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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MXICO

INSTITUTO DE BIOTECN OLOG A

MTODOS FSICO-QUMICOS EN BIOTECNOLOGA

Presenta: Erandi Lira Navarrete

Coordinador del curso: Dr. Roberto P. Stock Silberman

Cuernavaca, Morelos. Junio de 2007.

SNTESIS DE PPTIDOS

NDICE
CAPTULO I INTRODUCCIN ANTECEDENTES CONCEPTOS GENERALES Aminocidos. Enlace peptdico. Racemizacin. CAPTULO II GRUPOS PROTECTORES Grupos protectores del -amino. Grupos protectores del -carboxilo. Proteccin de las cadenas laterales. CAPTULO III FORMACIN DEL ENLACE PEPTDICO Activacin y acoplamiento. Racemizacin. CAPTULO IV SNTESIS DE PPTIDOS EN SOLUCIN Ejemplos de pptidos sintetizados en solucin. CAPTULO V SNTESIS DE PPTIDOS EN FASE SLIDA La tcnica de Merrifield. La tcnica de Sheppard. El soporte slido. Agentes espaciadores del pptido y la resina. Instrumentacin. CAPTULO VI CASOS ESPECIALES DE SNTESIS Sntesis de pptidos cclicos. Sntesis de glicopptidos. Sntesis de pptidos fosforilados. Bibliotecas de pptidos sintticos. CAPTULO VII PURIFICACIN DE PPTIDOS Cromatografa de alta resolucin (HPLC). 48 48 38 38 42 43 44 27 27 29 31 33 36 23 24 16 16 20 5 5 10 12 1 1 2 2 4 4

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CAPTULO VII HERRAMIENTAS PARA LA CARACTERIZACIN DE PPTIDOS SINTTICOS Anlisis de aminocidos. Degradacin de Edman. Electroforesis capilar. Espectrometra de masas. BIBLIOGRAFA 50 50 51 52 52 54

ndice de tablas
Tabla 1. Estructura de los 20 aminocidos encontrados en las protenas. Tabla 2. Aminocidos 1-5 Tabla 3. Aminocidos 6-13 Tabla 4. Aminocidos 14-17 3 25 25 26

ndice de figuras
Figura 1. Uretano o carbamato. Figura 2. Proteccin de un aminocido por cloruro de carbobenzxilo. Figura 3. Desproteccin de un Z-aminocido con HBr en cido actico fro. Figura 4. Desproteccin de un Z-aminocido por hidrogenacin cataltica. Figura 5. Los Boc-aminocidos se obtienen a partir del anhdrido terbutlico Figura 6. Desproteccin de un Boc-aminocido con TFA. Figura 7. Grupo protector Bpoc. Figura 8. Grupo protector Fmoc. Figura 9. Desproteccin de un Fmoc-aminocido con piperidina. Figura 10. Obtencin de un Trt-aminocido. Figura 11. Desproteccin de un Trt-aminocido con cido actico. Figura 12. Preparacin de un t-butil ster a partir de un Z-aminocido. Figura 13. Proteccin selectiva del -amino mediante el bloqueo del -amino con benzaldhedo. Figura 14. Proteccin selectiva del -amino mediante la formacin de un quelato. Figura 15. Proteccin selectiva de los grupos carboxilo de las cadenas laterales de los aminocidos cidos. Figura 16. Ejemplos de grupos protectores usados para la cadena lateral del aminocido 14 14
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cistena. Figura 17. La racemizacin no se evitar si el grupo protector est en el N. Figura 18. Generacin del enlace peptdico por aminlisis. Figura 19. Formacin del enlace peptdico por acil azidas. Figura 20. Aminlisis de anhdridos mixtos. Figura 21. Anhdrido derivado del cido pivltico. Figura 22. Formacin del enlace peptdico por un anhdrido carboxlico-carbnico intermediario. Figura 23. Generacin del enlace peptdico po un anhdrido intermediario formado a partir de un aminocido con cido difenilfosfnico. Figura 24. Formacin de O-acilurea. Figura 25. Formacin del enlace peptdico usando BOP como reactivo activador. Figura 26. Racemizacin por enolizacin directa. Figura 27. Racemizacin por formacin de una oxazolona. Figura 28. Estrategias para la sntesis de un pptido. Figura 29. Esquema de la SPPS, empleando la tcnica de Merrifield. Figura 30. Esquema de la SPPS, empleando la tcnica de Sheppard. Figura 31. Esquema del uso del espaciador en SPPS. Figura 32. cido 4-hidroximetilbenzoico. Figura 33. cido metoxi-4-hidroximetilbenzoico. Figura 34. cido 1,3 dimetoxi-4-hidroximetilbenzoico. Figura 35. Bencihidrilamina. Figura 36. Esquema de un sistema manual de flujo discontinuo para SPPS. Figura 37. Equipos automticos para SPPS. Figura 38. Opciones para la formacin de pptidos cclicos por enlace amida. Figura 39. Formacin del puente disulfuro correcto mediante la proteccin de las cistenas no participantes, con grupos protectores distintos a los usados para las cistenas participantes. Figura 40. Sntesis de bibliotecas peptdicas en multipines. Figura 41. Esquema general de la sntesis de bibliotecas peptdicas por la tcnica de las bolsas de t. Figura 42. Sntesis de una biblioteca de pptidos sobre una membrana de celulosa. 45 46 42 44 19 19 20 21 22 24 28 30 33 34 34 35 35 36 37 39 18 15 16 17 17 18

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CAPTULO I
INTRODUCCIN.
La palabra protena proviene del vocablo griego proteion, que significa primero. Este nombre fue dado a tales macromleculas para enfatizar el rango de importancia que tienen en un sistema viviente. Si bien es difcil decidir cul de las biomolculas es la de mayor importancia, es innegable que las protenas son los materiales que desempean el mayor nmero de funciones en las clulas de todos los seres vivos, las cuales van desde formar parte de la organizacin estructural bsica de la clula, hasta funciones metablicas y reguladoras. Toda esta variedad de actividades bioqumicas son las que definirn la identidad de un ser vivo. En consecuencia, han sido el foco de atencin de los cientficos a travs del tiempo. En el afn de comprenderlas mejor, se ha intentado sintetizarlas en el laboratorio llegando a desarrollar la tcnica de sntesis de pptidos, que aunque menos complejos que las protenas, han brindado informacin importante al poseer caractersticas de las protenas naturales (por constituirse de la misma manera). Adems, los pptidos por s mismos tienen roles significativos en la biologa como hormonas, factores de crecimiento, antibiticos, toxinas y neuropptidos. Entre las aplicaciones de la sntesis de pptidos se encuentran la de desarrollar pptidos de importancia mdica como lo son hormonas y vacunas, tambin pueden sintetizarse pptidos para producir anticuerpos contra porciones especficas de protenas o para modificar algunos pptidos naturales con el fin de hacerlos ms estables, entre otras.

ANTECEDENTES.
La historia de la sntesis de pptidos comienza con Emil Fisher, quien al establecer la qumica de las protenas obtuvo la sntesis del dipptido glicil-glicina en 1901, comprobando de esta manera su hiptesis de que los aminocidos estaban unidos entre s mediante el enlace peptdico. A partir de ah continu sintetizando tripptidos, tetrapptidos, etc., hasta finalmente alcanzar la sntesis un polipptido de 18 residuos aminoacdicos. Despus de esto, la evolucin de la tcnica fue lenta, los primeros polipptidos sintetizados fueron homopolmeros ya que se presentaba un problema al momento de combinar aminocidos: deba protegerse el grupo amino de un tipo para evitar que se uniera con un aminocido de su misma especie e impedir contaminaciones de pptidos distintos. Encontrar un compuesto qumico capaz de bloquear el grupo amino, pero que adems fuera removido fcilmente despus de la formacin del enlace peptdico deseado, no fue logrado hasta 1932 por Max Bergmann y Leonidas Zervas, el grupo

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carbobenzoxilo. A partir de esto los grupos protectores fueron perfeccionndose y en 1953 Vincent du Vigneaud fue capaz de sintetizar el primer polipptido funcional, la hormona oxitocina, lo que le llev a ganar el premio Nobel de qumica en 1955. Sin embargo, aislar y purificar un nuevo pptido significaba invertir muchsimo tiempo para obtener una cantidad nfima de producto, por lo que Bruce Merrifield pens que el mtodo poda mejorarse. En 1963 dio a conocer la sntesis del tetrapptido leucilalanilglicilalanina y en 1969 Merrifield anunci la sntesis de la enzima ribonucleasa pancretica bovina A de 124 residuos en 6 semanas, mediante la sntesis de pptidos en fase slida (SPPS, de sus siglas en ingls), tcnica por la que recibi el premio Nobel de qumica en 1984.

CONCEPTOS GENERALES.
Aminocidos. Qumicamente las protenas son polmeros de elevado peso molecular compuestos por unidades monomricas llamadas aminocidos, los cuales se unen entre s mediante un enlace amdico, mejor conocido como enlace peptdico. Los aminocidos son slidos cristalinos no voltiles que se funden con descomposicin a temperaturas relativamente elevadas, son insolubles en disolventes no polares, pero apreciablemente solubles en agua. Existen 20 clases diferentes de aminocidos que forman a las protenas, todos ellos coinciden estructuralmente en que llevan unido un grupo carboxlico (-COOH ) y un grupo amino (-NH2 ) al mismo tomo de carbono tetradrico denominado carbono , al cual tambin est unido un tomo de hidrgeno y una cadena lateral (R), Es precisamente esta cadena lateral la que los identifica y le confiere propiedades qumicas diferentes a cada aminocido. Las estructuras presentadas en la tabla 1, muestran que todos los aminocidos contienen al menos un centro quiral (con excepcin de glicina), debido a esto podemos encontrar dos estereoismeros de cada aminocido, especficamente enantimeros, es decir, imgenes especulares que no pueden superponerse una a la otra las cuales tienen propiedades fsicas idnticas exceptuando la direccin en que desvan el plano de la luz polarizada. Si la rotacin del plano es a la derecha se les denomina dextrgiros (D) y si es a la izquierda levgiros (L). Los L-aminocidos son los que forman a la gran mayora de las protenas. sta caracterstica de los aminocidos es importante recordarla para la sntesis de pptidos.

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Enlace Peptdico. La unin entre dos aminocidos se lleva a cabo por la reaccin que se presenta entre el grupo carboxilo de un aminocido con el grupo amino de otro formando una amida mediante la prdida de una molcula de agua. Esta unin covalente es a lo que se denomina enlace peptdico, el cual tiene una geometra planar y caractersticas de doble enlace, debido a la resonancia existente. Racemizacin. El trmino racemizacin se refiere a la conversin de un enantimero en su imagen especular, y una mezcla de partes iguales de enantimeros se denomina modificacin racmica, la cual es pticamente inactiva, ya que cuando se hace incidir un haz de luz polarizada sobre la mezcla la rotacin generada por un enantimero es cancelada por la misma rotacin que produce en sentido opuesto el otro. Una mezcla racmica no puede ser separada por mtodos ordinarios, por lo que se tiene que recurrir al uso de reactivos pticamente activos, en donde se observan propiedades fsicas diferentes para cada enantimero.

