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ANEXOS

Anexo 1. Desarrollo del proyecto

CONTROL BIOLGICO DE GALLINA CIEGA CON HONGOS Y NEMATODOS ENTOMOPATGENOS 1. RESUMEN EJECUTIVO
La plaga denominada como gallina ciega, es uno de los principales problemas fitosanitarios en el estado de Guanajuato afectando principalmente cultivos como el maz y otras hortalizas. EL mtodo tradicional de control de esta plaga ha sido mediante el uso de insecticidas qumicos, los cuales pueden tener efectos negativos principalmente a nivel ecolgico sin son usados de menara irracional, adems de que no estn siendo eficientes en el control de esta plaga. La bsqueda de alternativas de manejo de esta plaga ha encontrado en los entomopatogenos una alternativa ecolgicamente segura y sustentable. A pesar de que existen trabajos de investigacin acerca del uso de estos microorganismos para el manejo de esta plaga, los resultados han sido inconsistentes, la principal causa de esto es precisamente la falta de investigacin bsica acerca de primero entender la relacin insecto-entomopatgeno y como esta relacin es afectada por factores biticos y abiticos, ya que muchos trabajos dan el salto de experimentos en laboratorio en donde estiman nicamente virulencia, a experimentos de campo esperando encontrar resultados similares y no siempre es as. Es por esta razn que el objetivo principal de este proyecto fue la de generar datos que puedan permitir un mejor manejo de la gallina ciega mediante entomopatogenos. Para lograr esto se tuvieron diferentes objetivos los cuales iniciaron con ver el efecto del tipo de suelo en la diversidad y abundancia de especies tanto de hongos como de nematodos entomopatgenos as como su variacin gentica, posteriormente se aislaron entomopatgenos directamente de larvas de gallina ciega y corroborar su patogenicidad en larvas de gallina ciega sanas, tambin de estos aislamientos se detecto su variacin gentica. Con estos aislamientos se iniciaron una serie de experimentos para evaluar el efecto de factores biticos y abiticos en la relacin Phyllophaga spp. - entomopatgeno y ver cmo puede modificar esta relacin; primeramente se estimo la virulencia de cada uno de estos aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp., posteriormente se evalu el efecto de varios factores en esta virulencia estimada, se evalu el efecto de temperatura, genero de gallina ciega, tipo de suelo para finalmente realizar experimentos anivel de invernadero y campo, para evaluar el comportamiento de estos aislamientos en la infeccin de las larvas de Phyllophaga spp bajo condiciones naturales. Los resultados encontrados hasta el momento indican que la diversidad de entomopatgenos encontrados en los suelos evaluados es muy baja encontrndose nicamente dos especies de hongos entomopatgenos, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Se encontraron 126 aislamientos de hongos entomopatgenos pertenecientes a estas dos especies, distribuidas en 12 localidades muestreadas en esta fase. La abundancia relativa de dichos aislamientos fue afectada por el tipo de suelo, ya que se encontraron suelos que favorecen la presencia natural de una especie o la otra, as como hay suelos que no tienen presencia natural de ningn entomopatgeno. La variacin gentica de estos aislamientos est en proceso de estudio. Se aislaron 22 aislamientos pertenecientes a B. bassiana y M. anisopliae. De estos 22 aislamientos, 8 fueron descartados por la nula produccin de conidios por lo que su evaluacin fue imposible. Con los aislamientos restantes se evalu su virulencia hacia larvas del tercer instar de Phyllophaga spp. donde todos mostraron niveles diferentes de virulencia, de este experimento se puede concluir parcialmente, ya que todava hay repeticiones en proceso de evaluacin, que los aislamientos de B. bassiana mostraron la mayor virulencia comparada con los aislamientos de M. anisopliae, la mxima mortalidad alcanzada en promedio fue de 40%. Un nmero reducido de aislamientos fue evaluado ahora contra larvas del gnero Anomala spp., donde los resultados fueron contrastantes, la mayor virulencia la mostraron los aislamientos de M. anisopliae con porcentajes de hasta 100%, los aislamientos de B. bassiana mostraron una mortalidad mxima del 100%, concluyendo que la virulencia de estos aislamientos si es afectada por el gnero de gallina ciega ya que Anomala fue mucho ms susceptible que Phyllophaga. Se tiene un avance parcial en

los dems experimentos ya que algunos estn aun en toma de datos y otros en proceso de establecimiento.

