LUCRARE PRACTIC|

14

ANALIZA SPECTRAL|
A. Analiza spectral\ de emisie punerea `n eviden]\ a sodiului `n produsele biologice: A1. Spectroscopul cu trei bra]e A2. Spectroscopul PASCO B. Analiza spectral\ de absorb]ie - identificarea unor deriva]i de hemoglobin\: - Spectroscopul liniar C. ~ntreb\ri [i exerci]ii

Aceast\ lucrare practic\ v\ propune familiarizarea cu unele tehnici de spectroscopie prin luarea `n considerare a interac]iunii luminii cu materia, `n cursul c\reia atomii sau moleculele absorb sau emit lumin\ `ntr-un mod caracteristic. Prin m\surarea energiilor tranzi]iilor electronice, ansamblul metodelor spectroscopice face posibil\, `n laboratoarele clinice, dar [i `n cele de cercetare, analiza calitativ\ [i cantitativ\ a unor elemente chimice, precum [i a entit\]ilor moleculare mai complexe. Practic, `n lucrarea de fa]\, ve]i identifica sodiul [i unii deriva]i de hemoglobin\ prin intermediul spectrelor lor caracteristice.
253

LUCRARE PRACTIC|

PARTEA PRACTIC|
Principiul metodei Sodiul este depistat `ntr-un produs biologic lichid, dup\ aducere `n stare atomic\ prin volatilizare `n flacar\, cu ajutorul unui spectroscop cu prism\, identificnd liniile spectrale de emisie caracteristice acestui element.

Aparatele spectrale sunt dispozitive utilizate `n practic\ pentru studiul spectrelor. Ele sunt compuse `n general din trei elemente principale: sistemul dispersiv; receptorul; sursa luminoas\ luminoas\.

Descrierea spectroscopului cu trei bra]e

utilizat este alc\tuit din urm\toarele p\r]i componente ilustrate `n figura 3: o prism\ prism\ optic\ optic\ P din sticl\ (cu putere de dispersie suficient\, a[ezat\, pentru claritate maxim\, la devia]ie minim\), colimatorul C1 este un tub cilindric prev\zut la un cap\t cu o fant\ liniar\ (`ngust\), a[ezat\ `n focarul lentilei. Deschiderea fantei este reglabil\ prin intermediul unui [urub micrometric, un alt colimator C2 prev\zut la un cap\t cu o scal\ gradat\ (`n diviziuni echidistante, arbitrare; exist\ [i aparate ce au scala gradat\ direct `n unit\]i de lungime de und\ - nm) ce este proiectat\ de sursa luminoas\ S2 pe fa]a de emergen]\ a prismei, luneta L folose[te la observarea direct\ a razelor luminoase (organ receptor - ochiul); este compus\ din obiectivul Ob [i ocularul Oc (sistem de lentile), sursele de lumin\ lumin\ S1 [i S2.
254

Spectroscopul

a)

LUCRARE PRACTIC|
S2

C2

F S1

C1 L P

Spectroscopul cu trei bra]e a) imagine de ansamblu b) schema de principiu a spectroscopului cu trei bra]e

Fig. 3

b)

Materiale necesare: spectroscop cu trei bra]e (avnd scala neetalonat\), surse de lumin\ cu spectru cunoscut (pentru etalonare): - tub luminescent cu vapori de mercur, - bec cu neon, bec de gaz, plac\ de azbest ce poate fi a[ezat\ pe stativ pentru aducerea la incandescen]\ a sodiului (`n scopul ob]inerii sodiului atomic), produs de cercetat `n stare lichid\.

Razele luminoase, ce p\trund prin fanta iluminat\ de sursa S1, dup\ trecerea prin lentil\, cad pe fa]a de inciden]\ a prismei P, dup\ care sufer\ un fenomen de dispersie, fiind deviate invers propor]ional cu (ex. razele albastre - mic- sunt mai puternic deviate, cele ro[ii - mare- mai pu]in deviate). Fasciculul de lumin\ ajunge prin intermediul lunetei la ochiul experimentatorului. Imaginea ce poate fi observat\ va cuprinde imaginea spectrului suprapus\ peste imaginea scalei gradate.

