y brillo mtalico azul verdoso, a la luz reflejada. Algunas cepas no muestran brillo metlico. Poca tendencia al desarrollo confluente. COlias grandes de 4 a 6 mm. de dimetro, elevadas y mucoides con tendencia a unirse. Usualmente no presentan brillo metlico. A la luz transmitida muestran un centro grisceo caf y bordes claros. Ligeramente elevadas, de tamao medio, de 1 a 2 mm. de dimetro. Transparentes, desde incoloras hasta ambarinas. Despus de 24 a 48 horas de incubacin en atmsfera de un 10% de CO2 ya 35 - 36C, pueden presentar colonias plumosas semejantes a telaraas (miceliales). Las colonias no siempre presentan un aspecto tpico. Muy pequeos, puntiformes, incoloros y bastante inhibidos. Cuando no hay swarming, semejantes a SalmonelIa y Shigella. Puede evitarse la difusin del Proteus agregando al Medio de Cultivo huellas de alta-pnitrofenil-glicerol.
Escherichia coli
Usos: El Agar para Estafilococos No. 110 se emplea para aislar estafilococos de procesos purulentos, casos de neumona, meningitis, forunculosis, uretritis, vaginitis, etc. Tambin se emplea este medio para aislar estafilococos que contaminan alimentos diversos y que producen intoxicaciones alimentarias. Es posible enriquecer el medio agregando 5% de sangre con lo que se obtienen buenas reacciones de hemlisis y formacin de pigmento amarillo dorado. Si se agrega a las colonias seleccionadas unas gotas de azul de bromotimol, podemos apreciar la fermentacin del manitol apareciendo alrededor de ellas un halo amarillo. Por ltimo, las placas se pueden cubrir con 5 mi de una solucin saturada de sulfato de amonio, o mejor an, con una gota de solucin de cido Sulfosaliclico al 20 %, e incubarlas durante 12 minutos para apreciar la hidrlisis de la gelatina: Se observan zonas claras (Reaccin de Stone).
Bibliografa: Chapman J. Bacl. 51.409. 1946. Chapman J. Bacl. 63:147. 1952.
Enterobacter aerogenes Klebsiella
Salmonella y Shigella
Candida albicans
Estafilococos Coagulasa Positivos
Proteus Sp.
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La adicin de sangre desfibrinada (puede hacerse an ms rico adicionndole 1.0 mi de polienriquecimiento por cada 100 mi del medio) achocolatada o no, permite el desarrollo de Histoplasma capsulatum y Nocardia. Tambin se emplea para el anlisis de materiales clnicos como sangre, LCR o lquido pleura!. Estas muestras, en caso de infeccin contienen un solo germen y generalmente no estn contaminadas con flora acompaante alguna.
Agar para seleccin de Estreptococos

Agar Estreptosel
Agar Eugon
Cal. 254.1 4509
Bibliografa: Vera M.J. Bac!. 54:14. 1947. Petczar y Vera Milk Plant Monthy, 38:30, 1949. Frank J. Bac!. 70:269, 1955.
Ca!.
299.1
450 g
Medio excelente para obtener desarroltos abundantes de microorganismos muy exigentes y difciles de cultivar.
Medio para enriquecer y aislar selectivamente Estreptococos de diversos materiales clnicos y de productos de importancia sanitaria altamente contaminados.
Frmula aproximada en gramos por litro: Peplona de Caseina Peptona de Soya Cloruro de Sodio Sulfito de Sodio L.Cistina Dextrosa Agar pH final 7.0 .:!:. 0.2 15.0 5.0 4.0 0.2 0.7 5.5 15.0
Agar Extracto, Glucosa y Tripticasena

Recuento en placas de bacterias en aguas potables y de drenaje.
Ca!. 133.1 450 g
Bsicamente no es ms que el Caldo para seleccin de Estreptococos o Caldo Estreptosel (Bioxon 264-1 ), al cual se le ha agregado 13.5 g de Agar.
Preparacin: Suspender 45.4 g de polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Ca1entar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta disolucin completa de los grumos de agar. Distribuir en tubos de ensaye o matraces y esterilizar a 12 libras (118C) durante 15 minutos. Dejar que se enfre el medio entre 45-50C y agregar sangre desfibrinada estril al 5% de cordero o de conejo, si se desea.
Es un medio altamente nutritivo, y est preparado de acuerdo con la frmula del agar estndar nutritivo (APHA).
Frmula aproximada en gramos por litro: Peplona de Casena 5.0 Extracto de Carne........................................................3.0 Dextrosa 1.0 Agar 15.0
Usos:
Tienen los mismos usos que el caldo anteriormente mencionado, pero si se le agrega 0.5% de sangre desfibrinada estril de conejo o de cordero, aumenta notablemente su poder nutritivo (ya de por s bastante considerable), sirviendo adems como indicador de hemlisis. En estas condiciones da muy buenos resultados para aislar e identificar diferentes grupos de Estreptococos como a los alfa y beta hemolticos, y naturalmente, a los no hemoliticos.
pH linal 7.0 .:!:. 0.2
Preparacin:
Usos: Este medio permite obtener una buena multiplicacin de microorganismos (crecimiento eugnico) an con los grmenes ms difciles de cultivar, tales como Haemophilus, Neisserias, Pasteurellas, Bruceltas, Lactoba. cilos, etc. Es muy til tanto en Bacteriologa Mdica como en Microbiologa de Alimentos. Asimismo, este medio es ideal para cultivar microorganismos delicados productores de enfermedades y para obtener cultivos masivos en la preparacin de antgenos y vacunas, y para pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. En Bacteriologa Alimentaria se usa ampliamente para detectar la presencia de bacilos lcticos en carnes crudas, ahumadas, embutidos, etc., as como en el anlisis bacteriolgico de la leche y otros productos lcteos. Para el recuento de colonias en alimentos enlatados, y en general, en la deteccin y estudio de problemas sanitarios que se presentan en la industria alimentaria.
Preparacin:
Una vez esterilizado enfriar a unos 40-45C y vaciar en cajas de Petri.
Suspender 24 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos.
Usos:
El Agar Extracto, Glucosa y Tripticasena se emplea para el recuento bacteriano en aguas potables y de drenaje por el mtodo de la cuenta en placas. Las tcnicas que se siguen para preparar diluciones, distribuir en placas, incubar, contar colonias, etc., se ajustan a las indicacones del libro Standar Methods for the Examination of Water and Wastewaters.
Bibliografa:
Suspender 44.10 g del polvo en un litro de agua destilada estril de buena calidad. Mzcielos bien y djelos remojando de 10 a 15
minutos para que se hidraten correctamente las partculas de Agar. Caliente a ebullicin durante 1 minuto con agitacin continua. Esterilice en autoclave a 12 libras de presin (118C) durante 15 minutos. Evite el sobrecalentamiento. Vace en cajas de Petri. Djelas solidificar y una vez endurecida SI invirtalas para evitar que se les deposite un exceso de agua de condensacin.
Standard Methods for the Examination 01 Water and Was. lewater. 11th Edition APHA. Inc. New York. 1960.
78
Usos:
El especimen puede sembrarse directamente en la placa por estra superficial. o bien inocularlo en medios lquidos de enriquecimiento, tales como Caldo Tetrationato, Caldo Selenito Cistina o Caldo GN. Incubar placas y caldos a 35C de 18 a 24 horas. Hacer resiembras de estas ltimas en placas de Agar de MacConkey y volver a incubar. Se recomienda sembrar simultneamente las muestras en otros medios ms selectivos tales como Eosina y Azul de Metileno, Agar SS, Agar Tergitol 7, Agar XLD, Agar Entrico Hektoen, Agar Sulfito de Bismuto (altamente especfico para
Agar de MacConkey
Los grmenes Gram positivos son inhibidos por las sales biliares y el cristal violeta. Las enterobacterias fermentadoras de la lactosa bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rojas o rosadas. Las no fementadoras de la lactosa dan colonias transparentes, incoloras o ambarinas.
En el agar de MacConkey crecen tambin bacilos Gram negativos que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, como Pseudomonas y Aeromonas. Asimismo, pueden desarrollarse en nmero reducido colonias puntiformes de Streptococcus fecalis (enterococos) de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeas, opacas de color rosa plido.
Medio empleado amp1iamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como Salmonellas, Shigellas y coliformes a partir de heces fecales, orinas, aguas negras y diversos alimentos
SalmoneJ/a typhi), Agar Verde Brillante, especial para Salmonellas. Vase en este mismo manual las indicaciones y usos de esos medios.
Por ltimo, este medio puede usarse en la diferenciacin de especies de Mycobacterium.
Cal. 109.1
450 9
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS De rojas o rosadas. No son mucoides. Pueden rodearse de un precipitado opaco de sales biliares.
GERMENES Escherichia coli
Peptona de Gelatina Mezcla de Peptonas Lactosa Mezcla de Sales Biliares Cloruro de Sodio Agar Rojo Neutro Cristal Violeta
17.0 3.0 10.0 1.5 5.0 13.5 0.03 0.001
Grandes. rosadas, mucoides. Grandes, rosadas, No son mucoides. Rojas o rosa. No son mucoides. Incoloras, transparentes. Rojas si fermenta a la lactosa. Incoloras, transparentes, rojas si fermentan la lactosa.
Klebsiella Enterobacter Serratia Arizona Citrobacter Proteus Pseudomonas Salmonella Shigella Estafilococos Enterococos
pH final 7.1 :L 0.2
Preparacin:
Incoloras y transparentes Incoloras. hasta caf verdosas. Olor dljlzaino caracterstico. Incoloras, transparentes o ambarinas. Incoloras, transparentes o rosa muy tenue. Puntiformes, rosa plido, opacas y escasas. Escasas, puntiformes, rojas, opacas y con un halo claro como de 1 mm de dimetro alrededor de la colonia.
Bibliografa: MacConkey J. Hg. 5:33,
1905. Joseph Md. Sta/e. Dep/- Heal/. Procedures. 1960.
Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Remojar bien entre 1 O a 15 minutos y calentar a ebullicin agitando continuamente. Hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lb) durante 15 minutos. Enfriar a 45-50C'y vaciar en cajas de Petri unos 20 mi por placa. Dejar solidificar y luego invertir las cajas para evitar que se deposite tlr exceso de humedad en la superficie del medio.
79

