BIOQUMICA Y MICROBIOLOGA AMBIENTAL

SEMANA 3

CRECIMIENTO Y METABOLISMO MICROBIANO:

REPRODUCCIN BACTERIANA: Generalmente las bacterias se reproducen por biparticin, como se ve en el siguiente esquema:

Tras la duplicacin del ADN, que est dirigida por la ADN-polimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared bacteriana crece hasta formar un tabique transversal separador de las dos nuevas bacterias. Pero adems de este tipo de reproduccin asexual, las bacterias poseen unos mecanismos de reproduccin sexual o parasexual, mediante los cuales se intercambian fragmentos de ADN. Puede realizarse por: Conjugacin: en este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a travs de un puente o pili, un fragmento de DNA, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plasmidio, adems del cromosoma bacteriano.

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Esquema de la conjugacin bacteriana. 1-La clula donante genera un pili. 2-El pili se une a la clula receptora y ambas clulas se aproximan. 3-El plsmido mvil se desarma y una de las cadenas de ADN es transferida a la clula receptora. 4-Ambas clulas sintetizan la segunda cadena y regeneran un plsmido completo. Adems, ambas clulas generan nuevo pili y son ahora viables como donantes. Transformacin: Consiste en el intercambio gentico producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive. Transduccin: En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra, se realiza a travs de un virus bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

En las bacterias, el aumento en el tamao de las clulas (crecimiento) y la reproduccin por divisin celular estn ntimamente ligados, como en la mayor parte de los organismos unicelulares. Las bacterias crecen hasta un tamao fijo y despus se reproducen por fisin binaria, una forma de reproduccin asexual. En condiciones apropiadas, una bacteria Gram-positiva puede dividirse cada 2030 minutos y una Gram-negativa cada 1520 minutos, y en alrededor de 16 horas su nmero puede ascender a unos 5.000 millones (aproximadamente el nmero de personas que habitan la tierra). Bajo condiciones ptimas, algunas bacterias pueden crecer y dividirse muy rpido, tanto como cada 9,8 minutos. En la divisin celular se producen dos clulas hijas idnticas. Algunas bacterias, todava reproducindose asexualmente, forman estructuras reproductivas ms complejas que facilitan la dispersin de las clulas hijas recin formadas. Ejemplos incluyen la formacin de cuerpos fructferos (esporangios) en las mixobacterias, la formacin de hifas en Streptomyces y la gemacin. En la gemacin una clula forma una protuberancia que a continuacin se separa y produce una nueva clula hija. CRECIMIENTO BACTERIANO

Fases del crecimiento bacteriano. El crecimiento bacteriano sigue cuatro fases. Cuando una poblacin bacteriana se encuentra en un nuevo ambiente con elevada concentracin de nutrientes que le permiten crecer necesita un perodo de adaptacin a dicho ambiente. Esta primera fase se denomina fase de adaptacin o fase lag y conlleva un lento crecimiento, donde las clulas se preparan para comenzar un rpido crecimiento, y una elevada tasa de biosntesis de las protenas necesarias para ello, como ribosomas, protenas de membrana, etc. La segunda fase de crecimiento se denomina fase exponencial, ya que se caracteriza por el crecimiento exponencial de las clulas. La velocidad de crecimiento durante esta fase se conoce como la tasa de crecimiento k y el tiempo que tarda cada clula en dividirse como el tiempo de generacin g. Durante esta fase, los nutrientes son

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metabolizados a la mxima velocidad posible, hasta que dichos nutrientes se agoten, dando paso a la siguiente fase. Se denomina fase estacionaria y se produce como consecuencia del agotamiento de los nutrientes en el medio. En esta fase las clulas reducen drsticamente su actividad metablica y comienzan a utilizar como fuente energtica aquellas protenas celulares no esenciales. La fase estacionaria es un perodo de transicin desde el rpido crecimiento a un estado de respuesta a estrs, en el cual se activa la expresin de genes involucrados en la reparacin del ADN, en el metabolismo antioxidante y en el transporte de nutrientes. La Fase de declinacin es aquella donde las clulas bacterianas mueren. Crecimiento es el aumento ordenado en todos los componentes de un organismo. La multiplicacin celular es una consecuencia del crecimiento; en organismos unicelulares la multiplicacin conduce a un aumento en el nmero de individuos dando lugar a una poblacin o un cultivo. La reproduccin trae consigo el crecimiento y desarrollo de las bacterias, es decir el aumento en clulas de una colonia o poblacin. El aumento va en progresin geomtrica: N= log N- log A log 2 Donde: N= Nmero total de bacterias. A= Nmero de bacterias iniciales. N= Nmero de generaciones. g= Tiempo de generacin. En la prctica es costumbre expresar la velocidad de crecimiento de un cultivo microbiano en trminos de generaciones por hora. Una generacin se define como la duplicacin del nmero de clulas. As por ejemplo: Si un inculo de 103 clulas crece exponencialmente hasta 1X109 clulas: N=log (109)-log (103)=9-3= 20 generaciones Log 2 0.3

Si por ejemplo este crecimiento requiri 13.3 horas, la velocidad de crecimiento fue 20/13.3 es decir 1.5 generaciones por hora. Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisn celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: 1. 2. A escala individual. A escala poblacional.

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Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los siguientes temas: 1. 2. 3. 4. Inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos. Segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas. Sntesis de nuevos materiales, sobre todo de la pared celular. Seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye lo siguiente: 1. 2. 3. Cintica de crecimiento. Factores que afectan el tiempo de generacin. Factores ambientales que limitan el crecimiento.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS En la prctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan siempre con poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su crecimiento en un medio de cultivo. El crecimiento de una poblacin o cultivo bacteriano se puede expresar en funcin de: A. Aumento de masa del cultivo. B. Aumento del nmero de clulas.

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo). A. MEDIDA DE MASA CELULAR. a. Mtodos Directos: 1) Determinacin del peso hmedo: Se tara un tubo de centrfuga; luego se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante. Finalmente se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. 2) Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 3) Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl.

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4) Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc. Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales. b. Mtodos Indirectos: 1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos. 2) Mtodos turbidimtricos (pticos). Son muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la supensin). Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema. Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml. b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.

B. MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS. a. Mtodos Directos: 1) Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas: Excavacin con 0.02 mm de profundidad; rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4=16 cuadrados pequeos, es decir la muestra se distribuye en 16x25=400 celdillas (cuadrados pequeos).

La muestra, una vez distribuida entre el porta y el cubre objeto, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas

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(normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentracin celular es fcil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml. Ventajas: es un mtodo muy rpido. Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente. En bacterias mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua. 2) Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 m dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula). Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas extraas (las pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato). b. Mtodos Indirectos: 1) Recuento de las clulas viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la prctica correspondiente, que se suele realizar en la 3 tanda). Precauciones: Para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilucin. Hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin. Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias. Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un indiviudo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a clulas viables reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembr en placa infravalora el nmero real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms individuos que estaban juntos

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al ser sembrados en la placa.

2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

CULTIVO DISCONTINUO: Los cultivos discontinuos pueden considerarse como un sistema cerrado excepto para la aireacin, contiene una cantida limitada de medio, en el que el inoculado pasa a travs de un nmero de fases, el sustrato se aade al inicio del proceso.

CULTIVO CONTINUO: Los cultivos continuos pueden considerarse como un sistema abierto, en el que el medio se va aadiendo continuamente al biorreactor y se va eliminando simultneamente igual volumen de producto.

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