Un Escherichia coli sinttico ecosistema depredador-presa impact factor of 8.

626 Desde su reciente aparicin, la biologa sinttica ha mostrado gran potencial para la generacin de sistemas tiles en la prctica mientras que sirve como una aproximacin a la decodificacin biolgica principios de diseo. Un desafo clave en esta rea es identificar general las estrategias escalables que permitan la construccin de circuitos cada vez ms complejos de genes con rendimiento fiable, as como para desarrollar nuevas plataformas tecnologicas para la caracterizacin de un circuito cuantitativo. El ecosistema depredador-presa sirve como un excelente modelo para este desafo. Como un componente esencial de la dinmica ecolgica, el natural sistema depredador-presa ha sido analizado ampliamente por modelado y experimentos. En comparacin con otros tipos de interacciones ecolgicas (por ejemplo, mutualismo y competencia), la depredacin a menudo genera dinmicas ms ricas y, como tal, representa un desafo mayor para ingeniera de novo. En este estudio, hemos construido circuitos de gen sinttico que convierten dos poblaciones de Escherichia coli en un sistema sinttico depredadorpresa. A largo plazo, la cuantificacin de la dinmica del sistema, que requiri una versin mejorada (Figura S1) del recientemente desarrollado microchemostat (Balagadde et al, 2005), valid la funcin diseada. Adems de la superacin de los lmites de la programacin y caracterizacin de las complejas dinmicas celulares, nuestro sistema puede servir como un sistema modelo para abordar las cuestiones derivadas de su contrapartes naturales.

Resultados y discusin Como se muestra en el Cuadro 1A, dos poblaciones de E. coli ('Depredador' y 'Presa') se comunican y regulan la densidad de los dems a travs de la percepcin de qurum sensing (QS), un mecanismo por el cual muchos bacterias transmiten y responden a los cambios en su densidad de poblacin local (Camilli y Bassler, 2006). Dos mdulos QS, LuxI / LuxR de Vibrio fischeri y LasI/ LasR de Pseudomonas aeruginosa, se utilizaron para habilitar dos vas de comunicacin entre el depredador y las poblaciones de presas. Cuando la densidad de presas es bajo, las clulas predadoras mueren debido a la expresin constitutiva de un gen suicida (ccdB). En las clulas de presa un acil-homoserina lactona (AHL), 3OC6HSL, es sintetizada por LuxI. A medida que aumenta la densidad de presas, 3OC6HSL se acumula en el cultivo y, a concentraciones suficientemente altas, es obligado por el regulador transcripcional LuxR en el depredador las clulas que conducen a una mayor expresin de un gen de antdoto (CCDA) para rescatar los depredadores. Las clulas depredadores a su vez producen otro AHL 3OC12HSL , por LasI que penetra en la presa las clulas donde se vinculados por LasR, que activa la expresin de el gen ccdB asesino induciendo, 'depredacin.' Este sistema satisface la definicin ms amplia de la depredacin de los ecosistemas de dos especies, donde una especie (presa) sufre del crecimiento de la segunda (depredador) y los beneficios anteriores a partir del crecimiento de la primera (Taylor, 1984). Sin embargo, se diferencia del cannico sistema depredador-presa en dos aspectos. En primer lugar, de actuar como una fuente de alimento, la presa proporciona un 'antdoto' a muerte programada del depredador. En segundo lugar, existe una competencia entre el depredador y la presa por nutrientes en un co-cultivo, que es generalmente ausente en sistemas naturales depredador-presa.

