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TEMA 14: ENZIMAS.


Los enzimas son biomolculas especializadas en la catlisis de las reacciones qumicas que tienen lugar en la clula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones qumicas mucho ms que cualquier catalizador artificial conocido, y adems son altamente especficos ya que cada uno de ellos induce la transformacin de un slo tipo de sustancia y no de otras que se puedan encontrar en el medio de reaccin.

1.-CATLISIS QUMICA.
Antes de comenzar a analizar la naturaleza y funcin de los enzimas, resulta conveniente enunciar algunos conceptos bsicos acerca de la velocidad de las reacciones qumicas y el fenmeno de la catlisis. La teora cintica qumica establece que las reacciones qumicas transcurren molcula a molcula de modo que una reaccin tal como R (reactivos) P (productos) tiene lugar porque una determinada fraccin de la poblacin de molculas R, en un instante dado, posee energa suficiente como para alcanzar un estado activado llamado estado de transicin, en el que es muy fcil que se rompan o se formen uno o ms enlaces qumicos para formar los productos P. Es frecuente confundir el estado de transicin con un intermediario de reaccin; sin embargo este estado no es ninguna especie qumica concreta, sino que podra definirse con ms exactitud como un "momento molecular fugaz", altamente inestable, en el que uno o ms enlaces qumicos estn muy prximos a romperse o a formarse.

2 La velocidad de una reaccin qumica es proporcional al nmero de molculas por unidad de tiempo con energa suficiente para alcanzar el estado de transicin. Este estado de transicin posee una energa superior a la de los reactivos y a la de los productos constituyendo entre ellos una barrera energtica que debe superarse para que la reaccin tenga lugar. La diferencia entre la energa de los reactivos y la del estado de transicin recibe el nombre de energa libre de activacin (ver Figura 14.1). Existen dos mtodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reaccin qumica. Uno de ellos consiste en la elevacin de la temperatura de modo que al incrementarse el movimiento trmico de las molculas reaccionantes aumenta la fraccin de molculas que poseen energa suficiente para alcanzar el estado de transicin. El otro mtodo consiste en usar un catalizador, sustancia que se combina de un modo transitorio con los reaccionantes de manera que stos alcanzan un estado de transicin de menor energa de activacin; cuando se forman los productos se regenera el catalizador libre. As, un catalizador es una sustancia que, sin consumirse en el proceso, aumenta la velocidad de una reaccin qumica rebajando la barrera de energa de activacin (ver Figura 14.1). Es conveniente resaltar el hecho de que los catalizadores no alteran los equilibrios de las reacciones qumicas, slo consiguen que dichos equilibrios se alcancen ms rpidamente de lo que lo haran en ausencia de catalizador.

2.-INTRODUCCIN AL ESTUDIO DE LOS ENZIMAS.


Gran parte de la historia de la Bioqumica discurre pareja a la historia de la investigacin de los enzimas. Citaremos algunos hitos importantes: -La existencia de catalizadores biolgicos fue descrita por primera vez a comienzos del S. XIX en estudios acerca de la digestin de la carne por secreciones del estmago y la conversin del almidn en azcar por la saliva. -En 1835 la primera teora general sobre la catlisis qumica publicada por J.J. Berzelius inclua un ejemplo de lo que hoy conocemos como un enzima: la diastasa de la malta, sealando que la hidrlisis del almidn se catalizaba ms eficazmente por sta que por el cido sulfrico. -En 1860 Louis Pasteur propuso que la fermentacin del azcar para transformarse en alcohol era inducida por ciertos catalizadores biolgicos, razn por la cual los enzimas fueron llamados inicialmente "fermentos". Pasteur supuso que dichos catalizadores se hallaban unidos de modo indisoluble a la estructura de las clulas de la levadura por lo que no podan actuar fuera de estas. -En 1877 se utiliza por primera vez la denominacin "enzima" (etimolgicamente "en la levadura"). -En 1897 E. Bchner consigui extraer de las clulas de la levadura los enzimas que catalizan la fermentacin alcohlica, demostrando que stos pueden actuar independientemente de la estructura celular. Este hecho permiti estudiar "in vitro" la actividad y propiedades de los enzimas, aislarlos en estado puro y analizar su composicin. -En 1926 J.B. Sumner aisl un enzima, la ureasa, en forma cristalina pura y demostr que los cristales estaban formados por protenas. -Entre 1930 y 1936 se aislaron en forma cristalina pura diversos enzimas quedando establecida de modo definitivo la naturaleza proteica de estos catalizadores biolgicos. Desde entonces se han identificado varios miles de enzimas diferentes, habindose aislado muchos de ellos en forma cristalina. -En el mismo perodo J.B.S. Haldane expuso la idea de que los enzimas establecen

3 interacciones dbiles con el sustrato para distorsionarlo y catalizar as su transformacin; esta idea result capital para el moderno conocimiento de la accin enzimtica. -En 1981 se descubri que determinados tipos de RNA pueden catalizar su propia sntesis, hecho este que oblig a revisar algunas de las ideas preexistentes acerca de la naturaleza de los biocatalizadores. En la actualidad se considera que, con la excepcin de un reducido grupo de molculas de RNA con propiedades catalticas, los enzimas son protenas, y como tales, exhiben todas las propiedades inherentes a este grupo de biomolculas. Los pesos moleculares de las protenas enzimticas oscilan desde unos 12.000 daltons hasta ms de un milln. En muchos casos, las cadenas polipeptdicas de la protena enzimtica son suficientes para que sta desarrolle su actividad cataltica. En otros, se hace necesaria la participacin de un compuesto qumico adicional, de naturaleza no proteica, denominado cofactor.

