Universidad de Chile Facultad de Odontologa Biologa celular y gentica I

Cuantificacin de protenas
Grupo B1: Integrantes: Camila Marambio Francisca Mrquez M Ignacia Muoz Constanza Muoz Romina Neira Profesor: Sonja Buvinic R. INTRODUCCIN M de los ngeles Juricic

Antecedentes generales Las protenas son sustancias nitrogenadas complejas que se hallan en las clulas animales y vegetales, son macromolculas verstiles lineales en los que las unidades monomricas son los aminocidos, que se pliegan en una notable diversidad de formas tridimensionales, que les proporcionan una correspondiente variedad de funciones cruciales en prcticamente todos los procesos biolgicos. Funcionan como catalizadores, transportan y almacenan a otras molculas como el oxgeno, proporcionan apoyo mecnico y proteccin inmunolgica, generan movimiento, transmiten impulsos nerviosos y controlan el crecimiento y diferenciacin celular. (1) Sera posible la vida con ausencia de protenas? Claramente no, debido a que stas cumplen variadas funciones dentro del organismo, dependendiendo del tipo de protena, por ejemplo, una red de protena interna, el citoesqueleto, mantiene la forma y la integridad fsica celular. Filamentos de actina y miosina forman la maquinaria contrctil del msculo. La hemoglobina transporta oxgeno, mientras que los anticuerpos circundantes descubren invasores extraos. Las enzimas catalizan reacciones que generan energa, sintetizan biomolculas y las degradan, replican genes y los transcriben, procesan mRNA (cido ribonucleico mensajero), entre otras funciones. Los receptores permiten a las clulas detectar hormonas y otros indicios ambientales, asi como mostrar respuesta a los mismos. Las protenas estn sujetas a cambios fisicos y funcionales que reflejan el ciclo de vida de los organismos en los cuales residen. Una protena tpica nace en el momento de la traduccin, madura a travs de eventos de procesamiento postraduccional, como protelisis parcial, alterna entre estados de trabajo y de reposo por medio de la intervencin de factores regulares, envejece por oxidacin, desamidacin, etc. y muere cuando se degrada hacia los aminocidos de que la componen, Un objetivo importante de la medicina molecular es la identificacin de protenas y los eventos en su ciclo de vida cuya presencia, ausencia o deficiencia se relaciona con estados fisiolgicos o enfermedades especficos. (2) Para que el funcionamiento de nuestro organismo sea exitoso, necesitamos que exista un equilibrio interno, y desde el punto de vista de las protenas, necesitamos

una concentracin adecuada de cada una de ellas, ya que, una pequea irregularidad en esta concentracin podra eventualmente desencadenar graves trastornos corporales. Es por eso que determinar la cantidad de protenas en nuestro organismo es de vital importancia, determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos. (3) Para esto, existen variados mtodos dentro de los cuales encontramos el mtodo de Biuret, de Lowry, de Bradford y Turbidimtrico. En esta ocasin, se utilizar como mtodo de cuantificacin de protenas, el mtodo turbidimtrico, basado en la precipitacin de protenas en presencia de un cido, la turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (detector en la misma direccin del haz de luz). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminucin de la luz transmitida) Ej. Determinacin de protenas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las protenas precipiten con TCA o cido sulfosaliclico). (4) Se utilizar adems como protena de referencia o patrn, a la protena albmina srica de bovina. La albmina es la principal protena del plasma humano (3.4 a 4.7 g/dl) y constituye un 60% de la protena plasmtica total. Alrededor del 40% de la albmina est presente en el plasma, el otro 60%, en el espacio extracelular. La albmina madura consta de una cadena polipeptdica de 585 aminocidos, y contiene 17 enlaces disulfuro. Se cree el el 75 a 80% de la presin osmotica del plasma depende de la albmina. Otra funcin importante de la albmina es su capacidad para unirse a diversos ligandos, los cuales incluyem acidos libres, y ciertas hormonas esteroides. (2)

Objetivos generales

a. Determinar la concentracin de protenas de la muestra problema asignada (M4). b. Determinar si se cumple la curva estndar de acuerdo a la concentracin de protenas (BSA). c. Determinar la validez del mtodo turbidimtrico en la cuantificacin de protenas. Hiptesis La concentracin de la muestra M4, se encuentra dentro de la curva estndar obtenida de las distintas concentraciones de la protena albmina srica bovina (BSA) en presencia del cido sulfosaliclico.