2. INTRODUCCION
En el estado de Guanajuato, la gallina ciega es uno de los problemas ms importantes en cultivos bsicos como maz, frijol y sorgo, por ejemplo en el ao de 2002, el CESAVEG reporto una superficie afectada por gallina ciega de 50,000 ha. El mtodo tradicional de manejo de esta plaga ha sido mediante el uso de insecticidas qumicos, el cual no ha sido eficiente por la creciente superficie afectada ao tras ao. El uso de microorganismos entomopatgenos ha sido investigado e implementado en muchos otros insectos con xito; sin embargo, para el caso de gallina ciega, la investigacin es reducida con muy pocos ejemplos a nivel nacional e internacional. La bsqueda de aislamientos asociados a larvas de gallina ciega en algunos estados de la repblica ha sido realizada mediante bsquedas directas en larvas de gallina ciega y trampeo con larvas de Galleria mellonella en suelo (Berlanga et al., 2000; Hernndez Velzquez et al., 2003; Hernndez-Velzquez et al., 2005; Daz Mederos et al., 2002), en todos los casos, la bsqueda se ha quedado nicamente en el reporte de especies y numero de aislamientos encontrados. Por otro lado, tambin se reporta experimentos de virulencia en laboratorio con diferentes especies de gallina ciega como Phyllophaga crinita (Rodrguez del Bosque et al., 2005), Cyclocephala signaticollis (Beron y Daz, 2005) y contra complejos de gallina ciega del gnero Phyllophaga spp (Flores et al., 2002). As mismo, tambin se reportan experimentos en campo (Vzquez-Garca et al., 2003; Prez-Domnguez et al., 2003; Ruz-Vega y Aquino-Bolaos, 2002), donde los autores concluyen que los tratamientos realizados con hongos entomopatgenos son los ms eficientes, pero al momento de observar los resultados, estos no son del todo claros y en muchos casos el diseo experimental y mtodos de evaluacin pueden ser muy cuestionables. En ninguno de los trabajos revisados se reportan experimentos detallados que estudien aspectos bsicos de la relacin gallina ciega entomopatgeno. Los trabajos realizados estimando virulencia a nivel de laboratorio nicamente reportan datos de virulencia y tiempo letal, pero sin ningn seguimiento a campo; los estudios de campo extrapolan directamente de trabajos en laboratorio a campo sin considerar que esa relacin puede ser afectada por diversos factores, biticos y abiticos, y que lo encontrado en laboratorio puede ser modificado. Se considera que esa es precisamente la razn por la cual la implementacin de los hongos u otro entomopatgeno en campo, no ha sido del todo exitoso, ya que muchas de las investigaciones han dado resultados vagos y sin un seguimiento. Es cuestionable tambin las identificaciones realizadas por algunos autores nacionales de los aislamientos de hongos entomopatgenos con los que trabajan, ya que reportan especies que anteriormente se haba reportado solo para Europa y no Amrica, eso pone en evidencia que los mtodos de identificacin no solo deben ser morfolgicos sino corroborados molecularmente. Considerando lo anterior, se propuso este proyecto de investigacin cuyos objetivos son precisamente estudiar aspectos bsicos de interaccin de la relacin gallina ciega-entomopatgeno, donde la identificacin de los patgenos se realiz tanto morfolgica como molecularmente, lo cual adems de darnos una identificacin mas verdica tambin nos indica los niveles de variacin gentica en el estado de Guanajuato, cosa que no se ha hecho en otra parte de la repblica. As mismo, adems de estudiar la virulencia relativa de los aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp., tambin se estudio el efecto de factores biticos y abiticos en esta virulencia relativa lo cual nos indicara el posible efecto que se podra tener en campo, lo cual se confirmara con estudios a nivel de invernadero y campo. La presente investigacin tuvo por objetivo general, generar informacin que conlleve a un mejor manejo de la plaga gallina ciega mediante entomopatgenos. Para esto se comprometieron dos productos con diferentes actividades cada uno:

1. Aislamientos de de entomopatgenos identificados. a. Seleccin de reas para la bsqueda de aislamientos nativos. b. Bsqueda de de aislamientos de hongos y nematodos entomopatgenos nativos del estado de Guanajuato. c. Aislamiento de entomopatgenos. d. Identificacin morfolgica y molecular de los aislamientos. e. Corroboracin de patogenicidad de los aislamientos encontrados. 2. Documento con recomendaciones de uso de hongos y nematodos entomopatgenos. a. Estimacin de la virulencia de aislamientos hacia larvas de gallina ciega. b. Interaccin de la virulencia de los aislamientos con factores biticos (genero de gallina ciega) y abiticos (tipo de suelo, temperatura y genero de gallina ciega). c. Evaluacin de aislamientos a nivel de invernadero. d. Evaluacin de aislamientos a nivel de campo.