3.-ESTRUCTURA DE LOS ENZIMAS: EL CENTRO ACTIVO.


Los enzimas, en cuanto que protenas, presentan todos los rasgos estructurales y propiedades qumicas que caracterizan a esta notable clase de biomolculas. En efecto, se ha podido comprobar que los enzimas pierden su actividad cataltica cuando sufren desnaturalizacin por efecto de los mismos agentes que afectan a las dems protenas; la conformacin tridimensional nativa intacta de la protena enzimtica resulta indispensable para que sta desempee su funcin. Adems, los enzimas, al igual que otras muchas clases de protenas, presentan un centro activo a travs del cual interactan con la(s) molcula(s) de ligando, que en este caso recibe(n) el nombre de sustrato(s), mediante un acoplamiento espacial (las superficies moleculares de ambos tienen formas complementarias) y qumico (grupos funcionales complementarios del enzima y el (los) sustrato(s) establecen diferentes tipos de interacciones dbiles entre s). Tanto la actividad cataltica como el elevado grado de especificidad qumica que presentan los enzimas residen en esta interaccin especfica entre el enzima y su sustrato. El centro activo es una cavidad existente en la superficie del enzima que est forrada interiormente por una serie de restos de aminocidos (Figura 14.2). Por regla general los aminocidos que forman parte del centro activo no se encuentran contiguos en la cadena polipeptdica, sino ocupando posiciones a veces muy alejadas en la misma. El hecho de que estos aminocidos coincidan prximos entre s sobre el centro activo no es ms que una consecuencia del plegamiento caracterstico de la cadena polipeptdica, es decir, de la conformacin tridimensional nativa de la protena enzimtica. Puede resultar til, aunque no siempre posible, distinguir entre los aminocidos que forman parte del centro activo dos categoras: a)Aminocidos catalticos.- Son uno o ms aminocidos cuyas cadenas laterales R poseen unas

4 peculiaridades qumicas tales que los facultan para desarrollar una funcin cataltica. Constituyen el verdadero centro cataltico del enzima. b)Aminocidos de unin.- Son una serie de aminocidos cuyas cadenas laterales R poseen grupos funcionales que pueden establecer interacciones dbiles (puentes de hidrgeno, interacciones inicas, etc.) con grupos funcionales complementarios de la molcula de sustrato. Su funcin consiste en fijar la molcula de sustrato al centro activo en la posicin adecuada para que los aminocidos catalticos puedan actuar (ver Figura 14.2). En cuanto al resto de los aminocidos de la cadena polipeptdica del enzima, los que no forman parte del centro activo, podra pensarse en principio que no desempean ninguna funcin, pero esto no es cierto; tienen la importante misin de mantener la conformacin tridimensional catalticamente activa del enzima; sin ella no existira centro activo y el enzima no podra interactuar con su sustrato.

4.-CINTICA ENZIMTICA: EL COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO.


Los enzimas actan de acuerdo con los mismos principios generales que los dems catalizadores: aumentan la velocidad de las reacciones qumicas combinndose transitoriamente con los reactivos de manera que estos alcanzan un estado de transicin con una energa de activacin menor que el de la reaccin no catalizada. Hay que destacar sin embargo que los enzimas son mucho ms eficaces que cualquier catalizador artificial conocido. Se ha podido comprobar que los aumentos de velocidad que producen son de entre 107 y 1014 veces la velocidad de la reaccin no catalizada. La actividad molecular (nmero de molculas de sustrato transformadas por una sola molcula de enzima por minuto) de distintos enzimas oscila entre unos pocos miles y varios millones de molculas de sustrato por minuto. Cabe preguntarse pues, cmo consiguen los enzimas aumentos tan espectaculares en la velocidad de las reacciones qumicas que catalizan.

Los mtodos experimentales para conocer la actividad cataltica de los enzimas son cada

5 vez ms complejos y sofisticados. Sin embargo, el mtodo ms antiguo utilizado en enzimologa, desarrollado por Leonor Michaelis y Maud Menten (Figura 14.3), y que en la actualidad sigue siendo de gran utilidad, consiste en analizar como vara la velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente en funcin de algunos parmetros experimentales como la concentracin del sustrato o la del propio enzima, lo que globalmente se conoce con el nombre de cintica enzimtica.

La cintica de las reacciones catalizadas por enzimas muestra un rasgo caracterstico que no se observa en las reacciones no enzimticas: la saturacin del enzima por el sustrato (ver Figura 14.4). Cuando se mide la velocidad inicial de una reaccin catalizada enzimticamente se observa que para concentraciones de sustrato bajas la velocidad de reaccin es proporcional a dicha concentracin, como ocurre con carcter general para las reacciones no enzimticas. A medida que la concentracin de sustrato aumenta la velocidad de reaccin deja de ser proporcional a sta. Con un aumento posterior la velocidad de reaccin llega a ser totalmente independiente de la concentracin del sustrato y se aproxima asimptticamente a un valor mximo que es caracterstico de cada enzima y que se conoce como velocidad mxima. Se dice entonces que el enzima se halla saturado por el sustrato. La concentracin de sustrato a la cual la reaccin alcanza la mitad de su velocidad mxima se conoce con el nombre de KM (constante de Michaelis-Menten). KM es un valor caracterstico de cada enzima y constituye una medida de la afinidad del enzima por el Figura 14.4 sustrato: valores bajos de KM indican una alta afinidad mientras que valores altos representan una baja afinidad. El efecto de saturacin del enzima por el sustrato condujo a los primeros investigadores de la cintica enzimtica, incluso antes de que se conociera la naturaleza proteica de los enzimas, a formular la hiptesis, hoy corroborada, de que el enzima y el sustrato se combinan de modo transitorio para formar un complejo enzima-sustrato (Figura 14.5) en el que se alcanza el estado de transicin con mayor probabilidad que en la reaccin no catalizada. Una vez alcanzado dicho estado el complejo enzima-sustrato se descompone para dar lugar a los productos y el enzima libre segn se refleja en la siguiente ecuacin:

