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Ana Molina Fernndez-Pacheco Silvia Guijarro Sendra

PRCTICA 4: ENSAYO DE ECOTOXICIDAD DE INHIBICION DE LA LUMINISCENCIA DE PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM


En esta prctica realizaremos un ensayo de ecotoxicidad utilizando las bacterias Photobacterium phosphoreum. stas bacterias marinas emiten luminiscencia cuando se encuentran en medio salino y dicha luminiscencia puede perderse como consecuencia de exposicin a compuestos qumicos. La prctica se dividir en dos sesiones, en la primera de ellas aplicaremos un protocolo de ensayo con el objetivo de identificar la o las muestras potencialmente txicas de entre un conjunto de ellas. En la segunda sesin aplicaremos un protocolo destinado a estimar la potencia txica de la muestra identificada en el da anterior a travs del clculo de la concentracin de compuesto capaz de originar una disminucin de la luminiscencia del 50% (EC50). El material a utilizar ser: Luminmetro. Placa Peltier. Kit de bacterias luminiscentes. Cloruro sdico. Pipetas automticas y puntas. Guantes.

Recipientes para la recogida de residuos.


Las muestras txicas son identificadas por presentar una inhibicin de la luminiscencia superior al 25%. Para que el anlisis sea considerado como vlido los replicados de los controles y de cada muestra problema deben presentar un coeficiente de variacin inferior al 10%.

1.- Describa los principios generales de los ensayos de ecotoxicidad con bacterias luminiscentes, cuales son sus aplicaciones, sus ventajas y sus inconvenientes.
El estudio de bacterias luminiscentes en ensayos de ecotoxicidad lo hacemos para comprobar la inhibicin de luminiscencia. Con este ensayo podemos ver lo peligroso que es el medio contaminado. En este estudio vemos que los ensayos de ecotoxicidad con bacterias luminiscentes determina de modo directo lo txica que puede ser la mezcla. As con estos ensayos podemos comprobar lo txica que es un agua residual, lixiviados de residuos, suelos, etc. Principales ventajas:

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- Son muy fiables. - Rpidos y sencillos a la hora de utilizarlos. - Baratos. Principales inconvenientes: - Poseen una difcil conservacin. - No determinada la contaminacin cruzada y es muy sensible. - No se puede ver la toxicidad en productos insolubles en agua.

2.- Describa de manera general los ensayos de toxicidad aguda, crnica mutagenicidad con bacterias luminiscentes. Medimos la bajada de la luminiscencia que emiten las bacterias tras pones la muestra qumica a diferentes concentraciones entre diversos tiempos (5,15 y 30 minutos). Los controles que utilizamos son positivos y as el % de luminiscencia ser del 100%, as el valor lo calculamos a concentraciones y representamos este porcentaje con las concentraciones obteniendo el valor de EC50 (que es el valor del 50% de luminiscencia que pierden las bacterias). Si este valor es menor que 3mg/L esta la catalogaremos con una etiqueta que representa la toxicidad. Ensayos de ecotoxicidad crnica: Parecidas a los de toxicidad aguda, pero con diferente hora de exposicin (22 horas). As una exposicin de este tiempo conlleva a un efecto parecido al de ms de un ao de rata. Ensayos de mutagenicidad: Utilizamos cepas mutantes que no dan luminiscencia. Si exponemos el mutante a una sustancia y se produce luminiscencia, dicha sustancia ser mutagnica. 3.- Presente y discuta los resultado obtenidos para el ensayo de escrutinio de muestras toxicas.
Utilizamos 10 muestras para comprobar cual de ellas son txicas (en nuestro caso fueron 7). Para comprobar hacemos 3 controles positivos iguales, 3 negativos y dos rplicas para cada una de las 10 muestras. Cuando las bacterias liofilizadas una vez rehidratadas en medio salino se comprob la luminiscencia para ver que antes de la exposicin todas las bacterias emitan luz a un nivel normal. Para comprobar la luminiscencia tenemos que saber que esta depende mucho de la cantidad de partculas que haya.

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Para que podamos afirmar que el anlisis es verdadero la muestra problema tiene que presentar un coeficiente de variacin menor que el 10%. C.V. = 100*(desviacin tpica/media) El coeficiente de variacin es un poco mayor al 10%, pero al ser mnimo el error podramos decir que es vlido para la prctica.

Media con sustancia CONTR OL 455 63 432 49 432 53 448 41 444 73 M2 499 37 479 58 M3 671 23 670 76 M4 468 97 532 79 M5 149 1 50 467 22 770,5 50088 67099,5 48947,5 44021,6667

% Luminiscen cia

%Inhibic in

Media inhibicin

M1

44657

101,861205 101,025253 113,437323 108,941809 152,477189 152,370424 106,531632 121,029039 3,38696854 0,11358043

M6

42837,5

106,134101

1,861204 71 1,025252 72 13,43732 25 8,941808 96 52,47718 93 52,37042 37 6,531632 15 21,02903 87 96,6130 315 99,8864 196 6,134100 63

-1,44322871

-11,1895657

-52,4238065

-13,7803354

98,2497255

2,68996328

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M7

389 53 496 42 458 42 471 52 498 62

88,4859728 47742 112,767198 104,135085 48507 107,110892 113,266952 44554,5 100,918487 101,502291 14619 38,9331011 27,4841934

M8

M9

444 26 446 83

M10

171 39 120 99

11,51402 72 12,76719 8 4,135085 7,110892 36 13,26695 19 0,918487 11 1,502290 54 61,0668 989 72,5158 066

-8,45114148

-10,1889221

-1,21038882

66,7913527

CONTR OL

M1

M2

M3

M4

M5

MEDIA SIN SUSTANCIA 390 39320 13 388 30 401 17 467 41215 13 357 17 416 41497,5 21 413 74 571 60448,5 66 637 31 368 41004,5 92 451 17 364 37983 13 395 53