Para bajar el pH del medio a 4.0 se agregarn 15 mi de solucin de cido lctico al 10%, por cada litro del mismo. Una vez acidificado ste, no se vuelva a calentar porque el agar sufre un proceso de hidrlisis y pierde su capacidad gelificadora.
Bibliografa: Huppert y Walker, A.J. Clin. Path 29:291. 1958. Neauralh y Berliner Seienee, 146:648. 1956. Bridges, Olivo y Chandler, Applied, Mierobiol, 4:147,1956.
Despus de este tiempo se tendrn que revisar peridicamente las zonas de inhibicin ya que el microorganismo puede desarrollar cuando la concentracin del agente antimicrobiano comienza a disminuir.
Agar Micolgico
(Agar Micofil)
Se obtienen mejores resulados para aislar Neisserias patgenas preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton adicionndole a cada 100 mi del medio terminado y flido 1.0 mi de la suspensin VCN (Bioxon 303), ms 1.0 mi del poli enriquecimiento (Bioxon 304).
Bibliografia: Harris and Coleman Diagnoslie, Proeedures and Reagents. 4th Edition APHA. Ine. New York, 1963. Mueller and Hinton A. protein-free medium for primary ;satation 01 the Gonoeoeeus and meningoeoeeus. Proe. Soe. Exp. Biol. and Med. 49:330, 1941.
Cal. 2471
Agar de Mueller Hinton

450 9
Pruebas de sensibilidad a antibiticos y cultivo de Neisseria

Cal. 110,1 450 9
Para el cultivo, recuento, conservacin, identificacin y produccin de pigmentos por diversos hongos presentes en bebidas, alimentos, materiales clnicos y productos farmacuticos.
En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos. Tambin se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas).
Frmula aproximada en gramos p'" lilro:
Agar Nutritivo
Uso general en bacteriologa
Cat.104. 1
450 9
Peptona de Soya Dextrosa Agar
10.0 10.0 16.0

pH final 7.0 .:!:.. 0.2
Infusin de Carne de Res Peptona de Caseina Aeida '. Almidn Agar pH fnal 7.4 .:!:.. 0.2
.300.0 17.5 1.5 17.0
Preparacin: Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos y mezclar bien. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 12 libras de presin (118C) durante 15 minutos.
Preparacin:
El Agar Nutritivo es un medio de uso general en el laboratorio, no selectivo y adecuado para el cultivo de microorganismos poco exigentes. Puede emplearse en bacteriologa sanitaria, mdica e industrial.
Frmula aproximada en gramos por ftro: Peplona de Gelafna Extracto de Carne de Res Agar
pH final 6.8 .:!:.. 0.2
Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, yesterilizar a 121C (15 lb de presin) por un tiempo no mayor de 15 minutos.
Enfriar a 40-45C y vaciar en cajas de Petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar "chocolate", previa adicin de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en bao mara a 80 C 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningn momento.
5.0 3.0 15.0
Preparacin:
En Microbiologa Mdica se le utiliza para aislar hongos patgenos causantes tanto de micosis superficiales como de micosis profundas. Al mismo tiempo, se aconseja hacer cultivos simultneos con mdios que contienen antibiticos como el Agar para Seleccin de Hongos (Bioxon 259). De cualquier modo, al Agar Micolgico se le pueden agregar 0.5 g de cicloheximida por litro de medio para evitar el desarrollo de hongos saprfitos (mohos) y 0.05 g de cloranfenicol, que impide el crecimiento de las bacterias contaminantes.
Suspender 23 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar unos 15 minutos, mezclar y calentar a ebullicin de 1 a 2 minutos hasta disolver el producto. Distribuir y esterilizar a 121C (151b de presin) durante 15 minutos. Usos:
Muy empleado en los anlisis bacteriolgicos de aguas potables, de uso industrial y residuales, leches y otros alimentos. Se le emplea tambin en la multiplicacin de microorganismos para producir vacunas y antgenos en general; en las pruebas de sensibilidad y resistencia, y como base para preparar medios de cultivo ms ricos adicionados de lquido ascitico, etc. Lo mismo que en pruebas bioqumicas, por ejemplo indoldescarboxilasa y lisina-descarboxilasa.
Usos:
Es un medio til para el desarrollo de bacterias del gnero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35C, en atmsfera de CO2 (tcnica de la vela). El medio deber mantenerse hmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodn hmedo y una vela encendida, cerrando luego hermticamente.
El Agar Micolgico se usa tambin para valorar la actividad fungicida de medicamentos farmacuticos. Tambin para efectuar recuentos de levaduras, mohos y bacterias (recuento total de microorganismos) en diversos preparados de la industria farmacutica, Para obtener solamente el nmero de levaduras y mohos, deber bajarse el pH del medio de 4.0 a 4.7. Lo anterior tambin es vlido para la industria de bebidas y alimentos.
Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse despus de 12 a 18 horas de incubacin.
Bibliografa. Wetmore and Goehenour J. Bael. 72:79, 1956. Greenberg and Cooper Can. Med. Assn. J. 83:143, 1960.
80
Agar Proteosa No. 3

Aislamiento patgenas
Cal.
204.1
Agar de Sal y Manitol

Aislamiento de estafilococos
Cal. 146.1
Manual de Laboratorio Bacteriologa Agar para de Salmonella y
de
bacterias
Shigella (Agar SS)