Figura 14.5

E + S ES E+P
El enzima, una vez liberado, puede combinarse con una nueva molcula de sustrato para formar un nuevo complejo enzima-sustrato cerrndose as el ciclo cataltico del enzima. De este modo, una sola molcula de enzima puede transformar en producto, en sucesivos ciclos catalticos, a un elevado nmero de molculas de sustrato, lo que contribuira a explicar la gran eficacia cataltica que exhiben estas biomolculas.

La hiptesis del complejo enzima-sustrato explica de modo satisfactorio el efecto de saturacin del enzima por el sustrato observado en los estudios de cintica enzimtica: cuando la concentracin de sustrato es muy superior a la concentracin del enzima en el medio de reaccin, todos los centros activos de las molculas de enzima se hallan ocupados en un momento dado por molculas de sustrato, con lo que aumentos posteriores de la concentracin de ste no se traducen en aumentos en la velocidad de reaccin.

5.-CATLISIS ENZIMTICA: MECANISMOS.


La idea de que el enzima se combina transitoriamente con el sustrato para formar un complejo enzima-sustrato en el cual se alcanza ms fcilmente el estado de transicin de la reaccin catalizada es la piedra angular de todas las explicaciones acerca del fenmeno de la catlisis enzimtica. Sin embargo, esta idea no termina de explicar en su totalidad dicho fenmeno; ciertamente, responde a la pregunta de )qu hacen los enzimas? pero deja sin contestar otra pregunta esencial: )cmo lo hacen? Una forma interesante de abordar este problema consiste en preguntarse de donde procede la energa necesaria para provocar los considerables descensos en la energa de activacin asociados con las reacciones qumicas enzimticamente catalizadas. Si nos atenemos a las leyes termodinmicas, la cuanta de tales descensos debe ser energticamente "pagada" de alguna manera, ya que la energa "no se crea ni se destruye". La respuesta a esta pregunta reside en la propia naturaleza de la interaccin entre el enzima y el sustrato y en el concepto de energa de fijacin. Como ya se apunt anteriormente, la unin entre un enzima y su sustrato para formar el complejo enzima-sustrato se ve favorecida por la formacin de una serie de interacciones dbiles (puentes de hidrgeno, interacciones inicas, etc) entre grupos funcionales complementarios de ambas molculas. La formacin de cada una de estas interacciones dbiles va acompaada por la liberacin de una pequea cantidad de energa libre que contribuye a estabilizar el complejo. La suma de todas estas pequeas cantidades de energa liberadas por la totalidad de las interacciones dbiles formadas representa la energa de fijacin. El papel que juega esta energa en la catlisis enzimtica es de una importancia extraordinaria: la energa de fijacin no se limita a producir una estabilizacin del complejo enzima-sustrato, sino que