3. MATERIAL Y METODOS
3.1. Seleccin de reas para la bsqueda de aislamientos nativos Para esta fase se realizo una reunin con personal del Comit Estatal de Sanidad Vegetal de Guanajuato, el da 23 de Julio de 2007. Con base en la experiencia de los encargados de las campaas fitosanitarias y la base de datos desarrollada por personal de CESAVEG, se seleccionaron diferentes sitios de colecta. Estos sitios fueron seleccionados con base en presencia, abundancia y ausencia de poblaciones de gallina ciega, tipo de suelo y tipo de cultivo presente en las localidades seleccionadas. 3.2. Bsqueda de aislamientos de hongos y nematodos entomopatgenos nativos del estado de Guanajuato 3.2.1 Colecta de muestras de suelo con diferentes niveles de infestacin de larvas de gallina ciega Durante el periodo del 23 al 27 de Julio, y con ayuda del personal del CESAVEG, se colectaron muestras de suelo de 9 diferentes localidades. De cada localidad se obtuvieron 15 sub-muestras de 500 gr de suelo cada una. Las muestras de suelo se transportaron al laboratorio de Patologa de Insectos en donde se conservaron a 5 C hasta su procesamiento. El procesamiento consisti en buscar organismos entomopatgenos mediante la tcnica de trampeo usando larvas de Galleria mellonella, las cuales son criadas en el laboratorio de Patologa de Insectos. 3.2.2 Colecta de larvas de gallina ciega de localidades con suelos de diferentes cultivos y niveles de infestacin de la plaga Durante el periodo del 17 al 20 de Octubre de 2007 se colectaron larvas de gallina ciega en el estado de Guanajuato en siete localidades en tres diferentes municipios. Las zonas corresponden a dos parcelas de cada municipio. Las larvas se colectaron en hieleras con PEAT MOSS. Estas se transportaron al laboratorio de Patologa de Insectos del Colegio de Posgraduados en donde se separaron las larvas por gnero. Estas larvas se colocaron de manera individual en vasos de plstico con PEAT MOSS humedecido en un cuarto de incubacin a 25 C por 30 das. 3.3. Aislamiento de entomopatgenos 3.3.1 Muestras de suelo

Para cada zona de muestreo se utilizaron vasos de plstico con tapas. Estos se sometieron a un proceso de desinfeccin, la cual consisti en sumergir los vasos y tapas en una solucin de cloro comercial al 1% con jabn durante 5 minutos, posteriormente tapas y vasos se enjuagaron con agua destilada y se asperjaron con alcohol etlico al 70%. Por cada sub-muestra de suelo se ocuparon 5 vasos con tapa y 3 larvas de G. mellonella. Se colocaron 100 gramos de suelo por cada vaso. Para evitar que las larvas de G. mellonella formaran su capullo, las larvas se sumergieron durante 15 segundos en agua destilada estril a 56 C. Una vez hecho lo anterior, las muestras se incubaron a 25C por 15 das en oscuridad total. Las larvas se revisaron cada 24 horas para detectar signos y sntomas de enfermedad. Las larvas enfermas se aislaron en forma individual y colocaron en cajas de Petri con papel filtro estril humedecido con agua estril, y se incubaron a 25C hasta que se expresara el agente causal de la enfermedad. 3.3.2 Larvas de gallina ciega Los vasos conteniendo larvas individuales de gallina ciega se revisaron cada 7 das para observar la presencia de algn patgeno, se registro el nmero de larva, la zona y el probable patgeno presente. Las muestras con hongos o nematodos se colocaron en recipientes independientes para extraer los nematodos y para procesar las larvas con hongos. Las larvas con presencia de hongos se procesaron de la siguiente manera. -La larva se limpio con un pincel de residuos de PEAT MOSS. -Una vez limpia se coloco en alcohol al 70% por un minuto -Enseguida se coloco en una solucin de hipoclorito de sodio al 5% por cinco minutos -Posteriormente se le dieron dos lavados con una solucin estril de Tween 80 al 0.03 % para quitar el residuo de hipoclorito de sodio -El exceso de humedad se quito mediante absorcin usando papel filtro del nmero 4. -La larva seca se corto por la mitad con un bistur, se corto una rodaja de la larva. -La rodaja se parti en cinco partes, las cuales se distribuyeron en una caja con medio de ADS -Se selecciono una colonia por caja y se paso a una nueva caja con ADS. Las larvas con presencia de nematodos se procesaron de la siguiente manera: -La larva se limpio de residuos de PEAT MOSS con un pincel. -Posteriormente se dieron lavados con agua destilada estril. -Cada larva se coloco en una trampa blanca para colectar los juveniles infectivos. -Los nematodos infectivos colectados fueron lavados en formalina al 0.1% y mantenidos en refrigeracin hasta su uso. 3.4. Identificacin morfolgica y molecular de los aislamientos 3.4.1. Identificacin morfolgica de aislamientos de hongos

