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PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR FIBRA DIETTICA TOTAL Mtodo Enzimtico - Gravimtrico 1.0. OBJETIVO

Determinar fibra diettica total en diversos tipos de alimentos por mtodo enzimtico-gravimtrico. 2.0. CAMPO DE APLICACION El mtodo es aplicable a muestras de harinas, pan y cereales, recepcionadas en el Laboratorio de Aditivos del Subdepartamento de Laboratorios del Ambiente. 3.0. FUNDAMENTO Muestras en duplicado de alimentos secos y desgrasados son gelatinizados con - amilasa trmicamente estable y luego digeridas enzimticamente con proteasa y amiloglucosidasa para remover la protena y el almidn. La fibra diettica soluble es precipitada por la adicin de etanol ,el residuo total se filtra, se lava, se seca y se pesa. En el residuo en duplicado se determina protena, y en el otro cenizas. Fibra diettica total = Peso del residuo - Peso ( protena + cenizas). 4.0. REFERENCIAS 4.1.- Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15 th Edition. U.S.A. (1990). 5.0. TERMINOLOGIA 5.1. N.A. 6.0. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1. Materiales y Equipos 6.1.1. Balanza analtica, con sensibilidad de 0,1 mg. 6.1.2. Baos termorregulados: (a) a ebullicin y (b) ajustable a 60 C con agitacin directa en el interior de cada matraz de digestin para dar un movimiento constante al matraz de digestin durante la hidrlisis enzimtica. 6.1.3. Bomba de vaco. 6.1.4. Crisol con placa porosa, porosidad N 2 o equivalente de 40 - 60 m. 6.1.5. Desecador con silicagel o similar. 6.1.6. Estufa de vaco a 70 C o alternativamente estufa de aire de acuerdo a lo indicado en la referencia. 6.1.7. Mufla a 525 C. 6.1.8. Tamiz de 0,3 - 0,5 mm. 6.1.9. Vasos de precipitados altos de 400 a 600 mL.

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PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR FIBRA DIETTICA TOTAL Mtodo Enzimtico - Gravimtrico 6.1.10. pHmetro. 6.1.11. Homogenizador. 6.1.12. Material usual de laboratorio. 6.2. Reactivos

6.2.1. Etanol al 95 %, p.a. 6.2.2. Etanol al 78 %.Mezclar un volumen de agua con cuatro volmenes de etanol al 95 %. 6.2.3. Acetona p.a. 6.2.4. Tampn fosfato 0,08 M, pH 6,0: Disolver 1,4 g de fosfato dibsico de sodio anhidro (Na2HPO4) (o 1,753 g dihidratado) y 9,68 g de fosfato monobsico de sodio monohidratado (NaH2PO4) (o 10,94 g dihidratado) en alrededor de 700 ml de agua. Diluir a 1 L con agua. Chequear el pH con pHmetro. 6.2.5. - amilasa termoestable. Mantener refrigerada. 6.2.6.- Proteasa. Mantener refrigerada. 6.2.7. Amiloglucosidasa. Mantener refrigerada. 6.2.8. Hidrxido de sodio 0,275 N. Disolver 11,00 g de NaOH en 700 ml de agua en un matraz volumtrico de 1 L. Diluir a volumen con agua. 6.2.9. Acido clorhdrico 0,325 N Diluir una solucin stock de HCl de ttulo conocido. por ejemplo, 325 mL de HCl 1 N a 1 L con agua. 6.2.10. Celite C - 211, lavado con cido. 6.2.11. Eter de petrleo. 7.0. DESARROLLO DEL PROCESO 7.1. Determinacin de la pureza de la enzima Para asegurar la ausencia de actividad enzimtica indeseable en las enzimas usadas en esta tcnica, se deben ensayar las enzimas, cuando se cambia de lote, o a intervalos de 6 meses, para asegurar que la enzima no se ha degradado siguiendo el mismo procedimiento que para las muestras de acuerdo a la siguiente tabla.

Muestra Pectina ctrica Goma de alerce Almidn de trigo Almidn de maiz Casena glucano

Actividad ensayada pectinasa hemicelulasa amilasa amilasa proteasa glucanasa

Peso muestra (g) 0,1 0,1 1,0 1,0 0,3 0,1

% Recuperacin 95 - 100 95 - 100 0-1 0-2 0-2 95 - 100.