7 constituye la principal fuente de energa libre que los enzimas utilizan para rebajar la barrera de energa de activacin y con ello aumentar la velocidad de la reaccin catalizada. Prosiguiendo con nuestro anlisis sobre la naturaleza de la actividad cataltica de los enzimas trataremos ahora de averiguar de qu manera utilizan los enzimas la energa de fijacin para producir catlisis. En primer lugar, el enzima puede fijar a las molculas reaccionantes (sustratos) de manera que queden muy prximas entre s sobre el centro activo y a su vez prximos a eventuales grupos catalticos del propio enzima. En segundo lugar, el enzima fija a las molculas reaccionantes de manera que quedan no slo prximas entre s, sino orientadas en la relacin geomtrica ms favorable para que la reaccin tenga lugar, es decir, con sus grupos funcionales reaccionantes enfrentados. Las colisiones al azar de molculas reaccionantes en el medio de reaccin son extremadamente improbables, y an en el caso de producirse, la orientacin de los grupos funcionales reaccionantes no ser la ms favorable en la mayor parte de los casos. Sin embargo, el centro activo del enzima, al fijar a los sustratos de manera energticamente favorable mediante interacciones dbiles, y al hacerlo con una orientacin precisa, proporciona a stos un "lugar de encuentro" idneo para que se lleve a cabo la reaccin. La combinacin de los factores de proximidad y orientacin favorable de los sustratos sobre el centro activo explica por s misma los incrementos de velocidad observados en algunas reacciones catalizadas enzimticamente. Sin embargo, los enzimas todava pueden utilizar la energa de fijacin de un modo adicional para producir catlisis, a saber, provocando en la(s) molcula(s) de sustrato una distorsin favorable para que se alcance con prontitud el estado de transicin. )Cmo consiguen los enzimas provocar tal distorsin en su(s) sustrato(s)? Para contestar a esta pregunta es necesario revisar algunos conceptos que hasta ahora hemos tratado de una manera quizs excesivamente dogmtica. La elegante idea de que dos molculas con superficies complementarias "encajan" tal y como lo haran "una llave y una cerradura" ha resultado extraordinariamente til a la hora de explicar muchos procesos bioqumicos; sin embargo, esta idea puede resultar en cierto modo engaosa cuando se aplica a la catlisis enzimtica. Un enzima que fuese exactamente complementario con su sustrato sera con toda probabilidad un psimo enzima, puesto que estabilizara al sustrato en lugar de inducir su transformacin. Dicho de otro modo, el descenso de energa libre que acompaara a la formacin del complejo enzima-sustrato, gracias a la formacin de mltiples interacciones dbiles entre ambos, sumira a ste en una especie de "pozo" energtico del que le sera muy difcil salir. Este tipo de consideraciones tericas, apoyadas en muchos casos por resultados experimentales, han conducido a los investigadores de la catlisis enzimtica a afirmar que los enzimas no son exactamente complementarios con sus sustratos sino ms bien con las especies del estado de transicin, es decir, las interacciones dbiles que se forman entre el enzima y su sustrato son ptimas en el estado de transicin. Cuando el sustrato penetra en el centro activo del enzima se forman algunas interacciones dbiles entre ambos; a partir de este momento, cualquier distorsin del sustrato tendente a alcanzar el estado de transicin se ver acompaada por el establecimiento de interacciones dbiles adicionales energticamente favorables. As, el coste energtico que supone llevar al sustrato al estado de transicin es "pagado" gracias al descenso de energa libre asociado con el establecimiento de dichas interacciones dbiles (Figura 14.6). Una vez ms, el concepto de energa de fijacin resulta crucial para entender cmo los enzimas rebajan la barrera de energa de activacin para aumentar la velocidad de una reaccin qumica. Es conveniente resaltar el hecho de que la distorsin del sustrato a la que hemos hecho referencia no es slo estructural, es decir, no afecta slo a la forma de la molcula, ngulos o distancias de enlace, sino tambin electrnica: la formacin de interacciones dbiles puede provocar cambios en la distribucin global de la carga elctrica, aparicin de cargas parciales donde antes no las haba, etc. La energa de fijacin del sustrato al centro activo todava puede suponer una fuente

8 adicional de poder cataltico. La optimizacin de las interacciones dbiles entre el sustrato y el enzima puede conducir no slo a una distorsin estructural y electrnica del sustrato, sino tambin a una alteracin en la conformacin de la protena enzimtica. Tal alteracin conformacional, conocida como encaje inducido, puede conllevar una aproximacin de grupos catalticos esenciales del enzima a los grupos funcionales del sustrato susceptibles de reaccionar, con lo que las propiedades catalticas del enzima se habrn visto incrementadas. La vieja y en exceso rgida imagen de la "llave y la cerradura" para describir la interaccin especfica entre el sustrato y el centro activo del enzima, ha sido sustituida por una ms flexible en la que dicha interaccin se contempla ms bien como la que tiene lugar entre "una mano y un guante", reflejando as el ajuste mutuo que tiene lugar entre ambos objetos.

El importante papel que juega la energa de fijacin en la catlisis enzimtica da respuesta, por aadidura, a otra vieja pregunta que se formulaban los primeros investigadores de la naturaleza y accin de los enzimas: )por qu los enzimas han de ser tan grandes con respecto a sus sustratos? En efecto: si la energa de fijacin es la principal fuente de poder cataltico, el enzima debe ofrecer el mayor nmero posible de grupos funcionales capaces de establecer interacciones dbiles con el sustrato, con el consiguiente aumento en el tamao de la protena enzimtica. Hasta aqu hemos podido comprobar que los enzimas utilizan con gran eficacia la energa de fijacin como fuente principal de energa libre para producir catlisis. En muchos casos esta energa utilizada tal y como se ha descrito es suficiente para explicar los espectaculares aumentos en las velocidades de reaccin que los enzimas son capaces de producir. No obstante, una vez fijado el sustrato, el enzima puede recurrir a formas adicionales de catlisis que no estn basadas en la energa de fijacin sino en el poder cataltico que poseen en s mismos determinados grupos funcionales del centro activo. Estos grupos funcionales residen en los que hemos llamado anteriormente aminocidos catalticos y es su propia naturaleza qumica la que les permite funcionar como catalizadores. Aunque son mltiples los mecanismos segn los cuales actan estos grupos catalticos, en general se pueden encuadrar en alguna de las dos siguientes modalidades: a) Catlisis covalente.- Algunos enzimas se pueden combinar con el sustrato, a travs de un grupo cataltico, para formar un intermediario covalente inestable que se descompone con facilidad para formar los productos. b) Catlisis cido-base.- La velocidad de algunas reacciones qumicas se ve incrementada por la presencia de cidos o bases en el medio de reaccin. En estos casos, al proporcionar grupos funcionales capaces de actuar como dadores o aceptores de protones (carboxilo, amino, etc.), el enzima puede efectuar una catlisis general cido-bsica. Los diferentes mecanismos que los enzimas ponen en juego para acelerar las reacciones

9 qumicas, unos basados en la energa de fijacin , otros en la accin de grupos catalticos especficos, no son mutuamente excluyentes. Cada enzima particular recurre a una determinada combinacin de los diferentes mecanismos estudiados en la que pueden estar presentes todos o tan slo algunos de ellos; la contribucin especfica que cada mecanismo aporta al hecho cataltico tambin es diferente segn de qu enzima se trate. Todo parece indicar que, como regla general, los mecanismos basados en la energa de fijacin son responsables en mayor medida de los aumentos en la velocidad de reaccin que los basados en grupos catalticos especficos (catlisis covalente y cido-base) En la actualidad se han podido estudiar en detalle los mecanismos moleculares responsables de la actividad cataltica de unos cuantos enzimas confirmndose en lneas generales las ideas desarrolladas a lo largo del presente pargrafo.

