PARDEAMIENTO ENZIMATICO: CARACTERIZACION FENOTIPICAS, BIOQUIMICAS Y MOLECULAR EN VARIEDAD DE MANZANA, PERA, AGUACATE, PAPA CRIOLLA, BANANO Jairo Andres

Sanchez Sanchez, Ateven Ortiz Narvaez RESUMEN El pardeamiento enzimtico (PE) esta relacionado con la actividad de la enzima polifenol oxidasa (PPO) que cataliza la oxidacin a diferentes compuestos fenlicos, con la consecuente transformacin a pigmentos oscuros no deseables para la calidad industrial. Este trabajo contribuye a la caracterizacin del PE en manzana (Malus pumila), banano (musa paradisiaca), pera (Pyrus communis), aguacate (persea americana), papa criolla (solanum phureja), a travs de la determinacin de la variabilidad de cada una, la actividad enzimtica relacionada y la resultante calidad industrial por medio de parmetros cualitativos. En los 5 muestras analizadas cualitativamente, se encontraron diferencias significativas en la actividad de PPO, lo que permiti distinguir individuos con mejor comportamiento frente al PE. Asimismo, se observ variabilidad de cada muestra, frente al estudio enzimtico (polifenoloxidasa), la cual con mucha frecuencia se ha encontrada asociada a respuestas defensivas vegetales en otros modelos de interaccion. Palabras claves: polifenoloxidaxa, pardeamiento, fenol. INTRODUCCION Uno de los objetivos principales de la industria alimentaria es prevenir el pardeamiento enzimtico antes o durante el procesamiento de frutos y vegetales. El control de este fenmeno requiere un conocimiento qumico del tipo de sustratos fenolicos presentes en cada planta, del nivel de compuestos reductores, el nivel de accesibilidad del O2 , la naturaleza de los diferentes compuestos oxidables, la polimerizacin y la degradacin de las o-quinonas. Ademas es necesario conocer el nivel de PPO y los sustratos disponibles a lo largo de los diferentes estados de desarrollo de la planta y sobre todo, es importante distinguir entre el pardeamiento enzimtico y no enzimtico (reaccin de Maillard) (Lee y Witaker, 1995). Entre las diferentes tcnicas de controlar el pardeamiento y mantener la calidad de frutos y vegetales,una de las mas usadas es la aplicacin de inhibidores qumicos, los cuales consiguen inactivar los mecanismos no deseados, entre los diversos tipos de inhibidores se destacan cuatro grupos: sulfitos, agentes antioxidantes o reductores, acidulantes y compuestos quelantes, la distribucin y localizacin de la PPO, estudios clsicos localizan la enzima en la fraccin soluble de las clulas o fuertemente unida a membranas subcelulares (Mayer y Harel, 1979). La mayora de la polifenol oxidasas vegetales se encuentran asociadas a membranas, principalmente a las membranas tilacoidales del cloroplasto (Tolbert, 1973), la PPO se describe generalmente como metaloenzimas que contienen dos atomos de cobre en el sitio activo (Mayer y Harel, 1979). El estado de oxidacin del cobre en el centro activo de la polifenol oxidasa ha sido de gran controversia desde el firme estableciomiento de este metal como cofactor de la enzima.Aun asi la nica estructura de PPO determinada hasta la fecha es la de tubrculo de batata a partir de cristales por difraccin de rayos X (Klabunde y col., 1998). Esto ha supuesto un gran avance en la comprensin de la estructura y mecanismo de la polifenol oxidasa. Por lo que esta carecia de la extensin C- terminal, no existe ninguan estructura resuelta de la

protena madura completa. L a PPO de batata es un monmero de 39KDa, que presenta forma elpisoidal, con dimensiones 55x45x45.

Cada uno de los atomos de cobre del centro cataltico (CuA y CuB) se encuentra complejada mediante tres residuos de histidina. CuA se encuentra coordinado a los residuos de histidina 88, 109 y 118, mientras que CuB se encuentra unido a los residuos en las posiciones 240, 244 y 274.

