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Aislamiento, identificación y patrones de susceptibilidad

de cepas de Candida causantes de infección sistémica en
un hospital infantil
Adriana Loza, Jesús Reséndiz, Rosa Salgado y Rosamaría Bernal

Resumen

A partir de aislamientos de muestras de pacientes hospitalizados en el Hospital Infantil de

México “Federico Gómez”, se identificaron 50 cepas de Candida causantes de infección sistémica,
de las cuales 54% corresponden a C. albicans y el resto a C. no-albicans, y entre ellas C. glabrata
es la más frecuente. La diferenciación de especie se realizó con pruebas biológicas (formación
de tubo germinativo y de clamidoconias) y bioquímicas (ID 32C®). Las pruebas de susceptibili-
dad (FUNGITEST®) mostraron que C. albicans fue sensible a 5-Fluorocitosina y Anfotercina B,
contrario a las cepas C. no-albicans que también mostraron resistencia a los azoles.

Introducción Su nivel de profundidad o sistematización no depen-

En el Hospital Infantil de México “Federico Gómez”
(HIMFG) la candidosis sistémica es una importante cau-
sa de morbilidad y mortalidad en pacientes inmuno-
comprometidos y críticamente enfermos. En estudios
multicéntricos las especies de Candida han sido la cuar-
ta causa más común de septicemias. Así mismo, el cre-
ciente uso de fármacos antifúngicos ha resultado en
el surgimiento de cepas resistentes (Pfaller et al., 1998;
Pfaller et al., 2001; Pfaller et al., 2003).
Las especies de Candida (Berkhour, 1923) son orga-
nismos eucariontes, levaduriformes, unicelulares,
asexuales, aerobios, heterótrofos; muy versátiles
debido a su dualidad para sobrevivir como comen-
sales en varios sitios anatómicos (tracto gastrointes-
tinal, genitourinario y regiones mucocutáneas), y a
su capacidad oportunista para volverse patógenos
y causar desde leves infecciones cutáneas, hasta
sistémicas fatales, debido a la presencia de factores
de riesgo en el hospedero (Calderone y Fonzi, 2001;
Haynes, 2001; Odds, 1988).
Menos del 10% de las 150 especies de Candida que
han sido identificadas son de importancia médica,
entre ellas se encuentran: C. albicans, C. parapsilosis,
C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guillierrmondii,
C. dubliniensis, C. lusitaniae, C. kefyr, C. norvegensis
y C. rugosa (Schauer y Hanschke, 1999).
La candidosis sistémica es una micosis oportunista
causada por diversas especies del género Candida sp.
de tanto del agente etiológico en sí, sino del factor
de riesgo con el que se asocie (Bonifaz, 2000). En
pacientes neonatos y pediátricos, los factores de opor-
tunismo incluyen prematurez, desnutrición, trata-
miento prolongado con antibióticos de amplio es-
pectro y con corticoesteroides, nutrición parenteral,
diálisis, cateterización e intubación, alteraciones
inmumológicas originadas por quimioterapias
(neutropenia), transplantes e infecciones por tuber-
culosis o Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
(Anker, Popele y Sauer, 1995).
Un cultivo positivo no indica una candidosis, pues
Candida es parte de la microbiota. Es necesario
correlacionar los aspectos clínicos y micológicos para
llegar al diagnóstico (Bonifaz, 2000).
Rutinariamente, en el Laboratorio de Parasitología y
Micología del HIMFG se realizan pruebas biológicas
para llevar a cabo la identificación diferencial de
C. albicans. La formación de tubos germinativos es
una prueba simple y económica, considerada un mé-
todo de referencia. Se realiza en suero humano o
sueros con glucosa o sales de amonio. Aproximada-
mente, 5% de los aislamientos de C. albicans dan
tubos germinativos negativos y, así mismo, se pue-
den obtener resultados falso-positivos en algunas es-
pecies, como C. dubliniensis, C. tropicalis, C. glabrata y
C. parapsilosis (Hoppe y Frey, 1999; Odds, 1988). La
formación de clamidoconidias se lleva a cabo en me-
dios pobres y tensos, con una baja concentración de
glucosa, como harina de arroz, harina de maíz o papa-