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PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR FIBRA DIETTICA TOTAL Mtodo Enzimtico - Gravimtrico 7.2. Preparacin de la muestra y extraccin

7.2.1. Homogeneizar, secar y moler la muestra en un homogenizador. 7.2.2. Pasar por un tamiz de malla de 0,3 - 0,5 mm. 7.2.3. Extraer con ter de petrleo s el contenido de grasa es superior al 10 %, tres veces con porciones de 25 mL / g de muestra. 7.2.4. Anotar la prdida de peso por la remocin de la grasa y considerarlo en el clculo final. 7.3.- Determinacin 7.3.1. Pesar en duplicado alrededor de 1 g de muestra en un vaso de precipitados de 400 mL. El peso de las muestras no debe diferir en ms de 20 mg. Registrar m en el cuaderno foliado del Laboratorio de Aditivos y Contaminantes. 7.3.2. Agregar 50 mL de tampn fosfato pH 6,0 a cada vaso. 7.3.3. Controlar el pH y ajustar a pH 6 0,2 si fuese necesario. 7.3.4. Adicionar 0,1 mL de la solucin de amilasa. Cubrir el matraz con papel aluminio, colocarlo en un bao de agua y hervir durante 15 minutos. Agitar a intervalos de 5 minutos. El contenido debe llegar a 95 - 100 C. 7.3.5. Enfriar la solucin a temperatura ambiente. 7.3.6. Ajustar pH a 7,5 0,2 con aproximadamente 10 mL NaOH 0,275 N. 7.3.7. Adicionar 5 mg de proteasa. Cubrir el matraz con papel aluminio e incubar 30 minutos a 60 C con agitacin continua. 7.3.8. Enfriar y aadir 10 mL de HCl 0,325 N. 7.3.9. Medir el pH y agregar gotas de cido s fuese necesario. El pH final debe ser 4,0 - 4,6. 7.3.10. Aadir 0,3 mL amiloglucosidasa, cubrir con papel aluminio e incubar 30 minutos a 60 C con agitacin continua. 7.3.11. Adicionar 280 mL de etanol al 95 % precalentado a 60 C. 7.3.12. Dejar precipitar a temperatura ambiente por 60 minutos. 7.3.13. Pesar el crisol que contiene celite, humedecerlo y redistribuir el celite en el crisol usando etanol al 78 % y aplicar succin. 7.3.14. Mantener la succin y transferir cuantitativamente el precipitado al crisol. 7.3.15. Lavar el residuo sucesivamente con tres porciones de 20 mL de etanol al 78 %, dos porciones de 10 mL de etanol al 95 % y dos porciones de 10 mL de acetona. Se puede formar goma con algunas muestras, atrapando el lquido. S as fuera, rompa la pelcula de la superficie con esptula para mejorar el filtrado. El tiempo de filtracin y lavado variar de 0,1 a 6 horas, con un promedio de 1 1/2 hora por muestra. Se pueden evitar tiempos largos de filtracin, mediante una succin intermitente y cuidadosa. 7.3.16. Secar el crisol que contiene el residuo durante la noche en estufa de vaco a 70 C o en estufa de aire a 105 C.

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7.3.17. Enfriar en desecador y pesar . Restar el peso del crisol y del celite para determinar el peso del residuo. Registrar m1 en el cuaderno foliado del Laboratorio de Aditivos y Contaminantes. 7.3.18. Analizar protenas usando N x 6,25 como factor de conversin en el residuo de una de las muestras de los duplicados. Registrar P en el cuaderno foliado del Laboratorio de Aditivos y Contaminantes. 7.3.19. Calcinar el residuo de la segunda muestra del duplicado durante 5 horas a 525 C. 7.3.20. Enfriar en desecador y pesar. 7.3.21. Restar el peso del crisol y del celite para determinar cenizas. Registrar C en el cuaderno foliado del Laboratorio de Aditivos y Contaminantes. 7.3.22. Efectuar la determinacin del blanco en duplicado y en las mismas condiciones descritas en el procedimiento para el anlisis de muestras. 7.4. Clculo e informe de resultados 7.4.1.- Determinacin del blanco: B = blanco, mg = masa del residuo - PB - CB donde: - Masa del residuo = promedio de masa del residuo (mg) para la determinacin blanco. - PB y CB = masa (mg) de protena y cenizas, respectivamente en los residuos de los blancos. 7.4.2.- Clculo de fibra diettica total: % FDT = [ ( masa del residuo - P - C - B)/ masa de la muestra ) ] x 100 donde : - m = masa de la muestra = promedio de la masa de 2 muestras (mg). - m1 = masa del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado (mg). - P y C = masa (mg) de protena y cenizas, respectivamente en los residuos de las muestras. - B = blanco, indicado en 7.4.1. Promediar los valores obtenidos y expresar el resultado con dos decimales. Repetibilidad: La diferencia de los resultados no deber ser superior al 5 % del promedio. Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra original considerando que ha sido desgrasada en el caso de contener ms de 10 % de grasa.