Timpii de lucru:

1. Etalonarea aparatului Se conecteaz\ sursa de lumin\ S2 la re]ea Se conecteaz\ tubul luminescent cu vapori de mercur la re]ea; fanta colimatorului C1 trebuie centrat\ `n dreptul ferestrei dreptunghiulare practicat\ `n `nveli[ul acestuia. Acest tip de tub con]ine vapori metalici (mercur) `ntr-un tub de sticl\ sau silica. Electrozii p\trund `n tubul `nchis ermetic, iar vaporii sunt excita]i de desc\rc\rile electrice produse de diferen]a de poten]ial electric existent `ntre cei doi electrozi. Acest tip de l\mpi

furnizeaz\ spectre de linii.

Se regleaz\ l\rgimea fantei F prin intermediul [urubului micrometric astfel `nct liniile spectrale s\ fie vizibile [i suficient de `nguste.
255

12

LUCRARE PRACTIC|

579 577 546

492

436

408 nm

Spectrul mercurului 1 - galben, 2 - galben, 3 - verde, 4 - verde-albastru, 5 - indigo, 6 violet.

Fig. 4

Se regleaz\ ocularul aflat la extremitatea lunetei prin dep\rtare sau apropiere, pentru claritatea imaginii scalei. ~n cmpul vizual apare spectrul mercurului (fig. 4) peste care se suprapune imaginea scalei gradate atunci cnd este ac]ionat `ntrerup\torul ce comand\ sursa de iluminare a scalei. Privind prin luneta L se identific\ liniile spectrului de emisie al mercurului [i coresponden]a lor cu diviziunile scalei [i se trec `n caietele de referate `ntr-un tabel asem\n\tor cu cel prezentat mai jos. Se `nlocuie[te lampa cu vapori de mercur cu un bec cu neon, procedndu-se `n mod analog. Spectrul caracteristic neonului este prezentat `n figura 5. Cu ajutorul valorilor tabelate se traseaz\ graficul, `n sistem de coordonate XOY, reprezentnd pe abscis\ diviziunile scalei gradate [i pe ordonat\ lungimile de und\ corespunz\toare. 2. Depistarea biologice

640

614

585

nm

prezen]ei

sodiului

`n

produsele

Spectrul neonului 1 - ro[u aprins, 2 - ro[u-oranj, 3 - galben

(nm)

Fig. 5

Se a[eaz\ becul de gaz la 10-15 cm de fanta F a colimatorului C1, se aprinde cu grij\, reglndu-se arderea astfel `nct flac\ra s\ fie incolor\. Se conecteaz\ doar sursa S2 la re]ea. Se depune produsul de cercetat (prin picurare) pe pl\cu]a de azbest, apoi se introduce aceasta `n flac\r\, cu ajutorul stativului. Privind prin luneta spectroscopului etalonat [i reglat, `n cazul prezen]ei sodiului `n produsul de cercetat (condi]ionat de o densitate de atomi optim\, dependent\ la rndul s\u de concentra]ia `n flac\r\ a solu]iei) se vor observa cele dou\ linii spectrale caracteristice sodiului, foarte apropiate (D1 = 589,5 nm [i D2 = 589 nm). Valoarea lungimilor de und\ corespunz\toare diviziunilor scalei gradate se afl\ cu ajutorul graficului graficului de eta etalonare (ce se realizeaz\ obligatoriu pe hrtie
diviziunile scalei

milimetric\ sau cu ajutorul unui program de reprezentare grafic\ la calculator): se noteaz\

Graficul de etalonare

Fig. 6

num\rul diviziunilor pe abscis\, se ridic\ verticala pn\ la intersec]ia cu graficul, de unde se duce o orizontal\ pn\ la intersec]ia cu ordonata, punct `n care se cite[te valoarea lungimii de und\ a radia]iei respective. Se trece apoi `n tabel.

256

LUCRARE PRACTIC| Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Sursa de lumin\ lumin\ Etalon MERCUR MERCUR Culoarea radia]iei violet indigo verde-albastru verde galben galben Lungimea de und\ und\ (nm) 408 436 492 546 577 579 Diviziunea scalei

7. 8. 9.

