Resumen Prcticas7,8,9 Bacteriologa. M. en C. Yolanda Guevara G. Octubre 2010.

COPROCULTIVO Tiene por objetivo Aislar, Diferenciar e Identificar agentes bacterianos causantes de infecciones gastrointestinales, discriminando la flora intestinal normal Entre los agentes etiolgicos ms importantes se encuentran Salmonella, Shigella y Escherichia coli. Seguidamente de Klebsiella, Campylobacter sp., Yersinia, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus y Clostridium difficile. Obtencin de La Muestra: El diagnostico se realiza mediante cultivo de los microorganismos presentes en la materia fecal. El paciente este cursando la enfermedad No se encuentre bajo tratamiento antimicrobiano. Obtener una muestra de materia fecal en frasco estril boca ancha. Tomar una pequea porcin con un hisopo o abatelenguas estril de zonas con moco y sangre preferentemente. Introducir el hisopo en medio de transporte y llevarlo al

laboratorio. Si la muestra no puede obtenerse con este mtodo sobretodo en pacientes peditricos o geriatricos debe realizarse: Hisopado rectal: Introduciendo un hisopo esteril hasta rebasar el esfnter anal y rotarlo suavemente.Retirar el hisopo e introducirlo en un tubo con medio de transporte. Otros mtodos auque ms invasivos son la Proctoscopia y Sigmoidoscopa. Tiempo de envi al laboratorio Tiene que ser enviada en de 2 hrs. Porque es muy lbil al medio ambiente (fro, desecacin, T). La Refrigeracin es perjudicial para algunas cepas de Shigella. Si no se puede analizar inmediatamente, es recomendable el uso de medios de transporte Cary Blair, Stuart, Amies, los cuales carecen de nutrimentos, contiene sales y tioglicolato que preservan la viabilidad sin que ocurra crecimiento considerable mantener a temperatura ambiente. Medios de cultivo y pruebas bioqumicas tiles en Coprocultivo: Medio de transporte: Cariblair, Stuart, Amies Medios de enriquecimiento: CaldoTetrationato, Caldo Selenito Medios Selectivos: SS, VB. Diferenciales: EMB, McConkey, SS

Pruebas bioqumicas: TSI agar hierro - triple azcar LIA agar hierro lisina, MIO Movilidad indol ornitina Citrato de Simmons PRUEBAS BIOQUMICAS: TSI, LIA, MIO, CITRATO DE SIMMONS: TSI: Triple azcar hierro Determina la fermentacin de carbohidratos Produccin o no de gases Produccin de cido sulfhdrico H2S. Interpretacin: FERMENTACIN DE GLUCOSA: fondo del tubo el medio cambia a amarillo FERMENTACIN DE LACTOSA: La superficie del tubo el medio cambia a amarillo FERMENTACIN DE SACAROSA: Todo el tubo cambia a amarillo PRODUCCIN DE GAS: burbujas en el medio y/o el medio se desplaza hacia arriba. PRODUCCIN DE ACIDOSULFRICO: Precipitado negro en el fondo del tubo. MEDIO SIN ACTIVIDAD METABOLICA: Rojo naranja LIA: Agar hierro lisina

Determina la Descarboxilacin y Desaminacin de la lisina, as como la Produccin de SH2. Interpretacin: Fermentacin de la glucosa : el medio se torna amarillo. Descarboxilacin de la lisina: + el medio se torna color prpura, - el medio permanece amarillo. Desaminacin de la lisina: la superficie del medio se torna rojo/naranja . No degradacin base del tubo amarillo plido. Produccin de HS2 precipitado negro en la base del agar del tubo. MIO: Movilidad Indol Ornitina: Movilidad: Determina movilidad de un microorganismo. Interpretacin: Turbidez en el medio fuera del rea de inoculacin. Indol: Se detecta a partir del triptfano. Se manifiesta cuando se adiciona reactivo de Kovac o reactivo de Ehrlich.. Interpretacin: Indol + Formacin de anillo rojo Indol - Formacin de anillo amarillo