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CAPTULO II
GRUPOS PROTECTORES.
Uno de los principales pasos para la sntesis de pptidos es la proteccin de los grupos funcionales de los aminocidos, stos deben protegerse para evitar la formacin de un enlace peptdico no deseado, es decir, impedir que el grupo carboxilo de un aminocido reaccione con el grupo amino de uno de sus anlogos. As mismo, al proteger las cadenas laterales de los aminocidos tambin se est evitando que estos reaccionen con los grupos amino o carboxilo de otros aminocidos, o que den lugar a reacciones secundarias. Los grupos protectores tambin protegen el carbono alfa de ser susceptible a racemizacin. Entre las caractersticas que debe tener un grupo protector se encuentran, la de ser qumicamente estable en las condiciones en las que se da la sntesis peptdica, y la de ser fcilmente removibles en condiciones suaves que no alteren la formacin del enlace peptdico al final o en fases intermediarias de la sntesis. En este sentido, se pueden clasificar a los grupos protectores como permanentes, los cuales son retenidos hasta que el pptido ha sido completado, o temporales, los cuales se eliminan al final de cada etapa de sntesis.

Grupos protectores del -amino. El objetivo fundamental que se debe cubrir al proteger al grupo amino es el de suprimir su reactividad nucleoflica, para tal efecto existen una gran variedad de grupos protectores, el problema es encontrar uno que pueda ser removido fcilmente sin afectar la integridad del enlace peptdico formado o sin que el carbono corra riesgo de racemizacin. Los primeros grupos protectores presentaban estos problemas, ya que se fundamentaban en la formacin de una amida al unirse al grupo amino. El gran avance se dio cuando Bergman y Zervas observaron que los derivados de uretano (figura 1) eran particularmente adecuados para la proteccin del -amino. Un factor importante que los ha favorecido para ser ampliamente utilizados es su alto grado de estabilidad ptica, es decir, inhiben la racemizacin de los centros quirales adyacentes a estos grupos protectores.

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Entre los grupos derivados de uretano ms usados se encuentran los siguientes: Benciloxicarbonil. Tambin asignado con la abreviacin Z, este mtodo de proteccin es el desarrollado por Bergmann y Zervas. Se basa en la acilacin de una amina con cloruro de Carbobenzoxilo para dar una amida (figura 2).

Estas amidas, a diferencia de las amidas comunes, pueden degradarse por mtodos que dejan intacto el enlace peptdico. El rompimiento puede darse por hidrogenacin cataltica o por hidrlisis con HBr en cido actico fro. La reaccin que por que se lleva a cabo el rompimiento con HBr/AcOH se muestra en la figura 3.

Este procedimiento es muy conveniente realizarlo, ya que la mayora de los pptidos protegidos son solubles en cido cetico, especialmente cuando hay una alta concentracin de HBr, adems, el producto desprotegido puede ser precipitado como una sal de

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hidrobromuro cuando se le agrega ter. Por otra parte, la integridad de algunos pptidos sintetizados puede verse daada, especialmente si entre los aminocidos que conforman al producto se encuentran algunos con cadenas laterales susceptibles, como es el caso de triptfano, tirosina y metionina. La hidrogenacin cataltica (figura 4), usualmente es llevada acabo con 80% de cido actico y 10% de paladio a presin y temperatura ambiente. Es un mtodo bastante confiable ya que slo presenta una limitacin: el catalizador puede ser degradado por la existencia de azufre, el cual puede encontrarse si en la secuencia peptdica se encuentran aminocidos como cisteina o metionina. Algunos procesos que implican el uso de amonio como solvente o un exceso del catalizador en cido actico llevan a cabo esta reaccin sin importar si hay azufre presente, no obstante, estas condiciones no se han tratado adecuadamente.

t- Butoxicarbonil (Boc). Un aminocido Boc es actualmente obtenido del anhdrido correspondiente al grupo protector (figura 5).

El grupo Boc es completamente estable a la hidrogenacin cataltica, por lo que en la sntesis peptdica puede utilizarse un grupo protector Z como temporal y un Boc como permanente, o viceversa. La forma comn de desproteger un aminocido Boc, la cual es prcticamente inerte para un grupo Z, es mediante una dilucin de cido trifluoractico (TFA) a temperatura ambiente (figura 6).

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2-(4-bifenilil)-isopropoxicarbonil (Bpoc). El grupo Bpoc (figura 7) es ms lbil que el Boc. Puede ser removido por un tratamiento breve de una mezcla de cido cloroactico y diclorometano, condiciones que no afectan ni al grupo Boc ni al Z; por otro lado, el grupo Bpoc es susceptible a hidrogenacin cataltica.

Fluorenil-9-metoxicarbonil (Fmoc). Los aminocidos Fmoc (figura 8)

se obtienen a

partir de su respectivo cloruro de acilo o alternativamente utilizando un ster de succinimida.

El grupo Fmoc es muy estable en presencia de agentes cidos, pero puede removerse fcilmente en ciertas condiciones bsicas, usualmente se utiliza 20% de Piperidina en dimetilformamida (DMF) para desproteccin de los aminocidos Fmoc, mecanismo que es

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muy rpido a temperatura ambiente (figura 9). Este procedimiento no afecta a la mayora de los grupos protectores, incluidos los grupos Z o Boc.

Existen otros grupos protectores que no son derivados de los uretanos, estos grupos protectores tambin impiden la racemizacin y son aplicados en ciertas estrategias de sntesis, entre ellos se encuentran el trifenilmetil , el 2-nitrofenilsulfonil y el ditiosuccinil Trifenilmetil (trityl, Trt). El trifenilmetil es un radical libre muy estable. La produccin de los Trt-aminocidos mediante trifenilclorometano es muy pobre en condiciones bsicas, por lo que se requiere de un intermediario, el cual se obtiene al hacer reaccionar el aminocido, con trimetilclorosilano.

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El grupo trityl no sobrevive a las condiciones de hidrogenacin cataltica, es muy estable a las bases, y tan lbil frente a los cidos, que para desproteger un Trt-aminocido, slo basta tener un pH de 4, usualmente se utiliza cido actico. (figura 11)

No es un grupo protector frecuentemente usado, ya que el impedimento estrico de esta molcula tan grande dificulta la formacin del enlace peptdico, sin embargo se han reportado casos exitosos de pptidos sintetizados utilizando este grupo protector. 2-Nitrofenilsulfonil (Nps). Los Nps-aminocidos se obtienen a partir de la reaccin de los aminocidos con NpsCl en condiciones bsicas. No son muy estables en estado libre, se almacenan como sales de diciclohexilamonio, de donde son liberados por acidificacin con cido sulfrico. El grupo Nps es estable a las bases, no lo es a condiciones cidas o a hidrogenacin cataltica. La forma de desproteccin ms simple es por tratamiento con dos equivalentes de cloruro de hidrgeno anhidro, sin embargo pueden producirse reacciones secundarias, sobre todo en presencia de triptfano. Ditiosuccinil. La qumica de este grupo protector es muy complicada y no muy limpia, no es muy utilizado, pero posee la ventaja de que puede ser fcilmente removido por un tiol y una base dbil como trietilamina.

Grupos protectores del -carboxilo. La proteccin del grupo carboxilo no es tan necesaria como la del amino , ya que es menos nucleoflico. No obstante, es conveniente protegerlo, en especial para aumentar la solubilidad del pptido formado en solventes orgnicos. Tambin es importante tener bloqueado el grupo carboxilo que en ese momento no formar parte del enlace peptdico, mientras que el que participar en el enlace se encuentra desprotegido listo para ser activado. Los mtodos ms comunes para proteger el grupo -carboxilo es mediante esterificacin,. La liberacin del aminocido de este grupo

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protector es de manera similar a la aquella vista para los derivados del uretano, despus de todo, son steres de un tipo especial. Metil ster (-COO-CH3) y Etil ster (-COO-CH2-CH3). Fueron los primeros grupos utilizados para enmascarar el -carboxilo. No hay una distincin importante entre estos dos, por lo que se les trata como un mismo grupo protector. Pueden obtenerse haciendo reaccionar al aminocido con el alcohol correspondiente directamente o por medio de un halogenuro de acilo intermediario. No se ven afectados a temperatura ambiente por HBr/AcOH, TFA, hidrogenacin cataltica, tioles o aminas en solventes orgnicos, de esta manera puede combinrseles con cualquier grupo amino protector. Uno de los problemas de estos grupos protectores se presenta cuando se est protegiendo a un dipptido ya que tienden a ciclarse formando dicetopiperacinas. Son demasiado estables, debido a esto las condiciones de desproteccin exigen un tratamiento vigoroso; en ocasiones la saponificacin es confiable, pero se corre el riesgo de que la base utilizada pueda causar racemizacin. Bencil ster (-COO-CH2C6H5). Obtenido a partir de la esterificacin del alcohol benclico,

este grupo protector se populariz por presentar menos problemas para la desproteccin que el metil o etil ster, aunque al igual que estos ltimos, tienden a formar dicetopiperacinas. Pueden ser eliminados por saponificacin, pero tambin por HBr/AcOH e hidrogenacin cataltica, pero no por TFA (al igual que el grupo protector Z para el -amino), por esta razn se les usa en combinacin con un grupo amino protector distinto al Z durante la etapa de sntesis. t-Butil ster (-COO-C-(CH3)3). Estos pueden ser preparados directamente de los aminocidos pero el procedimiento estndar es indirecto (figura 12). A diferencia de los grupos anteriores, los dipptidos de los t-Butil steres no forman dicetopiperacinas con facilidad. La estabilidad y labilidad de este grupo es semejante a la del grupo Boc, aunque son menos sensibles a acidlisis, por lo que es posible diferenciar entre el rompimiento de un grupo Boc y un t Butil ster. Sin embargo, se recomienda utilizarlo en combinacin con un grupo protector diferente al Boc.

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Fenil ster (-COO-C6H5). Este grupo es completamente estable en medio cido y en condiciones de hidrogenacin cataltica. El rompimiento por accin de un lcali es mucho ms rpido que el del metil ster. Para efectuar la desproteccin de este grupo se utiliza un tratamiento de perxido de hidrgeno en DMF a un pH de 10.5 por 15 minutos, esto debido a la susceptibilidad que tienen los fenil steres al ataque del in perxido. Cadenas laterales sensibles al peroxido (Met, Trp, Cys), aparentemente no representan un gran problema si la desproteccin se lleva a cabo con un exceso de dimetil sulfuro.

Proteccin de las cadenas laterales. Las cadenas laterales de cada aminocido les confieren propiedades nicas, y aunque no todas son igualmente reactivas, es importante estar consciente de las consecuencias que puede ocasionar a la sntesis peptdica el no protegerlas. A continuacin se mencionan los aminocidos que contienen cadenas laterales que afectan mayormente a la qumica de la sntesis de pptidos. Lisina. La necesidad de proteger al grupo -amino de la lisina se debe a que este grupo amino es ms bsico y nucleoflico que el grupo -amino, y por consecuencia, se generaran pptidos ramificados en esta posicin, aunque en ocasiones, estas ramificaciones pueden ser deseadas (como en el caso de pptidos cclicos, cuando se quiere adjuntar otra secuencia peptdica o la conjugacin de un carbohidrato). En cualquier caso, para la proteccin de este aminocido deben seleccionarse grupos protectores amino ortogonales. Puede escogerse cualquier combinacin en base a lo mencionado con anterioridad, pero los grupos protectores principales para el grupo -amino son los grupos Z y Boc. Ahora bien, para poder dirigir cada grupo protector al amino que hemos decidido pueden seguirse dos estrategias: Puede aprovecharse el carcter ms bsico y nucleoflico del grupo -amino para hacerlo reaccionar con benzaldehdo y as formar una base de schiff, para proceder a la proteccin del -amino:

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O bien, mediante la formacin de un quelato coordinado por el grupo -amino y el carboxilo:

Arginina. El grupo guanidino de la arginina permanece protonado bajo las condiciones dadas en la proteccin de los grupos , en la formacin del enlace peptdico y en la desproteccin, por lo que podra no protegerse. Sin embargo, es recomendable hacerlo debido a que pueden presentarse problemas de solubilidad. Para protegerlo suele usarse nitracin que es resistente a HBr/AcOH, y la desproteccin para recuperar el grupo guanidino puede hacerse por tratamiento por HF lquido, reduccin con zinc en cido actico o hidrogenacin cataltica. cidos glutmico y asprtico. Como sucede con la lisina, a estos aminocidos debe protegrseles los grupos carboxilo de la cadena lateral para que no interfieran en la formacin del enlace peptdico. Para esta proteccin son usualmente utilizados el bencil o el

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t-butil ster. La diferenciacin de los grupos carboxilo puede hacerse como se muestra en la figura 15 (aunque podran existir otras alternativas).