Etalon NEON

galben ro[u-oranj ro[u-aprins

585 614 640

Produsul de cercetat

Spectroscopul produs de firma PASCO prezint\ urm\toarele p\r]i componente (fig. 7): o prism\ optic\, u n t e l e s c o p pentru observarea razelor difractate (echivalentul lunetei de la spectroscopul cu trei bra]e), u n c o l i m a t o r ce prezint\ la extremitatea ndreptat\ spre sursa de lumin\ o fant\ reglabil\. Att masa pe care este fixat telescopul, ct [i cea de fixare a colimatorului sunt reglabile (pot glisa, astfel nct s\ alinieze telescopul [i colimatorul fa]\ n fa]\).
6

Descrierea spectroscopului PASCO

Fig. 7

Spectroscopul PASCO 1. colimator, 2. prism\, 3. telescop, 4. mas\ de fixare a telescopului, 5. mas\ de fixare a colimatorului, 6. clem\ de fixare a prismei.

1 5

257

fir reticular vertical fir reticular orizontal

LUCRARE PRACTIC|

Fig. 8

Dispunerea perpendicular\ a firelor reticulare

Alinierea telescopului

Fig. 9

1. Etalonarea aparatului - se a[eaz\ spectroscopul pe o suprafa]\ perfect plan\, - se focalizeaz\ telescopul la infinit [i se regleaz\ imaginea pn\ ce firele reticulare (cel orizontal [i cel vertical) se suprapun perpendicular (a[ezate `n cruce) ca `n figura 8, - se verific\ dac\ fanta colimatorului este par]ial deschis\, - se aliniaz\ telescopul n direc]ie opus\ colimatorului, ca n figura 9, - linia luminoas\ vertical\ ce trece prin fanta colimatorului s\ fie centrat\ pe intersec]ia firelor reticulare lae telescopului. 2. Utilizarea prismei (fig. 10) ca element de difrac]ie are avantaje [i dezavantaje comparativ cu re]eaua de difrac]ie: indicele de refrac]ie este invers propor]ional cu lungimea de und\ incident\. Astfel, pentru m\surarea lungimii de und\ folosind prisma trebuie realizat un grafic de coresponden]\ ntre lungimea de und\ [i unghiul de refrac]ie folosind o surs\ de lumin\ cu spectru cunoscut. Lungimea de und\ necunoscut\ a unor linii spectrale poate fi determinat\ prin interpolarea graficului de etalonare. Telescopul poate fi rotit pentru observarea spectrelor emise, m\surndu-se ulterior, foarte precis, unghiul de difrac]ie. Cunoscnd valorile unghiului de difrac]ie se pot determina lungimile de und\ ale sursei de lumin\ emi]\toare.

Timpii de lucru

Etalonarea spectroscopului

Fig. 10

M\surarea unghiului de difrac]ie

Unghiurile de difrac]ie se m\soar\ utiliznd scala vernier (vezi fig. 11). Aliniindu-se fa]\ `n fa]\ telescopul [i colimatorul unghiul citit este 0. Se rote[te apoi telescopul pentru observarea liniei spectrale [i se cite[te pe scala vernier unghiul . Diferen]a (-0) corespunde unghiului de difrac]ie (vezi fig. 12).

15 (pe scala vernier) 155 pe scal\ 155 + 15 = 15515 Fig. 11

Citirea unghiului de difrac]ie

Fig. 12 12

258

M\surarea unghiului de difrac]ie

LUCRARE PRACTIC|

B. ANALIZA SPECTRAL| DE ABSORB}IE identificarea deriva]ilor hemoglobinei

PARTEA PRACTIC|
Principiul metodei Hemoglobina este o protein\ compus\ dintr-o frac]iune pigmentar\ care con]ine fier (numit\ hem), combinat\ cu o protein\ - globina. ~n mod normal fierul se g\se[te `n stare feroas\ Fe3+ permi]nd o combina]ie labil\ a hemoglobinei cu oxigenul oxioxihemo hemoglobina - responsabil\ de transportul oxigenului `n snge. Al\turi de oxihemoglobin\ (compus fiziologic) `n unele st\ri patologice pot apare [i compu[i anormali, stabili ai hemoglobinei (fierul fiind `n stare feric\ Fe2+) cum ar fi: hemoglobina redus\ redus\, methemoglobina, methemoglobina carboxihemoglobina, carboxihemoglobina cian cianhemohemoglobina. globina Ace[ti compu[i nocivi ai organismului pot fi detecta]i calitativ prin analiza spectral\ de absorb]ie, prin eviden]ierea spectrelor de absorb]ie caracteristice acestora prin intermediul spectroscopului liniar.