Ornitina: Determina la descarboxilacin de la ornitina. Interpretacin: Descarboxilacin: medio color lila o violeta NO Descarboxilacin: el medio vira a amarillo CITRATO DE SIMMONS: Determina la capacidad de la bacteria a utilizar el citrato como nica fuente de carbono para la obtencin de energa, provocando una alcalinizacin del medio. Interpretacion: citrato + el medio se torna azul citrato - el medio se mantiene de color verde SIEMBRA DE PRUEBAS BIOQUIMICAS: TSI: En el fondo por picadura y luego, en la superficie inclinada por estra. LIA: En el fondo por picadura y luego, en la superficie inclinada por estra. MIO: Por picadura con aguja de cultivo. CS: Por estra en la superficie inclinada del medio UROCULTIVO.El Urocultivo debe realizarse cuando hay signos de infeccin urinaria. uretritis (infeccin de la uretra), cistitis (infeccin de la vejiga), sndrome uretral agudo* y pielonefritis (inflamacin parnquima renal),.

*En mujeres (disuria= Emisin dolorosa o dificultosa de la orina) polaquiuria (miccin frecuente y de escaso volumen) Otros casos: pacientes sin sntomas de IU, bacteriuria o piuria de origen desconocido, obstruccin del aparato urinario, seguimiento despus de retirar catter permanente, seguimiento de tratamiento previo. La infeccin de vas urinarias (IVU) es una de las infecciones bacterianas ms frecuentes durante la infancia y su espectro va desde una bacteriuria asintomtica a una pielonefritis aguda (PNA). Las IVU se desarrollan como consecuencia de infecciones endgenas provenientes de otras partes del organismo, tales como septicemias o bacteriemias. Factores predisponentes de IVU: Cateterismo uretral prolongado Diabetes Hipertensin arterial Inmunosupresin Uropata obstructiva Alteraciones neurognicas de la vejiga Agentes etiolgicos causantes de IVU: Escherichia coli causa el 90% de las IVU, Enterococcus, Klebsiella, Enterobacter,

Proteus sp., Pseudomonas, Serratia, Citrobacter y Streptococcus pyogenes. Las IVU pueden ser producidas por agentes etiolgicos especficos y raras veces por flora mixta. Es muy importante entonces llevar a cabo estudios cuantitativos de bacterias viables en la orina. Indicaciones al paciente: 1. Orina de la maana (1 ml en nios, 10 ml ms en adultos. No debe administrarse lquidos antes de colectar la muestra porque esta se diluir. Previo aseo de genitales Al momento de la toma de muestra cuidar de no hacer contacto con piernas, vulva y que los dedos no toquen el borde del frasco. Colectar la orina emitida directamente en un recipiente estril, NO utilizar orinales o cmodos. En caso que la muestra no pueda analizarse inmediatamente despus de haberse obtenido, la muestra se debe mantener a 4C mximo 24 hrs. Tipos de colecta para la obtencin de la muestra:

Chorro medio de orina emitida espontneamente Catter vesical Por puncin (aspiracin) suprapbica de la vejiga Por sondas o catter Por cistoscopia Importancia de la toma de muestra:

Juntar el chorro del medio en el frasco estril 510ml. Descartar el ltimo chorro en el inodoro. Tapar el frasco inmediatamente despus de toma la muestra para evitar que se contamine. Hombres adultos: Lavado de manos con agua y jabn. Retraer completamente el prepucio, mantener as hasta que se haya recogido la orina. Limpiar el glande con jabn neutro y enjuagar con agua. Orinar en el frasco estril descartando el primer chorro en el inodoro. Juntar el chorro del medio en el frasco estril teniendo la precaucin de destaparlo momentos antes de usar Descartar el ltimo chorro en el inodoro y taparlo rpidamente para evitar contaminacin. Tcnica para nios (al acecho): En nios y nias mayores la orina se recoge de forma similar a los adultos. En nios y nias ms pequeos, la orina se recoger en colectores o bolsas estriles especialmente diseadas para ellos de la siguiente forma: Lavado cuidadoso de los genitales y rea perineal. Colocar la bolsa de plstico o el colector.