El hecho de tener el -carboxilo cerca al grupo amino protonado le da preferencia al otro carboxilo de ser esterificado. Cistena. El grupo tiol de las cistenas es de gran importancia, sobretodo si el pptido sintetizado contempla la formacin de un puente disulfuro, por lo que debe protegerse para guiar la formacin del mismo (ver ms adelante). La proteccin tambin debe llevarse a cabo toda vez que este grupo puede interferir con muchas operaciones de rutina. Existen muchos grupos protectores para este aminocido, pero usualmente se protegen con bencil ster, aunque este requiere condiciones vigorosas para su rompimiento (reduccin por sodio en amoniaco lquido o con cido fluorhdrico lquido). Tambin puede protegerse con t-butil ster, cuyo rompimiento se realiza con el in mercrico. Otros ejemplos de grupos protectores de la cistena es el Trt, Acm, Mob, TMob y Meb (figura 16).

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Metionina. Aunque generalmente representa problemas debido al tioster que se encuentra en su cadena lateral (como la intereferencia en la hidrogenacin catalticia o el ser susceptible al ataque de reactivos electroflicos debido a la desproteccin por cidos), no es muy recomendable preotegerlo, por lo que se usualmente se maneja as, cuidando otros aspectos para disminuir su interferencia. Serina, treonina y tirosina. Los grupos hidroxilo de estos aminocidos, en especial el de la tirosina, son capaces de reaccionar con reactivos acilados. No obstante, pueden dejarse sin proteccin si las condiciones para proteger el grupo -carboxilo son suaves. En caso de protegerse estos aminocidos, puede hacerse con la formacin de bencil ter o un t-butil ter. El rompimiento para cada caso, es similar que el usado para los steres correspondientes. Triptfano. El anillo indlico del triptfano no interviene en la formacin del enlace peptdico, pero es capaz de atrapar reactivos electroflicos con gran facilidad, por lo que debe protegrsele. Los grupos protectores usualmente utilizados para el nitrgeno del anillo indlico son el grupo formilo (For) y el Boc. Histidina. Este aminocido es uno de los ms problemticos por lo que es de primordial importancia protegerlo. El anillo imidazol es fcilmente acilado y una vez as es capaz de intercambiar grupos acilo de formas no deseadas. Un problema ms serio es que la basicidad del anillo cataliza la racemizacin de los carbonos , en especial el de la propia histidina. Para suprimir estos efectos no deseados debe protegerse el nitrgeno , que es el que se encuentra ms cercano al carbono (figura 17b). Usualmente se utiliza la proteccin Bom (benciloximetil), el cual puede removerse por HF o por HBr/AcOH.

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CAPTULO III
FORMACIN DEL ENLACE PEPTDICO.
Activacin y Acoplamiento. La formacin del enlace peptdico es una reaccin endergnica, una simple adicin de un cido carboxlico con una amina dar como resultado la obtencin de la sal orgnica correspondiente, por lo que, si lo que buscamos es la formacin de una amida, el grupo carboxilo debe ser activado. El mecanismo que se sigue para el acoplamiento de dos aminocidos es aminlisis y se resume en la figura 18. En donde X es cualquier agente activante de naturaleza electroflica, el cual debe ser minuciosamente escogido, ya que una mala eleccin puede llevarnos a racemizacin.

Cloruros y fluoruros de acilo. EL primer mtodo usado para la activacin en la sntesis de pptidos, consista en la conversin de un acil aminocido en el correspondiente cloruro de acilo, utilizando reactivos como el cloruro de tionilo o el pentacloruro de fsforo. Posteriormente se les haca reaccionar con el aminocido correspondiente para la formacin del enlace peptdico. Sin embargo, existan ciertas limitaciones usando esta tcnica, debido a la facilidad de eliminacin del ion cloruro, el carbonilo es propenso al ataque de incluso nucleoflos dbiles, por otro lado los ms simples cloruros de aminocidos ciclan espontneamente, formando oxazolonas y, por lo tanto, pptidos racmicos. Lo anterior aunado con el desarrollo de metodologas ms adecuadas para la activacin del grupo carboxilo tuvo como consecuencia que los cloruros de acilo dejaran de ser utilizados, hasta la aparicin de los cloruros y fluoruros de Fmoc aminocidos, los cuales son fciles de obtener y tienen intermediarios ms estables. Los fluoruros de acilo son ms estables que el correspondiente cloruro de acilo a bases ternarias y frente al agua, y muestra similar reactividad frente a grupos amino. Acil azidas. Se trata de otro de los procedimientos para la formacin del enlace peptdico utilizados en los inicios de la sntesis de pptidos. Las acil azidas se obtienen por

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hidrazinolisis de un aminocido protegido el cual posteriormente debe hacerse reaccionar con el aminocido correspondiente, como se muestra en la figura 19.

Las reacciones secundarias que puede dar este mtodo es una de sus limitaciones, entre la que destaca la transposicin de Curtius, obteniendo o bien una amina o un isocianato antes que se d la formacin del enlace peptdico. Fueron muy usadas antes de los aos cincuenta, debido a que no presentaban racemizacin. Anhdridos. La formacin de anhdridos surgi de la necesidad que tiene la sntesis de pptidos de la activacin del grupo carboxilo sin que haya liberacin de reacciones secundarias, ya que los productos obtenidos son difciles de purificar. Los anhdridos simtricos pueden obtenerse a partir del correspondiente acil aminocido mediante el uso de una variedad de reactivos, entre los que se encuentran la dicilohexilcarbodiimida. Los anhdridos simtricos de los aminocidos Boc, Z y Fmoc, son generalmente sustancias cristalinas estables. La aminlisis de los anhdridos simtricos no es ambigua, siempre obtendremos la amida deseada pero slo la mitad del componente ser incorporado al producto final. En la sntesis de pptidos se hace uso de distintos tipos de anhdridos mixtos, el primer tipo es el obtenido a partir de un acil aminocido (o un acil pptido) y un cido carboxlico. La aminlisis de este tipo de anhdridos a diferencia de los simtricos es un tanto ambigua, pudiendo obtener distintos productos cuando se forma el enlace peptdico (figura 20).

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Puede forzarse la reaccin para que nos de el producto deseado, mediante la introduccin de impedimento estrico en la parte del anhdrido que proviene del cido carboxlico, como es el caso del anhdrido mixto proveniente del cido pivlico (figura 21), en este caso, el reactivo nucleoflico (el grupo amino del aminocido que ataca este anhdrido por aminlisis) preferir actuar sobre a, debido a que el carbonilo se encuentra ms expuesto que en b (ver figura).

El mtodo de anhdridos mixtos ms utilizado en la sntesis de pptidos es el que implica la generacin y aminlisis de un anhdrido carboxlico-carbnico, como se ve en la figura 22. El ataque nucleoflico va directamente hacia el grupo carboxilo original, gracias a que el carbonilo proveniente del derivado de cido carbnico se encuentra flanqueado por dos tomos de oxigeno que disminuyen su reactividad.

El etilcloroformato es el reactivo mayormente utilizado, pero tambin puede usarse isobutilcloroformato. Una debilidad de los anhdridos formados, es que no son estables por largos periodos, su tiempo de vida media es de apenas unas horas, por lo que no pueden ser almacenados. Otro anhdrido mixto muy apropiado para la formacin del enlace peptdico muy limpio, dado que la aminlisis ocurre directamente sobre el carbonilo del acil-aminocido sin importar si sobre este hay un gran impedimento estrico, es el obtenido a partir del acido difenilfosfnico (figura 23).

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steres activados. En los comienzos de la sntesis de pptidos se intent el uso de steres para la activacin de los acil-aminocidos, pero la aminlisis de los steres alqulicos es demasiado lenta para las necesidades de un sntesis peptdica. A principios de los aos cincuenta se observ que la reaccin puede ser favorecida con el uso de steres de fenilo, los cuales son ms reactivos, y en presencia de sustituyentes electroflicos en el anillo aromtico, la aminlisis alcanza velocidades semejantes a las de los anhdridos. Su uso ha ido en ascenso debido a que son fciles de preparar, son muy estables y el riesgo de racemizacin es muy bajo. Carbodiimidas. La diciclohexilcarbodiimida (DCC) fue introducida por primera vez en la sntesis de pptidos en 1955 por Sheehan y Hess, y ha sido el reactivo ms importante para la activacin y acoplamiento desde entonces. Reacciona con los acil aminocidos para dar anhdridos simtricos, steres activados o actuar directamente como un agente acoplante. En cualquier caso el primer evento de la activacin es la formacin de una O-acilurea (figura 24).

En presencia de un exceso de carboxilato, por ejemplo cuando un equivalente de DCC es agregado a dos equivalentes de un acil aminocido, la O-acilurea es atacada por el anin

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carboxilato para formar el anhdrido, mientras que en presencia de fenoles u otros compuestos hidroxi forma los steres derivados. La DCC da un coproducto, diciclohexilurea, el cual es muy poco soluble en la mayora de los solventes, por lo que la separacin de ste del pptido sintentizado es muy fcil en sntesis de pptidos en solucin (por diferencia de solubilidades), y es lo suficientemente soluble como para removerlo mediante lavados en la sntesis de pptidos en fase slida. Por otro lado, en ausencia del reactivo nucleoflico, la Oacilurea se rearregla lentamente en N -acilurea, la cual no slo reduce la produccin, sino que tambin da problemas de purificacin, esto puede prevenirse agregando el reactivo nucleoflico adecuado, antes que las reacciones secundarias se den. Sales de fosfonio. Estas sales son utilizadas especialmente para acoplamiento de aminocidos de pptidos fosforilados, ya que el uso de otros agentes como DCC, pueden generar reacciones secundarias con el aminocido fosforilado. El reactivo de este tipo ms utilizado es el BOP (benzotriazoliloxi-tris-[dimetilamino] fosfonio hexafluorofosfato). La va de activacin es presentada en la siguiente figura:

Mediante este agente acoplante se obtienen altos rendimientos con pocas reacciones secundarias y todos los coproductos son fcilmente removibles. Presenta riesgo de racemizacin y el coproducto hexametilfosforoamida es altamente txico.