Recuadro 1 Un ecosistema sinttico depredador-presa. (A) El sistema consta de dos tipos de bacterias manipuladas de controlando cada uno supervivencia y la muerte a travs de dos diferentes seales de QS. Cajas exteriores representan las paredes celulares. Las flechas representan la activacin o la produccin; flechas romas representan la inhibicin o muerte. CcdB ('B') se controlado por Plac/ara-1 en el depredador y la presa en PluxI. CCDA ('A') es controlado por PluxI. El sistema de lux se muestra en azul y el sistema de LAS de color verde. Los genes en el QS depredador son controlados por PLtetO-1, y los de la presa por Plac/ara-1. Los crculos negros representan 3OC6HSL y diamantes rellenos representan 3OC12HSL. La interaccion presa-depredador es activada por IPTG. Vase el texto principal y la informacin complementaria para obtener ms detalles. (B) Analisis de bifurcacin del modelo en trminos de la muerte constante dc(dc1 (depredador) =dc2 (presa)) y la tasa de crecimiento kc (= kc1 (depredador) = kc2 (presa)) (panel izquierdo). La construccin del modelo se describe en las ecuaciones S14-S17. Una lnea que une los puntos de bifurcacin de Hopf delimita tres regiones: (i) la dominacin presa, (ii) la oscilacin depredador-presa y (iii) la dominacin depredador. Dinmicas tpicas de poblacin para los conjuntos de parmetros especficos se ilustran para cada regin (panel derecho).

Empleamos ecuaciones diferenciales ordinarias para modelar el principal eventos cintica durante el funcionamiento de este circuito (vase Informacin complementaria y Figura S5 para ms detalles). El modelo predice la extincin, la convivencia o la dinmica oscilatoria (Recuadro 1B) dependiendo de lasvelociades de crecimiento celular, la muerte celular controlado por AHL, as como la produccin y degradacin de los AHL. De acuerdo con el anlisis de bifurcacin (recuadro 1b, panel izquierdo), cuanto mayor sea la matanza CcdB constante de velocidad (DC1), ms alta la probabilidad de un comportamiento oscilatorio robusto: el aumento de dc1 ampla significativamente la regin de parmetro que da lugar a la oscilacin (regin obligado por los loci de puntos bifurcacin de Hopf). Nuestros experimentos indican que la original LacZ-CcdB protena de fusin, que fue utilizado en nuestro el circuito de control (You et al, 2004), pueden carecer de la necesaria toxicidad (datos no mostrados). Para superar esta limitacin, nosotros construimos un nuevo LacZ- CcdB protena mediante la supresin de 32 aminocidos en LacZ, lo que result en un aumento de ocho veces en potencia en comparacin con la protena de longitud completa (Suplementario Figura S2). La protena de fusin LacZ-CcdB se denomina 'CcdB "en este documento. Se ha demostrado anteriormente que tanto LasR activa y activa LuxR pueden iniciar la expresin de genes en el promotor luxI (PluxI) (Gray et al, 1994) (Figura S3).Por lo tanto, PluxI fue utilizado para accionar tanto el gen de la CCDA en las clulas de depredadores (Regulada por LuxR) y el gen ccdB en las clulas presa (Regulado por LasR).

Para acelerar el rescate de los depredadores por su seal de supervivencia (3OC6HSL), el correspondiente sistema de QS fue coloca bajo el control del promotor PLtetO-1 (Lutz y Bujard, 1997), que es constitutivamente activa en las cepa E. coli MG1655. Esta estrategia simultneamente acelera la sntesis 3OC12HSL y as mata a la presa. Para asegurar suficiente de matanza del depredador, hemos implementado los circuitos de induccin CCDB en un alto nmero de copias del plsmido (p15A origen de replicacin con un nmero de copias de ~20 por clula). Este ecosistema sinttico es activado por isopropil--D-tiogalactopiransido (IPTG), que induce la expresin ccdB en el depredador y el sistema QS de la presa. Para optimizar los niveles de expresin de protenas y sincronizar la temporizacin de los componentes del circuito, hemos probado muchas combinaciones de promotores, orgenes de replicacin y las cepas huespedes bacterianas, y redujo nuestra atencin a una configuracin (Figura complementario S4A). Salvo que se indique de lo contrario, el circuito de depredador se implement en la cepa MG1655 de E. coli, el circuito de la presa en el Top10F0. Finalmente, una desestabilizado gen de la protena verde fluorescente (GFPuv-LVA) fue introducido en el depredador (Suplementario figura S4A) para capturar los cambios dinmicos y diferenciar el depredador de las poblaciones de clulas presa en cultivos mixtos.