La orina normalmente es un lquido estril, por tanto es importante colectarla adecuadamente, ya que puede contaminarse con microorganismos de la flora normal del perin, la prstata, la uretra o la vagina.

Tcnica de chorro medio de orina emitida espontneamente: Mujeres adultas: La paciente debe quitarse la ropa interior. Aseo de manos con agua y jabn, secar con una toalla limpia. Separarn los labios vaginales y mantenerlos separados hasta el momento de recogida la orina. Con una gasa enjabonada lavar la vulva, de delante hacia atrs, repitiendo el proceso 4 veces. Enjuagar para eliminar los restos de jabn. Enjuagar nuevamente con abundante agua, sin secarse. Destapar el frasco momentos antes de usar. Descartar el primer chorro en el inodoro.

Vigilar la bolsa cada 30 minutos y tan pronto como el nio haya orinado, debe retirarse y enviarse al laboratorio para su procesamiento. Si la miccin no se ha realizado en una hora, se repite la operacin colocando una nueva bolsa. Cateterismo: Se utiliza en pacientes geritricos, pacientes con vejiga neurognica. En algunos centros lo utilizan para lactantes en lugar de la toma al acecho. Catter permanente (Sonda) : Se limpia el catter o sonda con una gasa humedecida en alcohol o solucin yodada y dejar secar unos minutos. Se obtura la sonda con una pinza "ad hoc". Punzar el catter por encima de la entrada a la bolsa colectora directamente con la aguja, aspirando 3 5 ml de orina. Puede enviarse la jeringa o pasar la orina a un frasco estril. Este procedimiento tiene la desventaja de aumentar el riesgo de infecciones del tracto urinario (bacteruria). Catter semipermanente: Puede ser utilizado por personal capacitado para obtener orina directamente de la vejiga, por el procedimiento anteriormente descrito. No se recomienda de rutina ya que tiene el

riesgo de introducir microorganismos a la vejiga. Puncin suprapbica: El mtodo se reserva para casos especiales, como neonatos graves, lactantes, mujeres embarazadas y pacientes cuyos urocultivos previos presenten resultados DUDOSOS, o sospecha de microorganismos de difcil desarrollo. El procedimiento debe ser efectuado por mdicos entrenados. 1. Primeramente se verifica que el paciente presente globo vesical palpable (Vejiga llena). 2. Se desinfecta zona pubiana (1 o 2 cm encima del pubis) con alcohol yodado y se deja actuar 1 min. 3. Posteriormente se limpia con alcohol 70%. 4. Se extrae la orina en una jeringa a travs de una aguja que se introduce va percutnea. 5. Se aspira la orina y se vuelca en frasco estril. Citoscopia: La citoscopia es una exploracin endoscpica donde se introduce un tubo delgado a travs del meato uretral, accediendo a la uretra y vejiga urinaria. Este mtodo es poco usado para colecta de orina.

Transporte de la muestra Despus de recolectar la muestra debe ser enviada de inmediato al laboratorio, con la informacin necesaria: mtodo de obtencin, hora de la obtencin, diagnstico probable, si hay o no terapia antimicrobiana. La muestra debe ser cultivada dentro de las dos horas posteriores a la toma de la muestra, si esto es imposible refrigerar la muestra a 4C hasta por 24 hrs. Medios de cultivo tiles en Urocultivo: Agar sangre Agar manitol Agar MacConkey EMB Caldo Tetrationato Caldo selenito Dextrosa Sabouraud Agar Tergitol Agar CLED (Gram + y Gram -) Agar Biggy Incubar a 37C x 24 h Pruebas bioqumicas para identificar enterobacterias en orina: La reduccin de nitrato a nitrito refleja la presencia de organismos gram-negativos, excepto en el caso de Pseudomonas aeruginosa.