Primeramente, se realizaron micro-cultivos para la identificacin de a nivel de gnero. Para esto, en una caja Petri de 90 mm de dimetro conteniendo 15 ml de agar-agua al 1.5% estril, se coloco un portaobjetos estril arriba de cual, uno en cada extremo, se colocaron dos circulo de ADS de 1 cm de dimetro. En cada crculo y con la ayuda de un asa bacteriolgica se inoculo conidios de cada aislamiento. Finalmente se coloco sobre cada crculo de ADS inoculado, un cubreobjetos estril y se incubo a 25 C durante 7 das o hasta observar esporulacin del hongo inoculado en el crculo. Una vez terminado el perodo de incubacin, los cubreobjetos fueron retirados con mucho cuidado del crculo de ADS y colocados sobre una gota de azul de algodn y lactofenol contenido en un portaobjetos. Estas preparaciones se sellaron con barniz de uas y se examinaron bajo el microscopio compuesto en el objetivo de 40X. Basndose en las caractersticas de los diferentes gneros de hongos entomopatgenos descritos por Humber (1997), se determinaron a gnero cada uno de los aislamientos. Finalmente, se elaboraron preparaciones semi-permanentes colocando 10 L de una suspensin de 1 X 108 conidios/mL de los diferentes aislamientos sobre un portaobjetos, se cubrieron con un cubre objetos y fueron selladas con barniz de uas. Las muestras fueron observadas con el objetivo de 40X en un fotomicroscopio III Carl Zeiss conectado a una cmara digital para microscopio PaxCam. A 200 conidios por aislamiento se les tomo una fotografa, la imagen se proceso con el programa Adobe Photoshop 7.0 y se analizo mediante el programa Image Tool 3.0 midiendo el largo y ancho de los conidios. 3.4.2. Identificacin molecular de hongos Esta fase se realizo nicamente para los aislamientos provenientes de larvas de gallina ciega infectadas. Se extrajo el DNA de todos los aislamientos mediante el kit para extraccin de DNA (QUIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se amplifico la regin ITS de cada uno de los aislamientos mediante los primers universales ITS5 y 4 (White et al., 1990). Posteriormente los productos de PCR se limpiaron mediante el kit de limpieza de QIAquik PCR Purification Kit (QUIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante, finalmente, todos los productos de PCR limpios se mando a la compaa MAGROGEN en Korea para su secuenciacin. Las secuencias resultantes se analizaron mediante el programa BIOEDIT para la generacin de una secuencia consenso, la cual posteriormente se subi a la pgina de GENBANK para su comparacin y alineacin con otras secuencias ah depositadas y mediante la cual se corroboro la identidad de los aislamientos. 3.4.3. Variacin gentica de los aislamientos En estos momentos, la variacin gentica de los asilamientos obtenidos de suelo est bajo estudio. Esto se est realizando mediante la amplificacin de microsatlites diseados con anterioridad por otros investigadores. De encontrarse agrupacin o diferencias genticas significativas, se seleccionaran al menos dos aislamientos de cada grupo y se amplificara la regin ITS del RNA ribosomal de cada aislamiento mediante iniciadores universales en reacciones de PCR convencional y se seguir el mismo procedimiento descrito en la seccin 3.3.3. 3.4.4. Identificacin morfolgica de nematodos Se encontraron aislamientos de nematodos, pero ninguno resulto ser entomopatgeno, basados en resultados de patogenicidad. Debido a esto no se sigui ms all con estos microorganismos, pero se sigue en la bsqueda de aislamientos de estos microorganismos. 3.5. Corroboracin de patogenicidad de los aislamientos encontrados Esta fase nicamente se realizo para los aislamientos provenientes de larvas infectadas. El mtodo fue el mismo para todos los aislamientos.