6.-ESPECIFICIDAD DE LOS ENZIMAS.


Los enzimas, adems de ser unos catalizadores muy eficaces, presentan un alto grado de especificidad qumica, es decir, son capaces de inducir la transformacin de un slo tipo de molculas y no de otros que tambin se encuentran presentes en el medio de reaccin. Un enzima es capaz de discriminar entre dos sustancias que potencialmente podran actuar como sustratos. Como ya se apunt anteriormente, la relacin que existe entre el enzima y su sustrato es un caso particular de un fenmeno ms amplio: la relacin entre las protenas y sus respectivos ligandos. Aunque hemos introducido alguna salvedad sobre el particular (el enzima no es exactamente complementario con el sustrato sino ms bien con el estado de transicin), podemos afirmar que entre el enzima y su sustrato se da un acoplamiento espacial (el sustrato "encaja" en el centro activo del enzima) y qumico (ambos poseen grupos funcionales que pueden establecer interacciones dbiles entre s). La especificidad de los enzimas reside en esta complementariedad estructural. As, aquellos potenciales sustratos que, por falta de acoplamiento espacial y/o qumico, no puedan acceder al centro activo del enzima, no podrn ser transformados por l. Por otra parte, es necesario tener en cuenta que, en muchos casos, no es la totalidad de la molcula de sustrato, sino solamente una parte de ella, denominada grupo determinante de la posicin, la que se acopla espacial y qumicamente con el centro activo (ver Figura 14.7). La importancia de las interacciones dbiles entre grupos funcionales complementarios del sustrato y del centro activo en la determinacin de la especificidad de los enzimas debe hacernos reflexionar sobre un hecho crucial: la energa de fijacin, que como hemos visto es la principal fuente de energa libre para la catlisis, proporciona tambin especificidad. Catlisis y especificidad son dos propiedades de los enzimas que, aunque conceptualmente se distinguen

10 con facilidad, responden en realidad a un mismo fenmeno: la interaccin energticamente favorable entre el enzima y el sustrato. Aunque los enzimas son en general muy especficos comparados con cualquier catalizador artificial, su grado de especificidad resulta ser muy variado. Existen enzimas con una especificidad muy estricta que slo reconocen a un sustrato determinado y no inducen la transformacin de otras molculas aunque estn estructuralmente muy relacionadas con l; algunos enzimas incluso son capaces de distinguir entre formas estereoismeras de una misma sustancia (por ejemplo la lactato-deshidrogenasa slo es capaz de deshidrogenar al estereoismero L del cido lctico). En el otro extremo del espectro de especificidades se encuentran enzimas con una especificidad relativamente amplia: pueden inducir la transformacin de toda una serie de sustratos que presentan determinado rasgo estructural comn (por ejemplo la fosfatasa alcalina induce la hidrlisis de diferentes steres del cido fosfrico). Existen entre ambos extremos todos los grados de especificidad imaginables.

7.-FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMTICA.


Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad enzimtica. Destacaremos dos: el pH y la temperatura. 7.1.-EFECTO DEL pH. La mayora de los enzimas presentan un pH ptimo para el cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras protenas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH vara ms all de unos lmites estrechos (Figura 14.8). De ah la conocida importancia biolgica de los sistemas tampn. En la mayor parte de los casos el pH ptimo est prximo a la neutralidad, en consonancia con el pH intracelular, pero existen enzimas con pH ptimo muy diverso segn sea el pH del medio en el que habitualmente actan (los enzimas proteolticos del jugo gstrico tienen pHs ptimos prximos a 2 ya que este es el pH de dicho jugo). Por ltimo existen algunos enzimas a los que el pH no afecta en absoluto. 7.2.-EFECTO DE LA TEMPERATURA. Al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La variacin de la actividad enzimtica con la temperatura es diferente de unos enzimas a otros en funcin de la barrera de energa de activacin de la reaccin catalizada. Sin embargo, a diferencia de lo que

11 ocurre en otras reacciones qumicas, en las reacciones catalizadas por enzimas se produce un brusco descenso de la actividad cuando se alcanza una temperatura crtica. Este efecto no es ms que un reflejo de la desnaturalizacin trmica del enzima cuando se alcanza dicha temperatura. Si representamos grficamente la variacin de la actividad de los enzimas en funcin de la temperatura (ver Figura 14.9) da la impresin de que existe una temperatura "ptima" anloga al pH ptimo estudiado anteriormente; hay que resaltar que esa aparente temperatura ptima no es ms que el resultado de dos procesos contrapuestos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reaccin con la temperatura y 2) la desnaturalizacin trmica del enzima.

