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Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec Ingeniera Bioqumica.


Bioqumica I Reporte de Laboratorio.

DETERMINACION CUANTITATIVA DE AZUCARES


RESUMEN
Los azcares reductores poseer un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal que le confiere la caracterstica de poder reaccionar con otros compuestos. La determinacin de estos azcares se realiz con el objeto de obtener una curva de calibracin aplicando la tcnica de Miller o DNS (cido dinitrosaliclico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azcares reductores dando resultados colorimtricos que se pueden medir con una longitud de onda de 575nm. ABSTRACT Reducing sugars have a free carbonyl group forming a hemiacetal group that gives the feature of being able to react with other compounds. The determination of the sugars was carried out with the aim of obtaining a calibration curve using the technique of Miller DNS (dinitrosalicylic acid) reagent having the ability to oxidize the reducing sugars resulting colorimetric results that can be measured with a length of 575nm wavelength. INTRUDCCION Los carbohidratos son molculas formadas por carbono, hidrogeno y oxgeno. Todos los carbohidratos son azucares pequeos, solubles en agua (glucosa y fructosa, por ejemplo) o bien cadenas, como el almidn y

la celulosa, que se elaboran enlazando subunidades de azcar. Los monosacridos se clasifican en aldosas si tienen grupo aldehdo y cetosas si tienen un grupo cetona. Todos los monosacridos, aldosas o cetosas y la mayora de los disacridos son azucares reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anomricos no est formando enlace glucosdico. (Berg, Stryer, & Tymoczko, 2008) Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo para reconocer azucares que pueden existir como aldehdo o cetona libre. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma inespecfica a otras molculas; los que no lo hacen, azucares no reductores. (Armstrong & Bennet, 1982)

En la cuantificacin de sacarosa se utilizan mtodos analticos basados en una curva de calibracin en la que una cantidad medida y se relaciona en proporcin directa a la concentracin conocida x de una serie de patrones. La elaboracin de estas curvas de calibracin tiene por objeto fundamental determinar la concentracin en este caso la sacarosa. Se utilizara el mtodo de interpolacin para llevar a cabo la curva de calibracin. Se utilizara el mtodo colorimtrico que utilizara el cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

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por que reacciona con sacarosa tras la hidrolisis con HCL pero el DNS solo reacciona con los azucares reductores, para esta se har su hidrolisis. OBJETIVO Consiste en utilizar la tcnica de espectrofotometra para la elaboracin de una recta patrn de sacarosa a partir de concentraciones conocidas de este disacrido. Mediante interpolacin esta recta permite determinar la concentracin de sacarosa de muestras. Se utilizara un mtodo colorimtrico que utiliza el DNS para que reaccione con la sacarosa tras su hidrolisis qumica con HCL.

En el esquema siguiente se muestran cmo se construye una curva de calibracin y cules son sus componentes. La ordenada a (la variable dependiente) es el are bajo la seal mxima en este ejemplo de isoctano, y la abscisa (la variable independiente)

MARCO TEORICO DNS: El cido 3,5 dinitrosalicilico, se utiliza como mtodo colormetro para hacer reaccionar la sacarosa tras su hidrolisis qumica de polisacridos presentes en una muestra con HCL. El DNS reacciona nicamente con los azucares reductores, como la sacarosa es un disacrido no reductor; tras su hidrolisis en un medio acido se libera glucosa y fructosa que si son azucares reductores, y as reacciona con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por mtodos Espectrofotmetro es proporcional a la concentracin de la sacarosa. CURVA DE CALIBRACION

representa el porcentaje de moles de isoctano. Sin embargo se observa que no todos los datos caen exactamente en la recta, la cual se debe a errores aleatorios en el proceso de medicin.