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M6

M7

M8

M9

M10

360 --------94 0 447 87 379 03 370 87 420 45 340 28 371 76 376 57 168 65

41345

39566

35602

27261

4.- Presente y discuta los resultado obtenidos para el ensayo de determinacin de la potencia toxica de la muestra problema. Cul es la EC50 de la misma?
DILUCIN MUESTRA 0 1. / 32. 1. / 16. 1. / 8. 1. / 6. 1. / 4. 1. / 3. 1. / 2. 2. / 3. 1. / 1. [muestra](%v,v) 0 1,56 3,13 6,25 8,33 12,5 16,7 25 33,3 50 RLU 77971 35640 52460 36493 84667 13013 71855 32135 39928 29423 36649 33599 34276 32517 37684 18032 34199 9303 26690 24475 Media 56805,5 44476,5 48840 51995 34675,5 35124 33396,5 27858 21751 25582,5 %ACT 100 78,29 85,9 91,53 61,04 61,8 58,79 49,04 38,29 45,03 log[muestra] 0,193 0,495 0,796 0,92 1,097 1,222 1,398 1,522 1,699

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Para calcular la EC50 tenemos que representar la actividad de luminiscencia con el logaritmo de la concentracin de la muestra y por el mtodo de mnimos cuadrados calculamos la lnea de tendencia. Al hacer el % de inhibicin frente a la concentracin podemos comprobar que la EC50 su valor que nos da es el mismo que el % de actividad luminosa. log[muestra] 0,193 0,495 0,796 0,92 1,097 1,222 1,398 1,522 1,699 %ACT 78,29 85,9 91,53 61,04 61,8 58,79 49,04 38,29 45,03

DL50= log 1.4528.18


5.- Resuelva el caso real de un ensayo con bacterias luminiscentes que suministrar el profesor. Se desea ensayar la peligrosidad de las sustancias A y B para el medio acuoso. El correspondiente ensayo con bacterias luminiscentes ha producido los siguientes resultados:

[A] (g/ml) 0

RLUs 75462 y

[B] (g/ml) 0

RLUs 65000 y

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15 25 50 75 100 150 200 500

79987 78000 y 79880 82369 y 80853 76589 y 69835 59000 y 60696 56999 y 54925 14125 y 16965 3000 y 4772 12 y 3

7 15 50 100 200 300 500 600

60446 55000 y 54138 46612 y 42454 32987 y 33499 27890 y 29816 9005 y 8557 6000 y 5290 800 y 454 2y4

Cules son las CE50 de A y de B? Cul de las dos sustancias es ms peligrosa para el medio acuoso? Justificar la respuesta.

[A] (g/l) contro l 15


25 50 75 100 150 200 500

RLU
75462 y 79987 78000 y 79880 82369 y 80853 76589 y 69835 59000 y 60696 56999 y 54925 14125 y 16965 3000 y 4772 12 y 3

Media RLU 77724.5 78940 163222 73212 59848 55962 15545 3886 7.5

%RLU 100 101.56 % 210% 94.19 % 77% 72% 20% 5% 0.0096 % %RLU 100 86.99 70.99

% inhibicin RLU 0% -1.56 -110.00% 5.80 % 22.99 % 27.99% 79.99% 95.00% 99.99%

Log [A] 1.117 1.39 1.69 1.87 2 2.17 2.30 2.69

[B] (g/l) contro l 7


15

RLU
65000 y 60446 55000 y 54138 46612 y 42454

Media RLU 62723 54569 44533

% inhibicin RLU 0 13.01 29.01

Log [B] 0.84 1.17

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50 100 200 300 500 600

32987 y 33499 27890 y 29816 9005 y 8557 6000 y 5290 800 y 454 2y4

33243 28853 8781 5645 627 3

52.99 46 13.99 8.99 0.99 0.004 78

47.01 54 86.01 91.01 99.01 99.995

1.69 2 2.30 2.47 2.69 2.77

CE50 (A)= 128.22 g/l CE50 (B)= 46.77g/l


Parece ms peligrosa la sustancia B, pero seran tambin necesarios ensayos con otros modelos de toxicidad acutica (Daphnia, algas y peces).

6. Determinar la EC50
Tu bo 1 2 Dilucin de la muestra 0
[muestra](%v,v)

RL Medi %AC log[mues U a T tra] 0 174 1 160 1671 100 2 ,5

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3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1/32

1,56

1/16

3,13

1/8

6,25

1/6

8,33

1/4

12,5

1/3

16,7

1/2

25

178 4 175 5 184 4 177 0 172 7 153 6 147 4 145 6 127 3 130 8 103 5 104 8 649 587 224 264 39 30

1769 ,5 1807

105, 86 108, 1 97,6

0,193

0,495

1631 ,5 1465

0,7958

87,6 4 77,2

0,92

1290 ,5 1041 ,5 618

1,0969

62,3

1,222

36,9 7 14,5 9 2,06 4

1,3979

2/3

33,3

244

1,522

1/1

50

34,5

1,699

Para calcular la EC50 tenemos que representar la actividad de luminiscencia con el logaritmo de la concentracin de la muestra y por el mtodo de mnimos cuadrados calculamos la lnea de tendencia. Al hacer el % de inhibicin frente a la concentracin podemos comprobar que la EC50 su valor que nos da es el mismo que l % de actividad luminosa. log[mues tra] 0,193 0,495 0,7958 0,92 %AC T 105, 86 108, 1 97,6 87,6

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1,0969 1,222 1,3979 1,522 1,699

4 77,2 62,3 36,9 7 14,5 9 2,06 4

DL50= log 1.2417.378