8.-NOMENCLATURA Y CLASIFICACIN.
Inicialmente se designaba a los enzimas aadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, o bien a una palabra que describe su actividad. Por ejemplo la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea para rendir CO2 y agua, la arginasa cataliza la hidrlisis del aminocido arginina y la DNA polimerasa cataliza la sntesis del DNA. Sin embargo, a medida que el nmero de enzimas conocidos iba aumentando, este tipo de nomenclatura comenz a revelarse poco operativa y en ocasiones ambigua, por lo que se ha adoptado una clasificacin sistemtica elaborada por una Comisin Internacional de Enzimas reunida a tal efecto. El nuevo sistema divide a los enzimas en seis clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases y stas en sub-subclases atendiendo al tipo de reaccin catalizada. Cada enzima es designada de tres modos: 1) un nombre recomendado, generalmente corto y apropiado para su uso habitual, 2) un nombre sistemtico que identifica la reaccin que cataliza, y 3) un nmero de clasificacin, que se emplea cuando se precisa una identificacin inequvoca del enzima. Veamos como ejemplo el del enzima que cataliza la siguiente reaccin. ATP + CREATINA ADP + FOSFOCREATINA Nombre recomendado: CREATIN-KINASA Nombre sistemtico: ATP:CREATIN FOSFOTRANSFERASA Nmero de clasificacin: EC 2.7.3.2. En el nmero de clasificacin EC es la abreviatura de Comisin de Enzimas; el primer dgito (2) indica la clase a la que pertenece el enzima, en este caso la clase transferasas (ver tabla); el segundo dgito (7) indica la subclase (fosfotransferasas); el tercer dgito (3) la subsubclase (fosfotransferasas con grupo nitrogenado como aceptor); el cuarto dgito (2) identifica inequvocamente al enzima en cuestin.

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9.-INHIBICIN ENZIMATICA.
Existen una serie de sustancias, llamadas inhibidores, que inhiben o anulan la accin de los enzimas sin ser transformados por ellos. Su estudio resulta de gran utilidad a la hora de comprender los mecanismos de catlisis, la especificidad de los enzimas y otros aspectos de la actividad enzimtica. La inhibicin enzimtica puede ser irreversible o reversible, esta ltima comprende a su vez tres tipos: inhibicin competitiva, acompetitiva y no competitiva. 9.1.-INHIBICIN IRREVERSIBLE. Algunos inhibidores se combinan de modo permanente con el enzima unindose covalentemente a algn grupo funcional esencial para la catlisis con lo que el enzima queda inactivado irreversiblemente. El estudio de este tipo de inhibidores ha resultado de gran utilidad para identificar los grupos funcionales esenciales para la catlisis en aquellos enzimas a los que inactivan. Este tipo de inhibicin se conoce tambin como "envenenamiento" del enzima. Por ejemplo algunos compuestos organofosforados txicos llamados venenos nerviosos, que se utilizan como insecticidas, actan inhibiendo irreversiblemente al enzima acetilcolinesterasa, la cual interviene en la actividad del sistema nervioso. Se sabe que estos compuestos organofosforados inactivan al enzima formando un enlace ster fosfrico con el grupo hidroxilo de un determinado resto del aminocido serina, lo que demuestra que ese grupo funcional es esencial para la catlisis. 9.2.-INHIBICIN REVERSIBLE. Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima, de manera parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos inhibidores reversibles no se combinan con el enzima libre sino con el complejo enzima-sustrato. Se distinguen tres tipos de inhibicin reversible: 9.2.1.-INHIBICIN COMPETITIVA.

El inhibidor es una molcula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con l por acceder al centro activo, pero que no posee ningn enlace susceptible de ser atacado por el enzima (Figura 14.10). El

13 inhibidor forma con el enzima libre un complejo enzima-inhibidor de caractersticas cinticas anlogas a las del complejo enzima-sustrato, pero que, lgicamente, no puede descomponerse a continuacin para dar lugar al enzima libre y a los productos:

E + I EI
9.2.2.-INHIBICIN INCOMPETITIVA.

El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su unin al sustrato, sino que lo hace con el complejo enzima-sustrato dando lugar a un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a los productos (Figura 14.11). El inhibidor se coloca prximo al centro activo situado de tal manera que impide fsicamente la salida de los productos:

ES + I ESI
9.2.3.-INHIBICIN NO COMPETITIVA.

14 El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzimasustrato, interfiriendo en la accin de ambos (Figura 14.12). Los inhibidores no competitivos se unen a un lugar del enzima diferente del centro activo provocando en el una alteracin que dificulta bien la formacin del complejo enzima-sustrato o bien la descomposicin de ste para dar lugar a los productos. La unin con el inhibidor produce dos formas inactivas: los complejos EI y ESI, ninguna de las cuales puede descomponerse para dar lugar a los productos y al enzima libre:

E + I EI ES + I ESI
Aunque podra pensarse que los distintos tipos de inhibicin estudiados pueden desempear algn papel en la regulacin de la actividad enzimtica, todo parece indicar que no es as; la regulacin de la actividad enzimtica se lleva a cabo mediante mecanismos que no se ajustan a ninguno de los modelos de inhibicin estudiados y que se describirn en el prximo apartado. El inters del estudio de la inhibicin enzimtica reside ms en su utilidad para comprender la estructura, mecanismos catalticos y especificidad de los enzimas, que en una importancia biolgica real.

