Laboratorio Inmunopatologa, Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biolgicas-San Luis (IMIBIO-SL) CONICET-UNSL. Inmunologa, Fac.

de Qumica, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL)

MODULO 4: Apoptosis
Dra. Mara Silvia Di Genaro

Especialidad en Bacteriologa Clnica Universidad Nacional de San Luis, 13 de abril de 2013

Apoptosis, del griego cada de las hojas (Kerr, 1972). (premio Nobel en 2002)

Apoptosis o muerte celular programada, se caracteriza por cambios morfolgicos propios y por mecanismos bioqumicos dependientes de energa (activacin de cistein proteasas, caspasas). Es vital para la renovacin normal de las clulas, el desarrollo y el funcionamiento del sistema inmune, atrofia dependiente de hormonas, desarrollo embrionario,. Inapropiada apoptosis (aumento o disminucin) se asocia con: Enfermedades neurovegetativas Dao isqumico, desordenes autoinmunes, Diferentes tipos de cncer.

Disminucin del volumen celular, membranas celulares extendida, cromatina condensada debajo de la envoltura nuclear, y eventualmente celda de aislamiento con la formacin de numerosos vesculas que contienen orgnulos intactos.

Microscopia ptica (Hematoxilina-eosina). Clula redondeada u ovalada, ncleos picnticos por condensacin de la cromatina, citoplasma eosinfilo.

Toxic Pathol, 2007

Microscopia electrnica: Condensacin de cromatina agregacin de material electrodenso en periferia, debajo de membrana nuclear, aunque el ncleo puede ser uniformemente denso

budding

Cuerpo apopttico

Macrfago fagocita cuerpo apopttico

Toxic Pathol, 2007

Apoptosis vs Necrosis

NECROSIS

APOPTOSIS

Caractersticas morfolgicas Prdida de la integridad de membrana Floculacin de la cromatina Dilatacin de la clula y lisis No hay formacin de vesculas, lisis completa Desintegracin (dilatacin) de organelas Deformacin de la membrana, sin prdida de integridad Agregacin de la cromatina en la membrana nuclear interna Condensacin y/o reduccin celular Formacin de vesculas limitadas por membrana (cuerpos apoptticos) No hay desintegracin de organelas y permanecen intactas

NECROSIS

APOPTOSIS

Caractersticas bioqumicas Prdida de la regulacin de la homeostasis inica No requiere energa (proceso pasivo, tambin sucede a 4C) Digestin del DNA al azar (patrn en mancha del DNA despus de electroforesis en gel de agarosa) Fragmentacin postltica del DNA (ltimo evento de muerte celular) Proceso muy regulado, que implica pasos enzimticos y de activacin Requiere energa (ATP) (proceso activo, no sucede a 4C) Fragmentacin del DNA en mono- y oligonucleosomas, no al azar (patrn en escalera despus de electroforesis en gel de agarosa) Fragmentacin preltica del DNA (primer evento de muerte celular)

NECROSIS

APOPTOSIS Significado fisiolgico

Muerte de grupos de clulas Originada por estmulos no fisiolgicos Fagocitosis por macrfagos Respuesta inflamatoria significativa

Muerte de clulas individuales Inducida por estmulos fisiolgicos Fagocitosis por clulas adyacentes o macrfagos Respuesta no inflamatoria

Seal de muerte celular Tipo de tejido Estado de desarrollo del tejido Medio fisiolgico ?

NECROSIS

APOPTOSIS

Otros tipos de muerte celular

Mecanismos de Apoptosis

(por receptores)

(mitocondrial) infecciones

Independiente de caspasas

Cliva SET, el que inhibe un gen que codifica para una DNAsa

Expresin de ligandos para los receptores de fagocitosis (expresin de fosfatidilserina de la bicapa lipidica a la exerna

Caspasas: cistein proteasa que clivan protenas en residuos de acido asprtico. Se expresan como procaspasas inactivas, una vez activadas, activan otras procaspasas (cascada proteoltica, que amplifica la seal apopttica) 10 caspasas han sido identificadas: Iniciadoras: caspasas-2, -8, -9, 10. Efectoras: caspasas-3, -6, -7. Inflamatorias: caspasas-1, 4, -5. Otras: -11 (regula apoptosis en
shock sptico) -12 (apoptosis por endoplasmina y amiloide), -13 (bovina), y -14 en tejido embrionario, no en adulto)

Otras funciones de las caspasas

FasL

DISC
(deathdeathinducing complex) complex )

TNF

infecciones

Rol de la mitocondria

Toxic Pathol, 2007

Toxic Pathol, 2007

Toxic Pathol, 2007

Fagocitosis de clulas apoptticas: ltima fase del proceso de apoptosis

Cuerpo apopttico fagocitado

Clula fagoctica

Asimetra de fosfolpidos y externalizacin de fosfatidilserina

Mtodos para estudiar la Apoptosis

Tener en cuenta: Cintica: Medir apoptosis temprana (iniciacin) y tarda (ejecucin) Combinar mtodos de diferentes principios. Clulas en cultivo sufren apoptosis in vitro y eventualmente necrosis secundaria Clulas en apoptosis pueden morir y desaparecer relativamente rpido. (entonces falsos negativos) Tiempo desde inicio a finalizacin de apoptosis puede ser tan rpido como 2-3 hs. Caspasas pueden expresarse transitoriamente. Apoptosis puede ocurrir con baja frecuencia.

Tipos de ensayos: 1. Alteraciones citomorfolgicas 2. Fragmentacin del ADN 3. Deteccin de de caspasas, clivaje de sustratos, reguladores e inhibidores 4. Alteraciones de membrana 5. Ensayos de mitocondrias.

Mtodos para estudiar la Apoptosis

Alteraciones citomorfolgicas
TEM: mtodo gold standard para confrimar apoptosis

Mtodos para estudiar la Apoptosis

Fragmentacin del ADN escalera de ADN

Apoptosis tarda

Mtodos para estudiar la Apoptosis TUNEL

IHQ Mtodo sensible

Mtodos para estudiar la Apoptosis Deteccin de de caspasas, clivaje de sustratos, reguladores e inhibidores

Figure 5 are of myocardium from 14-week-old rats treated with ephedrine (25 mg/kg) and caffeine (30 mg/kg). Figure 5A is the interventricular septum stained by anti-phosphoH2A.X, a histone variant that becomes phosphorylated during apoptosis; note the strongly stained apoptotic bodies (arrows).

Mtodos para estudiar la Apoptosis Alteraciones de membrana (Anexina V)

Mtodos para estudiar la Apoptosis Ensayos de mitocondrias.

Potencial transmembrana de mitocondria Con colorantes flurorescentes lipoficos. En apoptosis el potencial de la membrana esta disminuido, entonces el colorante permanece monomrico, de color verde. Puede medirse por citometra de flujo o por microscopia.

MUCHAS GRACIAS