Racemizacin. Como se mencion anteriormente, racemizacin es el trmino dado a la conversin que tiene un enantimero en otro, y ha sido profundamente estudiada en la sntesis de pptidos, dado que 19 de los 20 aminocidos utilizados en protenas son compuestos ptimamente activos, susceptibles a ella, y la conservacin de la configuracin L en los pptidos y protenas es esencial para que preserven sus propiedades biolgicas. Por lo anterior, es trascendental impedir que este

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fenmeno ocurra, ya que si tenemos una mnima tasa de racemizacin en cada residuo aadido, podemos obtener muchos productos distintos con aminocidos D, y purificar el pptido correcto representa un serio problema. La etapa de la sntesis en la que se presenta el riesgo de racemizacin, dado que esta reaccin es casi exclusivamente inducida por una base, es en la de activacin y acoplamiento. Los dos mecanismos por los que puede ocurrir son los siguientes: Enolizacin directa. Puede presentarse cuando se prepara un aminocido para activacin, el carbanin intermediario puede volver a protonarse en cualquier lado de la molcula (figura 26). Ya que el carbanin es un ion plano, y dependiendo de cul cara elija el protn, nos dar un enantimero o el otro.

En la prctica, no es una fuente importante de racemizacin, puesto que los factores de los que depende, como la base que cataliza y el solvente pueden ser controlados. As mismo, la velocidad de acoplamiento juega un papel importante, y este mecanismo se presenta en acoplamientos que son extremadamente lentos, cosa que no es muy comn en la sntesis de pptidos. Mecanismo de oxazolona. Con excepcin de prolina, los acil aminocidos activados y los pptidos acilados pueden dar un compuesto heterocclico bajo la influencia de una base. Las oxazolonas formadas son activadas a travs de la aminlisis y la reaccin con un grupo amino llevar eventualmente a la formacin de pptidos. Sin embargo, la velocidad de racemizacin es mayor a la de la formacin del enlace peptdico, por lo que los pptidos producidos se encontrarn racemizados .

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La sntesis de pptidos a partir del amino terminal (como son sintentizadas naturalmente las protenas en las clulas), provee una oportunidad mayor para la formacin de una oxazolona, por esta razn la sntesis de pptidos se lleva a cabo usualmente en el sentido contrario, del grupo carboxilo hacia el amino. El riesgo de que se forme una oxazolona se reduce cuando el aminocido est protegido por un derivado de uretano, y en el caso de que se formara, sta sera ms resistente a racemizacin; de ah que el uso de grupos protectores derivados de uretano sea muy popular en la sntesis de pptidos.

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CAPTULO IV
SNTESIS DE PPTIDOS EN SOLUCIN.
La sntesis de pptidos en solucin, tambin conocida como el mtodo clsico, fue la tcnica utilizada para elaborar pptidos hasta la aparicin de la sntesis de pptidos en fase slida (ver ms adelante), la cual ha venido a sustituir al mtodo clsico en casi todos los laboratorios, esto debido a que en cada ciclo de la sntesis en solucin deba aislarse y purificarse el pptido obtenido, por lo que el tiempo que consume es enorme y los rendimientos muy bajos. No obstante, an es utilizada para la produccin a gran escala en la mayora de las aplicaciones industriales. Se lleva a cabo en distintos solventes orgnicos, pero para prevenir formacin de oxazolonas se recomienda el uso de acetato de etilo, tetrahidrofurano, t-butanol, y acetonitrilo. La elongacin del pptido por el mtodo clsico puede llevarse a cabo de dos formas, por elongacin gradual (figura 28a) o por condensacin fragmentada (figura 28b), la eleccin depender de las necesidades de cada pptido. El primer factor a considerar, es que un pptido puede sintetizarse a partir del amino terminal o del carboxilo terminal, pero como ya se mencion en el apartado anterior, es preferible hacerlo a partir del carboxilo terminal para reducir el riesgo de racemizacin. Para comprender mejor las estrategias de elongacin, supongamos que tenemos un tetrapptido a sintetizar ABCD, si se sigue la elongacin gradual, se pondran a reaccionar el aminocido D con el C, se purifica el producto, posteriormente se le agregara el aminocido B, ahora purificaramos BCD para finalmente adicionar el aminocido A. En la condensacin fragmentada se sintetizaran el dipptido AB y el CD por separado, y los productos purificados se haran reaccionar para de esta manera tener el producto esperado. Si suponemos un rendimiento del 80% en cada etapa de purificacin, al final de la sntesis por elongacin gradual tendramos un rendimiento del 51.2%, mientras que por el mtodo de condensacin fragmentada el rendimiento total sera del 64%.

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Conforme aumenta el nmero de aminocidos, el rendimiento total para la fragmentacin condensada ser mejor que el obtenido para la elongacin gradual, as mismo, el tiempo que consume es menor si ms de una persona trabaja en la obtencin del producto. Por otro lado, tambin existen contras en la fragmentacin condensada, es desarrollada mejor en unas posiciones que en otras, por lo que es ms complicado sintetizar a partir del grupo carboxilo que en la elongacin gradual. La eleccin sobre qu estrategia utilizar depender de todas las variables involucradas en la sntesis, como la composicin y el tamao del pptido. Es posible hacer combinaciones de las estrategias, generalmente si existe en la secuencia un puente disulfuro, la sntesis girar en torno a ste. Por otro lado, si nos encontramos aminocidos que causen problemas (como la metionina, cuya cadena lateral usualmente se deja sin proteccin) estos pueden dejarse fuera de la regin central. As pues, volviendo a nuestro ejemplo anterior, se podra sintetizar [(A+B)+(C+D)], como ya se haba planteado, o bien, {[A+(B+C)]+D} , {A+[(B+C)]+D]}, {[(A+B)+C)]+D} o cualquier combinacin posible segn el nmero de aminocidos implicados. Es importante recordar, sea cual sea la estrategia seleccionada, que deben escogerse los grupos protectores correspondientes a cada grupo funcional, siendo cautelosos en que los permanentes y los temporales deben ser ortogonales entre s.

Ejemplos de pptidos sintetizados en solucin. Muchos fueron los pptidos y protenas sintetizados mediante el mtodo clsico, pptido son varias. Oxitocina (CYIQNCPLG). Sintetizada por du Vigneaud y sus colaboradores en 1953, esta hormona est involucrada en el control de las contracciones uterinas durante el parto, y de la liberacin de la leche despus de ste. La estrategia que siguieron fue elongacin gradual a continuacin se mencionan dos ejemplos para demostrar que las posibilidades de sintetizar un

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a partir del carboxilo terminal, cuyo grupo protector permanente era un etil ster, otros grupos permanentes utilizados fueron bencil ter para la tirosina y bencil ster para las cistenas. El grupo temporal del amino utilizado fue el benciloxicarbonil, el cual fue removido por HBr/AcOH (figura 3). Gastrina porcina (QGPWMEEEEEAYGWMDF). Considerada como el ms potente

estimulante de la secrecin cida del estmago, esta hormona se encuentra en los mamferos por lo menos en tres formas, Su sntesis fue llevada a cabo mediante fragmentacin condensada en grupos que excluyeran metionina del fragmento central, y de esta manera emplear hidrogenacin cataltica en cada preparacin. Los pptidos intermediarios fueron distribuidos de la siguiente manera:

Tabla 2. Aminocidos 1-5 Condensacin Estrategia Fragmentada

Grupo protector permanente de C Terminal Metil ster Grupo protector Temporal del amino Grupo protector Temporal del carboxilo Cadenas laterales protegidas Boc Bencil ster Ninguna

Tabla 3. Aminocidos 6-13 Estrategia Elongacin gradual

Grupo protector permanente de C Terminal Metil ster Grupo protector Temporal del amino Grupo protector Temporal del carboxilo benciloxicarbonil Niguno El carboxilo de los Cadenas laterales protegidas glutamatos con t-butil ster

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Tabla 4. Aminocidos 14-17 Estrategia Condensacin fragmentada

Grupo protector permanente de C Terminal Metil ster Grupo protector permanente de C Terminal Boc Grupo protector Temporal del amino Grupo protector Temporal del carboxilo Benciloxicarbonil Metil ster* El carboxilo de los Cadenas laterales protegidas glutamatos con t-butil ster
*Cuando se sintetiz 14 y 15 estuvo presente el grupo temporal del carboxilo, y no haba dicho grupo durante la sntesis de 16 y 17, por lo que no haba por qu preocuparse de que fuese ortogonal.

Finalmente se condensaron todos los fragmentos sintetizados previamente, DCC fue el activador en todos los casos, excepto en la etapa final, en donde se utiliz un anhdrido mixto.

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CAPTULO V
SNTESIS DE PPTIDOS EN FASE SLIDA.

La tcnica de Merrifield. Cuando Bruce Merrifield incursion en el rea de sntesis de pptidos se dio cuenta de lo extenuante y largo que significaba obtener el producto deseado, por lo que imagin que el proceso poda simplificarse. Su idea bsicamente consista en ensamblar en un soporte slido insoluble el residuo C-terminal del pptido a sintetizar, con lo cual la cadena de aminocidos ira creciendo anclada al soporte slido mediante una estrategia de elongacin gradual. Finalmente, el producto deseado es desprendido del soporte, y su purificacin y caracterizacin se llevan a cabo en solucin. Lo anterior permite que haya una rpida filtracin y lavados para deshacerse de reactivos y productos secundarios despus de cada etapa de la sntesis, en consecuencia, no habr que purificar cada pptido intermediario, lo que se traducir en una reduccin de tiempo y un aumento en la produccin. Su idea fue llevada a la realidad, y en 1963 report la obtencin del tetrapptido leucilalanilglicilvalina mediante la adicin de Z-aminocidos a una resina de poliestireno. Sin embargo, pareca que esta tcnica no prometa mucho para la construccin de pptidos ms grandes, las reacciones de desproteccin y/o acoplamiento no llegaban a completarse y el tetrapptido estaba contaminado con fragmentos ms pequeos. Entonces Merrifield realiz importantes cambios para la sntesis del nonapptido bradiquinina, sustituy los Z-aminocidos por Boc-aminocidos y en 1964 report la obtencin de un producto ms puro. Aunque las reacciones se llevan a cabo en solventes orgnicos, como en el mtodo clsico, el nombre de sntesis de pptidos en fase slida, fue dado por el hecho de que el pptido va creciendo anclado a un soporte, un esquema detallado puede observarse en la siguiente figura:

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Una de las caractersticas particulares de la tcnica de Merrifield es el uso t-butoxicarbonil como grupo protector temporal del -amino, y como permanentes grupos bencil ster (o los relacionados a ste). El soporte slido comnmente utilizado en la tcnica de Merrifield es una resina de poliestireno clorometilada entrecruzada por la incorporacin con una pequea cantidad de divinilbenceno. El primer aminocido es adherido a la resina a travs de la sustitucin del cloro por ayuda de una amina terciaria del Boc-aminocido, generando el equivalente de un bencil ster. La desproteccin es llevada a cabo con una solucin de cido trifluoroactico en diclorometano, le sigue una neutralizacin para que el siguiente residuo pueda ser acoplado por medio de DCC. Las etapas de desproteccin, neutralizacin y acoplamiento son repetidas con los Boc-aminocidos apropiados hasta que la secuencia ha sido completada. Al final de cada etapa el conjugado insoluble polmero-pptido es lavado exhaustivamente para remover el exceso de reactivos y coproductos. Finalmente, tratamiento con cidos fuertes, usualmente HF, remueve todos los grupos protectores permanentes de las cadenas laterales y el producto formado es liberado de la resina.