Grupos de 12 larvas del tercer instar fueron expuestas a una suspensin de 1x108 conidios/ml. Las larvas fueron sumergidas por 20 segundos, posteriormente fueron colocadas sobre una toalla de papel para quitar el exceso de humedad. Finalmente cada una de las larvas tratadas fue colocada de manera individual una placa de cultivo de tejidos de 12 orificios, una larva en cada orificio. La mortalidad se revis cada 5 das durante 35 das. Todo insecto muerto se incub en una caja Petri estril de 30 mm de dimetro conteniendo papel filtro humedecido en la base para promover la esporulacin y confirmar agente causal de la infeccin. Todo el bioensayo se incub a 25 C en total oscuridad. El tratamiento control fueron larvas sumergidas en Tween 80 al 0.03% durante 20 segundos e incubadas de la misma manera descrita anteriormente. 3.6. Virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp De los resultados obtenidos en la seccin 3.5, se seleccionaron 7 aislamientos para su evaluacin en esta seccin, 4 aislamientos de B. bassiana y 3 de M. anisopliae. Siguiendo la misma metodologa reportada en la seccin anterior se evalu la virulencia de estos aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp. todo el experimento se incubo durante 35 das a 25 C en total oscuridad. El experimento se realizo bajo un diseo completamente al azar y todo el experimento se repiti en tres diferentes ocasiones. 3.7. Efecto del gnero de gallina ciega en la virulencia de los aislamientos seleccionados Con base en los resultados de virulencia (seccin 3.6) se seleccionaron 4 aislamientos, 2 de cada especie bajo estudio. Se sigui la misma metodologa descrita en la seccin 3.5. Se inocularon larvas de Phyllophaga spp y Anomala spp. para comparar susceptibilidad relativa hacia los aislamientos seleccionados. Los mtodos de inoculacin e incubacin asi como de toma de datos son los mismos descritos en la seccin 3.5. 3.8. Efecto de la temperatura en la virulencia de los aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp. Empleando los mismos aislamientos de la seccin 3.7., se evaluara el efecto de la temperatura en la virulencia de los aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp. Para este experimento se tienen ya las incubadoras listas a las temperaturas seleccionadas que son de 15, 25 y 30 C. Las larvas a usarse estn en fase de observacin para confirmar salud de las mismas antes de evaluarse. 3.9. Efecto del tipo de suelo en la virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp Para este experimento tambin se est en espera de los resultados de virulencia, y con los aislamientos seleccionados se proceder a realizar los experimentos en suelos ya seleccionados. Para este experimento, adems de las larvas, se requiere de diferentes tipos de suelo para los experimentos. Se avanz en el anlisis de los diferentes tipos de suelos, los cuales se tuvieron que realizar previo a la experimentacin con larvas de gallina ciega mediante la metodologa que a continuacin se describe. 3.9.1 Muestras de suelo Las muestras de suelo fueron colectadas con una pala a una profundidad de 30 cm en 5 localidades de los municipios de Jerecuaro, Valle de Santiago, Penjamo y Comonfort en el estado de Guanajuato. En cada localidad, se tomaron cinco muestras de 3 kg. Las muestras de cada localidad se mezclaron con la mano para obtener una sub-muestra de 1 kg de suelo. Las muestras de suelo se colectaron en Junio del 2009 almacenndose a 4 C y cuatro das despus fueron utilizadas para cuantificar la poblacin de microorganismos.

3.9.2. Recuento en placa Muestras de 10 g de suelo de las sub-muestras de cada localidad se utilizaron para cuantificar los microorganismos. En un recipiente con 90 mL de agua destilada estril se suspendieron 10 g de suelo de cada una de las muestras. Las muestras fueron agitadas durante 18 minutos en un agitador orbital, posteriormente diluciones seriadas fueron hechas. Las diluciones utilizadas para cuantificar bacterias fueron 1-4 1-6, 1-2 1-4 para actinomicetos y 1-1 1-3 para hongos. Una alcuota de 100 L de cada una de las diluciones fue distribuida con una varilla de vidrio sobre la superficie de medio contenida en una caja de Petri. El medio de cultivo Agar Nutritivo fue para bacterias, PDA con rosa de Bengala para hongos y el Czapeck con pH de 8 para actinomicetos. Por cada dilucin se hicieron tres repeticiones. Las placas de agar se incubaron a 28 C. La cuantificacin de bacterias se realizo cuatro das despus de incubadas las placas, a los cinco das los hongos y los actinomicetos a los 15 das. El nmero de clulas de los microorganismo incubados se expreso en unidades formadoras de colonias (UFC). Las UFC por gramo de suelo seco al aire se calculo multiplicando el promedio aritmtico del nmero de colonias/caja por el factor de dilucin y dividiendo entre el peso de suelo seco presente en la alcuota. 3.9.3. Determinacin de humedad Una muestra de 1 g de la sub-muestra de suelo de cada localidad se calent en un horno de microondas por 20 min. El peso de suelo seco fue determinado pesando 1 g de suelo secado en horno de microondas. 3.9.4. Determinacin de pH Una muestra de 2 g de la sub-muestra de suelo de cada localidad se suspendi en 40 mL de agua destilada. La muestra se agito durante 5 min y se determino el pH con un potencimetro. 3.10. Evaluacin de los aislamientos a nivel de invernadero Este experimento an no se inicia pero se tiene todo lo necesario para su realizacin como el invernadero, los vasos para la mantencin de las larvas tratadas etc. Se emplearan los mismos 4 aislamientos seleccionados a partir del experimento de virulencia (3.6.) y se evaluaran en larvas de Phyllophaga spp. Se evaluara el efecto de diferentes tipos inoculacin (tratamientos) en la sobrevivencia de larvas de gallina ciega del genero Phyllophaga bajo condiciones de temperatura fluctuante. El tipo de suelo que se empleara ser aquel que haya dado mejores resultados en los experimentos de laboratorio. Se evaluaran dos tipos de inoculacin de los hongos, en la primera el inoculo ser homogenizado con el suelo y 24 horas despus se introducirn las larvas, y en la segunda, las larvas sern introducidas en el suelo 24 antes de inocular los conidios, los cuales sern depositados en la superficie del suelo contenidos en un volumen determinado de Tween 80 al 0.03% mediante una pipeta serolgica. Cada tipo de inoculacin tendr su propio testigo en el cual no se aplicara conidio alguno, con lo que se evaluara 4 tratamientos en total. Cada tratamiento tendr tres repeticiones y cuatro diferentes fechas de muestreo, uno cada semana durante un mes. Para cada combinacin tratamiento/aislamiento/fecha de muestreo, se emplearan 12 larvas de Phyllophaga spp. los cuales estarn contenidos en vasos de plstico de manera individual. El registro de mortalidad se realizara cada semana durante un mes y ser de manera destructiva. La humedad de los vasos ser mantenida aplicando 5 ml de agua destilada en la superficie del suelo contenida en los vasos cada dos a tres das. Adicionalmente, se registrara la temperatura y humedad del suelo durante el experimento. El diseo experimental ser completamente al azar y todo el experimento se repetir en al menos dos ocasiones. El anlisis de los resultados se realizara mediante una regresin logstica usando el paquete estadstico Genstat. 3.11. Evaluacin de aislamientos a nivel de campo