Aislamiento de enterobacterias patgenas
Cal. 144.1 450 g
450 g
450 g
El Agar Proteosa No. 3 ha sido utilizado para el aislamiento y cultivo de grmenes patgenos exigentes, especialmente Neisseria gonorrhoeae.
Frmula aproximada en gramos por litro: Mezcla de Peptenas Dextrosa Cloruro de Sodio. Fosfato de Sodio. Agar pH final 7.3 lO.2 20.0 0.5 5.0 5.0 15.0
Es un medio selectivo muy empleado para aislar estafilococos patgenos de materiales clnicos diversos (orina, genitales, heridas, exudados farngeos, etc.). Tambin se utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines, el aislamiento e indentificacin de Estafilococos que se encuentran en la leche y productos lcteos, carnes y derivados crnicos incluyendo conservas de pescado.
Frmula aproximada en gramos por litro: Extracto de Carne Mezcla de Peptonas Cloruro de Sodio D.Manitol Agar Rojo de Fenol. pH final 7.4 lO.2 1.0 10.0 75.0 10.0 15.0 0.025
Medio diferencial selectivo muy empleado en bacteriologa sanitaria para aislar Salmonella y Shigella, a partir de heces, orina y alimentos diversos. tanto frescos como enlatados. La inhibicin de bacterias Gram positivas se obtiene por una mezcla de sales biliares.
Frmula aproximada en gramos por litro: Extracto de Carne Mezcla de Peptonas Lactosa Mezcla de Sales Billares Citrato de Sodio Tiosulfato de Sodio Citrato Frrico Agar Rojo Neutro Verde Brillante pH final 7.0 lO.2 5.0 5.0 10.0 8.5 8.5 8.5 1.0 13.5 0.025 0.330 mg
Preparacin: Suspender 45 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar bien. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos. Enfriar y aadir 5% de sangre de cordero desfibrinada y estril. Si el medio va a usarse para el cultivo de Neisseria, calentar la mezcla a 80C, durante 10 minutos o hasta que adquiera un color caf chocolate; enfriar y vaciar en cajas de Petri sin dejar de agitarla. Agregar antibiticos VCN (Bioxon 303) y polienriquecimiento (Bioxon 304), si se desea.
Preparacin: Suspender 111 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien y calentar a ebullicin durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos. Vaciar en cajas de Petri. Preparacin:
Usos:
La degradacin del manitol con produccin de cido cambia el color del medio, de rosado a amarillo. Debido a su alto contenido de cloruro de sOdio, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio. Generalmente se incuban las placas unas 36 hrs., apareciendo las colonias de estafilococos no patgenos de tamao pequeo y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patgenos fermentadores del manitol, dan colonias ms grandes y rodeadas de una zona amarilla. Si agregamos a cada litro del medio, una yema de huevo en condiciones de esterilidad, los estafilococos, que adems de fermentar el manitol producen lipasa, darn un precipitado amarillento de cidos grasos alrededor de la colonia. Este fenmeno concuerda bastante bien con la propiedad de coagular el plasma que presentan los estafilococos patgenos coagulasa positivos.
Bibliografa: Me. Cutloch Am. J. Vel. Research 8:173. 1947. Velilla. Faber and Pelczar Am. J. Vel. Research 8:275. 1947
Suspender 60 9 del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar unos 15 minutos. Agitar para obtener una suspensin homognea, calentar con agitacin frecuente y hervir durante un minuto. No deber esterilizarse en autoclave. Verter en placas. Evtese la congelacin. Usos: Debido a su gran poder de inhibicin, este medio puede sembrarse con una buena cantidad del material en estudio, pero adems debern inocularse paralelamente otros medios menos inhibidores como Agar de Desoxicolato, Agar de MacConkey, Agar de Eosina y Azul de Metileno, Agar Tergitol7, Agar XLD y Agar Entrico Hektoen. Las bacterias no fermentado ras de la lactosa (supuestamente patgenas) dan colonias claras, transparentes e incoloras, en cambio los coliformes que son bastante inhibidos, forman colonias pequeas que varan del rosa al rojo. Las bacterias formadoras de sulfuros dan colonias que presentan un centro negro y un halo claro alrededor cOmo Proteus y algunas especies de Salmonella. Las placas del medio se conservan en buenas condiciones de trabajo durante una semana en el refrigerador.
COLONIAS
Usos:
El agar "chocolate" se utiliza en diversas formas. Para obtener un desarrollo satisfactorio de Gonococos, se pueden aadir materiales de enriquecimiento tales como plasma de caballo, hemoglobina y azul nilo o almidn y sangre. Al incubar placas para el cultivo de Neisseria deber usarse una atmsfera reforzada con bixido de carbono, en un tarro con buja o vela encendida. Incubar a 35C pero no a ms de 37C. Se obtienen mejores resultados para aislar Neisserias patgenas, agregando a cada 100 mi de agar chocolate, 1.0 mi de la mezcla antimicrobiana VCN Bioxon ms 1.0 mi de solucin de Polienriquecimiento Bioxon.
Bibliografa: Pelzer and Steffen J. Ven. Dis. Inl. 23;224, 1942. Steinberg and Mollov J. Bacl. Clin. Med. 27:56, 1942.
BACTERIAS Shigel:a y la mayor parte de las Salmonellas Escherichia cofi
Claras, incoloras, transpa[entes. Pequeas que van del rosa al rojo. De mayor tamao que las de E. cofi.
Enterobacter, Klebsiella
mucosas, opacas de crema plido hasta rosa.
Proteus y algunas Salmonellas
Incoloras, transparentes; con un centro negro si producen H2S. Paper Read Al Microbiological Congress, 1950. Proc. 22 nd. Ann. Meet. Normeastern Cont. Lab. Workers in Pullorum Dlsease Control Burlington. Vermont. June 20-21, 1950.
Bibliografa: Pub. Health Reporls. 65: 1075, 1950.
81
82
Agar de Soya Tripticasena

Aislamiento y cultivo de grmenes exigentes
Cal. 108.1
450 g
Una lista somera de microorganismos que se desarrollan en este medio es la siguiente: Estreptococos, Neumococos, Neisseria, Brucella, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella, Vibrio, Haemophilus vaginalis, Candida, etc.
Bibliograla: Altord, Wiese and Gunter J. Bacl., 69:516. 1955. Ctapper and Parker J. Bacl. 70:125. 1955. Standard Methods for the Examination of Dairy Products 11th Ed. A.P.H.A" Inc. New York, 1960. Hentges A.J. Clin. Path. 38:304, 1962. Hereluk and Gunderson. Appleid Microbiot. 22:299. 1959.
Es un medio slido, muy rico en nutrientes por lo que tiene un "uso general" en los labo
ratorios de Microbiologa. Permite la multiplicacin abundante y satisfactoria de grmenes de desarrollo difcil y exigentes, como Neumococos, Estreptococos, Neisserias, elc. Muy til para pruebas de hemlisis y de sensibilidad a los antibiticos (antibiogramas).
Frmula aproximada de gramos por litro:
Peptona de Casena Peptona de Soya Cloruro de Sodio Agar
15 5 5 15
pH final 7.3 1:... 0.2
Preparacin: Suspender y remojar de 10 a 15 minutos 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente durante un minuto para que se disuelva. Esterilizar en autoclave entre 118 y 121C ya una presin no mayor de 15 lb por 15 minutos. En caso de preparar volmenes grandes, aumentar el tiempo de esterilizacin pero no la presin ni la temperatura. Enfriar y vaciar en placas de Petri. Si se preparan placas de agar sangre para estudios de hemlisis, agregar de 5 a 10% de sangre de conejo o de carnero, preferiblemente de esta ltima.
Usos:
Por contener dos P1ptonas obtenidas por hi drlisis enzimtica a partir de casena y soya, en este medio se desarrollan ampliamente una gran variedad de microorganismos, incluyendo aquellos de cultivo difcil y delicado, tanto aerobios como anaerobios. Como carece de carbohidratos es muy til para estudiar reacciones de hemlisis y tambin para preparar agar-chocolate.
Si se desea puede agregrsele antibiticos. Tambin se le pueden agregar otros nutrientes o bien inhibores para usos especiales.
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como Agar Eosina Azul.de Metileno, Agar Mac Manual de Laboratorio deyBacteriologa Conkey, Agar Tergitol7, Agar XLD, Agar Entrico Hektoen, Agar SS, etc.
Agar Sulfito y Bismuto
Es un medio de Wilson y Blair* modificado y altamente selectivo para aislar Salmonella typhi, as como otros baCilos entricos, de heces, aguas negras, aguas de bebidas y diversos alimentos
La selectividad del medio depende en gran parte de la dispersin uniforme del precipitado del sulfito de bismuto en el gel final. Es por esta razn que el medio debe mantenerse bien mezclado y no vaciarse mientras estdemasiado caliente. En el medio caliente una vez depositado en las placas, tiende a precipitarse el sulfito de bismuto en forma irregular y desordenada propiciando que en unas zonas se encuentre demasiado concentrado y en otras casi sin nada o ausente.
Por lo comn, el Agar Sulfito de Bismuto se siembra por estra superficial tratando de obtener colonias muy bien aisladas. Pueden hacerse inoculaciones por vaciado de una suspensin de heces como del 10% en agua destilada o en solucin salina estriles. Vaciar aproximadamente. 5 mi de la suspensin en no menos de 20 mi del medio previamente fundido y enfriado a unos 4550C. Mezclar perfectamente, dejar que solidifique (que se forme un gel) e incube de 24 a 48 hrs.
Cal. 212-1
450 9
Mezcla de Peptonas Extracto de Carne Dextrosa Fosfato Disdico Sulfato Ferroso Indicador de Sulfito de Bismuto Verde Brillante Agar
10.000 5.000 5.000 4.000 0.300 8.000 0.025 20.000
Las placas una vez solidificadas debern presentar una opacidad crema uniforme, y gradualmente un color verde muy plido. Si Las placas delgadas con poco medio, se desecan se guarda en refrigeracin, el medio que pronto y dan reacciones retardadas, est en forma reducida, se ir oxidando inhibiendo el ennegrecimiento de las colonias' poco a poco hasta adquirir un color productoras de sulfuros, debido a la concentracin francamente verde. Al llegar a este momento de los ingredientes. descrtelo. Cook (1952) recomienda dejarlo p.n refrigeracin durante 4 das antes de usarlo para aislar Salmonella typhimurium * No confundirlo con el medio de Wilson y con el fin de hacerlo menos inhtbidor. En Blair para aislar C/ostridium perfringes. presencia de H2S, las Salmonellas reducen las sales de hierro y bismuto a sulfuro de hierro negro que se deposita en la colonia, y, Usos: a bismuto metlico (Mac-Coy, 1962) que se Junto a este medio, por ser fuertemente in- precipita en el medio de cultivo, formando un hibidor, se aconseja inocular tambin otros halo brillante pero menos obscuro alrededor de la misma. medios selectivos menos inhibidores, tales
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS

pH final 7.5 :!:.. 0.2
Elevadas con centro negro, bordes claros y translcidos. Colonias en "ojo de pescado o de conejo" Se vuelven uniformemente negras a las 48 horas. Entre las 18 a 24 horas se forma en el medio de cultivo un halo negro grisceo y con brillo metlico rodeando a la colonia. Elevadas y generalmente ms pequeas que las de S. typhi. Negras si producen H2S. Halo negro griOtras Salmonellas sceo con brillo metlico despus de 36 a 48 horas de incubacin. Verdosas si no son productoras de sulfuros como S. paratyphi A. Pequeas y pardas como S. choleraesuis y S. gallinarum, que son bastante inhibidas. Grandes elevadas, negras gisceas, como gotas de Arizona y Citrobacter plomo. Halo gris negro y con brillo metlico. Las cepas no fermentadoras de la lactosa varan del verde al caf. Desarrollo ocasional. Colonias que pueden ser verCOllformes, Proteus des, cafs y an negras. Estas ltimas ms pequeas que S. typhi y por lo general sin brillo metlico en el medio que rodea a la colonia. Casi todas inhibidas. En el caso de crecer. Sh. flexShigella neri y Sh. sonnei son de color caf, deprimidas en el centro y con bordes elevados (crateriformes).
Salmonella typhi
Preparacin: Suspender 52 g del polvo en un litro de agua destilada, aunque en general, los autores ingleses recomiendan no reconstituir ms de 400 mi en un solo matraz para lograr una mejor uniformidad de mezclado. Mezclar muy bien y remojar el medio deshidratado de 10 a 15 minutos para obtener un .buen gel. Hervir no ms de un minuto agitando continuamente para que se disuelva completamente el Agar. Dejar que el medio se enfre a 45C
Esto es muy importante) y sin dejar de
agitarlo, vace en cajas de Petri no menos de 20 mi del medio fluido. Las placas deben permanecer parcialmente descubiertas hasta que se seque la superficie del medio y usarlos el mismo da. Evite el sobrecalentamiento.
84

Azul de Bromotimol Agar
0.04 14.0
sa y dan colonias amarillentas por la produccin de cido. Algunas cepas de Proteus fermentado res de la sacarosa pueden formar colonias amarillentas similares a las de los Vibrios.
Bibliografia: Cholera Inlormation (W.H.O. 1965). WHO Expert Comitee on Cholera (2 and Rep. Techn.. Rep. Series No. 352 1967). Felsemfeld, Bu" World Org. 34: 161, 1966. Kobayashi. T. Enomoto S. Sakasaki. R.Y. Kwajaras. S., Jap. J. Bact 18 387 291. 1963.
Tanto el color negro de la colonia como el brillo metlico del halo aumentan si la placa se deja de 2 a 3 horas a temperatura ambiente y en presencia de la luz.
pH final 8.6 :t. 0.2
Preparacin:
Las colonias de coliformes, Shigella (que generalmente no desarrollan) y Proteus presentan un color verde, caf o negro y no ennegrecen el medio. Las placas debern incubarse hasta 48 horas.
Suspender 86 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante 1 minuto. Enfriar entre 45 - 50C Y vaCiar en cajas de Petri. No esterilizar en autoclave. Usos:
Se emplea ampliamente para aislar y cultivar diversas especies del gnero Vibrio que pueden provocar clera, diarreas coliformes e intoxicaciones por alimentos contaminados. Las 2 ltimas afecciones provocadas sobre todo, a partir de diversos pescados y mariscos que se ingieren crudos o semicrudos y que pueden ser causadas por Vibrio parahemolyticus.
Agar Tech
Cal. 265-1 450 g
Agar TCBS
Para cultivar Vibrios selectivamente Cal. 268-1
450 g
Incrementa y promueve la formacin de piocianina por Pseudomonas.

Frmula aproximada en gramos por litro: Peptona de Gelatina. Cloruro de Magnesio Sulfato de Potasio. Agar 20.0 1.4 10.0 13.6
Para el aislamiento selectivo de vibrios patgenos a partir de materiales clnicos, aguas y alimentos.
Frmula aproximada en gramos por litro: Extracto de Levadura. . 5.0 Mezcla de Peplonas................................................10.0 Citrato de Sodio 10.0 Tiosulfato de Sodio.. 10.0 Bilis de buey. .. .. . .. . .. .. .. . . . .. .. .. .. .. .. . ... 5.0 Colato de Sodio .3.0 Sacarosa. . . 20.c Cloruro de Sodio. 10.0 Citrato de Hi~rro. 1.0 Azul de Timol. .0.04
El Agar TCBS, es altamente inhibitorio para las Enterob,"":.~ri;:s, incluyendo coliformes y Proteus. Los Enterococos son tambin inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferacin de los Vibrios, como el antes mencionado, el V. cholerae y el V. algino/yticus. El material sospechoso (heces, vmitos, hi~(';:Jos rectales, pescados u otros alimentos), se siembra masivamente por estra superficial y se incuba a 35C, de 18 a 24 horas. Casi todos los Vibrios fermentan la sacaro
Preparacin: Suspender 45 g de polvo en un litro de agua destilada de buena calidad. Agregar 10 mi de glicerina y mezclar muy bien. Remojar durante unos 10 minutos para que se hidraten correctamente las partculas de Agar.
MICROORGANISMOS Vibrio choleare y su biotipo el Tor V. parahemolyticus
CARACTERISTlCAS DE LAS COLONIAS Grandes, lisas, elevadas, amarillas o caf claroamarillentas. De 2 a 3 mm. de dimetro. Agar amarillo. Incoloras con el centro verde. De 3 a 4 mm. de dimetro. El Agar sin cambio. Amarillas o caf claro-amarillentas. De 3 a 4 mm. de dimetro. Agar Amarillo. Amarillas, grandes. Escaso desarrollo, puntiformes, transparentes. Agar sin cambio. Pequeas azules. Escaso desarrollo, puntiformes. Agar amarillo.
Agitando continuamente, calentar a ebullicin, ms o menos por un minuto. Distribuir en tubos de ensaye colocando la cantidad suficiente para que se forme un fondo de buen tamao y esteriliz8r en autoclave a 15 libras de presin (118-121C) durante 15 minutos. Los tubos de ensaye se dejarn solidificar en posicin inclinada. Pueden prepararse placas de Agar, si as se requiere. Usos: El cultivo en estudio deber sembrarse por estra superficial e incubarse a 35C de 24 a 72 horas, o ms si es necesario.
El Agar TECH promueve y favorece la produccin de piocianina. El pigmento de color verde difunde el agar del medio de cultivo a partir de la colonia. A la observacin bajo luz ultravioleta, la piocianina da una fluorescencia verdosa o azul verde.
(GRUPO 1)
V. parahemolyticus
(GRUPO 11)
V. algino/yticus Enterobacteriaceae Pseudomonas Aeromonas Enterococos
Si la cepa de Pseudomona forma tambin fluoresceina, la fluorescencia observada es de color azul verdoso. En cambio, si hay formacin de piorrubina, la fluorescencia es de color rojizo.
El color y tonalidad del pigmento varan con la cepa de Pseudomonas. El pigmento puede extraerse con cloroformo.
Bibliografia: King Ward and Ramey J. Lab. and Cin. Med. 44:30. 1954. Burton. Eagle Campell Canad J. Res. C. 25:121, 1947 Sellers and Graber. Bacteriol Proc. M. 108: 129. 1961.
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COLONIAS Sin TIC.
MICROORGANISMOS
Agar Tergitol 7
Amarillas, con halo amarillo. Amarillo-verdosas, grandes, mucosas. Azules
Escherichia cofi. Enterobacter, Klebsiella Grmenes lactosa-negativos
Deteccin de coliformes
organismos
Con TIC. Amarillo-verdosas, con halo amarillo. Escherichia cofi. Enterobacter Hafnia, Serratia, Providencia, Proteus, Pseudomonas y Citrobacter. Lactosa-negativos, levaduras
Bibliografia:
Cal. 118-1
450 9
Rojizas, con halo azulado.
Azuladas. Es un medio de cultivo selectivo muy til para detectar bacterias coliformes en materiales clnicos como heces y orina. Se le ha empleado as mismo en anlisis bacteriolgico de aguas y alimentos.
Frmula aproximada en gramos por litro: Hepladecil Sullato de Sodio Mezcla de Peptonas Extracto de Levadura. Lactosa Agar Azul de Bromotimol . QI 5.0 .3.0 10.0 15.0 0.025
Chapman J. Bact. 53:504, 1947 Chapman J. Bact. 64:769. 1952. Chapman AJPH 41:1381.1951. Mossel J. Applied Bact. 25:20. 1962.
Usos:
Debido a que es un medio fuertemente inhibidor, inocule las placas con una asada bien cargada con el material en estudio. Al mismo tiempo siembre otros medios selectivos menos inhibido res como el Agar Desoxicolato, SS, XLD, MacConkey, EMB, Agar Tergitol 7, Agar Entrico Hektoen. Cuando se sospecha que el material en estudio contiene bajas concentraciones de Salmonella es necesario inocular la muestra inicialmente en Caldo Tetrationato o Caldo Selenito-Cistina (Bioxon 266).
pH final 6.9 .:t. 0.2
Agar Verde Brillante