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Existe un problema que es importante tener en cuenta cuando se lleva a cabo esta tcnica, si cualquier residuo N-terminal de una de las muchas cadenas polipeptdicas en crecimiento adheridas a la resina permanece sin acilar despus de la etapa de acoplamiento, esto llevar a que el producto final est contaminado por secuencias incompletas mediante dos eventos: a) El residuo puede ser exitosamente acoplado en el siguiente ciclo, resultando en un pptido suprimido, o b) El residuo puede no ser acoplado subsecuentemente, lo que dara un pptido truncado. Al aplicar matemticas a esto, nos damos cuenta del grave problema que representa, si suponemos un 99% de reacciones llevadas a trmino en la etapa de acoplamiento, al final de 10 ciclos tendremos un 90% del producto puro y un 10 % de secuencias incompletas contaminantes. Entre ms ciclos existan, obviamente el rendimiento ser menor. Este problema puede solucionarse forzando a que la etapa de acoplamiento se lleve a cabo en un 100%. Puede usarse un exceso del agente acilado o incluso repetir esta etapa ms de una vez. Puede monitorearse si la etapa no se ha completado mediante la prueba de Kaiser, la cual es una prueba basada en el cambio de color de la resina, si la resina no cambia de color, nos indicara que la etapa de acoplamiento se ha completado, si el color de la resina cambia a azul es indicativo de que an hay algunos grupos amino libres (este cambio de color es el resultado de la reaccin entre la ninhidrina utilizada en la prueba y los grupos amino libres). El acoplamiento tambin puede ser monitoreado por la prueba de azul de bromofenol, el cual en presencia de grupos amino libres da una coloracin azul, y en ausencia de stos una coloracin amarillo verdosa. Este procedimiento puede hacerse de manera continua agregando el azul de bromofenol al agente acilante, o de manera discontinua tomando una muestra de la resina y tratarla con el reactivo.

La tcnica de Sheppard. El modelo propuesto por Merrifield no fue del agrado de muchos qumicos de la poca, les preocupaba sobretodo la debilidad que presentaba y que no pudieran revisar el producto en cada etapa sino tener que esperar hasta el final. Aunque ya se ha comentado en la seccin anterior posibles soluciones al problema de contaminacin por pptidos truncados, las vigorosas condiciones en las que se llevaba a cabo la tcnica de Merrifield no terminaban de convencerlos acerca de obtener un 100% de acoplamiento. Por lo que, en 1971 Sheppard y colaboradores estudiaron de nuevo el modelo de Merrifield para optimizarlo. Sheppard argumentaba que sera deseable que el acarreador polimrico fuera

qumicamente similar a la cadena polipeptdica creciente, de esta manera, ambos podan ser solvatados por disolventes polares aprticos, lo que permitira crear un sistema en el que hubiera acceso libre a las sustancias participantes a los sitios reactivos en cada etapa de la sntesis. Esto no suceda con el soporte de poliestireno utilizado por Merrifield, el cual impeda la adecuada

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solvatacin del pptido en crecimiento, lo que reduca la disponibilidad de los sitios reactivos. La propuesta de Sheppard era la introduccin de soportes de poliamida en sustitucin del poliestireno. Otra caracterstica importante de esta tcnica, debido a la factibilidad de cambiar del solvente, es el uso de Fmoc-aminocidos en lugar de los Boc utilizados por Merrifield, de ah que a la tcnica de Sheppard tambin se le conozca como sntesis Fmoc-poliamida, la cual se resume en la figura 30.

En esta tcnica se usa preferentemente dimetilformamida como solvente, dado que provee condiciones ms adecuadas para llevar a cabo la reaccin de acoplamiento. A partir de ah, surgi la idea del cambio de resina, dado que para que el pptido formado fuera completamente solvatado necesitaba de un acarreador que fuera de naturaleza polar, y aunque la poliacrilamida comercial pareca no ser la adecuada para este propsito, s lo fue un derivado de sta, un soporte de polidimetilacrilamida. Un brazo espaciador separa a el primer aminocido de la resina, e incrustado en ste se encuentra un aminocido de referencia, usualmente Norleucina. La desproteccin de Boc-aminocidos en la tcnica de Merrifield conlleva a una exposicin prolongada al cido, ya que no hay una purificacin intermedia, y estas son precisamente las condiciones vigorosas que se mencionaban anteriormente. Por esta razn, se dio la sustitucin de los Boc-aminocidos por los

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Fmoc-aminocidos en la tcnica de Sheppard, como grupos protectores permanentes se utilizan los grupos t-butil. Para comprobar que la etapa de acoplamiento se ha llevado a cabo tambin se usa la prueba de Kaiser, adems que puede aprovecharse el hecho de que el grupo protector Fmoc es un cromforo, el flujo que pasa por la resina puede hacerse pasar a travs de un detector de rayos u.v.

El soporte slido. Dadas las caractersticas de la sntesis de pptidos las resinas deben tener una serie de requerimientos que imponen algunas de restricciones para el diseo adecuado de una resina. Merrifield y Ericksson enlistaron algunas de ellas cuando se empezaba el desarrollo de la sntesis de pptidos en fase slida: Un soporte til debe contener sitios reactivos en los cuales la cadena polipeptdica pueda ser adjuntada y removida posteriormente, y debe ser estable a las condiciones fsicas y qumicas de la sntesis. El soporte debe permitir un contacto rpido entre el pptido creciente y los reactivos. Debe proveer suficientes puntos de adherencia para obtener una buena produccin por unidad de volumen y debe minimizar las interacciones entre las cadenas peptdicas unidas. No todos estos requerimientos son fciles de cumplir, y algunos de ellos pueden ocasionar conflictos al momento de seleccionar la mejor resina. A continuacin se mencionan los soportes que han sido usados en SPPS : Soportes de tipo gel. Son los soportes ms usados debido a la igual distribucin de los grupos funcionales a travs de la red polimrica altamente solvatada e inerte, la cual es ideal para el ensamblaje de los pptidos. La red polimrica es flexible y la resina puede expandirse para acomodar a la molcula creciente dentro del gel. Para la sntesis de pptidos se han desarrollado 4 tipos de resinas de gel: 1. La resina hidrofbica de poliestireno, que fue la desarrollada por Merrifield.

Originalmente era una resina con un 2% de entrecruzamiento por la incorporacin de divinilbenceno clorometilado (fue modificada a un 1% de entrecruzamiento debido a los problemas que presentaba para la sntesis de pptidos ms complejos), esta resina es muy estable en todo el rango de pH y a la temperatura. El tamao de las perlas de esta resina es de 10 a 200 m, la solvatacin de estas perlas no es muy eficiente, y los pptidos solvatados pueden cambiar las propiedades de

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hinchamiento (swelling) de la resina, esto sumado al carcter frgil de la resina a lo largo de la sntesis, la hacen intil para un flujo continuo. 2. Las resinas de poliacrilamida desarrolladas por Sheppard como una alternativa hidroflica para las resinas de poliestireno, son obtenidas mediante el entrecruzamiento de poly-N,N-dimetilacrilamida con 5% de bis-N,N-acriloiletilendiamina y como grupos funcionales N-acriloilsarcosina metil ster. Es una resina mucho ms flexible que la anterior, por lo que permite un mayor entrecruzamiento. Las resinas de poliacilamida se hinchan mejor con solventes polares y tiene mejores propiedades que las de poliestireno bajo condiciones polares de sntesis. Su carcter frgil no las hace adecuadas para un flujo continuo. 3. Las resinas con polietilenglicol (PEG) incrustado fueron desarrolladas para la obtencin de una resina ms estable. Estas resinas tambin mejoran la sntesis de pptidos difciles. Se obtienen por la reaccin de oligoxietilenos con perlas de poliestireno aminometilado. Estas perlas ahora tienen la propiedad de hincharse con solventes no polares y polares, exceptuando el agua, por lo que pueden utilizarse indistintamente Boc-aminocidos o Fmoc aminocidos. Su grado de hinchazn no cambia durante toda la sntesis, lo que las hace ms estables al flujo. 4. Las resinas basadas en PEG, las cuales estn compuestas exclusivamente de una red de Polietilenglicol/polipropilenglicol (PPG) o por una combinacin de PEG con una pequea cantidad de poliamida o poliestireno. Estas resinas confieren propiedades ptimas para el soporte, debido a los arreglos presentados por los enlaces entre en carbono y el oxgeno a lo largo de la cadena asumiendo 3 tipos de estructuras helicoidales. La primera esconde los tomos de oxgeno, convirtindola en una estructura hidrofbica, la segunda de polaridad intermedia, y la tercera con los tomos de oxgeno expuestos por lo que es una estructura hidroflica. Lo anterior permite que este tipo de resina sea compatible con solventes tanto polares como no polares. Las molculas de PEG son altamente dinmicas, lo que permite que las reacciones de acoplamiento se lleven a cabo rpidamente. El carcter anfptico del PEG tambin impide que los pptidos se agreguen. Soportes de superficie. Existen muchos materiales que se utilizan para este tipo de soporte durante la sntesis de pptidos, entre los que se encuentran fibras de celulosa, poliestireno o polimetacrilato poroso altamente entrecruzado, vidrio de poro controlado, y slices.

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Geles soportados. Surgieron debido a que los geles de poliestireno y poliamida no eran estables en las condiciones del flujo. Para incrementar su estabilidad mecnica los geles fueron apoyados en matrices rgidas, el primer ejemplo utilizado fue la diatomita, polimerizando la solucin de poliamida despus de la absorcin dentro de los grnulos de la matriz inorgnica. Posteriormente la diatomita fue sustituida por una esponja de poliestireno entrecruzado en cuyo interior se encontraba la poliamida incrustada mediante un enlace covalente. Cepillos polimricos. Son un tipo especial de polmero donde un componente linear,

como poliestireno, es incrustado en otro, por ejemplo un filme o un tubo de polietileno.

Agentes espaciadores del pptido y la resina. El anclaje a la resina y el posterior desprendimiento del pptido de la misma, se logra a travs del uso de molculas bifuncionales, las cuales se adhieren de manera permanente a la resina por un extremo, usualmente mediante un enlace amida, y por el otro se unen temporalmente al aminocido que dar inicio al pptido a sintetizar mediante la formacin habitual de un ster (figura 31).

El espaciador debe formarse fcilmente, ser lo suficientemente estable a los continuas reacciones de desproteccin y acoplamiento, y al mismo tiempo permitir la liberacin del pptido recin formado sin daar ninguno de sus enlaces peptdicos. Existen varios espaciadores que son usados en combinacin con los Fmoc-aminocidos de los cuales slo se mencionarn algunos con fines ilustrativos, para ms informacin se recomienda al lector consultar la referencia 21. El cido 4-hidroximetilbenzoico (figura 32) , forma un ster con el primer aminocido que es estable a cidos anhdridos. Sobrevive tratamiento prolongado con cidos fuertes como HF, el enlace puede romperse con reactivos nucleoflicos, como amonaco e hidracina, lo que lo hace til

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para pptidos que tienen una amida en el C-terminal. El hecho de que sean estables a cidos permite la desproteccin de grupos protegidos permanentemente sin liberar el pptido de la resina, esto no suceda en la tcnica de Merrifield, donde la desproteccin de los grupos permanentes y la liberacin del pptido de la resina se daba en un solo paso. Aminlisis intramolecular, que conlleva a la liberacin del pptido de la resina, es una posible reaccin secundaria en cualquier pptido, pero especialmente con este agente espaciador cuando se forma el dipptido, esto sucede porque la desproteccin de un Fmoc-aminocido no libera el amino terminal es su forma protonada, contrario a lo que sucede con la desproteccin de los Boc-aminocidos (figuras 9 y 6, respectivamente). Razn por la que, como regla general, la desproteccin no se lleva a cabo a menos que la reaccin de acoplamiento sea realizada inmediatamente.

cido metoxi-4-hidroximetilbenzoico (figura 33), es el espaciador ms usado en la tcnica de Sheppard, el grupo metoxi incrementa su labilidad, dando una reactividad comparable a los derivados del terbutilo. Los pptidos ligados a la resina por este reactivo, pueden ser liberados por TFA, de esta manera se desprotegeran los grupos permanentes a la vez que es desprendido el producto final de la resina.