Para este experimento, se evaluar nicamente dos aislamientos, uno de cada especie. Se seleccion ya una zona en la comunidad de San Lorenzo, municipio de Jerecuaro. Se evaluar el efecto que tendrn aislamientos de hongos y nematodos en la sobrevivencia de larvas de gallina ciega del genero Phyllophaga spp. bajo condiciones de campo. Se evaluara nicamente dos aislamientos de hongos entomopatgenos, uno de B. bassiana y otro de M. anisopliae. Se evaluara el efecto de las condiciones de campo en los niveles de infeccin que pudieran lograr los aislamientos. Se evaluara un total de 4 tratamientos, dos tratamientos sern larvas inoculadas con un aislamiento y el tratamiento control donde se inocularn con Tween 80 al 0.03 %. Y los otros dos tratamientos sern con el otro aislamiento. El tipo de experimento ser a pequea escala y con un muestreo destructivo. Se realizarn orificios en el sulo de 20x20x20 cm. Aproximadamente, en estos, se colocarn jaulas hecha de malla de alambre de 5 x5 mm de apertura y se volvern a rellenar con el suelo previamente retirado. Quince larvas, que fueron colectadas con anterioridad y puestas bajo condiciones de laboratorio para confirmar su salud, sern depositadas en la superficie del suelo contenida en las jaulas, estas sern previamente inoculadas con los 4 tratamientos mediante la misma metodologa descrita en la seccin 3.5. Las larvas que no se hayan enterrado una hora despus se retiraran del experimento. El experimento durara dos meses para los cuales se tendr 48 unidades experimentales para cada combinacin tratamiento/aislamiento/fecha de muestreo, dando un total de 48 unidades experimentales. Se muestrearan 12 jaulas cada 15 das, dichas jaulas representarn tres repeticiones de cada tratamiento. En cada muestreo se cuantificara el nmero de larvas sobrevivientes, y se colectaran larvas muertas, las cuales sern llevadas al laboratorio para confirmar causa de muerte.

4. RESULTADOS
4.1. Seleccin de reas para la bsqueda de aislamientos nativos Despus de la reunin sostenida con personal del CESAVEG, se seleccionaron 12 zonas de muestreo (Cuadro 1). Cuadro 1. Localidades seleccionadas para la colecta de muestras de suelo. Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Localidad ----Jaripeo Maravatio San Lorenzo Magallanes Meza Neutla Neutla Tacubaya Piedra Parada Rancho San Jos Rancho Alvaro Nieto Municipio Valle de Santiago Acambaro Michoacan Jerecuaro Penjamo Penjamo Comonfort Comonfort Penjamo Manual Doblado Miguel Hidalgo Comonfort Cultivo Sorgo Maz (Riego) Maz (Temp.) Baldo Maz Baldo Maz Baldo Maz (Riego) Maz (Temp.) Chile Sin sembrar