Materiale necesare: Spectroscop liniar cu scala etalonat\ `n lungimi de und\, fixat `ntr-un stativ `mpreun\ cu cele dou\ surse de lumin\ alb\ S1 [i S2 Stativ cu suport pentru eprubete Eprubete Snge heparinat Ap\ distilat\ Solu]ie Stockes Solu]ie de ferocianur\ de potasiu sau clorat de potasiu Dispozitiv special pentru barbotarea gazului metan `n solu]ia de snge (numai pentru ob]inerea carboxihemoglobinei).

Descrierea spectroscopului liniar

Dispozitivul respect\ schema general\ de alc\tuire a spectroscoapelor, `n care elementul dispersiv, denumit prisma Amici [i constituit dintr-un sistem de trei prisme (fig. 13) are drept scop m\rirea puterii de rezolu]ie cromatic\ cromatic\ (ce define[te calitatea unui spectroscop). Pentru o lungime de und\ medie, raza emergent\ iese din prisma Amici dup\ direc]ia razei incidente, motiv pentru care se mai nume[te [i prism\ cu vedere

direct\.

Sistemul de prisme Amici

Fig. 13

Pentru func]ionarea spectroscopului sunt necesare dou\ surse de lumin\ : S1 - sursa de lumin\ cu spectru continuu situat\ lateral; spectrul s\u este proiectat la partea inferioar\ a spectrului de examinat, realiznd un spectru de control;
259

LUCRARE PRACTIC|

S2 - cu spectru continuu a[ezat\ `n dreptul eprubetei cu solu]ia de cercetat, serve[te la realizarea spectrului de absorb]ie al acesteia. Receptorul este ochiul experimentatorului, care examineaz\ prin intermediul ocularului cmpul spectroscopului `n care vor fi deci vizibile, simultan cu spectrul de examinat, [i spectrul de control [i scala gradat\, etalonat\ direct `n nm, permi]nd, deci, citirea direct\ a lungimilor de und\. Schema de principiu a spectroscopului liniar este redat\ `n figura 14 a) [i b):
SG

a)
E F

S3

S2 S1

PA

b)

a) Spectroscopul liniar (geometric) b) Schema de principiu a spectroscopului liniar: S1, S2, S3 - surse de lumin\ alb\, E - eprubet\, F - fant\ reglabil\, PA - prisme Amici, SG - scal\ gradat\ `n nanometri

Fig. 14

Timpii de lucru

1. Reglarea spectroscopului

Se conecteaz\ spectroscopul la re]ea Se examineaz\ lumina unei l\mpi de sodiu Se verific\ coresponden]a liniei spectrale a sodiului, ap\rut\ `n cmpul ocularului, cu valoarea cunoscut\ din tabel, deplasndu-se eventual scala gradat\ pn\ la realizarea coresponden]ei.

2. Realizarea spectrelor de absorb]ie caracteristice hemoglobinei [i deriva]ilor s\ s\i

Se realizeaz\ o solu]ie de snge hemolizat: cteva pic\turi de snge heparinat sunt introduse `ntr-un volum mare de ap\ distilat\ (aprox. 50 ml). Se realizeaz\ succesiv solu]ii de oxihemoglobin\, hemoglobin\ redus\, methemoglobin\ (a se vedea mai jos tehnica de ob]inere) [i se a[eaz\ `n stativul
260

LUCRARE PRACTIC|

special construit, observndu-se, pe rnd, intervalele de lungimi de und\ corespunz\toare spectrelor de absorb]ie ale fiec\rei solu]ii.

a) Spectrul oxihemoglobinei: Mod de ob]inere: se separ\ `ntr-o eprubet\ 5 ml

B C

ro[u oranj

galben verde albastru indigo

Spectrul oxihemoglobinei
BC D E F
G

Fig. 15 15

de snge hemolizat, omogenizndu-se solu]ia pentru o bun\ oxigenare cu o baghet\ de sticl\. Spectru: oxihemoglobina prezint\ dou\ benzi `ntunecate (de absorb]ie) caracteristice, una `n regiunea verde (552-527 nm, max. la 542 nm) [i alta `n regiunea galben\ (587-568 nm, max. la 578 nm) (fig. 15).