Figura 1 comportamientos individuales de crecimiento (sin interaccin) de (A) depredador y (B) clulas de presa en medios lquidos. Para cada condicin, 6 ml de medio que contiene LBK cloranfenicol y kanamicina se inocul con una sola colonia bacteriana y se dividi en tres cultivos de 2ml: 'Off' cultivos no contena inductores, "+IPTG" cultivos contenian 1 mM IPTG y '+IPTG+AHL "contenia 1mM IPTG y 100 nM AHL, respectivamente. Despus de 20 h de incubacin (barras grises), las densidades pticas (OD) de estos cultivos se midieron con un lector de microplacas (ver informacin complementaria). Las barras de error representan la desviacin estndar de cultivos por triplicado.

Se verific la funcin bsica de cada poblacin independientemente usando IPTG y la AHL correspondiente suministrada exgena (Figura 1). En el cultivo que no contiene ni APAGADO IPTG ni 3OC6HSL, las clulas depredadores crecieron a un nivel relativamente alto la densidad en medio LBK (Figura 1A). El crecimiento fue significativamente inhibido en el cultivo que contenia 1 mM de IPTG, que plenamente indujo la expresin ccdB. Sin embargo, las clulas de los depredadores indujeron con IPTG fueron rescatados por 3OC6HSL (100 nM), que cuando obligado por LuxR puede iniciar la expresin CCDA. Depredadores rescatados (con IPTG y 3OC6HSL) crecieron ligeramente ms lento que los de la condicin OFF (Figura 1A), posiblemente debido a la carga metablica implicada en la expresin de los componentes del circuito, neutralizacin incompleta de CcdB por CCDA, o ambos. Como se muestra en la Figura 1B, las clulas de presa son capaces de crecer en la posicin OFF cultivo (sin inductores), as como un medio que contiene slo IPTG pero falleci cuando ambos IPTG y 3OC12HSL estaban presentes. Un aparato para el continuo cultivo de microorganismos en un estado estacionario La poblacin de presas IPTG inducida creci ms lento en comparacin con la del cultivo OFF. Este menor crecimiento de retraso podra ser un resultado de la carga metablica del componentes del circuito, la expresin basal nivel CcdB debido a diafona entre 3OC6HSL y LasR, o ambos.