Para comprender el mecanismo de reaccin complejo de esta enzima hay que tener en cuenta la estructura de su centro activo con dos atomos de cobre, la existencia de dos actividades catalticas y la posterior evolucin qumica de los compuestos formados, la pollifenol oxidase suelen presentar una doble actividad, monofenolosa (monofenol monooxigenasa) y difenolasa(catecol oxidasa). A pesar de que Kablunde y col. (1998) han propuesto un mecanismoalgo diferente para la PPO de batat basado en datos de tipo bioqumico, espectroscpico y estructural para esta enzima, aun se mantiene el modelo de Lee y Whitaker (1995) debido a que es un modelo general, capaz de explicar ambas actividades, catecolasa y creolasa de la PPO de muchos vegetales y frutos.

MATERIALES Y METODOS El estudio se realizo con frutos y verduras, se evaluaron tres tipos de frutas (banano, manzana, pera), y dos tipos de verduras (aguacate y papa criolla), provenientes de distintas parte de colombia, proporcionado por el Departamento de Ciencias Basicas de la Univerisdad de Bogota Jorge Tadeo Lozano, sede Bogota, las cuales fueron lavadas y secadas, se tomaron trozos de pulpa de cada muestra (banano, pera, manzana, aguacate y papa criolla), se determino la actividad de la PPO mediante el contacto del tejido vegetal con el aire y sumergidas en soluciones, se tomaron 9 trozos de pulpa de cada muestra, respectivamente cada una fue sumergida en agua, acido ctrico 1.5% y 0.5%, zumo de limn, bicarbonato de sodio 1% y 2%, cloruro de sodio 2%, los dos ltimos se realizo cortes pequeos, y se raspo la pulpa dejndolas en contacto con el aire, al final del ensayo se observa la aparicion de color mas rapiodo y se mide el pH. RESULTADOS Y DISCUSION El pardeamiento enzimtico de las muestras esta relacionado con la oxidacin de compuestos fenolicos en presencia de oxigeno, al hacerse un rompimiento en la superficie, estos compuestos que estn localizados en las membranas tilacoidales del cloroplasto, son catalizadas por la enzima polifenoloxidasa constituida por varias etapas: en la primera (hidroxilacion de monofenoles a o.difenoles) la enzima liga primero al oxigenoy despus el monofenol; en seguna etapa, se produce un cambio de valencia (Cu1+ cu2+), y sed forma un complejo, en el que el enlace O-O esta

tan polarizado que se produce la hidroxilacion hasta O-difenilos, finalmente la oxidacin del odifenol hasta quinona, una de las formas de prevenir esat accin enzimtica fue sumergiendo las muestras en agua, para controlar la accin del oxigeno sobre la PPO, asi mismo la accin sobre las o-quinonas son reducidas a o-difenoles al dejar la muestra en zumo de limn que contiene un alto contenido de acido ctrico que actua como acidulante que mantiene el pH por debajo del punto optimo de acticidad cataltica de la PPO y acido ascrbico que acta como antioxidante, es considerado como un buen secuestrador de oxigeno, sin embargo, el acido ascrbico es oxidado al acido dihidroascorbico en forma irreversible durante el proceso de reduccin y permite el pardeamiento posteriormente. De una froma contraria el bicarbonato de sodio aumenta la catlisis por su efecto de pH entre mas concentrado este mayor ser la aparicion del aprdeamiento en este caso se utilizaron bicarbonato al 1% y 2%. El control de pH de la enzima POLIFENOLOXIDASA presenta su actividad mxima en estrechos intervalos de pH, la exposicin a valores de pH por fuera del intervalo, puede conducir a la perdida irreversible de actividad CONCLUSIONES Los niveles de PPO y el contenido de fenoles varian dependiendo de la especie,cultivo, estadio de desarrollo y maduracin Debido a que la PPO es una metaloproteina con cobre puede ser inhibida por agentes como el acido ascrbico, acido ctrico, y bicarbonato de sodio. Se describe el mecanismo de reaccin catalizada por la PPO por oxido reduccin, donde el catecol reacciona con el oxigeno, obtenindose como producto O-quinona, observada de un color caf. El acido ascrbico es la sustancia con mayor efectividad para inhibir el pardeamiento enzimtico en comparacin con el acido ctrico, bicarbonato de potasio y cloruro de La actividad cataltica de la enzima PPO, esta determinada como todas las enzimas por el efecto del pH.