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zanahoria agar, a los que se les agrega un tensoactivo.
Se observan clamidoconidias terminales o intercalares
que miden 10-12 µm de diámetro, con una doble
membrana, producidas in vitro por C. albicans y
C. dubliniensis; esta última presenta una producción
más abundante (Mosca et al., 2003). Todas las demás
especies presentan pseudomicelios largos, ramifica-
dos, con cúmulos de blastoconidias (Bonifaz, 2000;
Odds, 1988).
La identificación específica de las especias causan-
tes de candidosis sistémica es necesaria e importan-
te debido al aumento en la frecuencia de cepas C.
no-albicans. Las pruebas bioquímicas se basan en la
asimilación (auxonograma: utilización) y fermenta-
ción (zimograma: producción de gas) de carbohidra-
tos. Existe un perfil bioquímico que identifica a cada
una de las especies de Candida (Bonifaz, 2000). Ac-
tualmente, se han desarrollado pruebas comercia-
les que permiten identificar la mayoría de los hon-
gos levaduriformes (Buchaille, Freydiere, Guinet y
Gille, 1998; Ramani et al., 1998).
En el HIMFG rutinariamente no se realizan ensayos
de susceptibilidad antifúngica de aislamientos clíni-
cos de Candida.
El objetivo de este trabajo consiste en aislar e iden-
tificar las cepas de Candida causantes de infección
sistémica y evaluar sus patrones de susceptibilidad.
Con base en esta información, se estudiará la distri-
bución de especies, su asociación con el producto
biológico de origen, el padecimiento del paciente y
su sexo. Así mismo, se analizará la presencia de re-
sistencia a los antifúngicos disponibles.
Metodología
Las cepas, aisladas durante el periodo 2001-2003, se
tomaron de muestras biológicas provenientes de
niños hospitalizados en el HIMFG, cuyos exámenes
directos mostraron blastoconidias y/o pseudomice-
lios (formas invasivas). Las muestras fueron proce-
sadas en el Laboratorio de Parasitología y Micología
del HIMFG y en el Laboratorio de la Licenciatura en
Químico Farmacéutico Biólogo de la Universidad
Simón Bolívar (USB).
Para el examen directo, la muestra biológica se colo-
có entre porta y cubreobjetos con un agente aclarante
(KOH a 20%), la preparación se calentó al mechero y
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se observó al microscopio. A 40x las blastoconidias se
aprecian como células ovales o esféricas de 1-6 µm
de diámetro. Los pseudomicelios forman estructu-
ras alargadas, septadas de 1-2 µm de diámetro y de
8-15 µm de longitud. En el caso de C. glabrata, sólo
se observaron abundantes blastoconidias, las cuales
son más pequeñas (1-4 µm) que las de C. albicans
(1-6 µm) (Fidel, Vázquez y Sobel, 1999).
El aislamiento primario a partir de las muestras bio-
lógicas se realizó en agar Sabouraud, y para las
muestras de sangre se empleó el medio bifásico tipo
Ruiz Castañeda. Las cajas Petri y los hemocultivos se
incubaron a 37 oC . El crecimiento se detecta de 24 a
72 horas. Las características de las colonias en los
medios fueron similares: blanco amarillentas, húme-
das, limitadas y opacas.
La formación de tubos germinativos se llevó a cabo
en suero humano, el cual se inoculó con la cepa a
investigar y se incubó a 37 oC durante 3-31/2 hs. Se
realizó un examen en fresco a 40x, donde se observa-
ron estructuras filamentosas producidas por C. albicans
de aproximadamente 5-15 µm de largo, que parten
de las blastoconidias.
La formación de clamidoconidias se realizó en agar
harina de arroz con Tween 80 a 1%. El medio se
inoculó por estría cruzada con la cepa a investigar
y se incubó a 25 oC durante 48-72 hs. Se observa-
ron a 40x estructuras celulares refráctiles, termina-
les o intercalares de entre 10 y 12 µm de diámetro,
con una doble membrana, producidas in vitro por
C. albicans y C. dubliniensis (Bonifaz, 2000; Odds,
1988).
Para la identificación de especie mediante pruebas
bioquímicas, se utilizó el equipo comercial ID 32C®
(bioMérieux), el cual consta de una microplaca con
32 pozos que contienen los sustratos deshidratados
para 29 pruebas de asimilación (carbohidratos, áci-
dos orgánicos y aminoácidos); una prueba de sus-
ceptibilidad (cicloheximida); una prueba clorimétrica
(esculina), y un control negativo. Los pozos se ino-
cularon con la cepa a investigar, la cual creció única-
mente cuando fue capaz de metabolizar el sustrato
correspondiente. Las microplacas fueron examina-
das para determinar si el crecimiento fue positivo,
basándose en la presencia de turbidez en los pozos
(Ramani et al., 1998).
El equipo comercial FUNGITEST® (Bio-Rad) se em-
pleó para determinar los patrones de susceptibili
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dad a seis antifúngicos a dos concentraciones diferentes: Anfotercina B (2 y 8µg/ml); 5-Fluorocitosina (2 y 32

µg/ml); Miconazol (0.5 y 8 µg/ml); Fluconazol (8 y 64 µg/ml); Itraconazol y Ketoconazol (0.5 y 4 µg/ml).