Pruebas de degradacin de aminocidos: LIA, MIO, y produccin de H2S. Citrato Simmons Pruebas de fermentacin de carbohidratos: Prueba de kligler o TSI (triple azcar hierro) En la bioqumica se evaluar la funcin renal. En IVU complicadas la Protena C reactiva srica se encuentra elevada y su determinacin peridica puede evaluarla respuesta al tratamiento. Deteccin de bacteriuria :Tincin de Gram Frotis: Colocar 10 l de orina en un portaobjetos Fijar, teir e identificar Determinar el N de microorganismos por campo de inmersin. Interpretacin: La presencia de 1 o + microorganismos por campo de inmersin correlaciona con una cuenta de 105 UFC/ml o sea 100.000UFC/ml. --- indica una IVU La presencia de muchas clulas epiteliales escamosas indica contaminacin ---- hay que repetir la muestra. La presencia de leucocitos (10 o ms) en orina es un indicador muy sensible de ITU. Existen mtodos rpidos de deteccin de bacteriuria: Tiras reactivas se utilizan para el anlisis rpido de la orina, permiten detectar la

presencia de eritrocitos, cristales, glucosa, cuerpos cetnicos o protenas, as como pH. Fotometra o bioluminiscencia. Mtodos de siembra de orina e interpretacin Procedimiento: 1. Se homogeniza la orina agitando el frasco por rotacin. 2. Empleando asas calibradas de 0.01 ml y/o 0.001 ml 3. Las muestras de orina de siembran en los medios de cultivo que se vayan a emplear. 4. Posteriormente se procede a incubar los cultivos a 37 C durante 24-72 horas. - Tcnica de dispersin con varilla de vidrio. La muestra se toma con asa calibrada, se deposita en el centro de la superficie del medio de cultivo, despus con una varilla de vidrio en forma de L se dispersa la muestra sobre la superficie del agar rotando la caja de Petri unas dos veces para asegurar la distribucin uniforme de la muestra. Tcnica de Kass. Se inocula el medio depositando la cantidad de muestra tomada con el asa calibrada en el centro del agar, apartir de ah se traza la lnea recta vertical de extremo a

extremo de la caja. Con la misma asa, sin esterilizarla, se realiza una estriacin en zigzag de manera que intercepte la lnea central de lado a lado. Este es el mtodo mas utilizado. - Tcnica de cultivo de cuatro estras. Se inocula con el asa calibrada, trazando 4 lneas verticales sin tomar ms muestra cada vez y sin esterilizar entre una y otra lnea. Parmetros de interpretacin. Existen diferentes normas de interpretacin de cultivos de muestras de orina. El recuento bacteriano de la muestra es la parte ms importante del urocultivo. El ms utilizado es de Kass-Stanford:

Criterios de Kass Stanford < 10,000 UFC/ml se considera contaminacin Entre 10,000 y 100,000 UFC/ml se sospecha de infeccin hay que identifiar con cultivos nuevos >100,000 UFC/ml se considera infeccin de vas urinarias (IVU). *UFC Unidades Formadoras de Colonias La deteccin de clulas epiteliales escamosas en la orina indica que la muestra es inadecuada para su procesamiento en el diagnstico etiolgico de una ITU.

ANTIBIOGRAMA: Estas pruebas estn indicadas para microorganismos que causan infecciones intrahospitalarias. Para microorganismos reportados como resistentes. Infecciones crnicas o cuadros clnicos de repeticin. Para seleccionar el antibitico mas adecuado en pacientes de edad avanzada o hipersensibles a los antibiticos. MICROORGANISMOS QUE DESARROLLAN RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS CON MAYOR FRECUENCIA. Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Neisseria gonorrheae Streptococcus pneumoniae Proteus sp. PRUEBAS UTILES PARA REALIZAR ANTIBIOGRAMA Pruebas de sensibilidad por difusin en disco Prueba de concentracin mnima inhibitoria (mic) Concentracin mnima bactericida.