El ster que se forma entre el primer aminocido y el cido 1,3 dimetoxi-4hidroximetilbenzoico, (figura 34), es mucho ms lbil al cido debido al segundo grupo alcoxi introducido, no tiene muchas aplicaciones dado a las propiedades no favorables de solubilidad que confiere a los pptidos protegidos.

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La esterificacin del primer aminocido con el grupo hidroxilo del agente espaciador, es ms benfica si se hace antes de que ste sea unido a la resina, aunque esto no es fcil de lograr. Una manera de hacerlo, es mediante la conversin del grupo carboxilo del agente espaciador en un ster activado moderadamente reactivo, como el triclorofenil ster, el cual es lo suficientemente estable para no interferir con la esterficacin del grupo hidroxilo al primer aminocido, y son lo suficientemente reactivos, para posteriormente poder acilar la resina. Aunque usualmente, el espaciador es unido primero a la resina. Existen casos especiales de pptidos en los que el extremo C-terminal contiene un grupo amida al final, para estos casos puede romperse el enlace ster formado mediante aminlisis, como se mencion en el ejemplo del cido 4-hidroximetilbenzoico, pero tambin, pueden utilizarse espaciadores que contengan un grupo amino para la formacin del enlace amida con el primer aminocido anclado a la resina, lo cual es ms recomendado. Un ejemplo de estos espaciadores es la bencihidrilamina (BHA) que se muestra en la figura 35.

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Instrumentacin. La sntesis de pptidos en fase slida puede llevarse a cabo manualmente o de forma automtica mediante el uso de equipos comerciales. El sistema ms simple y menos costoso se trata de un contenedor cilndrico en donde se encuentra la resina, todos los reactivos son adicionados manualmente y drenados de la resina mediante vaco. Otro sistema consiste de un contenedor de la resina conectado a dos vlvulas, la vlvula A llena el contenedor de la resina con el liquido correspondiente que es elegido mediante la vlvula B y entra al contenedor mediante presin controlada por nitrgeno, o por vaco. Dado la simplicidad del sistema, la vlvula B slo elige entre solvente para la reaccin de acoplamiento, y el reactivo para la desproteccin temporal de los aminocidos (en la figura 36 se muestra piperidina, que sera utilizada en caso del uso de Fmoc aminocidos). Cada etapa de la sntesis es llevada a cabo con agitacin, una vez terminada la reaccin se vaca el contenedor de la resina con la vlvula A.

La automatizacin de los sintetizadores de pptidos ha ido evolucionando hasta tener los modernos aparatos con los que se cuenta ahora. En un inicio eran semiautomticos, ya que a pesar de ser de flujo continuo, requeran que los aminocidos fueran introducidos en cada ronda. Los sintetizadores actuales son completamente automticos, son sistemas complejos de vlvulas que seleccionan el flujo que ser bombeado hacia la resina dependiendo de la reaccin que deba ser

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SNTESIS DE PPTIDOS

llevada a cabo (figura 37a),

controlados y monitoreados por una computadora externa. La

computadora est provista de un software que le permite controlar las velocidades de flujo, la cantidad de aminocidos, los tiempos de desproteccin y acoplamiento de los mismos, los lavados y si alguna de las etapas de la sntesis debe ser repetida. Algunos tambin cuentan con un espectofotmetro el cual monitorea la concentracin de los reactivos en la corriente de salida. Las botellas con los reactivos son presurizadas con nitrgeno slo para una purga inicial de los reactivos para que stos no tapen la bomba.

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CAPTULO VI
CASOS ESPECIALES DE SNTESIS.
Sntesis de pptidos cclicos. Existen dos clases de pptidos cclicos, detallada de lo que son y cmo se sintetizan. Pptidos cclicos por un enlace entre un grupo amino y un carboxilo. Dada la enorme variedad de pptidos naturales que presentan secuencias de aminocidos cclicas, como antibiticos y toxinas, surgi el inters por sintentizarlos de esta forma para obtenerlos funcionales. Durante la era de la sntesis de pptidos en solucin, la ciclacin era llevada a cabo al final de la sntesis, ms tarde, con el surgimiento de la SPPS, los pptidos eran sintetizados linealmente en la resina, para su posterior ciclacin en solucin, sin embargo hacerlo en solucin tiene grandes desventajas, ya que pueden obtenerse dmeros u oligmeros del pptido a ciclar, para evitarlo, usualmente se realiza en condiciones en las cuales el pptido se encuentra muy diluido. Posteriormente se observ que esto no ocurra si el pptido estaba anclado a la resina, ya que las interacciones intramoleculares se ven favorecidas sobre las intermoleculares, debido a la distancia entre las cadenas. Otra de las ventajas observadas es que las reacciones pueden llevarse a cabo hasta ser completadas por el uso de un exceso de reactivos y ser simplemente removidos en los lavados subsecuentes. La formacin del anillo a travs de un enlace amida entre un grupo amino y un grupo carboxilo, puede ser de 4 tipos: (1) de cabeza a cola, que se da mediante la unin del amino terminal con el carboxilo terminal, (2) de cadena lateral a cadena lateral, mediante la unin de un grupo amino de una cadena lateral de lisina con el grupo carboxilo de la cadena lateral de un cido asprtico o glutmico, (3) de amino terminal a cadena lateral, entre el amino terminal y carboxilo de la cadena lateral de los cidos asprtico o glutmico y finalmente (4) de cadena lateral a carboxilo terminal, que se da entre el -amino de la lisina y el carboxilo terminal. a continuacin se da una explicacin ms

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SNTESIS DE PPTIDOS

En la figura 38 se observan las distintas estrategias para la sntesis de un pptido cclico en fase slida, la resina que es usada con preferencia es la de poliestireno con PEG incrustado, matriz aunque tambin se ha utilizado con xito las de poliamida que tengan una eleccin del agente espaciador debe hacerse con cuidado, de soporte. La

principalmente si se necesita adjuntar el primer aminocido a travs de su cadena lateral (figura 38 d), y en la literatura se encuentran varios ejemplos. Pero el aspecto ms importante que hay que cuidar cuando se va sintentizar un pptido cclico, es la eleccin de la combinacin de los grupos protectores a utilizar. En este caso, no slo necesitaremos el grupo protector temporal del -amino, y los permanentes del carboxilo unido a la resina y las cadenas laterales, sino que adems necesitaremos un tercer grupo protector semipermanente (cuando la formacin del anillo no se d entre el amino terminal y el carboxilo terminal), que sea ortogonal a los otros dos, el cual va a estar unido a los grupos que formarn parte de enlace que generar el anillo al final de la sntesis. Un ejemplo de esto puede ser la eleccin de los derivados del grupo bencil como permanentes, el grupo F-moc como semipermanente y el Boc como grupo temporal. Es importante tener en cuenta, que de la combinacin de

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grupos protectores que se haga, depender tambin la eleccin de la resina, pues no todas son compatibles con los solventes utilizados en la desproteccin temporal, aunque las de poliestireno con PEG incrustado pueden ser usadas independientemente si el grupo protector temporal es Boc o Fmoc. Finalmente, la formacin del enlace amida se da con la ayuda de un reactivo activador, como para la formacin del enlace peptdico, usualmente su ocupa DCC. Pptidos cclicos por puentes disulfuro. Los puentes disulfuro juegan un papel importante en el plegamiento y la estabilidad de algunas protenas, entre las que se incluyen hormonas, enzimas, factores de crecimiento, toxinas, entre otras. Por lo tanto, la introduccin artificial de este tipo de enlace a pptidos o protenas pequeas sintetizadas en el laboratorio, servir para mejorar sus actividades biolgicas, as como su especificidad y estabilidad. Los puentes disulfuro intramoleculares unen porciones de la cadena polipeptdica que se encuentran muy lejanas la una de la otra, estos pueden formarse en solucin o mientras el pptido se encuentra adherido a la resina, pero al igual que en los pptidos cclicos de la seccin anterior, cuando la formacin del enlace se da en solucin, sta debe estar altamente diluida para evitar la formacin de puentes disulfuro intermoleculares y por consecuencia, evitar formacin de dmeros u oligmeros. Para la formacin de los puentes disulfuro, pueden tomarse dos caminos. El primero de ellos es la oxidacin de los grupos tiol de las cistenas libres, es decir, al finalizar la sntesis del precursor lineal, se realiza la desproteccin de todos los grupos protectores permanentes, incluidos los de las cistenas presentes, posteriormente el pptido es sometido a diferentes condiciones para lograr la formacin del puente disulfuro, entre las cuales destacan: 1. Por oxidacin con aire, que es la ms fcil de realizar, pues slo necesita el oxgeno presente en la atmsfera. Generalmente se realiza bajo condiciones levemente alcalinas. Entre las desventajas que presenta se encuentran: la cantidad de tiempo que necesita el proceso para completar la reaccin (ms de cinco das), la inadecuada solubilidad de algunos pptidos a pH bsico y acumulacin de productos secundarios debido a que tambin pueden oxidarse residuos de metionina. 2. Por oxidacin en presencia de amortiguadores Redox, la cual aumenta la velocidad y la produccin de la reaccin, con respecto a la oxidacin con aire. 3. Por oxidacin mediada por ferricianida de potasio, que es un reactivo oxidante muy suave usado ampliamente. Es sensible a la luz, por lo que se logran mejores

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resultados si la reaccin se lleva a cabo en la oscuridad. Puede oxidar otras cadenas laterales como la de metionina o triptfano. 4. Por oxidacin con dimetilsulfxido (DMSO), que puede ser llevada a cabo en un rango de pH ms amplio (3-8) que el que se requiere para la oxidacin por aire. Pueden usarse grandes concentraciones para acelerar la reaccin, pues no se ha observado que afecte a las cadenas laterales nucleoflicas como metionina, tirosina o triptfano, sin embargo, puede ser problemtico deshacerse de l en el producto final La segunda opcin para formar el puente disulfuro, es oxidando directamente las cistenas protegidas: 1. Oxidacin por el ion yoduro. Los reactivos utilizados como fuente del ion son Niodosuccinimida y el yoduro de ciangeno. Los grupos protectores utilizados para esta tcnica usualmente son el S-Trt y el S-Acm (uno por cistena participante en el enlace). Puede oxidar otros aminocidos como Tirosina, metionina y triptfano, lo cual puede evitarse utilizando el solvente adecuado y controlando el pH. 2. Trifluoracetato de talio (III). Puede usarse en sustitucin al anterior, dando incluso mejores resultados en la produccin y pureza de los puentes disulfuro formados. Sin embargo, es altamente txico. No afecta aminocidos como histidina o tirosina, pero s a metionina y a triptfano por lo que stos deben estar protegidos si se utiliza esta tcnica. Funciona si ambas cistenas tienen el grupo protector Acm o Tmob, pero no si tienen Trt. El talio es difcilmente removible de el producto final. 3. Oxidacin por sulfxido y clorosilano. Una mezcla de estos dos reactivos pueden desproteger y formar puentes disulfuro a partir de varios grupos protectores del grupo tiol, como Acm, terbutilo, Mob, Meb, etc. La mezcla para la formacin ptima del puente disulfuro, depende del grupo protector. El nico aminocido que puede verse afectado usando esta tcnica es el triptfano, por lo que debe permanecer protegido cuando se lleve a cabo. Si en la secuencia del pptido existen ms de dos cistenas debe cuidarse de que se forme el puente disulfuro correcto (figura 39). Para el caso en que ms de un puente disulfuro deba formarse, debe plantearse una estrategia para lograr formar las combinaciones correctas, por lo que se usan grupos protectores ortogonales. Debe formarse un puente disulfuro a la vez, ya sea por oxidacin directa de los grupos tiol, o por oxidacin en presencia de los grupos protectores. La eleccin de la tcnica para la formacin de cada puente disulfuro, depender de las necesidades que presente cada caso.