Este equipo permite catalogar a la cepa como sensible, resistente o con sensibilidad intermedia al antifúngico.
Consiste en una microplaca con 16 pozos: dos controles negativos, dos controles positivos de crecimiento y 12
pozos que contienen los antifúngicos deshidratados. Los pozos fueron reconstituidos por la adición del inóculo
en medio RPMI 1640 amortiguado, con un indicador redox (azul de alomar). La estimación del crecimiento se
basó en la reducción del indicador, que torna el medio de azul a rosa. Cuando el crecimiento de la levadura
fue inhibido por el agente antifúngico, el medio permaneció azul (Davey et al., 1998).

Resultados

Durante el periodo de estudio se obtuvieron 120 aislamientos clínicos de Candida. Hasta el momento se han
analizado 50 cepas, correspondientes a 42 pacientes –25 masculinos (60%) y 17 femeninos (40%)–, en los
cuales los factores asociados fueron inmunocompromiso (36%) –transplantes, lupus eritematoso sistémico,
hepatitis autoinmune, enfermedad granulomatosa crónica y neoplasias–; infección (32%) –sepsis, síndrome
urémico hemolítico, varicela, neumonía, celulitis, neuroinfección, infección de vías urinarias por Pseudomonas sp.
y tuberculosis peritoneal–, y otras patologías (32%) –síndrome nefrótico, tratamiento con antibióticos, síndro-
me de abdomen en “ciruela pasa”, quirúrgicos y recién nacido pretérmino.

Las cepas se aislaron de distintos productos biológicos: orina (74%, n=37); sangre (8%, n=4); tejidos (4%, n=2)
(biopsias de páncreas, pulmón); broncoaspirados (4%, n=2), y secreciones de otros sitios anatómicos normal-
mente estériles (10%, n=5) (líquidos peritoneal, biliar, de ventriculostomía, secreción de herida quirúrgica).
Los exámenes directos de las muestras analizadas mostraron abundantes blastoconidias y/o pseudomicelios
(Figura 1).

Figura 1. Examen directo

A 40x se observan abundantes blastoconidias y pseudomicelios.

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A partir de las cepas aisladas en los medios de cultivo, se aplicaron las pruebas biológicas para la identificación
diferencial de C. albicans (formación de tubo germinativo y clamidoconidias) (Figura 2).

Figura 2. Identificación por pruebas biológicas de C. albicans

2a

En 2a (40x) se observan las clamidoconidias producidas in vitro por C. albicans en agar harina de arroz con Tween 80 a 1%. En 2b (40x) se
aprecian los tubos germinativos formados en suero humano por C. albicans.

Mediante una tabla de 2X2 se comparó la presencia de clamidoconidias con el tubo germinativo, para calcular
sensibilidad (83.3%), especificidad (100%) y valores predictivos: positivo (100%) y negativo (80%). Ocurrieron
dos falsos negativos para la clamidoconidia y el tubo germinativo (C. tropicalis [n=2]; C. parapsilosis [n=1]).

Se empleó el ID 32C® para identificar las siguientes especies: C. albicans (54%, n=27); C. glabrata (16%, n=8);
C. tropicalis (14%, n=7); C. parapsilosis (8%, n=4); C. lusitaniae (6%, n=3), y C. norvegensis (2%, n=1), y se
correlacionaron con el producto biológico de origen (Figura 3).

Figura 3. Procedencia biológica de las cepas

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Las pruebas de susceptibilidad mostraron los siguientes datos: 100% de cepas C. albicans fue sensible a:
5-Fluorocitosina y Anfotericina B, 88% a Miconazol y Ketoconazol, 96% a Itraconazol y 98% a Fluconazol
(Figura 4); y 95% de las cepas Candida sp. fue sensible a Anfotericina B, 13% mostró sensibilidad intermedia a
5-Fluorocitosina. Se encontró resistencia a Miconazol, Itraconazol y Fluconazol en C. glabrata, C. tropicalis y
C. parapsilosis, así como a Ketoconazol en C. glabrata (Figura 5).

Figura 4. Porcentaje de susceptibilidad de las cepas C. albicans

Sensible
% de susceptibilidad

Sensibilidad
intermedia

Resistente

Antifúngicos

5-Fluorocitosina (5-FC); Anfotericina B (Anf); Miconazol (Mic); Ketoconazol (Ket); Itraconazol (Itra), y Fluconazol (Flu).