Ejemplo de una curva de calibracin construida para determinar glucosa en una muestra de hidrocarburos. LEY DE LAMBERT Y BEER La ley de absorcin tambin llamada ley Lambert y Beer indica cuantitativamente la forma en el que el grado de atenuacin depende de la concentracin de las molculas absorbentes y de la longitud del trayecto en que ocurre la absorcin en el que la luz atraviesa un medio contiene un analito absorbente disminuye su intensidad como consecuencia de la excitacin del analito. Cuando ms largo sea el medio por el que

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pasa la luz (longitud del trayecto de la luz ) , en el caso de una solucin del analito de concentracin dada, extraen ms molculas o tomos absorbentes en el trayecto (dado la luz) por tanto mayor sea la atenuacin. Adems para una longitud de trayecto dado de la luz cuanto mayor sea la concentracin de los tomos o molculas adsorbentes y de la longitud de trayecto en que ocurre la absorcin. En la siguiente figura se muestra la ilustracin de un haz de (reaccin) radiacin monocromtica a su paso por la solucin absorbente con un graso de bcm y concentracin de mol/L. Debido a las interacciones de los fotones con las partculas adsorbentes, la fuerza radiante del haz se reduce de P0 a P1. Solucin absorbente de concentracin.

Los mtodos espectrofotomtricos permiten calcular la intensidad de radiacin (luz con una longitud de onda determinada) emitida o absorbida por una sustancia. La cuantificacin se realizara aplicando la ley de Lambert-Beer. A= E * C * I Dnde: A= absorbancia espectrofotmetro medida en el

E= coeficiente absorcin molar a una determinada longitud de onda de una disolucin 1, cuando el paso ptico es de 1cm. Se expresa en M 1 , cm
1

C= concentraciones en (M) mol/L misma unidad de E)

(en la

I= Paso ptico (espesor del tubo que contiene la disolucin en cm.), en las celdas estndar que se utilizan para hacer las medidas es de 1cm. SACAROSA La sacarosa, es el disacrido ms abundante, est formado por la unin de una -Dglucosa y una -D-fructosa a travs de un enlace (1,2) Atenuacin de un haz de redaccin por una solucin adsorbente. La flecha gruesa es la energa radiante, es mayor a la que transmite la solucin. La longitud de trayecto que atraviesa el rayo en una solucin es b y la concentracin es c.

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En la sacarosa, el enlace glucosidico est formado por la unin de dos carbonos anomerico de cada monosacrido, por lo tanto, la azcar es un azcar no reductor.

La sacarosa se descompone en fructosa y glucosa al contacto con el agua.

C12 H 22 O11 H 2 O C 6 H 2 O6 C 6 H 2 O6
Grafica de la concentracin de sacarosa con respecto al tiempo. Para la determinacin de azucares reductores se emplea el mtodo colorimtrico de DNS. Este mtodo se basa en que los azucares reductores, reaccionan con el DNS reducindolo bajo ciertas condiciones y genera un color rojizo amarillo.

AZUCAR NO REDUCTOR Monosacrido que puede ceder electrones a otras molculas y pueden por tanto actuar como agente reductor. La presencia de un grupo cetonico ( -CO-) o aldehdo (-CHO) libre permite actuar como azcar reductor. AZUCAR REDUCTOR Azucares que son capaces de ceder electrones a otras molculas y, por tanto, no puede actuar como agente reductor. La sacarosa es el azcar ms comn, la unin entre las unidades glucosa y fructosa en las que estn involucrados grupos aldehdos y cetonas es responsable de la incapacidad de

la sacarosa para actuar como azcar reductor. HIDROLISIS QUIMICA DE LA SACAROSA

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Mtodo DNS
TUBO

Tomar 1 ml de solucin acuosa de la muestra Adicionar 1 ml del reactivo DNS Calentar por 5min. En bao de agua hirviente Enfriar y diluir con 10 ml de agua destilada Leer la absorbancia del color producido a 540 nm frente a un blanco de reactivos Agua tratada igual que la muestra Cuantificar los azucares reductores interpolando los valores de la absorbancia obtenidos en una curva estndar en concentraciones de 0.0 a 1 mg/ml.

mL de sol patrn de glucosa

mL de agua destilada

Volumen Total

Concentracin (mg/L)

0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Reactivo DNS

Tabla 1. Se muestra el volumen de solucin patrn y agua destilada aadidos a cada tubo, as como la concentracin final de cada uno.