Este sistema sinttico depredador-presa representa uno de los circuitos sintticos ms complicados reportado hasta la fecha. A largo plazo la caracterizacin de tales circuitos, es esencial para la verificacin de la dinmica de diseado, presenta una mayor desafo tecnolgico. Medicin del rendimiento de circuito convencionales en macroscpicas (tubo de ensayo) cultivos ha insinuado una dinmica oscilatoria (datos no mostrados). Pero insuficiente resolucin temporal debido a la ardua y tiempo de consumo proceso implicado en la adquisicin de estos datos hizo estas observaciones concluyentes. Adems, la estabilidad de corta duracin del circuito en las poblaciones de tamao macro (Desai et al, 2007) podra slo proporcionan una visin fugaz del comportamiento programado: la funcin se perdi antes de que el comportamiento de los circuitos pudiera ser apreciablemente observada. Para este fin, hemos recurrido a una recientemente desarrollada plataforma microchemostat (Balagadde et al, 2005), una tecnologa de alto rendimiento que econmicamente pueden realizar la caracterizacin rpida de circuitos sintticos bajo una matriz de condiciones con capacidades sin precedentes incluyendo a largo plazo, mediciones no invasivas de poblaciones microbianas propiedades de la poblacin bajo condiciones de estado estable con resolucin nica clula y la automatizacin avanzada. Igualmente importante, el microchemostat de tamao micro poblacin 2 4 9 (~10 -10 clulas en comparacin con al menos ~10 en cultivos macroescala) reduce el nmero de eventos de la divisin celular por unidad de tiempo y por lo tanto, retarda la evolucin microbiana abajo (Desai et al, 2007). Este aspecto facilita el seguimiento del comportamiento programado de las poblaciones de bacterias durante cientos de horas a pesar de la fuerte presin de seleccin para evadir el control de poblacin (Balagadde et al, 2005). Adems, el desafo de monitoreo en tiempo real de composicin de la comunidad se encontr con una ingeniera revisin al canal reactor microchemostat a permitir que una sola clula de resolverse la cuantificacin de fluorescencia (Figura S1). Adems, hemos reducido el volumen del reactor de ~16 a ~9 nl para reducir an ms la poblacin bacteriana en cada reactor, que se ha demostrado que ayuda estabilizar un controlador de poblacin durante el cultivo a largo plazo (Balagadde et al, 2005). Esta estrategia tambin nos permiti aumentar el nmero de reactores en paralelo por cada chip de 6-14 para mayor rendimiento. La Figura 2A ilustra la dinmica tpicas oscilatorios de poblaciones de depredadores y presas en la microchemostat con un perodo de ~180 h (IPTG = 5 mM, la tasa de dilucin (D) = 0,1125 h-1). Inicialmente, cuando la densidad de la presa fue baja, el crecimiento depredador fue inhibida debido a la expresin constitutiva de CcdB. A la inversa, la presa creci a una densidad alta (~35 000 clulas por reactor) en ~10h. La densidad de las presas ms elevada llev a rescatar la poblacin depredador, que se recuper de ~5000 clulas por reactor para 20 000 clulas por reactor en ~10h. El incremento de densidad de depredador a su vez result en la muerte de las clulas de la presa, lo que lleva a una drstica reduccin en la densidad de presas (~35 000 clulas por reactor a slo unas cuantas clulas por reactor). La disminucin de la densidad de la presa condujo al rescate insuficiente de las clulas de los depredadores y la subsiguiente disminucin de la densidad de depredadores en ~35 h. La poblacin de las presas se recuper ~10 h ms tarde. En resumen, el sistema dio dinmica oscilatoria entre el depredador y la poblacin de la presa que claramente se asemejan a las observadas en ecosistemas naturales depredador-presa. El diseo de los reactores en paralelo microchemostat facilita la investigacin de respuesta del circuito para cambiar los parmetros del circuito. La Figura 2B ilustra un conjunto tpico de dinmica del ecosistema sinttico depredador-presa para varios niveles de circuitos de induccin. Sin induccin (IPTG = 0), depredador y la presa tena interacciones insignificantes circuito- impulsados . Puesto que el depredador (cepa MG1655) crece ms rpido que la presa (cepa Top10F), la poblacin de la presa fue finalmente (despus de ~50 h) conducido a la extincin (las fluctuaciones de la densidad de presas alrededor de 0 celulas por reactor eran artefactos numricos de formacin de procesamiento de imgenes, consulte la informacin complementaria para detalles). Los ms altos niveles de IPTG niveles (5 mM) han suscitado dinmica oscilatoria entre el depredador y las poblaciones de presas.

Estos resultados sugieren el cruce de una bifurcacin de Hopf punto utilizando el nivel de IPTG como el parmetro de control (vase tambin Figuras complementario S6 y S7A). Este aspecto se ilustra con el anlisis de bifurcacin (Figura 2C) que representa la efectos de IPTG en la produccin 3OC6HSL por la presa y CcdB expresin por parte del depredador. A niveles suficientemente bajos de IPTG, hay depredacin mnima programada entre dos poblaciones y la interaccin principal es la competencia. Como resultado, la poblacin de depredadores domino debido a su ventaja de crecimiento, que conduce al fracaso de la presa. El aumento de IPTG ms all de un nivel crtico permite cruzar de un punto de bifurcacin de Hopf y provoca dinmicas oscilatorias. El modelo predice adems dos caractersticas destacadas del comportamiento depredador a altos niveles de induccin de IPTG. En primer lugar, la dinmica de respuesta son mucho ms lento en comparacin con los bajo niveles de induccin de IPTG (Figura 2C, insercin). En segundo lugar, esas dinmicas implican densidades mnimas de depredadores que se acercan a cero. Ambos aspectos son cualitativamente consistentes con los datos experimentales (paneles superiores de la Figura 2B; complementaria Figura S7A), aunque los datos no excluyen la posibilidad que el sistema puede llegar a aproximarse estado estacionario. Porque del volumen miniaturizada del reactor microchemostat (~9 nl), el depredador (o presa) la poblacin es propensa a caer por debajo del lmite de deteccin (~75 clulas por reactor) durante una oscilacin canal (Figura 2B, fila 1, columnas 1 y 2; desde ~10 a ~80 h) y en casos severos, consiguiendo el fracaso (Figura 2B, fila 1, columna 3).