Aislamiento de Salmonella
Cal. 145.1 450 9
Preparacin: Suspender 33 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada o desmineralizada y dejarlo remojar unos 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Esperar a que se enfre a unos 45 -50C Y si se desea, agregar 3.0 mi de una solucin de trifenil tetrazolio estril al 1 %. Distribuir en placas de Petri.
Es un medio altamente selectivo empleado para aislar Salmonella (excepto S. typhi y Shigellas), de heces, orina, leche y productos lcteos y de otros alimentos de importancia sanitaria.
Frmula aproximada en gramos por litro: Extracto de Levadura. Mezcla de Peptonas. Cloruro de Sodio. Lactosa. . Sacarosa. . Rojo de Fenol Agar.. . Verde Brillante 3.0 10.0 5.0 .10.0 10.0 0.08 . 20.0 .12.5 mg
Usos:
Este medio es muy adecuado para el desarrollo de microorganismos coliformes ya que da alrededor de un 30% de recuentos ms altos que otros medios selectivos empleados para el mismo fin. Escherichia cofi produce colonias de mayor tamao, amarillo verdosas y mucosas. Los microorganismos que no fermentan la lactosa desarrollan colonias azules. El heptadecilsulfato de sodio (tergitol 7) inhibe la flora secundaria indeseable e impide la difusin del Proteus (swarming). En ocasiones se agrega trifenil tetrazolio para el reconocimiento e identificacin de E. cofi y E. aerogenes.
El medio, de un color caf al principio pasa a rojo durante la incubacin a 370: Los grmenes que degradan la lactosa son inhibidos completamente, presentando algunas de las cepas no inhibidas, colonias verde amarillentas, opacas y rodeadas de un halo amarillento. Los microorganismos lactosa negativos, como Salmonella y ocasionalmente Proteus, forman colonias de color rosa plido transparentes y rodeadas de un halo rojo brillante. Algunas colonias de Proteus forman colonias rojas.
pH final 6.9 .:t. 0.2
Preparacin:
Suspender 58 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar remojar unos 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos y distribuir en cajas de Petri.
Bibliografia: American Public Health Association. Standar Methods for the Examination of Water and Wastewater 11Th Edition APHA. New York. 1960. American Public Health Association. Recommended Methods lor the Microbiological Examination 01 Foods. APHA. Inc. New York. 1958.
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Recomendado especialmente en la deteccin ae portadores y para estudios de control sanitario.
Tiosullato de Sodio Cllrato de Hierro y Amonio pH finat 7.4 :t. 0.2
6.80 0.80
Agar de Vogel Johnson

Aislamiento y diferenciacin de Staphylococcus aureus
Cal. 217-1
450 g
Excelente para la determinacin de estafilococos coagulasa-positivos en los alimentos.

Bibliografa: Vogel and Johnson, Public. Health lab. 18:131, 1960. Zabovitx, Evars and Niven J. Bacl. 70:687, 1955.
Preparacin: Suspender 55 9 del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar que se remoje durante 10 a 15 minutos. Calentar con todo cuidado y agitando con frecuencia justamente hasta que el medio hierva. No sobrecalentar. Dejar de calentar en cuanto se obtenga la disolucin completa del polvo. Una vez disuelto, enfriar rpidamente en agua o en bao mara a 50C y verter.en cajas de Petri. El medio debe ser transparente o casi transparente y tener un color rojo rub anaranjado.
El Agar de Vogel Johnson permite una determinacin temprana de las colonias de estafilococos coagulasa positivos y manitol positivos.
Peptona de Caseina. Extracto de levadura Manitol . Fosfato Dipotsico. Cloruro de Litio. Glicina. Agar. ... Rojo de Fenol .
AgarXLD
Xilosa-Lisina Desoxicolato
Cal. 211-1 450 g
10 5 .10 5 5 10 16 .25 mg
Para aislamiento de bacterias enteropatgenas, especialmente de los gneros Shigella, Salmonella y Arizona.
Frmula aproximada en gramos por litro: Xilosa l-Lisina. lactosa . . Sacarosa.. . Cloruro de Sodio. Extracto de ~c'.'cdura. Rojo de Fenol. Agar .. ... .. Desoxicolato de Sodio. 3.50 5.0 7.50 7.50 5.0 3.0 0.08 13.50 2.50
Preparacin:
El calentamiento excesivo o el mantener el medio demasiado tiempo en bao mara a 50C puede ocasionar que se formen precipitados. En este caso se corre el riesgo de que las colonias sean de menor tamao y presenten reacciones menos ntidas. Sin embargo, el precipitado no perjudica el desarrollo bacteriano y puede eliminarse por filtracin con papel filtro. Usos: En el Agar XLD es posible obtener las si
Suspender 61 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar bien. Remojar de 5 a 10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos. Enfriar a 45-50C y agregar 20 mi de una solucin de telurito de potasio al1 %. Agitar vigorosamente y vaciar en placas, utilizan do unos 20 mi para cajas de Petri de viar;:) y 15 mi :Jara las de plstico.
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS Arizona Citrobacter Edwarsiella E. cofi. Enterobacter, Serratia Rojas y transparentes con 31 cntro negro Amarillas y opacas. Pueden presentar un centro negro y orillas claras. Rojas con el centro negro y bordes claros. Amarillas y opacas. Halo de precipitado amarillo alrededor de las colonias. Grandes amarillas plidas, mucoide y Klebsiella opacas. Halo de precipitado amarillo rodeando a la colonia. Amarillas transparentes con bordes claros. Rojas y transparentes Rojas y transparentes Rojas transparentes y bordes amarillos con centro negro si producen H2S. Sin centro negro si no son productoras de H2S.
Bibliografa: Taylor A.J. Clin. Path 44:471, 1965 Taylor and Harris A.J. Clin. Path. 44:476. 1965.
Usos:
Las placas de agar pueden inocularse intensamente estriando con hisopos y se incuban a 35-37C. Las placas se examinan entre 24 y 30 horas, y generalmente tambin despus de 48 horas en busca de colonias negras con zonas amarillas. Durante las primeras 24 horas la mayor parte de los microorganismos, excepto los estafilococos coagulasa-positivos estn total o marcadamente inhibidos. A las 48 horas aparecen en el medio numerosos estafilococos coagulasanegativos fermentadores y no fermentadores del manitol.Staph. Epidermidis, casi siempre inhibido, forma pequeas colonias negro. grisceas sin halo amarillo.
P. vulgaris Proteus morganii y P. rettgeri Providencia y Shigella Salmonella
Los estafilococos coagulasa-positivos, forman pequeas colonias negras en las placas rojas. Si hay fermentacin de manitol, las colonias aparecen rodeadas por zonas amarillas debido a la formacin del cido del manitol. Si no hay fermentacin del manitol, no se observa ninguna zona amarilla y el color del medio alrededor de las colonias puede ser an ms roio de lo normal.
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Preparacin: Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos. Despus de esto enfriar a 45-50C y aadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estril, homogen izar y vaciar en cajas de Petri estriles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo. Tambin es posible inocular el fondo de una caja de Petri estril con un pequeo inculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50C; la caja se hace girar suavemente para homogenizar la muestra.
Con la adicin de uno por ciento de glicerol y de 15 a 20 % de sangre humana de banco de sangre, se obtiene un buen desarrollo de bacilos tuberculosos.
Frmula aproximada en gramos p'or litro: Inlusin de Msculo Cardiaco Peplona de Carne Cloruro de Sodio Agar 375 10 5 15
pH final 6.8 .:t.0.2
Preparacin:
Base de Agar Sangre