DETERMINACIN DE LA LONGITUD DE ONDA DE ABSORCIN DEL PRODUCTO DE REDUCCIN DEL DNS Se disolvieron 2.5g de DNS, 2.5g de NaOH, 0.125g de Na2SO4 y 0.5g de C6H6O en 200mL de agua destilada. Se afor a 250mL con agua destilada, y la solucin se en un frasco mbar previamente etiquetado. La longitud de onda de absorcin del producto de la reduccin de la glucosa con el DNS, se realiz desde una longitud de onda de 500 a 700 nm. La longitud de onda de mayor absorcin del producto fue obtenida por interpolacin de la curva obtenida del espectro de absorcin complejo, que dio como resultado 570 nm. Esta longitud de onda es la empleada para la lectura de las

Solucin patrn de glucosa

Se prepar una solucin de glucosa con una concentracin de 1.0g/L, para lo cual se disolvi 0.1g de glucosa en 90mL de agua destilada, y se afor a 100mL.

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dems soluciones patrn de glucosa a diferentes coordenadas. CURVA DE CALIBRACIN PARA PATRONE DE GLUCOSA PARA EL METODO DE DNS La curva de calibracin obtenida para el mtodo de cuantificacin de GLUCOSA por el mtodo de DNS, presenta una tendencia lineal donde se aplica a la ley de beer que representa la relacin entre la absorbancia y la concentracin del complejo obtenido por la reduccin de la glucosa con el DNS directamente proporcional.

Tabla 2. Se muestran las absorbancias medidas a una longitud de onda de 575nm, as como el promedio de las tres.

Media ( )

Desviacin ( Estndar )

Dnde: N= nmero de valores y= Abs 575nm Dnde: N= nmero de valores = Abs 575nm = media

Resultados En la Tabla 2 se reportan las absorbancias obtenidas de las tres muestras. Utilizando las formulas Tabla 3 se obtuvieron la media (Y) de cada duplicado y la desviacin estndar. Se muestra tambin la curva patrn obtenida y ajustada con regresin lineal, as como la ecuacin de la curva. Tubo Concentracin
(mg/L) Abs. A Abs. B Abs. C Promedio De Abs

Tabla 3. Se enlistan las frmulas utilizadas para el clculo del promedio y la desviacin estndar.

0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

0 0.021 0.023 0.065 0.105 0.153 0.264 0.347 0.396 0.430 0.497

0 0.025 0.038 0.084 0.101 0.149 0.242 0.307 0.393 0.400 0.450

0 0.033 0.029 0.067 0.112 0.137 0.258 0.298 0.387 0.420 0.470

0 0.026 0.030 0.072 0.106 0.146 0.255 0.317 0.392 0.417 0.472

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Curva patron dela glucosa


0.5 0.4 Absorbancia (570 nm) 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1 200 400 600 Concentracion (mg/L) 800 1000 1200

Grfico 1. Se muestra la curva patrn obtenida de glucosa. Se grafica la concentracin en miligramos por litro contra el promedio obtenido de las absorbancias de las tres muestras. Se observa la ecuacin dada por la regresin lineal.

COCLUCIONES

presentes en una muestra, seguido de la determinacin espectrofotomtrica a 540nm de los azcares reductores. As comprobamos tambin que la espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms adecuado para la determinacin de una concentracin en una muestra. Dicho de otro modo es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia en este caso la glucosa

Con esta prctica pudimos determinar de manera cuantitativa la concentracin de azucares en determinadas muestras con concentraciones conocidas para poder obtener un curva patrn de la absorbancia en la muestra y nuestras concentraciones u/o diluciones. Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo para reconocer azucares que pueden existir como aldehdo o cetona libre. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma inespecfica a otras molculas; los que no lo hacen, azucares no reductores. El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cido dinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos

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Skoog, F.J. Holler y S.R. Crouch. Principios de Anlisis Instrumental 6 ed.Cengage, 2008