4.2. Bsqueda de aislamientos de hongos y nematodos entomopatgenos nativos del estado de Guanajuato 4.2.1 Colecta de muestras de suelo de localidades con diferentes niveles de infestacin de larvas de gallina ciega En total, de las 12 zonas de colecta, se obtuvieron 126 aislamientos, de las cuales 112 son de Beauveria bassiana y 14 de Metarhizium anisopliae. El nmero de aislamientos por zona de colecta es diferente. Es evidente que el hongo Beauveria bassiana es el de mayor predominancia en las regiones muestreadas comparado con Metarhizium anisopliae. Existen diferencias importantes en la abundancia relativa de aislamientos de las dos especies de hongos entomopatgenos en las diferentes localidades (Fig. 1). Por ejemplo, la mayor poblacin de aislamientos de B. bassiana se encontraron en Meza, municipio de Pnjamo, y la menor poblacin en Villa Diego, municipio de Valle de Santiago.

Figura 1. Diferencias relativas en la abundancia y diversidad de aislamientos de hongos entomopatgenos encontrados en las diferentes localidades del estado de Guanajuato. Ma= Metarhizium anisopliae, Bb= Beauveria bassiana. Esta informacin resulta muy importante para el estado de Guanajuato, porque da evidencias del tipo de suelo y localidades donde probablemente se logre una mayor eficacia y persistencia de los hongos entomopatgenos para el control de la gallina ciega. Se cuenta ya con los resultados de los anlisis fsicoqumicos de las diferentes muestras de suelo. Se estn llevando a cabo los anlisis estadsticos para poder determinar si existe alguna relacin entre diversidad y abundancia con el tipo de suelo.

Existen diferencias importantes en la abundancia relativa de aislamientos de las dos especies de hongos entomopatgenos en las diferentes localidades (Fig. 1). Por ejemplo, la mayor poblacin de aislamientos de B. bassiana se encontraron en Meza, municipio de Pnjamo, y la menor poblacin en Villa Diego, municipio de Valle de Santiago. Estas diferencias tan evidentes entre B. bassiana y M. anisopliae sealan a la primera como la especie con mayores posibilidades de sobrevivir en el ambiente. As mismo, est bajo estudio la estructura gentica de las poblaciones de estos aislamientos en cada localidad. Esta estructura gentica nos servir para poder saber ms acerca de las estrategias de estos hongos para sobrevivir. Si es una poblacin genticamente diversa, esto sugiere que no es el mismo aislamiento el que pudiera encontrarse el inicio del periodo que al final, lo genera la hiptesis de que la diversidad poblacional es empleada como estrategia de sobrevivencia. Por otro lado si no existe una diversidad poblacional gentica, entonces debe haber aislamientos con ciertos atributos que le permiten sobrevivir bajo ciertos tipos de suelo. Llama la atencin la baja persistencia de M. anisopliae. Aunque la baja persistencia de M. anisopliae no es algo nuevo, llama la atencin que en una localidad existi un nmero razonable de aislamientos lo que sugiere que este suelo podra favorecer la persistencia de esta especie de hongo. Desafortunadamente no se cuenta con informacin derivado de un anlisis de suelo para poder corroborar si existe algn factor responsable de esta mayor sobrevivencia. 4.2.2 Colecta de larvas de gallina ciega de localidades con diferentes niveles de infestacin de la plaga Se colectaron un total de 385 larvas de gallina ciega. Algunas de las larvas fueron colectadas ya con signos de infeccin por lo cual no fue posible identificar gnero. En total, se obtuvieron 20 aislamientos de B. bassiana, 2 de M. anisopliae. Todos los aislamientos obtenidos estn purificados, las versiones pluri y monosprica estn bajo crio-preservacin a -80 C.

Figura 2. Diferencias en abundancia relativa de aislamientos tanto de hongos y nematodos provenientes de larvas infectadas de gallina ciega de diferentes localidades del estado de Guanajuato. Ma = Metarhizium anisopliae, Bb = Beauveria bassiana.