Aislamiento, cultivo y actividad hemolltica de grmenes difciles
En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapn de rosca que se pueden inocular (a 45C) y posteriormente vaciar en cajas de Petri estriles. Usos: Para el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis, la Base de Agar Sangre con 0.1 % de glicerol, 2.5 % de sangre humana de banco de sangre y 100 unidades de Penicilina por mililitro ha dado resultados comparables con los del medio de Lowenstein-Jensen. Otra forma que ha sido propuesta por Tarshis y
Frisch consiste en preparar gelosa sangre con 25% de sangre de banco y 1 % de glicerol. Este medio era satisfactorio para el cultivo de M. tuberculosis a partir de inculos pequeos y daba resultados equiparables a otros tres medios usualmente empleados para este propsito. La Base de Agar Sangre tambin puede usar se para la preparacin de antgenos.
Suspender '40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar reposar durante 5 minutos y mezclar bien. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en el autoclave. Esterilizar a 121C (15 lb de presin) durante 15 minutos. Despus de esterilizar hacer rotar los matraces y enfriar a unos 45C. Aadir de 5 a 10% de sangre estril desfibrinada de carnero o de conejo, y vaciar en cajas de Petri estriles. Usos: La Base de Agar con bajo pH se recomienda como un medio para el cultivo de varios microorganismos de dificil crecimiento. La adicin de 5 a 10% de sangre estril desfibrinada proporciona un medio excelente para el aislamiento de pneumococos, gonococos, meningococos. Tambin est indicado para estudiar reacciones de hemlisis.
Para el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis, la base de Agar Sangre con 0.1 % de glicerol, 2.5% de sangre humana y 100 unidades de Penicilina por mili litro di resultados comparables al medio de Lowenstein Jensen. (Tarshis).
Bibliografa: Frisch and Tarshis A. Rew. Tuberc. 64:55, 1951. Tarshis and Weed A. Rev. Tuberc. 67:391, 1953. Tarshis J. Bacl. 67: 117, 1954.
Cal. 201.1
450 9
La Base de Agar Sangre es adecuada para aislar y cultivar diversos microorganismos de difcil crecimiento. Al aadir sangre, puede usarse para descubrir la actividad hemolti ca y para aislar bacilos tuberculosos.
frmula aproximada en gramos por litro: Bibliografa: Snavelyanl Brahier A.J. Clin. Path. 33:511, 1960. Hosty, freeman and Irwin. Public. Heallh. Lab.. 1953. Schubert, Edwards and Ramsey J. Bacl. 77:648, 1959. APHA Diagnostic Procedures and Reagents 3rd edition. 1951. Tharshis and Frish AM. J. Clin. Path. 21:101,1951.
Infusin de Msculo Cardiaco Peptona de Carne. Agar Cloruro de Sodio. pH final 7.3 .:t.0.2
375 10 15 5
Base de Agar Sangre con bajo pH

Aislamiento y diferenciacin de bacterias exigentes con actividad hemoltica.
Cal. 219.1
450 g
La Base de Agar de Sangre con bajo pH es un agar de infusin de corazn con un pH de 6.8. Se usa en la misma forma y para los mismos fines que la Base de Agar Sangre.
88
Usos: Para obtener mejores resultados debe prepararse slo unos das antes de usarlo, ya que es realmente inestable y se oxida rpidamente. Est elaborado de acuerdo a la frmula del "Nationallnstitute of Health ,; y de la USP.
F'
APENDICE B. NORMA Oficial

Caldo Tioglicolato (NIH) NOM-166-
Mexicana
SSA1-1997, Para la organizacin y Bibliogralia: funcionamiento U.S. Pharmacopea XVI. 1960. Prueba de esterilidad de de los laboratorios clnicos productos biolgicos
y farmacuticos
Caldo de Tripticasena y Fosfato

Hemocultivo exigentes
Cat 225-1
de
bacterias
450 9
Cal 132-1
450 9
Caldo de Todd - Hewitt

Cultivo de Estreptococos Bhemolticos para tipificacin serolgica
Cal 2061
450 9
El Caldo de Tripticasena y Fosfato es un!

rel dio que se recomienda para el desarrollo de' estreptococos, pneumococos, meningoco-I cos y otros microorganismos de difci crecimiento.
Tambin se conoce como caldo para pruebas de esterilidad y se puede usar en lugar del Medio Lquido de Tioglicolato, para el anlisis de esterilidad de productos farmacuticos.
El Caldo de Todd-Hewitt fue originalmente desarrollado para la produccin de hemolisina estreptoccica. El caldo modificado por Updyke y Nikle se emplea de preferencia para el cultivo de estreptococos beta hemolticos. especialmente para estudios de tipificacin serolgica.
Peplona de Caseina Dextrosa Cloruro de Sodio Fosfalo Disdico