10.-ENZIMAS REGULADORES.
La clula es una mquina qumica que debe ser capaz de autoajustarse o regular su propio funcionamiento para no desperdiciar tiempo ni energa en realizar procesos que no le son tiles en un momento dado, siguiendo as un principio de mxima economa molecular. Este autoajuste se lleva a cabo a varios niveles entre los que destaca la regulacin de la propia actividad enzimtica. Todos los enzimas presentan propiedades que los hacen candidatos a constituir elementos reguladores del metabolismo. Estas propiedades son su sensibilidad a los cambios de pH, a la concentracin del sustrato o a la concentracin de otras sustancias accesorias que denominaremos cofactores. Sin embargo, existen una serie de enzimas que, adems de estas propiedades comunes a todos ellos, poseen otras que les confieren un papel especficamente regulador del metabolismo: son los enzimas reguladores. Existen dos tipos principales de enzimas reguladores: los enzimas alostricos y los enzimas modulados covalentemente. Ambos tipos son responsables de alteraciones en el estado metablico de las clulas en intervalos cortos de tiempo (los enzimas alostricos en cuestin de segundos, los modulados covalentemente en cuestin de minutos). 10.1.-ENZIMAS ALOSTRICOS. Los enzimas alostricos son aquellos que, adems del centro activo mediante el cual interactan con el sustrato, poseen otro centro de unin llamado centro alostrico mediante el cual interactan con otra molcula denominada efector o modulador (la palabra "alostrico" hace referencia a la existencia de ese "otro lugar"). La interaccin del modulador con el centro alostrico es tan especfica como lo es la interaccin del sustrato con el centro activo y tambin est basada en la complementariedad estructural (Figura 14.13). Los enzimas alostricos presentan pesos moleculares en general superiores a los de otros enzimas y en la mayor parte de los casos son protenas oligomricas, es decir estn formados por varias subunidades

15 (normalmente en nmero par). Los moduladores alostricos pueden ser de dos tipos: unos estimulan la actividad del enzima al unirse al centro alostrico, reciben el nombre de moduladores positivos o activadores; otros la inhiben y se llaman moduladores negativos o inhibidores. Los inhibidores alostricos no responden a ninguno de los modelos de inhibicin enzimtica estudiados en el apartado anterior.

Los enzimas alostricos presentan siempre dos formas, una activa y otra inactiva, interconvertibles por efecto del modulador (Figura 14.10). Existen dos tipos de control alostrico: el control heterotrpico que se da cuando el modulador es una molcula diferente del sustrato, y el control homotrpico que se da cuando el modulador es el propio sustrato. En ambos casos el modulador puede ser positivo o negativo. Los enzimas con control homotrpico poseen dos o ms centros de unin para el sustrato; en ellos la interconversin entre las formas activa e inactiva depende de cuntos sean los centros de unin que estn ocupados por molculas de sustrato. Un caso muy comn de regulacin del metabolismo mediante enzimas alostricos es la inhibicin por el producto final, tambin llamada retroinhibicin o control feed-back. En ella, el producto final de una ruta metablica inhibe alostricamente al enzima que cataliza la primera reaccin de dicha ruta, interrumpiendo as su propia sntesis cuando sta ya no es necesaria. Este tipo de control es muy rentable para la clula, ya que no se interrumpe solamente

16 la sntesis del producto final sino la de todos los intermediarios. Se trata de un control heterotrpico mediante un modulador negativo. Otro caso es el del sustrato de la primera reaccin de una ruta metablica que acta como activador del enzima que cataliza dicha reaccin. Se tratara aqu de un control homotrpico mediante modulador positivo. Aunque existen enzimas alostricos monovalentes, que responden a un slo modulador, la inmensa mayora son enzimas polivalentes, que poseen varios centros alostricos mediante los cuales interactan con distintos moduladores positivos y/o negativos, presentando un tipo de control mixto homotrpico-heterotrpico. 10.2.-ENZIMAS MODULADOS COVALENTEMENTE.

Los enzimas modulados covalentemente tambin presentan dos formas, una activa y otra inactiva, que son interconvertibles por modificacin covalente de sus estructuras catalizada por otros enzimas, denominados enzimas moduladores. Tal modificacin suele consistir en la adicin o eliminacin de un grupo qumico esencial para la catlisis (generalmente un grupo fosfato, metilo, adenilato u otros) de manera que el enzima modulado se activa cuando est unido a dicho grupo y se inactiva cuando ste se elimina. En la mayor parte de los casos son necesarios dos enzimas moduladores diferentes, uno que activa el enzima modulado y otro que lo inactiva. Un ejemplo clsico de modulacin covalente lo constituye el enzima glucgenofosforilasa, que acta en el metabolismo de los glcidos liberando unidades de glucosa-1fosfato a partir de las cadenas polisacardicas del glucgeno. La glucgeno-fosforilasa es activada por un enzima modulador, la fosforilasa-quinasa, que une covalentemente un grupo fosfato a un resto especfico de serina en cada una de las dos subunidades del enzima modulado. Otro enzima modulador, la fosforilasa-fosfatasa, escinde hidrolticamente dichos grupos fosfato desactivando as el enzima (Figura 14.14). La modulacin covalente tiene la ventaja de que puede utilizarse para amplificar una seal qumica, ya que una sola molcula del enzima modulador puede activar o desactivar a muchas molculas del enzima modulado, que a su vez podrn actuar o no sobre un elevado nmero de molculas de sustrato, producindose as lo que se conoce como efecto cascada. En muchos casos, los enzimas moduladores a su vez pueden activarse o desactivarse como