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Sntesis de glicopptidos. Se han hecho muchos esfuerzos para la sntesis de glicopptidos dada la importancia biolgica de estos junto a las glicoprotenas. En un inicio, la glicosilacin era aadida despus de terminada la sntesis del pptido, y aunque esto poda ser logrado con los N-glicopptidos, era muy difcil lograrlo para los O-glicopptidos. Afortunadamente, se han desarrollado mtodos eficientes para la obtencin de aminocidos glicosilados, de esta manera, pueden incorporarse mediante elongacin gradual a la cadena polipeptdica creciente sin temor al que el impedimento estrico inhiba el acoplamiento, pues incluso se han acoplado aminocidos con heptasacridos con resultados positivos. Los grupos protectores de los aminocidos glicosilados deben ser escogidos considerando que los enlaces glicosdicos son muy lbiles a cidos, y que pptidos glicosilados en serina y treonina pueden perder la glicosilacin, mediante eliminacin . El grupo amino protector ms utilizado para la incorporacin de aminocidos glicosilados, es el grupo Fmoc. El riesgo que corren los aminocidos glicosilados serina y treonina a perder el azcar debido a que la desproteccin del grupo Fmoc se lleva a cabo con piperidina, puede reducirse con el uso de morfolina, sin embargo, es menos eficiente para la desproteccin que la piperidina, y algunos expertos en el tema consideran que el temor a que suceda la eliminacin usando piperidina es exagerado. Por otro lado, los grupos hidroxilo del carbohidrato pueden protegerse con cualquier grupo acilo,

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preferentemente un bencil ter, o con un grupo silil o isopropilideno, aunque pudieran incluso dejarse sin proteccin.

Sntesis de pptidos fosforilados. Este tipo de pptidos pueden obtenerse acoplando los aminocidos Tyr, Thr o Ser previamente fosforilados, los cuales se encuentran comercialmente disponibles tanto para la sntesis de Boc aminocidos, como para los Fmoc aminocidos, aunque tambin pueden ser sintetizados en el laboratorio (ver referencia 26). Sntesis en fase slida para pptidos con fosfotirosina. Las tirosinas empleadas en la sntesis de Sheppard son de la forma Fmoc-Tyr(PO3R2)-OH, donde R puede ser un grupo metilo, bencilo o terbutilo, y para ser acoplados requieren el uso de sales de fosfonio, siendo BOP el reactivo preferencial. En el caso de las Boc tirosinas, R slo puede corresponder al grupo metilo, toda vez que los otros dos grupos son utilizados para proteccin temporal y permanente en otras etapas de la sntesis, Boc-Tyr(PO3Me2)-OH son compatibles con cualquier agente acoplante. La liberacin de los grupos R de las tirosinas fosforiladas se da al final de la sntesis, de manera anloga a la que se da para desproteger otros grupos que contienen proteccin metilo, bencilo y terbutilo y que han sido previamente explicadas, de ah que en caso de la sntesis de Sheppard y utilizando Fmoc-Tyr(PO3tBu2)-OH, el rompimiento del pptido de la resina y la liberacin del grupo terbutilo de la tirosina fosforilada se den al mismo tiempo debido al tratamiento con TFA. Sntesis en fase slida para pptidos con fosfoserina y fosfotreonina. Los

aminocidos utilizados la sntesis Boc para el acoplamiento de fosfoserina o fosfotreonina son del tipo Boc-Ser(PO3R2)-OH, donde R puede ser un grupo metilo o un grupo arilo. El acoplamiento puede ser llevado a cabo usando tanto DCC como BOP, la desproteccin de los grupos permanentes utilizando HF puede ocasionar desfosforilacin cuando R es un grupo arilo, aunque puede ser utilizado teniendo en cuenta que el rendimiento no ser muy alto. Para la sntesis de Sheppard, los grupos R son H o bencilo y el acoplamiento es llevado a cabo con una sal de fosfonio. Otra alternativa de obtener pptidos fosforilados, cuyo uso ha sido limitado, es fosforilando posterior a la sntesis del pptido. Esto se logra con el uso de dialquil N,N dietilfosforamiditas despus de haber secado la resina por vaco (dado que el reactivo fosforilante puede reaccionar con agua), utilizando DMF como solvente. Se ha encontrado especial aplicacin para fosforilar de esta forma pptidos que contienen tirosinas, ya que stas se fosforilan rpidamente.

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SNTESIS DE PPTIDOS

Bibliotecas de pptidos sintticos. Las bibliotecas de pptidos sintticos tienen mltiples aplicaciones como lo son la identificacin de ligandos, identificacin de eptopes de unin a anticuerpos, desarrollo de vacunas y medicamentos, etc. Las bibliotecas pueden ser obtenidas mediante SPPS, por lo que se toman en cuenta los mismos parmetros que para la sntesis de un nico pptido. Entre los soportes slidos ms utilizados se encuentra el soporte de polidimetilacrilamida con una incrustracin de poliestireno (Tentagel), el de poliestireno entrecruzado con divinilbenceno (soporte de Merrifield), celulosa, e incluso vidrio. Los grupos protectores que se usan habitualmente son aquellos utilizados en la sntesis de Sheppard (Fmoc/t-butil), aunque dependiendo de la tcnica que se lleve a cabo para la construccin de la biblioteca los grupos protectores pueden variar. A continuacin se mencionan algunas de las tcnicas utilizadas para obtencin de la sntesis de pptidos mltiple: Sntesis en multipines. Fue el primer mtodo desarrollado para la sntesis de pptidos mltiple, ya que pueden sintetizarse hasta 96 pptidos a la vez. Consiste en el ensamblaje del cuerpo de plstico de los pines con una matriz polimrica (de poliestireno o poliacrilamida), llamada corona, sobre la cual ir adherido el aminocido que iniciar la sntesis peptdica. Posteriormente cada pin ser sumergido en un pozo distinto con un aminocido diferente, el cual ser acoplado (figura 40). Y as consecutivamente hasta llegar el nmero de aminocidos que se desee. Cada uno de los pines tendr un pptido de secuencia conocida y pueden llevarse a cabo ensayos de unin mientras el pptido siga unido al pin o liberndolos en solucin.

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Sntesis en bolsas de polipropileno. Fue desarrollada por Richard A. Houghten y se conoce popularmente como sntesis en bolsas de t, dada la semejanza que presentan con las bolsas de polipropileno que son utilizadas para realizar esta tcnica. Consiste en poner dentro de las bolsas una resina que usualmente es de 4-metilbencilhidrilamina (MBHA), aada bolsa se etiqueta para identificar el pptido que se va a sintetizar dentro de ella. Las etapas de desproteccin y los lavados se realizan en un contenedor con todas las bolsas juntas. Para el acoplamiento se separa cada bolsa para unir el aminocido respectivo, y as sucesivamente hasta completar la secuencia (figura 41).

Sntesis sobre membranas de celulosa. Esta tcnica desarrollada por Ronald Frank, consiste en la utilizacin de la superficie de una membrana de celulosa como soporte slido para la sntesis de los distintos pptidos. Para la funcionalizacin de la superficie de la membrana se fija Fmoc- alanina , usualmente por esterificacin del aminocido con los grupos hidroxilo de la celulosa, de esta manera puede procederse ahora al ensamblaje de las secuencias peptdicas. Las partes de la membrana en las que no se uni este aminocido, quedan inactivadas por acetilacin. La membrana de celulosa es ahora marcada con un lpiz para la identificacin de cada uno de los pptidos. Cada aminocido protegido se

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SNTESIS DE PPTIDOS

disuelve

en

dimetilformamida

dimetilacetamida

es

colocado

sobre

la

marca

correspondiente. Esta mezcla va difundindose sobre la membrana creando un crculo de dimetro proporcional al volumen que dispersa. Los lavados y la etapa de desproteccin se llevan a cabo sobre toda la membrana. La etapa de acoplamiento se va repitiendo para cada aminocido sobre el punto que le corresponde y puede ser monitoreada con azul de bromofenol. Esto se repite hasta tener las secuencias deseadas. (figura 42)

Sntesis

por

fotolitografa.

Esta

tecnologa

para

la

produccin

de

chips

para

computadoras es utilizada para la produccin de bibliotecas peptdicas. La superficie de un vidrio es funcionalizada con aminopropiltrietoxisilano, posteriormente se hace reaccionar la superficie con el cido Nvoc-N-aminohexanoico. Se empieza el acoplamiento del respectivo aminocido, los cuales deben estar forzosamente protegidos con el grupo Nvoc (nitroveratriloxicarbonilo), pues la desproteccin se realiza irradiando con luz ultravioleta de 365 nm a travs de una pantalla litogrfica, y este grupo protector se elimina fcilmente mediante este procedimiento. Posteriormente, la superficie es lavada y se hace reaccionar con el siguiente aminocido. Sntesis por el mtodo una perla, un componente. A diferencia de las tcnicas

anteriores, utilizando este mtodo se desconocen las secuencias de los distintos pptidos que se estn sintetizando. Esta tcnica se basa en el hecho de que cada perla de una resina slo encontrar un aminocido para reaccionar. La resina ms utilizada es TentaGel,

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SNTESIS DE PPTIDOS

aunque en general cualquier resina compatible con solventes orgnicos puede ser utilizada. La resina entonces es dividida en 19 alcuotas, las cuales sern contenidas en frascos de polipropileno, y se agrega a cada frasco un aminocido presente en las protenas (con excepcin de cistena). Las alcuotas entonces se juntan y se lleva a cabo la desproteccin de los aminocidos, vuelven a separarse 19 alcuotas y se les hacen pasar 1 de los 19 aminocidos. El proceso se repite juntando las alcuotas para llevar a cabo la etapa de desproteccin, y separndolas para el acoplamiento.