Nuevamente se observa que B. bassiana es el hongo ms exitoso al haberse encontrado ms larvas de gallina ciega infectadas con este hongo comprado con M. anisopliae (Fig 2.) As mismo, el municipio con el mayor nmero de aislamientos es Pnjamo, resultado similar al obtenido con los aislamientos provenientes de suelo (Fig. 1). 4.3. Identificacin morfolgica y molecular de los aislamientos 4.3.1 Identificacin morfolgica de aislamientos de hongos Todos los aislamientos provenientes de larvas de gallina ciega infectadas y de muestras de suelo estn identificados. Todos los aislamientos obtenidos son de la especie Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. 4.3.2 Identificacin molecular de hongos La identificacin molecular se realiz nicamente para los aislamientos obtenidos de insectos. De acuerdo a las secuencias obtenidas, todos los aislamientos fueron confirmados como B. bassiana y M. anisopliae. 4.4. Corroboracin de patogenicidad de los aislamientos encontrados Diferencias significativas se encontraron en los niveles de virulencia de los diferentes aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae hacia larvas del tercer instar de Phyllophaga spp. (Figura 3). De todos los aislamientos evaluados, sobresalen los aislamientos BbGC07 con 45 % de mortalidad, seguido por BbGC15 con 35% y BbGC03 con 33%, todos del gnero Beauveria. Los anlisis se realizaron con base en las mortalidades totales considerando mortalidad por micosis y mortalidad por causas no identificadas. Sin embargo, al observar los niveles de mortalidad confirmada por hongo nicamente, otros aislamientos sobresalen, como por ejemplo BbGC03, BbGC13, BbGC15, MaGC01, BbGC11, BbGC09, BbGC14 y BbGC16 (Fig.3).

Figura 3. Mortalidad de larvas del tercer instar de Phyllophaga spp. despues de 32 das de inoculadas con 12 aislamientos de Beauveria bassiana y 4 de Metarhizium anisopliae.

4.5 Virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp Experimento en progreso. 4.6 Efecto del gnero de gallina ciega en la virulencia de los aislamientos seleccionados Experimento en progreso. 4.7 Efecto de la temperatura en la virulencia de los aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp. Experimento en progreso. 4.8 Efecto del tipo de suelo en la virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp Para este experimento se tiene ya caracterizado los tipos de suelo que se evaluaran y los resultados se presentan a continuacin. En el Cuadro 2 y Figura 4 se presenta las poblaciones microbianas presentes en el suelo muestreado en cinco localidades de Guanajuato. De los tres grupos microbianos evaluados, las bacterias se encontraron en mayor abundancia (Figura 4), comparado con las poblaciones de actinomicetos y hongos. Las bacterias son los primeros colonizadores en la descomposicin de la materia orgnica y por su tamao es comprensible que se encuentren en grandes proporciones. En el suelo pueden encontrarse de 106 a 107 UFC/ g de suelo seco (Alexander, 1980). Cuadro 2. Poblacin de grupos microbianos en suelos del sur de Guanajuato
Bacterias Muestras pH Actinomicetos UFC / g de suelo seco UFC X 106 San Lorenzo, Jerecuaro:Guanajuato Puruagua,Jerecuaro: Guanajuato Valle de Santiago:Guanajuato Penjamo: Guanajuato Comonfort: Guanajuato 6.2 6.2 7.7 6.6 6.3 9.15 6.85 12.1 13.1 40.8 UFC X 104 2.27 7.97 79.5 43.5 19 UFC X 104 2.27 31.5 3.51 25.8 7.17 Hongos

Las poblaciones de actinomicetos en general fueron un poco superiores a las poblaciones de hongos (Figura 3). En el suelo, su proporcin es menor que la de las bacterias pero en mayor nmero que la de los hongos, con rangos estimativos entre 1-5-1-8 por gramo de suelo seco (Gray y Williams, 1971). Las poblaciones de hongos en el suelo coinciden con los reportes de Alexander (1980) quien menciona que en el suelo hay entre 2-4-1-6 propgulos por gramo de suelo seco. En el caso de diversidad de hongos en el suelo, en las muestras monitoreadas se encontr muy poca diversidad.

Los valores de las poblaciones pueden variar mucho entre suelos. Un gramo de suelo agrcola contiene varios millones de bacterias, cientos de miles de propgulos de hongos y decenas de millones de protozoarios y algas (Campbell, 2005). La distribucin de las poblaciones de microorganismos en el suelo est determinada por las partculas de las cuales estn constituidos los suelos, la cantidad de nutrientes y el pH. Los suelos que monitoreamos tienen poblaciones altas de microorganismos, al parecer el pH no influyo sobre las poblaciones. En general, esto se debe a que las prcticas agrcolas como el arado, encalado, aplicacin de fertilizantes, etc, incrementan la actividad microbiana del suelo. Los suelos provenan de suelos arados y preparados para la siembra de maz probablemente por esa razn se encontr poblaciones altas de microorganismos. Las actividades agrcolas como el arado del suelo incrementan las poblaciones de los microorganismos, porque mezcla la materia orgnica que se encuentra en la superficie con todo el suelo y esto permite que tanto bacterias como actinomicetos y hongos se reproduzcan.

Figura 4. Anlisis cuantitativo de las poblaciones microbianas de diferentes suelos muestreados en el sur del estado de Guanajuato.

4.9 Evaluacin de los aislamientos a nivel de invernadero Experimento en proceso de establecimiento. 4.10 Evaluacin de aislamientos a nivel de campo Experimento en proceso de establecimiento.

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