pH final 7.3 .:t. 0,2
20 ~ 2r 5, 0 2,;
Preparacin:
Peptona de Casena Extracto de Levadura Dextrosa Cloruro de Sodio Tioglicolato de Sodio L.Cistina
15.0 5.0 5.0 2.5 0.5 0.5
Infusin de msculo cardiaco Peptona Dextrosa Cloruro de Sodio Fosfato disdico Carbonato de Sodio pH final 7.8 .:t. 0.2
Disolver 29.5 9 del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos. Esterilizar en autoclave a 121C (151b de presin) durante 15 minutos. 500,0
20,0 2,0 Usos: 2,0 0.4 2.5 medio est especialmente adaptado para Este
pH final 7.1 .:t. 0.2
hemocultivos: un procedimiento frecuente es la inoculacin de 1 O mi de sangre a un frasco o matraz con 150 mi del medio de cultivo. El frasco Preparacin: se incuba a 35-37C, se observa a diferentes intervalos de tiempo. Cuando se obtiene el Disolver 30 9 del medio deshidratado en un desarrollo, se transfieren los microorganismos a litro de agua destilada. Distribuir y esterilizar un medio slido para hacer el aislamiento e en autoclave a 121C (15 lb de presin) identificacin de los mismos.
Preparacin:
durante 15 minutos. Usos:
Suspender 28.5 9 del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar bien. Calentar agitando frecuentemente. Hervir hasla disolucin. Distribuir en tubos de fermenlacin o en recipientes adecuados. Esterili~ar a 121C (15 lb de presin) durante 18 Iflinulos.
El Caldo de Todd Hewitt se usa en los dios de agrupamiento y tipificacin serolgicas de estreptococos beta hemolticos. para su identificacin en estudios clinicos y epidemiolgicos.
Para la elaboracin del agar de Todd Hewitt se aaden de 13 a 15 9 de Agar Bacteriolgico por litro de medio de cultivo.
Bibliogralia: Todd and Hewitt J. Path. 1. Bacl. 35:973. 1932. Updyke and Nlckle. Applled. Microbio!. 2:117. 1954. Diagnostic Procedures and Reagenls. Cuarta Edition APHA, Inc. New York, 1963. Noody. Slegel. Plttman and Winler. AJPH. 53:1083. 1962.
Bibliografa: Diagnostic, Procedures and Reagents. 3rd. Edition. 16:1950. J. Milk and Food Tech. 13:226. 1950. estu-
NORMA Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretara de Salud. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-166-SSA1-1997. PARA LA ORGANIZACION Y FUNCIONAMIENTO DE LOS LABORATORIOS CLINICOS. JOSE IGNACIO CAMPILLO GARCIA, Presidente del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, con fundamento en los artculos 39 de la Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal; 1o., 2o., 3o. fraccin VII, 5o., 6o., 7o., 10, 12, 13 apartado A, 18, 21, 23, 24, 27, 32, 33, 45, 46, 48, 51, 78, 79 y dems relativos de la Ley General de Salud; 3o. fraccin XI, 40 fracciones I y XII, 41, 43, 44, 45, 46, 47 fraccin I y 52 de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin; 1o., 3o., 5o., 8o., 9o., 10, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 37, 43, 46, 48, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 216, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 229, 233, 238 y 258 del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestacin de Servicios de Atencin Mdica y 23 fraccin III del Reglamento Interior de la Secretara de Salud, me permito ordenar la publicacin en el Diario Oficial de la Federacin de la Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997. Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos. CONSIDERANDO Que con fecha 4 de diciembre de 1998, en cumplimiento del acuerdo del Comit y de lo previsto en el artculo 47 fraccin I de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin, se public en el Diario Oficial de la Federacin el proyecto de la presente Norma Oficial Mexicana, a efecto de que dentro de los siguientes sesenta das naturales posteriores a dicha publicacin, los interesados presentaran sus comentarios a la Direccin General de Regulacin de los Servicios de Salud. Que las respuestas a los comentarios recibidos por el mencionado comit, fueron publicadas previamente a la expedicin de esta Norma en el Diario Oficial de la Federacin, en los trminos del artculo 47 fraccin III de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. Que en atencin a las anteriores consideraciones, contando con la aprobacin del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, se expide la siguiente: Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997. Para la organizacion y funcionamiento de los laboratorios clnicos. Sufragio Efectivo. No Reeleccin. Mxico, D.F., a 14 de septiembre de 1999.- El Presidente del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, Jos Ignacio Campillo Garca.- Rbrica. INDICE Prefacio 90
Manual de Laboratorio de Bacteriologa 0. Introduccin. 1. Objetivo y campo de aplicacin. 2. Referencias. 3. Definiciones. 4. Especificaciones. 5. Recursos humanos. 6. Recursos materiales y tecnolgicos. 7. Principios cientficos y ticos. 8. Contratos y procedimientos de servicios de referencia. 9. Aseguramiento de la calidad. 10. Higiene y bioseguridad. 11. Publicidad. 12. Concordancia con normas internacionales y mexicanas. 13. Bibliografa. 14. Observancia de la norma. 15. Vigencia. PREFACIO En la elaboracin de esta Norma Oficial Mexicana participaron: SECRETARIA DE SALUD. Subsecretara de Regulacin y Fomento Sanitario. Direccin General de Regulacin de los Servicios de Salud. Coordinacin de Institutos Nacionales de Salud. SECRETARIA DE LA DEFENSA NACIONAL. Direccin General de Sanidad Militar. Hospital Central Militar. Jefatura de Patologa Clnica. Seccin de Microbiologa. SECRETARIA DE MARINA. Direccin General de Sanidad Naval. Direccin de Centro Mdico Naval. SECRETARIA DE SALUD DEL DISTRITO FEDERAL. Coordinacin de Hospitales. Coordinacin de Laboratorios Clnicos. INSTITUTO NACIONAL DE LA NUTRICION "DR. SALVADOR ZUBIRAN". 91
Manual de Laboratorio de Bacteriologa INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL. Direccin de Prestaciones Mdicas. Coordinacin de Planeacin e Infraestructura Mdicas. INSTITUTO DE SEGURIDAD Y SERVICIOS SOCIALES DE LOS TRABAJADORES DEL ESTADO. Subdireccin General Mdica. Subdireccin Tcnica. Servicios de Normatividad. Oficina de Laboratorio, Banco de Sangre y Cuadro Bsico. INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Jefatura de Laboratorio de Investigacin en Bioqumica Clnica. CENTRO ESTATAL DE LABORATORIOS DE LA SECRETARIA DE SALUD DEL ESTADO DE JALISCO. COMITE ESTATAL PARA LA MEJORIA DE LA CALIDAD DE LOS LABORATORIOS CLINICOS. PETROLEOS MEXICANOS. Gerencia de Servicios Mdicos. Jefatura de Laboratorios de Anlisis Clnicos, Hospital Central Norte; Jefatura de Laboratorios de Anlisis Clnicos, Hospital Central Sur. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO. Facultad de Qumica. ASOCIACION MEXICANA DE BIOQUIMICA CLINICA, A.C. ASOCIACION MEXICANA DE PROPIETARIOS DE LABORATORIOS CLINICOS, A.C. CONFEDERACION NACIONAL DE QUIMICOS CLINICOS, A.C. CONSEJO MEXICANO DE PATOLOGIA CLINICA, A.C. FEDERACION MEXICANA DE PATOLOGIA CLINICA, A.C. 1. Objetivo y campo de aplicacin 1.1 La presente Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos que deben satisfacerse para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos. 1.2 La aplicacin de la presente norma es obligatoria en el territorio nacional para los profesionales, tcnicos y auxiliares para la salud de los sectores pblico, social y privado que intervengan en la organizacin y funcionamiento de laboratorios clnicos. 2. Referencias Para la correcta aplicacin de esta Norma es necesario consultar las siguientes: 2.1 NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos.
92
Manual de Laboratorio de Bacteriologa 2.2 NOM-009-STPS-1993, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para el almacenamiento, transporte y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y txicas en los centros de trabajo. 2.3 NOM-012-STPS-1993, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se produzcan, usen, manejen, almacenen o transporten fuentes generadoras o emisoras de radiaciones ionizantes. 2.4 NOM-114-STPS-1994, Sistema para la identificacin y comunicacin de riesgos por sustancias qumicas en los centros de trabajo. 3. Definiciones Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana, se entender por: 3.1 Laboratorios clnicos, a los establecimientos pblicos, sociales y privados, independientes o ligados a algn servicio de atencin mdica, que tengan como fin realizar anlisis clnicos y as coadyuvar en el estudio, prevencin, diagnstico, resolucin y tratamiento de los problemas de salud. 3.2 Ley, a la Ley General de Salud. 3.3 Reglamento, al Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestacin de Servicios de Atencin Mdica. 3.4 Secretara, a la Secretara de Salud. 3.5 Servicios de referencia, a la realizacin de anlisis clnicos por un laboratorio a solicitud de otro laboratorio. 4. Especificaciones 4.1 Los laboratorios debern contar con un responsable sanitario cuyas funciones son: 4.1.1 Informar por escrito a la Secretara, en los trminos, forma y periodicidad que la misma determine, los casos de enfermedades transmisibles de notificacin obligatoria, as como adoptar las medidas necesarias para la vigilancia epidemiolgica, tomando en cuenta lo dispuesto en la ley y dems disposiciones generales aplicables. 4.1.2 Comunicar por escrito a la Secretara el horario de asistencia al establecimiento, as como cualquier modificacin al mismo. 4.1.3 Comunicar por escrito a la Secretara la fecha de su designacin, renuncia o sustitucin. 4.1.4 Notificar en su caso al ministerio pblico y dems autoridades competentes, los casos en que se presuma la comisin de hechos ilcitos. 4.1.5 Atender en forma directa las reclamaciones que se formulen en la prestacin de los servicios, y coadyuvar para su resolucin, ya sean las originadas por el personal del establecimiento o por profesionales, tcnicos o auxiliares independientes que en l presten sus servicios, por servicios de referencia, por el proveedor o por el usuario, sin perjuicio de la responsabilidad profesional en que se incurra.
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Manual de Laboratorio de Bacteriologa 4.1.6 Vigilar y mantener el buen funcionamiento de la recepcin, toma, conservacin, transporte y procesamiento de muestras dentro y fuera del establecimiento. 4.1.7 Vigilar que se lleven a cabo los sistemas de control, tanto internos como externos que determine esta norma. 4.1.8 Firmar los reportes de los anlisis realizados o, en su caso, vigilar que sean firmados por el personal profesional o tcnico por l autorizado y de manera autgrafa. 4.1.9 Vigilar que dentro de los establecimientos a su cargo se apliquen las medidas de seguridad e higiene para la proteccin de la salud del personal expuesto por su ocupacin. 4.1.10 Mantener actualizada la documentacin curricular y laboral de su personal. 4.1.11 Las dems que sealen otros ordenamientos legales aplicables. 4.2 Los laboratorios llevarn un registro cronolgico de los anlisis que realicen. Estos debern conservarse por un periodo mnimo de seis meses. 4.3 Los informes de resultados de los anlisis debern tener impresos los valores de referencia conforme a las tcnicas empleadas, salvo en aquellos casos donde no se requiera. 4.4 Para la obtencin de licencia sanitaria o aviso de funcionamiento que ampare el legal funcionamiento del laboratorio, los propietarios y, en su caso, los responsables, debern presentar ante la autoridad sanitaria, el formato con los datos y requisitos que correspondan al trmite que se realiza, de conformidad con lo dispuesto en el acuerdo por el que se dan a conocer los trmites inscritos en el Registro Federal de Trmites Empresariales que aplica la Secretara de Salud y se establecen diversas medidas de mejora regulatoria y su anexo nico. 4.4.1 Los laboratorios que utilicen fuentes de radiacin ionizante, requerirn de licencia sanitaria y nicamente aviso de funcionamiento aquellos que no manejen este tipo de materiales. 4.5 Organizacin. Contar con los siguientes documentos actualizados: 4.5.1. Manual de organizacin que deber contener como mnimo los apartados siguientes: 4.5.1.1 Indice. 4.5.1.2 Introduccin. 4.5.1.3 Atribuciones u objeto. 4.5.1.4 Estructura orgnica. 4.5.1.5 Objetivo. 4.5.1.6 Descripcin de funciones. 94