MATERIALES

Micropipeta Punta amarilla para micropipeta (200l) Tubo Eppendorf Tubo Falcon cido sulfosaliclico 5 % Agua destilada Albmina srica bovina (BSA) Muestra M4 Recipiente de desechos Espectrofotmetro de densidad ptica Gradilla multiuso (Portatubos Eppendorf)

MTODOS El trabajo experimental, requiri de una serie de pasos metdicos y meticulosos, para determinar la concentracin de protenas de la muestra problema. Se us el mtodo turbidimtrico en relacin a las soluciones con distinta concentracin de BSA detalladas a continuacin: Tabla N 1 : Concentraciones

CONCENTRACIN TUBO 1 2 3 4 5 6 BSA 0 g/ml 100 g/ml 200 g/ml 300 g/ml 400 g/ml 500 g/ml BSA 0 L 30 L 60 L 90 L 120 L 150 L AGUA 150 L 120 L 90 L 60 L 30 L 0 L

Incluyendo la muestra problema nmero 4: 7 MUESTRA 75 L 75 L

Al inicio del experimento se recomend rotular cada tubo eppendorf, del 1 al 7, siendo este ltimo, la muestra problema. De este modo se evita una confusin entre las soluciones y sus contenidos. Debido a que las cantidades utilizadas eran pequeas, fue necesario el uso de una micropipeta, la cual fue graduada con las distintas cantidades micromtricas detalladas con anterioridad. Posterior a este paso se coloc un punta de plstico

1. Preparacin de soluciones

Primeramente, el agua destilada se puso en los tubos eppendorf, procurando que la micropipeta estuviera graduada con la medida exacta para cada tubo (1, 2, 3, 4, 5 y 6). Es necesario mencionar que las concentraciones de agua destilada estaban comprendidas entre los 0 y 150l. Para verter el contenido, se presion lentamente hasta el primer tope del instrumento, para ser colocado en el frasco de . Una vez terminado el llenado de los 6 tubos, se procedi a cambiar la punta de la micropipeta mecnica, debido a que al ser agua no existi contaminacin en el manipulado de la sustancia y los tubos eppendorf se encontraban vacos al momento de usarse. Siguiendo el mismo procedimiento se agregaron las concentraciones de BSA expuestas en la tabla, calibrando la micropipeta y cambiando en una cantidad constante de 300 L. En este paso se cambi la punta entre cada manipulacin de los microtubos Eppendorf. Finalmente, se preparo la solucin de la muestra problema (tubo eppendorf 7), agregando 75L de agua, 75L de M4 y 300L de cido sulfosaliclico al 5% siguiendo los mismos procedimientos anteriores. 2. Incubacin y observaciones Una vez concluidos los pasos anteriores, se esperaron 5 minutos, para obtener las primeras conclusiones preliminares. Se compar el nivel de turbidez de cada uno de los microtubos, teniendo en consideracin que mientras mayor era la turbidez, mayor era la concentracin de BSA. De este modo se lleg a una primera aproximacin del experimento.

3. Absorbancia Este paso, fue realizado por las profesoras, quienes indicaron las densidades de cada una de las mezclas (se examina la absorbancia de la proyeccin del haz de luz monocromtica en el espectrofotmetro a 420 nm, donde la concentracin es proporcional a la absorbancia), con las cuales se pudo ejecutar la curva de calibracin, la cual nos arroj una ecuacin que nos permiti poder calcular la concentracin de protenas de nuestra muestra, pudiendo verificar de este modo, si sta se encontraba o no dentro de la curva.

RESULTADOS Los valores obtenidos se presentan en las siguientes tablas de datos: Tabla N2

TUBO MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3 PROMEDIO DE ABSORBANCIA 1 0,055 0,103 0,077 0,078333333 2 0,143 0,144 0,143 0,143333333 3 0,224 0,216 0,21 0,216666667

4 5 6 7

0,263 0,354 0,365 0,344

0,278 0,347 0,374 0,342

0,24 0,341 0,337 0,279

0,260333333 0,347333333 0,358666667 0,321666667

La tabla N2 muestra los valores obtenidos por el espectrofotmetro para las muestras 1 a 7, y sus respectivos promedios de absorbancia. Tabla N3 CONCENTRACIN TUBO 1 2 3 4 5 6 7 BSA (ug/ml) 0 100 200 300 400 500 MUESTRA BSA (ul) 0 30 60 90 120 150 75 H2O (ul) 150 120 90 60 30 0 75 ACIDO SULFOSALICLICO 300 300 300 300 300 300 300 PROMEDIO DE ABSORBANCIA 0,078333333 0,143333333 0,216666667 0,260333333 0,347333333 0,358666667 0,321666667

La Tabla N3 muestra que los promedios de absorbancia aumentan, desde 0.078 a 0.358, en la medida que aumenta la concentracin BSA, desde 0 a 500 (ug/ml). El promedio de absorbancia para la MUESTRA, corresponde a 0.321. Si los datos se ordenaran en forma creciente de acuerdo al promedio de absorbancia, la muestra se encontrara en una concentracin entre 300 y 400 (ug/ml).