b) Spectrul hemoglobinei reduse: Mod de ob]inere: `n eprubeta `n care s-a realizat

oxihemoglobina se adaug\ cteva pic\turi dintr-un reduc\tor - solu]ie Stockes sau solu]ie sulfat feros. Oxihemoglobina fiind un compus foarte instabil poate ceda `n anumite condi]ii o parte din oxigen, rezultnd hemoglobina redus\. Culoarea sngelui devine `n acest caz mai `nchis\, cu o nuan]\ alb\struie. Spectru: este format dintr-o singur\ band\ `ntunecoas\ (banda lui Stockes) ce ocup\ locul celor dou\ benzi ale oxihemoglobinei (fig. 16).

ro[u oranj

galben verde albastru indigo

Spectrul hemoglobinei reduse

BC D E F
G

Fig. 16 16

c) Spectrul methemoglobinei: Mod de ob]inere: `n eprubeta cu oxihemoglobin\

se adaug\ ferocianura de potasiu. Se realizeaz\ methemoglobina, compus mai stabil dect oxihemoglobina, `n aceast\ combina]ie fierul fiind trivalent. Methemoglobina apare `n sngele subiec]ilor intoxica]i cu anumite medicamente ca: nitra]i, clora]i, sulfa]i, acetanilid\, subnitrat de bismut, compu[i nitrobenzenici, precum [i `n methemoglobinemiile congenitale. ~n cazul prezen]ei sale, sngele este mai deschis la culoare. Spectru: methemoglobina prezint\ patru benzi de absorb]ie, dintre care o band\ caracteristic\ situat\ `n ro[u `ntre 642-624 nm, cu max. la 633 nm (fig. 17).

ro[u oranj

galben verde albastru indigo

Spectrul methemoglobinei
BC D E F
G

Fig. 17 17

ro[u oranj

galben verde albastru indigo

d) Spectrul carboxihemoglobinei: Mod de ob]inere: se barboteaz\ oxid de carbon

`ntr-o solu]ie de hemoglobin\ (snge hemolizat); culoarea sngelui devine cire[ie. Acest lucru se va realiza practic prin barbotarea gazului metan pentru cteva minute `n solu]ia de snge. Dispozitivul special pentru barbotarea gazului metan va fi adaptat la becul becul de gaz numai de c\ c\tre laborantul care asist\ asist\ la lucr\ lucr\rile practice! Carboxihemoglobina apare `n sngele celor intoxica]i cu oxid de carbon.
261

Spectrul carboxihemoglobinei

Fig. 18

LUCRARE PRACTIC|

Spectru: prezint\ dou\ benzi de absorb]ie sensibil apropiate celor caracteristice oxihemoglobinei (`n galben [i verde, cu max. la 570 nm [i respectiv la 539 nm). Diferen]a dintre oxihemoglobin\ [i carboxihemoglobin\ se evinden]iaz\ cu reactivul Stockes: oxihemoglobina se reduce `n prezen]a acestuia la hemoglobin\ redus\ cu banda sa caracteristic\, `n timp ce `n cazul carboxihemoglobinei nu apare nici o modificare de spectru (vezi fig. 18, pagina anterioar\).
Substan]a Valori teoretice Valori practice culoarea interval culoarea interval radia]iei de radia]iei de lungimi lungimi de und\ de und\ galben 587568 verde 552527 verde 565545 ro[u 642624 galben max. 570 verde max. 539

OxihemoOxihemoglobin\ globin\ HemogloHemoglobin\ \ redus\ bin dus\ MethemoMethemoglobin\ globin\ Carboxihe Carboxihehemoglobin\ moglobin\

Rezultate experimentale: experimentale: Valorile lungimilor de und\ corespunz\toare radia]iilor absorbite (respectiv limitele benzilor spectrale) observate experimental se vor trece `n caietele de referate `ntr-un tabel de rezultate. Se vor compara valorile ob]inute experimental cu cele men]ionate `n literatura de specialitate, prezentate `n tabelul al\turat.

262