Figura 2.-Caracterizacion a largo plazo de la dinmica del sistema mediante el microchemostat. (A) la dinmica tpicas oscilatorios del sistema con un perodo de ~180 h (IPTG = 5 mM, la tasa de dilucin = -1 0,1125 h ). (B) la dinmica del sistema para diferentes niveles de induccin con IPTG. La tasa de dilucin -1 microchemostat fue 0,1125 h . Sin induccin, Las clulas presa son acabadas. A nivel IPTG aumentado (IPTG5 mM), dinmica oscilatoria se suscit en varios reactores. (C) Bifurcacin diagrama de la densidad de depredadores en comparacin con el nivel de IPTG. El recuadro muestra el periodo de oscilacin como una funcin de IPTG. Cursos de tiempo de las dos poblaciones en las concentraciones de IPTG diferentes se ilustran.

Figura 3 Dependencia de la dinmica de los sistemas sobre la tasa de dilucin (D). (A) la dinmica depredador y experimentales de las poblaciones de presas en D diferente en el microchemostat: para el par de depredador (MG1655) y presa (Top10F). (B) Para el par de depredador (Top10F) y presa (Top10F). (C) Diagrama de bifurcacin perodo oscilatorio frente a D. insercin es el perodo de oscilacin dinmica frente a D. sistemas cualitativamente diferentes (sostenido y oscilaciones amortiguadas, y el estado de equilibrio) se puede obtener por la variacin de D. Estos experimentos se llevaron a cabo en IPTG=50 M. Del mismo modo, se analiz el impacto de la tasa de dilucin (D) en la dinmica del sistema. La figura 3A ilustra la dinmica de coexistencia en D= 0,11 h-1, lo que sugiere una fase inicial de largo plazo de oscilaciones. Sin embargo, un incremento en D (a 0,2 h-1) condujo a una fase amortiguadas dinmica oscilatoria con mucho ms corto perodos (~50 h). Se observ respuesta similar con una configuracin del circuito distinto: depredador (Top10F) y la presa (Top10F) (Figura 3B; ver tambin S4B Figura complementario). -1 Estas poblaciones inicialmente coexistieron con una baja tasa de dilucin (D=0,15 h ). Se Cambiaron a oscilaciones amortiguadas con periodos cortos (~30 h) a un incremento en D (a 0,23 h-1). Mayor incremento en D (a 0,31 h-1) en ~250 h condujo a depredador a muerte. El anlisis de Bifurcacin cualitativo representa las observaciones experimentales que un aumento en la tasa de dilucin puede conducir a una disminucin significativa en el perodo de las oscilaciones (Figura 3C, insercin). Otras simulaciones muestran que un aumento en D puede cambiar una oscilacin lenta, sostenida (Figura 3C, parte inferior izquierda panel) para un rpido, oscilacin amortiguada (Figura 3C, medio fondo panel). Clulas predadoras fueron acabadas si D es demasiado grande (Figura 3C, panel inferior derecho). Estos resultados del modelado cualitativo cuenta por las observaciones experimentales de la dependencia de la dinmica de los sistemas tasa de dilucin .Notamos que la respuesta de dilucin del sistema a un cambio en D es muy sensible a las condiciones predominantes de funcionamiento. *************Al conectar D de 0,11 a 0,2 h-1, el sistema ya sea exhibe una oscilacin amortiguada o se aproxima a un estado de equilibrio (la tercera fila, Figura complementario S7A, donde IPTG =50 M). La sensibilidad de la oscilacin amortiguada a perturbaciones de un parmetro o condiciones iniciales