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SNTESIS DE PPTIDOS

CAPTULO VII
PURIFICACIN DE PPTIDOS.
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Esta herramienta ha sido muy til para la purificacin y caracterizacin de pptidos. Es capaz de separar el pptido de inters de una mezcla formada durante la SPPS, incluso si el producto esperado se encuentra contaminado con un pptido al que slo le hace falta un aminocido. Los tipos principales de HPLC utilizados para la separacin de pptidos son: Cromatografa por exclusin de tamao. Este tipo de cromatografa tambin conocida como filtracin en gel, no es una tcnica muy efectiva para separar pptidos contaminantes del pptido de inters, a menos que haya una diferencia importante en el tamao (aunque ya se han diseado columnas que pueden separar pptidos con masas moleculares del rango de 100-7000 Da). Pese a ser la menos efectiva de las cromatografas utilizadas, puede ser implementada en las primeras etapas del proceso de purificacin, sobretodo si lo que se desea es deshacerse de otro tipo de contaminantes como los grupos protectores o agentes acoplantes. Cromatografa de intercambio inico. Es muy til para separar mezclas de pptidos, particularmente cuando especies cargadas han sido removidas de la secuencias esperada. Puede ser capaz de separar especies cargadas que difieren por slo una carga neta. Para purificacin de pptidos sintticos es usada con mayor frecuencia una columna de intercambio catinico. Cromatografa de fase reversa. Es el mtodo ms utilizado para separar pptidos debido a que es generalmente superior a los otros dos en velocidad y eficiencia. Ofrece un amplio rango de manipulacin de las caractersticas de la fases mvil y estacionaria para mejorar las separaciones peptdicas entre los que se encuentran: 1. Variacin de los grupos funcionales de la fase estacionaria. Los ligandos funcionales que usualmente protectores, se encuentran en la no fase son estacionaria exitosamente de RP-HPLC con cadenas muy hidrocarbonadas de 8 o 18 carbonos; sin embargo, algunos contaminantes como grupos agentes acoplantes separados. Pptidos hidrofbicos tambin presentan problemas para purificarse, ya que las interacciones con los compuestos acoplados a la fase estacionaria son muy fuertes. Para solucionar ambos

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SNTESIS DE PPTIDOS

problemas mencionados, se ha optado por sustituir los hidrocarburos de 8 tomos de carbono por cianopropil, el cual ha resultado muy eficiente para la purificacin de los casos expuestos. 2. Efecto de las sales en la fase mvil. La adicin de sales a la fase mvil, generalmente de 50 a 100 mM, en un rango de pH aproximado de 4-7, es tradicionalmente utilizado para suprimir las interacciones de grupos silanol libres con solutos positivamente cargados. 3. Efecto de la elevacin de la temperatura en la purificacin. Los tiempos de retencin del pptido en la columna cromatogrfica decrecen cuando se incrementa la temperatura, mejorando la resolucin del pptido. Aumentar la temperatura previene posibles agregados del pptido y lo hace ms soluble, lo que facilita su elucin, especialmente si el pptido a purificar es altamente hidrofbico. Una desventaja del incremento de la temperatura es que reduce el tiempo de vida de la columna. Combinaciones entre las cromatografas antes descritas, pueden ofrecer una purificacin ms eficiente.

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SNTESIS DE PPTIDOS

CAPTULO VIII
HERRAMIENTAS SINTTICOS.
Anlisis de aminocidos. Es el mtodo ms antiguo para la caracterizar pptidos, el cual an es comnmente utilizado para determinar el estado de la sntesis antes de que sta llegue a trmino, y en caso de que se presente algn error detener la sntesis y volver a fabricar el pptido. El anlisis de aminocidos comprende tres etapas: Preparacin de la muestra e hidrlisis. Cuando se desea conocer el contenido absoluto del pptido, la muestra debe ser secada y pesada dentro de un tubo para hidrlisis. Si slo desea conocer la composicin, entonces solamente se requiere un estimado inicial de la cantidad de pptido. Las condiciones estndar para la hidrlisis del pptido son 6N de HCl a 110 C por 24 horas tanto en fase lquida como en fase gaseosa. Si lo que se va a analizar es un pptido an unido a la resina, se utiliza una mezcla 1:1 de HCl/cido propinico 12 N a 150 C, reduciendo el tiempo a slo 90 minutos. No todos los aminocidos pueden ser recuperados por las condiciones estndares de hidrlisis, cistena y triptfano son totalmente destruidos. En caso de tener estos aminocidos en la secuencia es recomendable utilizar otros mtodos de hidrlisis. Separacin y derivatizacin. En la metodologa original, comnmente denominada qumica postcolumna, los aminocidos son separados por cromatografa de intercambio inico y su visualizacin es llevada a cabo por la reaccin con un cromforo. En la qumica precolumna, los aminocidos son derivatizados directamente en el hidrolizado y la separacin es llevada a cabo mediante RP-HPLC.

PARA

LA

CARACTERIZACIN

DE

PPTIDOS

Anlisis de los datos e interpretacin. El reporte de los datos de un anlisis tpico de aminocidos, arroja los aminocidos en el orden en que se eluyeron, e indica la cantidad que estaba presente en la alcuota, si de sta eran 50 l el resultado se dar en nanomoles/50 l. Estos datos deben entonces ser comparados con la composicin terica de la muestra. Si se requiere cuantificacin absoluta, los datos del anlisis deben ser corregidos para la cantidad de muestra que fue analizada, las cantidades de cada aminocido tienen que ser

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SNTESIS DE PPTIDOS

convertidas a pesos para la comparacin con el peso original de la muestra. Durante el anlisis podemos obtener informacin acerca de la cantidad de norleucina, de donde podemos conocer el porcentaje de resina analizado y nos proporciona un control para conocer que porcentaje de la resina est siendo utilizado para la produccin del pptido,

Degradacin de Edman. Este mtodo para determinar la secuencia de aminocidos en un pptido o protena, puede ser utilizado para analizar un pptido sinttico incluso si este aun se encuentra adherido a la resina. Sin embargo, no produce datos tiles en la regin C-terminal. Consiste en la degradacin repetitiva de los pptidos a partir de una reaccin con el grupo amino terminal libre y con fenil isotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando feniltiocarbamilo, el producto es entonces tratado con cido fluorhdrico para liberar el aminocido que ha reaccionado del resto de la cadena peptdica mediante la formacin de un derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un derivado ms estable (un aminocido PHT) por la adicin de TFA. Como consecuencia el pptido tiene ahora un nuevo residuo amino terminal listo para repetir el ciclo. La identificacin de los PHT-aminocidos es usualmente llevada a cabo por RP-HPLC. Los pptidos que ya han sido liberados de la columna y que son analizados por esta metodologa no presentan ninguna consideracin especial, no as cuando el pptido analizado aun se encuentra adherido a la columna. Debido a que este mtodo requiere del grupo amino libre, los grupos protectores utilizados en la sntesis para proteger al -amino deben ser removidos o de otra forma no ser posible analizar el pptido sintetizado mediante la degradacin de Edman. Con respecto a los grupos protectores de las cadenas laterales, stas slo tendrn un efecto durante la identificacin del aminocido, ya que los grupos protectores tienden a hacer las cadenas laterales ms hidrofbicas; por la tanto el gradiente utilizado para eluir los PTH-aminocidos en RP-HPLC deben extenderse, aunque esto no sucede si tales grupos protectores son derivados de Boc, pues los aminocidos sern desprotegidos por el uso de TFA durante la fase final. Los residuos de cistena no pueden ser detectados por este mtodo a menos que sean modificados, usualmente se utiliza acrilamida o bromopropilamina para derivatizarlos. Cuando el anlisis es hecho en la resina, estos residuos pueden ser muy problemticos, pues muchos de los grupos protectores utilizados para cistena durante la sntesis no son estables a la qumica de Edman. La glutamina se cicla en condiciones cidas para formar una estructura de piroglutamato, lo que hace que el pptido sea bloqueado y el anlisis de la secuencia no pueda llevarse a cabo.

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SNTESIS DE PPTIDOS

Electroforesis capilar. Esta tcnica analtica basada en la separacin de molculas debido a su carga, y en menor medida en su tamao, es ampliamente utilizada para la caracterizacin de pptidos, sobre todo cuando es aplicada en combinacin con espectrometra de masas, HPLC y anlisis de aminocidos. Gracias a los fenmenos de migracin electrofortica y el flujo electroosmtico que interactan, y a que pueden aplicarse altos voltajes (dado a la capacidad que tiene el capilar para disipar calor), hacen de sta, una tcnica muy verstil, rpida, eficiente y con una alta capacidad de resolucin. En la sntesis de pptidos se utiliza para analizar si el producto final no presenta contaminantes como pptidos con supresiones, o truncados. De igual manera, es utilizada para monitorear remocin de los grupos protectores, esto es posible debido a que las separaciones en la electroforesis capilar son llevadas a cabo en condiciones de pH bajo (usualmente un pH entre 2 y 3) y mientras el pptido est protegido la carga neta del mismo difiere de cuando no lo est. Tambin es aplicada para observar la formacin o rompimiento de un puente disulfuro, por un cambio en la forma (ciclacin) del pptido.

Espectrometra de masas. La espectrometra de masas es una herramienta muy apreciada para el anlisis de pptidos sintticos, dada su sensibilidad, velocidad y alto grado de especificidad molecular. Las tcnicas de ionizacin utilizadas para el anlisis de pptidos son el bombardeo rpido de tomos (FAB por sus siglas en ingls), electrospray (ESI) y desorcin/ionizacin mediante lser asistida por matriz (MALDI). FAB. Fue la primera tcnica de ionizacin utilizada para la caracterizacin de pptidos sintticos. La muestra es ionizada debido al impacto que recibe por un rpido haz de partculas de xenn. La eleccin de la matriz es determinante para el evento de ionizacin, toda vez que sirve de mediador de la transferencia de energa hacia el analito y reduce el dao por radiacin que sufrira irremediablemente el analito en ausencia de la matriz, las matrices comnmente utilizadas en FAB para el anlisis de pptidos sintticos son glicerol, tioglicerol y alcohol nitrobenclico. ESI. Para que los iones sean producidos mediante esta tcnica, se induce a la formacin de gotas al hacer pasar las molculas en solucin por una boquilla en presencia de un campo elctrico. Dado que el analito se encuentra disuelto en una sustancia muy voltil, los iones se forman cuando el solvente se ha evaporado. Ha sido particularmente utilizada para caracterizar bibliotecas de pptidos.

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SNTESIS DE PPTIDOS

MALDI. En esta tcnica de ionizacin, los analitos son cocristalizados, por lo general, con una matriz aromtica. Los iones se forman al irradiar un lser de nitrgeno de 337 nm sobre la muestra. La matriz acta como intermediaria para transferir energa del lser al analito, adems juega un papel fundamental en ceder protones al mismo. Las matrices ms utilizadas son la matriz de cido -ciano-4-hidroxicinmico, para pptidos pequeos y para pptidos ms grandes la matriz de cido 2-(4-hidroxifenilazol) benzoico. Todas estas tcnicas de ionizacin son utilizadas para determinar el peso molecular del pptido sintetizado con gran precisin. Es recomendable determinar el peso molecular del producto antes de la purificacin, de esta manera, es posible conocer el estado de pureza del producto, si no existen mezclas de pptidos truncados contaminantes, o si la desproteccin del pptido ha sido satisfactoria (analizando el producto final, o monitoreando etapas intermedias de la sntesis). En caso contrario, este anlisis previo por espectrometra de masas, puede dar informacin para volver a sintetizar el pptido, cambiando las condiciones de desproteccin y/o acoplamiento. Para tener una mejor caracterizacin del pptido sintetizado, una vez determinado el peso molecular del producto en crudo, se purifica y se vuelve a determinarse el peso molecular. Adems, gracias a la espectrometra de masas se puede monitorear la ciclacin de los pptidos por un puente disulfuro, pues es factible observar la prdida de dos unidades de masa debido a la formacin de este tipo de enlace. Tambin es posible determinar la secuencia del pptido sintetizado, esto se lleva a cabo mediante la espectrometra de masas en tndem, en donde un in producido previamente por una de las tcnicas antes mencionadas, es disociado por colisiones con un gas. Los iones fragmentados son obtenidos a partir del rompimiento de los enlaces de la cadena peptdica, generando iones con el N-terminal y con el C-terminal, y a partir de una serie completa de los iones fragmentados la secuencia de aminocidos puede ser deducida.

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