Figura 5. Porcentaje de susceptibilidad de las cepas C. no-albicans

Sensible
% de susceptibilidad

Sensibilidad
intermedia

Resistente

Antifúngicos

5-Fluorocitosina (5-FC); Anfotericina B (Anf); Miconazol (Mic); Ketoconazol (Ket); Itraconazol (Itra), y Fluconazol (Flu).

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Discusión
Hasta el momento se han aislado 120 cepas de
Candida sp. causantes de infección sistémica, de las
cuales sólo 50 –cuyos patrones de susceptibilidad
conocemos– han sido identificadas específicamente.
Estas 50 cepas se obtuvieron de muestras biológi-
cas, cuyos exámenes directos mostraron blastoconi-
dias y pseudomicelios, que son la forma invasiva, a
excepción de C. glabrata que es la única especie no
dimórfica, pues no genera pseudomicelios y, por lo
tanto, en su forma comensal y patógena es encon-
trada como blastoconidia.
En los pacientes masculinos, C. albicans (56%) y C.
glabrata (13%) fueron las especie más aisladas, y en
los femeninos, C. albicans (50%) y C. tropicalis (25%).
En los pacientes con inmunocompromiso, los que
padecen neoplasias (38%) fueron los más frecuen-
tes; en los pacientes con otros hallazgos, los postope-
rados (62%) fueron los más comunes, y en los pa-
cientes infectados, el padecimiento más observado
fue sepsis (37%).
En los pacientes inmunocomprometidos se identifi-
caron C. albicans (39%) y C. glabrata (33%); en los
niños con otras patologías se aislaron C. tropicalis
(19%) y C. albicans (68%), y en los pacientes infec-
tados, C. albicans (50%) y C. lusitaniae (19%).
Más de 50% de las candidemias y candidurias se
debieron a C. albicans, esto es similar a lo reporta-
do por el programa de vigilancia antimicrobiana
SENTRY (Pfaller et al., 2001). En muestras de orina y
de líquido de ventriculostomía se aisló C. lusitaniae de
pacientes infectados primariamente con varicela y por
N. meningitidis. Así mismo, se encontró C. norvegensis
en la sangre de un paciente con inmunocompromiso.
La formación de clamidoconidias en agar harina de
arroz tuvo una alta especificidad y valor predictivo
positivo, todas las cepas positivas, al ser identifica-
das mediante el ID 32C®, correspondieron a C.
albicans. Los falsos negativos obtenidos se atribu-
yen a cepas que fueron mantenidas en subcultivos
por periodos prolongados, por lo que perdieron la
capacidad de formar clamidoconidias; sin embargo,
la prueba de formación de tubos germinativos fue
positiva. Como está reportado (Hoppe y Frey, 1999;
Odds, 1988), se obtuvieron falsos positivos con C.
tropicalis y C. parapsilosis, que también formaron
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tubos germinativos. El 100% de cepas C. albicans
dio tubo germinativo positivo.
C. glabrata (16%) fue la especie no-albicans más fre-
cuente, similar a lo encontrado por Pfaller y sus co-
laboradores en el 2003 durante el programa global
ARTEMIS.
Entre las distintas especies, más de 80% de las cepas
C. albicans resultaron ser sensibles a los seis anti-
fúngicos probados. C. glabrata mostró resistencia a
los azoles, y C. tropicalis (14%), C. lusitaniae (33%) y
C. norvegensis (100%) presentaron sensibilidad in-
termedia a la 5-Fluorocitosina. C. lusitaniae (33%) fue
la única especie que presentó sensibilidad interme-
dia a la Anfotericina B, todas las demás especies fue-
ron sensibles. C. tropicalis (43%) y C. parapsilosis
(50%) mostraron resistencia al Miconazol.
Conclusiones
La observación de blastoconidias y pseudomicelios
en el examen directo de los productos biológicos
pronostica 100% la candidosis.
La formación de clamidoconidias es una prueba con
alto valor predictivo positivo y tiene la ventaja de ser
mucho más económica que las pruebas bioquímicas,
sin embargo, solamente permite la diferenciación
entre C. albicans y C. no-albicans.
C. albicans es la especie dominante en pacientes con
factores de riesgo, como inmunocompromiso, infec-
ciones y otras patologías. Así mismo, C. albicans pue-
de aislarse de varios productos biológicos (orina,
sangre, tejidos y secreciones).
Durante los últimos años, en el Hospital Infantil de
México “Federico Gómez”, ha habido un aumento
en la frecuencia de candidosis sistémicas causadas
por especies C. no-albicans.
Las especies C. no-albicans presentan una mayor re-
sistencia a los azoles comúnmente utilizados en la
práctica clínica, lo que podría determinar una tera-
pia inadecuada y el deterioro del paciente.
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