cualitativamente puede explicar este fenmeno (Suplementario figura S7c, recuadros). Desde oscilaciones amortiguadas son dinmicas transitorios, variaciones pequeas en el control de la tasa de dilucin microchemostat o diferentes fases iniciales del depredador y de las poblaciones de presas puede impactar significativamente el comportamiento de oscilacin. Inspirndose en la naturaleza, los bilogos sintticos han creado circuitos que operan en las clulas individuales (y Elowitz Leibler, 2000; Gardner et al, 2000; Atkinson et al, 2003; Fung et al, 2005; Levskaya et al, 2005), en las poblaciones individuales (Kobayashi et al, 2004; You et al, 2004; Basu et al, 2005; Anderson et al, 2006) y entre las poblaciones (Brenner et al, 2007). Nuestros estudios representa un mayor avance masalla de los reciente esfuerzos en la construccin de los ecosistemas sintticos (Shou et al, 2007; Weber et al, 2007), en trminos de la complejidad del sistema y resolucin de caracterizacin. Proporciona un marco para explorar la naturalidad existentes de componentes celulares pueden ser reunidos para programar y coordinar altamente su comportamiento celular complejo. Adems, los ecosistemas sintticos como el nuestro puede servir como sistemas bien definidos para explorar cuestiones evolutivas y ecolgicas con respecto a, por ejemplo, la generacin y el mantenimiento de la biodiversidad (Chesson, 2000; Nowak y Sigmund, 2004). Convencionalmente, los experimentos tpicos que implica sistemas de microorganismos se limitan al uso de nutrientes la concentracin y la velocidad de dilucin como los parmetros de control nico (Fussmann et al, 2000; Becks et al, 2005). En comparacin, nuestro sistema permite la manipulacin directa de los parmetros intrnsecos, tales como la tasa de crecimiento, tasa de mortalidad y la fuerza de la comunicacin clula-clula. En este sistema, hay una clara y explcita asignacin entre las construcciones genticas y las correspondientes dinmica de la poblacin, lo que puede facilitar futuros estudios de cmo las interacciones moleculares son manifestadas en el modelo temporal de dinmicas de la poblacin, un tema central en ecologa (Bohannan y Lenski, 2000; Foster et al, 2007). La naturaleza genrica de nuestro diseo del sistema hace que sea portable a otras interacciones ecolgicas, incluyendo el mutualismo, la competencia, comensalismo y amensalismo (mayo, 1974). La virtual ilimitada configuracion que son posibles con estos bsicos elementos nos permitir examinar ms a fondo la interaccin entre la regulacin de genes y medio ambiente, y la poblacin dinmica. Con un control adicional sobre la poblacin de mezcla o segregacin, ser posible programar las poblaciones bacterianas para imitar el desarrollo y la diferenciacin en organismos multicelulares. Materiales y mtodos Microquimiostato diseo y fabricacin La asamblea general de que el lector se describi anteriormente (Balagadde et al, 2005). Las clulas en el microchemostat fueron imgenes a travs de microscopa de campo claro o de fluorescencia. Iluminacin en cada caso fue sincronizada a la operacin de chip utilizando dos obturadores electrnicos (Uniblitz persianas electrnicas, AG Heinz Inc., Lake Forest, CA, EE.UU.). Imgenes digitales fluorescentes y de contraste de fase-se capturaron usando una cmara de carga acoplaun dispositivo refrigerado (monocromo SRV Retiga 2000 RV de QImaging Corporation). Labview software fue utilizado para controlar el funcionamiento sincronizado de estos componentes y el chip de toda operacin.