Grfico 1: Concentracin BSA/Promedio de Absorbancia

El grfico N 1 que representa la relacin entre la Concentracin BSA y el Promedio de Absorbancia, muestra un crecimiento en el promedio de absorbancia, en la medida que aumenta la concentracin. Entre 0 y 400 ug/ml se observa un crecimiento lineal, a partir de una concentracin de 400 ug/ml, el crecimiento se observa a tasas menores, que indican saturacin. Grfico 2: Recta de estimacin

El grfico N 2 muestra la recta de ajuste, que se aproxima a los datos obtenidos, y permite interpolar y extrapolar valores. La Recta de Estimacin para el promedio de Absorbancia, est determinada por: y = 0,0006x + 0,0872 con, R2=0.9779 Donde, Y representa el promedio de absorbancia, X representa la Concentracin BSA. Con esta recta es posible determinar los valores del promedio de absorbancia, para valores conocidos de concentracin de BSA. La siguiente tabla muestra los valores de x e y para las muestras 1 a 6, y el promedio de absorbancia de la MUESTRA.

Tabla N4 X : Concentracin BSA 0 100 200 300 400 500 MUESTRA Y: Promedio de Absorbancia 0,0872 0,1472 0,2072 0,2672 0,3272 0,3872 0,3216

Para el valor conocido y = 0,321666667, se requiere determinar el valor de x (MUESTRA). Al reemplazar en la curva de estimacin, se obtiene que la concentracin de la MUESTRA es el valor: x= 390,7777778 ug/ml.

DISCUSIN

En la hiptesis se plante que la concentracin de la muestra M4, se encuentra dentro de la curva estndar obtenida de las distintas concentraciones de la protena albmina srica bovina (BSA) en presencia del cido sulfosaliclico, a travs del mtodo turbidimtrico, por lo tanto, luego de realizar el procedimiento experimental y realizar un anlisis de los resultados, se puede decir que la hiptesis es aceptada ya que la concentracin de la muestra M4 se encuentra dentro de la curva estndar, con una concentracin de 390,7777778 ug/ml. Tambin es importante mencionar que se cumplieron los objetivos propuestos al comienzo del trabajo prctico, ya que finalmente, se logra determinar la concentracin de protenas de la muestra M4. De las otras muestras utilizadas se logra llegar a un acercamiento hacia la curva estndar, y se determina la validez del mtodo turbidimtrico utilizado en esta ocasin para medir la concentracin de protenas en la muestra. A pesar de que la hiptesis es aceptada, al realizar el grfico se pueden apreciar leves discrepancias o diferencias entre los promedios de absorbancia de las muestras del grupo a las que deberan existir de acuerdo a la recta planteada, esto puede ser causa de variadas fuentes de error que se pueden haber cometido durante el procedimiento experimental, como el mal uso de la micropipeta en la succin de los lquidos desde los tubos Eppendorf, que pueden haber causado que pequeas burbujas de aire se hayan absorbido junto con el lquido, o la errada expulsin del lquido hacia los tubos, lo que producira que no todo el lquido se haya expulsado y que ste haya quedado en las puntas de plstico de la micropipeta, lo mismo puede haber ocurrido al no reemplazar las puntas de la micropipeta cuando se estaba trabajando con el agua destilada, pueden haberse quedado pequeos volmenes de lquido, los que afectaran la concentracin de las muestras siguientes. Otra fuente de error puede haber sido la descalibracin de las micropipetas debido a un mal uso por parte de algn integrante, lo cual puede haber generado diferencias de volmenes de los lquidos utilizados en el

procedimiento. Cuando ya se tenan completas las soluciones con sus concentraciones de BSA, agua destilada y cido sulfosaliclico, estos preparados deban ser homogeneizados, lo cual era indispensable para obtener buenos resultados, esto indica que quizs no haya existido una buena homogeneizacin o agitacin de la disolucin, lo que puede afectar a los resultados de absorbancia producidos por el espectrofotmetro. Finalmente, se logra apreciar que existen variados factores que influyeron en los resultados finales de cada muestra, que quizs con un poco ms de control de las variables involucradas se podran haber obtenido resultados ms exactos y satisfactorios.

BIBLIOGRAFA

(1) Berg Jeremy M., Tymoczko John L., Stryer Lubert., Bioqumica, 6ta edicin, Editorial Reverte.

(2) Harper, Bioqumica ilustrada, 28 edicin, Editorial McGraw Hill. (3)Fernndez Reyes E. y Galvn Cejudo A. , Mtodos para la Cuantificacin de Protenas, Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, p.1

(4) Universidad de Jan. Departamento de biologa experimental, rea qumica y biologa molecular. Metodos para el anlisis de protenas [en lnea] <http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA3PROTEINASalumno.pdf> [consulta: 10 de Abril 2013]