17 respuesta a una seal hormonal. Por ejemplo, la hormona denominada adrenalina acta sobre receptores especficos de la membrana de las clulas musculares desencadenando un proceso en el que estn implicados varios enzimas moduladores que a su vez resultan modulados covalentemente por otros enzimas moduladores de un nivel superior. El resultado final de dicho proceso es una degradacin masiva de glucgeno a glucosa-1-fosfato destinada a la produccin de energa para las clulas musculares. De este modo, una dbil seal qumica, consistente en unas pocas molculas de hormona, es amplificada en varios escalones para producir un efecto metablico de grandes proporciones. Un caso particular de este tipo de regulacin es la activacin covalente de los zimgenos. Algunos enzimas se sintetizan dentro de las clulas en formas inactivas denominadas zimgenos. Una vez secretados al exterior de la clula son activados mediante la escisin hidroltica catalizada enzimticamente de algunos pptidos de su cadena polipeptdica. Este tipo de activacin es irreversible. El ejemplo clsico de este tipo de regulacin es el de los enzimas digestivos pepsina, tripsina y quimotripsina que, con el objeto de que evitar que lleven a cabo su actividad degradativa en el interior de las clulas, se sintetizan en forma de sus respectivos zimgenos inactivos y slo se activan una vez han sido secretados al tracto digestivo.

11.-COFACTORES ENZIMTICOS.
Algunos enzimas necesitan para llevar a cabo su actividad cataltica de la concurrencia de una o ms sustancias de naturaleza no proteica que reciben el nombre de cofactores. No debe entenderse que los cofactores son sustancias que meramente potencian la actividad enzimtica sino que, en determinados enzimas, son absolutamente imprescindibles para que sta se realice. En ausencia de cofactor el enzima resulta catalticamente inactivo y recibe el nombre de apoenzima; la combinacin de apoenzima y cofactor da el holoenzima catalticamente activo. Existen dos tipos de cofactores enzimticos: los iones metlicos y los coenzimas. Los iones metlicos que actan como cofactores enzimticos son generalmente cationes mono o divalentes. Pueden actuar de varias maneras: 1) En algunos enzimas el ion metlico constituye el verdadero centro cataltico; en estos casos el ion suele presentar por s solo una cierta actividad cataltica, que se ve incrementada cuando forma parte del enzima. 2) En otros enzimas el ion metlico constituye un grupo puente para unir el sustrato al centro activo. 3) A veces el ion metlico no forma parte del centro activo sino que se encuentra en un lugar del enzima muy alejado del mismo, actuando como agente estabilizador de la conformacin nativa del enzima. Cuando el cofactor es una sustancia orgnica de naturaleza no proteica recibe el nombre de coenzima. Los coenzimas actan generalmente como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de determinados tomos o de electrones, los cuales son transferidos de una sustancia a otra en la reaccin enzimtica global. A veces los coenzimas se hallan ntimamente unidos a la molcula proteica constituyendo un verdadero grupo prosttico. En otros casos la unin es dbil y el coenzima acta en realidad como si de un sustrato ms del enzima se tratase. Cuando se analiza la estructura qumica de muchos coenzimas se comprueba que tienen formando parte de ella a alguna de las sustancias conocidas como vitaminas. Existe pues una clara relacin entre vitaminas y coenzimas.

12.- VITAMINAS.
Las vitaminas son una serie de sustancias de naturaleza qumica variada que, en

18 cantidades mnimas, son necesarias para el normal desarrollo y funcionamiento de muchos organismos. Su importancia biolgica se manifest debido a que algunos organismos no las pueden sintetizar y deben adquirirlas por tanto de procedencia exgena. Desde muy antiguo se saba que determinados alimentos tenan propiedades curativas o preventivas para determinadas enfermedades. El fraccionamiento qumico de estos alimentos condujo al aislamiento y purificacin de las sustancias responsables de este efecto preventivo, las cuales recibieron el nombre de vitaminas debido a que la primera que se identific era una amina (de "vital amina"). Pudo constatarse entonces su variada naturaleza qumica, siendo clasificadas en hidrosolubles y liposolubles segn su mayor o menor afinidad por el agua o por las sustancias lipdicas. En la actualidad est perfectamente establecida la funcin coenzimtica de la mayora de las vitaminas hidrosolubles: a excepcin de la vitamina C todas forman parte de alguno de los coenzimas conocidos. Es conveniente resaltar que, aunque existe una clara relacin entre las vitaminas hidrosolubles y los diferentes coenzimas que actan en el metabolismo, vitaminas y coenzimas no son exactamente la misma cosa; un ejemplo nos ayudar a aclararlo: el cido nicotnico es una vitamina hidrosoluble que no puede ser sintetizada por las clulas humanas. Ahora bien, dichas clulas s pueden transformar el cido nicotnico en nicotinamida, la cual, unida a otros componentes celulares, forma parte de los coenzimas NAD y NADP, que actan en el metabolismo como transportadores de electrones. Por otra parte, las vitaminas liposolubles parecen presentar funciones de naturaleza hormonal o reguladora del metabolismo que en algunos casos an no son bien comprendidas. Las necesidades exgenas de vitaminas difieren ampliamente de unas especies a otras segn stas sean capaces o no de sintetizarlas. Por ejemplo el hombre necesita 14 vitaminas de procedencia exgena, mientras que la especie bacteriana Escherichia coli slo necesita una (la biotina) pudiendo sintetizar todas las dems. Por otra parte, slo los animales superiores parecen necesitar vitaminas liposolubles de procedencia exgena.