El recuento de clulas microscpico Dentro de la altura de 3 m de la seccin de formacin de imgenes (en comparacin con el 10 m altura de otro tipo), las clulas fueron fotografiados en un limitado suficientemente plano horizontal delgada a fin de que todos ellos podran estar en el foco simultneamente. Esto tambin mejora la resolubilidad por la disminucin de la superposicin clula-clula en el plano horizontal

(Figura S1). El nmero total de clulas en cada reactor continuo fue determina directamente a travs automatizado brillante microscopa de campo por contando el nmero de clulas presentes en una seccin de la cmara de crecimiento volumen conocido. Tpicamente, un conjunto de ocho imgenes de contraste de fase fue tomada en la seccin de formacin de imgenes de cada reactor a travs del campo brillante microscopa, con mezcla de rotacin de la cultura en el medio consecutivo instantneas. Algoritmos de procesamiento de imgenes en Matlab se utilizaron para determinar el nmero medio de clulas en cada conjunto de imgenes, desde la que los totales celulares determinadas como se ha descrito previamente (Balagadde et al, 2005). Para determinar la composicin de las comunidades de poblaciones mixtas, una de la especies (depredador o presa) fue etiquetado con una etiqueta fluorescente gfpuv. La seal fluorescente se determin por recuento directo de clulas fluorescentes en un conjunto de tpicamente cuatro imgenes adquiridas a travs microscopa de fluorescencia automatizada, utilizando el filtro adecuado gfpuv set: excitacin 395/40 y la emisin de 510/40. Por lo tanto, la densidad no fluorescente, obtenida restando la fluorescencia del conteo total de clulas, representado la densidad de la segunda poblacin. Segn este enfoque, los miembros de una especie "fluorescente" que no son suficientemente brillantes para ser capturado por los algoritmos de procesamiento de imgenes son contadas como clulas de especies no fluorescentes. Esto podra ser una fuente de ruido en el nmero de clulas reportados para cada especie. En el futuro, este problema podra abordarse mediante la asignacin de un marcador fluorescente diferente para cada especies involucradas en el experimento. Una platina motorizada del sistema (Prior Scientific, Rockland, MA, EE.UU.) documentacin activar simultnea de mltiples microchemostat Los plsmidos Los plsmidos utilizados en este estudio se muestran en la Figura S4. Para construir placCcdBs (p15A origen, KanR), 96 pares de bases entre dos sitiosNSTI en la regin codificante de LacZ-CcdB (pZErO-2), se eliminaron y el gen resultante lacZ-ccdB, junto con su ascendente promotor lac, se clon en pPROLar.A122 (BD Biosciences Clontech). ptetLuxRLasI-luxCcdA (SC101 origen, CMR) se construy en varias pasos. En primer lugar, el gen LasI junto con su sitio de unin al ribosoma era clonado a partir de la P. aeruginosa (PAO1) cromosoma en el plsmido pLuxR (Collins et al, 2005), donde fue colocada aguas abajo de la luxR gen. En segundo lugar, el casete de luxR-Lasi se clon en el plsmido pPROTet.E132 (Clontech) para generar ptetLuxRLasI, donde el casete est bajo el control de un promotor PLtetO-1 (Lutz y Bujard, 1997). Siguiente, el gen de la CCDA se clon a partir del plsmido F, PCR-fusionado con un PluxI promotor de pluxGFPuv (Collins et al, 2005), y se inserta en ptetLuxRLasI, en direccin opuesta desde el cassette de PLtetO-1-LasR-Lasi. Finalmente, el origen de replicacin ColE1 de este plsmido fue sustituido con el origen SC101, que se clon a partir del plsmido repressilator (Elowitz y Leibler, 2000). pLasRLuxI-luxCcdBs (p15A origen, KanR) fue construido en varias etapas. En primer lugar, el gen se clon LasR a partir de la P. aeruginosa (PAO1) cromosoma en pPROLar.A122 (Clontech) colocndolo bajo el control del promotor de Plac/ara-1 generar pLasR. En segundo lugar, la luxI genewas PSND-clonado fromplasmid 1 (Weiss y Knight, 2000) en pLasR donde se coloca directamente abajo del gen LasR, generando pLasRLuxI. En tercer lugar, un pluxIlacZa0- ccdB casete se clon a partir pluxCcdBs plsmido, que se derivados de pluxCcdB mediante la eliminacin de 96 pares de bases entre dos sitios Nst1 (vase ms arriba). Stress response protein NST1 El plsmido ptetGFPuv (LVA) (ColE1 origen, CmR) fue construido por la insercin de una porcin N-terminal de GFPuv amplificado por PCR con un cebador, incluyendo un sitio KpnI rio arriba del codn de iniciacin y un cebador recocido a la interna sitio AvaII, y una parte C-terminal de GFPuv