Manual de Laboratorio de Bacteriologa 4.5.2 Manual de procedimientos administrativos que deber contener como mnimo: 4.5.2.1 Indice. 4.5.2.2 Presentacin. 4.5.2.3 Objetivo del manual. 4.5.2.4 Procedimientos. 4.5.2.5 Descripcin de actividades. 4.5.2.6 Diagramas de flujo. 4.5.2.7 Formatos e instructivos. 4.5.3 Manual de todos los mtodos analticos en idioma espaol que deber contener: 4.5.3.1 Nombre de todos los mtodos utilizados. 4.5.3.2 Fundamento. 4.5.3.3 Preparacin. 4.5.3.4 Procedimientos. 4.5.3.5 Resultados. 4.5.3.6 Valores de referencia. 4.5.3.7 Bibliografa. 4.5.4 Bitcora de mantenimiento y calibracin de equipo que deber incluir: 4.5.4.1 Nombre del equipo, fabricante y nmero de serie. 4.5.4.2 Fecha de recibo y fecha de inicio de operaciones del equipo. 4.5.4.3 Fechas de mantenimiento, especificando las calibraciones y verificaciones realizadas al equipo, de acuerdo a un programa de mantenimiento preventivo. 4.5.5 Gua para la toma, identificacin, manejo, conservacin y transporte de muestras que deber incluir: 4.5.5.1 Indice. 4.5.5.2 Introduccin. 4.5.5.3 Relacin de pruebas que se efectuarn. 4.5.5.4 Tipo de muestra que se requiere.
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Manual de Laboratorio de Bacteriologa 4.5.5.5 Instrucciones y precauciones especiales para la toma y conservacin de cada tipo de muestras. 4.5.5.6 En su caso, instrucciones para el transporte de las muestras. 4.5.6 Manual de manejo de equipo en el idioma espaol que incluya: 4.5.6.1 Nombre del equipo. 4.5.6.2 Procedimientos de uso. 4.5.6.3 Cuidados especiales. 4.5.6.4 Mantenimiento preventivo. 4.5.6.5 Bibliografa. 4.5.7 Manual de seguridad e higiene ocupacional y, en su caso, de seguridad radiolgica. 4.5.8 Manual de procedimientos para el manejo de desechos peligrosos, conforme a la NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generen en establecimientos que presten atencin mdica. 4.5.9 Programa de mantenimiento preventivo de instrumentos de medicin y equipo utilizado en el establecimiento. 4.5.10 Programa de desinfeccin y desinfestacin del establecimiento. 4.5.10.1 Todos los documentos anteriores podrn integrarse con informacin en espaol que el fabricante enve con los reactivos o equipos, o bien, ser elaborados por el propio laboratorio clnico y quedar contenidos en uno o varios volmenes. 4.6 Los laboratorios debern contar con las siguientes reas: 4.6.1 Registro de pacientes y sala de espera para toma de muestras, para la recepcin de solicitudes de exmenes y entrega de resultados. 4.6.2 Toma de muestras. 4.6.3 Area de laboratorio, en la que debern existir instalaciones elctricas, hidrulicas y de gas; rea de lavado de material, esterilizacin o antisepsia y secciones para la realizacin de anlisis. 4.6.4 Almacn. 4.6.5 Servicios sanitarios. 5. Recursos humanos 5.1 Contar con un responsable sanitario de laboratorio clnico que podr ser: 96
Manual de Laboratorio de Bacteriologa 5.1.1 Qumico con curriculum orientado al laboratorio clnico y mnimo 3 aos de experiencia en el rea tcnica, comprobable con documentos oficiales. 5.1.2 Mdico cirujano con certificado vigente de la especialidad en patologa clnica, expedido por el Consejo correspondiente o constancia de grado de maestra o doctorado en las reas de laboratorio clnico, expedida por institucin educativa competente. 5.1.3 Mdico, Qumico o Bilogo, con grado de maestra o doctorado en las reas de laboratorio clnico, expedidos por instituciones de educacin superior y registrados ante la autoridad competente. 5.2 Contar con personal suficiente e idneo: 5.2.1 Profesional del rea de laboratorio clnico con ttulo y cdula profesional legalmente expedidos y registrados por las autoridades educativas competentes. 5.2.2 Tcnico en laboratorio clnico con certificado o diploma legalmente expedido y registrado por la autoridad educativa competente. 5.2.3 Puede contar adems con personal de enfermera, auxiliar y administrativo en sus respectivas reas de competencia. 6. Recursos materiales y tecnolgicos 6.1 Los Laboratorios debern comprobar que cuentan con los recursos materiales y tecnolgicos de acuerdo al tipo de anlisis que realicen. 6.2 Las jeringas, agujas y lancetas utilizadas para la toma de muestras sanguneas debern ser desechables. 7. Principios cientficos y ticos 7.1 La prestacin de servicios de laboratorio clnico deber sujetarse a los siguientes principios: 7.1.2 Respetar la personalidad, dignidad e intimidad de todos los usuarios. 7.1.3 Brindar informacin completa, en trminos comprensibles, sobre los servicios y procedimientos a los que se va a someter al paciente, as como los requisitos para su realizacin. 7.1.4 Mantener la confidencialidad de toda la informacin relacionada con los resultados de los anlisis realizados, excepto cuando sea solicitada por la autoridad competente. 7.1.5 Informar a los usuarios, en su caso, si los procedimientos a los que se va a someter sern utilizados en funcin de un proyecto de investigacin o docencia. En estos casos, ser imprescindible que el consentimiento sea realizado por escrito ante dos testigos idneos, con las formalidades que para tal efecto establezca el Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigacin para la Salud. 7.1.6 El personal de laboratorio clnico no podr emitir opiniones ni sugerir interpretaciones sobre los resultados obtenidos, excepto al mdico o laboratorio que solicite el servicio de referencia. 97
Manual de Laboratorio de Bacteriologa 7.1.7 Las tcnicas y procedimientos realizados en los laboratorios clnicos, se sujetarn a los principios cientficos que los sustenten. 7.2 Cuando el mdico requerira los servicios de un laboratorio clnico privado, deber ofrecer cuando menos tres opciones al paciente, no pudiendo condicionar la prestacin de sus servicios profesionales, a la presentacin de los resultados de un determinado laboratorio exclusivamente. 8. Contratos de servicios de referencia 8.1 Los contratos de servicios de referencia debern ser por escrito y ajustarse a lo que establece esta Norma y otras disposiciones generales aplicables. En caso de que los servicios de referencia se realicen en el extranjero, los prestadores de los mismos debern cumplir con las disposiciones reglamentarias del pas en el que estn establecidos. 8.2 Los responsables que suscriban los contratos de servicios de referencia asumirn mancomunadamente la responsabilidad de los resultados. 8.2.1 Los resultados podrn transmitirse por medios electrnicos. 9. Aseguramiento de la calidad 9.1 Debern aplicar un programa interno de control de calidad que incluya las etapas preanaltica, analtica y postanaltica. 9.2 Debern participar al menos en un programa de evaluacin externa de la calidad en el cual debern integrar los anlisis que realice y que incluya el programa. 9.3 Acreditar la evaluacin de cada una de las pruebas incluidas en programas externos y desarrollar una investigacin dirigida para solucionar la problemtica de aquellos anlisis en los que la calidad no sea satisfactoria. 10. Higiene y bioseguridad 10.1 La superficie libre por trabajador no podr ser menor de dos metros cuadrados. 10.2 Todo el personal del laboratorio deber adoptar las medidas preventivas para su proteccin en el almacenamiento, transporte y manejo de substancias txicas, e infecciosas; tomando en cuenta los requisitos que sealen las disposiciones generales aplicables en la materia, en particular las normas oficiales mexicanas NOM-087-ECOL1995, NOM-009-STPS-1993, NOM-012-STPS-1993 y NOM-114-STPS-1994. 10.3 El responsable sanitario deber informar al personal sobre los riesgos que implica el uso y manejo de sustancias txicas, corrosivas o irritantes y, en su caso, fuentes de radiacin ionizante; as como, material infectocontagioso y los inherentes a los procesos de las muestras, con el fin de que cumplan con las normas de seguridad correspondiente y utilizar el equipo de proteccin personal. 11. Publicidad 11.1 Ser de carcter informativo sobre el tipo, caractersticas y finalidades de la prestacin de servicios. 11.2 El mensaje deber tener contenido orientador, educativo y en idioma espaol. 98
Manual de Laboratorio de Bacteriologa 11.3 La publicidad no podr ofrecer tcnicas y tratamientos preventivos, curativos o rehabilitatorios de carcter mdico o paramdico. 12. Concordancia con normas internacionales y mexicanas Esta Norma equivale parcialmente con los lineamientos y recomendaciones internacionales para laboratorios de anlisis clnicos y no es equivalente con ninguna Norma Mexicana. 13. Bibliografa 13.1 Ley General de Salud. 1984. 13.2 Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. 1992. 13.3 Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestacin de Servicios de Atencin Mdica. 1986. 14. Observancia de la norma La vigilancia de la aplicacin de esta Norma corresponde a la Secretara de Salud y a los gobiernos de las entidades federativas en sus respectivos mbitos de competencia. 15. Vigencia Esta Norma entrar en vigor al da siguiente de su publicacin en el Diario Oficial de la Federacin a excepcin de las disposiciones contenidas en los apartados 9.1, 9.2 y 9.3 que entrarn en vigor un ao despus. Las disposiciones contenidas en los subnumerales 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3, 4.5.4, 4.5.5, 4.5.6, 4.5.7, 4.5.8, 4.5.9 y 4.5.10 surtirn sus efectos dos aos posteriores a la publicacin de esta Norma y las disposiciones contenidas en los subnumerales 5.1.1, 5.1.2 y 5.1.3 entrarn en vigor tres aos despus de su publicacin. Sufragio Efectivo. No Reeleccin. Mxico, D.F., a 14 de septiembre de 1999.- El Presidente del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, Jos Ignacio Campillo Garca.- Rbrica.
Fecha de publicacin: 13 de enero de 2000
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5. Enjuagar al chorro de agua.

3. Dejar secar el frotis. Y fijarlo por calor.

6. Agregar la solucin de YodoLugo. Y dejar actuar por 1 a 2 minutos.

7. Enjuagar al chorro de agua. Decolorar con alcohol-cetona durante 5 segundos.

9. Enjuagar al chorro de agua.

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8. Agregar safranina y dejar por 15 a 20 segundos.

10. Dejar secar al aire libre, o colocar el frotis en un papel absorbente.

11. Agregar una gota de aceite de inmersin.

12. Observar al microscopio en objetivo de 100x.

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Demostracin de C. trachomatis: Tincin de Inmunofluerescencia.