Pruebas de produccin de beta lactamasa Pruebas para detectar la resistencia a oxacilina (metacilina) en Staphylococcus. Pruebas de sensibilidad por microdilucion en caldo para bacterias anaerobias.

TIPOS DE ANTIBIOGRAMA Los antibiogramas se clasifican segn la forma de incorporacin del agente antimicrobiano y segn el medio de cultivo empleado. Antibiograma por dilucin en medio lquido slido. Antibiograma por difusin en medio slido Antibiograma por elucin en disco Prueba de la beta - lactamasa ANTIBIOGRAMA POR MICRODILUCION: DILUCIN Y

antimicrobiano frente a varios microorganismos a la vez en una misma placa de petri. Se divide la placa en distintas partes y se inoculan diferentes microorganismos en cada una de ellas. INTERPRETACIN: Se observa en la placa la mnima concentracin inhibitoria, es decir la [ ] del antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de los microorganismos . ANTIBIOGRAMA POR ELUCIN EN DISCO: Permite identificar cuando un microorganismo es capaz de resistir la accin del agente antimicrobiano y crecer, siendo as resistente a dicho agente. Interpretacin: Si es capaz de crecer el microorganismo se considera resistente.

EN MEDIO LQUIDO: Se basa en un estudio cuantitativo, empleando distintas concentraciones de agente antimicrobiano. INTERPRETACIN: Se observa el crecimiento de los microorganismos mediante la aparicin de turbidez en el medio, o mediante cambio de color debido al viraje del indicador previamente adicionado al medio. EN MEDIO SLIDO: Puede detectar la accin del

PRUEBA DE LA BETA-LACTAMASA: Algunos microorganismos son capaces de producir enzimas beta-lactamasas destruyendo derivados del grupo de las penicilinas. Tambin pueden actuar las penicilasas, cefalosporinasas y enzimas r-te que destruyen penicilinas,

ampicilinas y cefalosporinas. Ejemplos: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae . TECNICA KIRBY BAUER (Es la ms utilizada en laboratorio). ANTIBIOGRAMA POR DIFUCIN EN DISCO (MEDIO SLIDO: Consiste en colocar discos de papel impregnado con antibiticos sobre el medio de agar MullerHinton, el cual ha sido antes inoculado con el microorganismos problema. INTERPRETACIN: A medida que el/los antibiticos se difunden desde los discos van matando las bacterias sensibles, observndose halos de inhibicin alrededor de los disco, cuyo dimetro es proporcional a la accin del agente antimicrobiano.

PRUEBA DE CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA (MIC CMI): Concentracin mnima de antibitico que impide el crecimiento de una cepa Bacteriana (CMI50 y CMI90, ,inhiben el 50 y 90% de las bacterias, respectivamente). SITIOS DE ACCION ANTIMICROBIANA. Permeabilidad de la membrana Sntesis de cidos nucleicos Sntesis de la pared celular Sntesis de protenas CONDICIONES QUE DEBEN TOMARSE EN CUENTA PARA PREESCRIBIR UN MEDICAMENTO A UN PACIENTE: DEL FARMACO Farmacodinamia Efectos secundarios Costo de los medicamentos Dosis del medicamento

METODOLOGIA DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS POR LA TECNICA DE DIFUSIN EN DISCO (Kirby-Bauer) 1. Inoculacin del microorganismo problema en solucin salina. 2. Ajuste del inoculo a Escala de MacFarlan. 3. Siembra del microorganismo en Medio de cultivo Mller Hinton. 4. Colocacin de sensidiscos segn morfotipo al Gram. 5. Incubacin a 37C 24 hrs. 6. Comparar resultados con tablas de interpretacin

CONCENTRACIN MNIMA BACTERICIDA (CMB): Permite identificar la concentracin mnima de antibitico que mata a las bacterias.

DEL PACIENTE Edad Estado nutricional Alergias a medicamentos