(LVA) amplificado por PCR a partir de PINV-4 (Weiss, 2001) con un cebador recocido a la interna sitio AvaII y un cebador incluyendo BamHI rio abajo de la etiqueta de LVA en KpnI y BamHI digerido-pPROTet. E132 (BD Biosciences Clontech). Cepas, condiciones de crecimiento y los datos macro escala adquisicin MG1655 y Top10F cepas de E. coli celulas (Invitrogen) se utilizaron a menos se indique lo contrario. Para las pruebas de respuesta IPTG / AHL en la Figura 1, se utiliz 3OC6HSL (Sigma Aldrich) y 3OC12HSL sintetizado por E Toone (Departamento de Qumica de la Universidad de Duke), que han sido formuladas y se almacena como referencia (Collins et al, 2005).PH-tamponada LBK medios de comunicacin (que contiene 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 7 g de KCl l-1) se utiliz para el cultivo lquido. Los medios se tamponaron con 100 mM de cidos dbiles (tuberas se utiliz un pH de 6,2 y 6,6, y MOPS para pH 7,0), y el pH se ajust mediante la adicin de KOH 5M. Antibiticos (50 gml-1 cloranfenicol y gml 50-1 kanamicina) anhidrotetraciclina y se aadieron. IPTG ms 0,05% de arabinosa (1 mM) se utiliza para activar el circuito. Los cultivos se agitaron en un 12 ml tubo de cultivo a 37oC y 250 rpm Un cultivo iniciador de la clulas de depredadores o las clulas de presa se inocul a partir de una sola colonia y crecido por separado por lo menos durante 10 h, y despus se diluy 1000-veces en 4 ml de medio fresco. Medio Microchemostat, preparacin precultivo y las condiciones de crecimiento LBK medio se utiliz en todos los experimentos microchemostat menos se indique lo contrario. Poblaciones de depredadores y presas de forma independiente probado para la funcin de circuito de acuerdo con el procedimiento ilustrado en Figura 1. Soluciones de glicerol de valores (30 ml) se crearon utilizando la prueba culturas depredadores y presas andwere colocado en un congelador? 801C para largo plazo almacenamiento. Estas poblaciones de mini-se utilizaron para preparar pre-cultivos para microchemostat experimentos posteriores. Precultivos fueron preparadas por inoculacin de un medio 2 ml estril muestra con 10 ml de clulas preparada previamente almacenadas mini-glicerol solucin y agitacin a 280 rpm para B9 horas a 371C (arriba VWR banco incubadora, modelo 1575R). El precultivos se usaron luego para semilla microchemostat reactores con clulas B20 nl? 1. Para medir depredadorpresa dinmica del circuito en la microchemostat, las clulas fueron cultivadas en pH 7.0 medio tamponado LBK. Todos los medios fueron suplementados microchemostat con 5 gl? 1 albmina de suero bovino como un anti-adhesin adyuvante. Los plsmidos circuito depredador-presa se mantuvieron con 50 mgml? 1 de kanamicina y 15 mgml? 1 cloranfenicol. Todos los experimentos se realizaron dentro de un microscopio de plexigls incubadora a control de la temperatura de crecimiento a 37oC. Bifurcacin de Hopf se refiere al nacimiento local o la muerte de una solucin peridica (auto-excitado oscilacin) de un equilibrio como un parmetro cruza un valor crtico