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Apuntes de Inmunología. Curso 2005-06. Tema 9

TEMA 9: HIBRIDOMAS Y TÉCNICA DE FUSIÓN CELULAR. Anticuerpos monoclonales y sus aplicaciones. Anticuerpos monoclonales obtenidos por ingeniería genética.

OBJETIVOS

1. Definir qué es un anticuerpo monoclonal

2. Saber como se producen

3. Reconocer las ventajas e inconvenientes de su producción y uso comparados con los sueros tradicionales

4. Conocer las aplicaciones que se ven mejoradas con el empleo de anticuerpos monoclonales

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS

empleo de anticuerpos monoclonales OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS Existen dos tipos de anticuerpos (desde el punto de

Existen dos tipos de anticuerpos (desde el punto de vista de este tema):

1. Policlonales (Sueros)

Se obtienen inmunizando animales de experimentación (conejos, cabras, équidos, etc.) con el antígeno deseado, siguiendo un protocolo adecuado, tras el que se extrae sangre y se obtiene el suero donde estarán los anticuerpos dirigidos frente al antígeno con el que se ha realizado la inmunización (frente a todos sus determinantes antigénicos) y frente a otros antígenos a los que se haya enfrentado el animal

2.

Monoclonales

Los anticuerpos monoclonales son aquellos producidos por un clon, es decir, por un grupo de células derivados de una única célula y, por lo tanto, con características idénticas (en nuestro caso lo que nos interesa es que todas producen el mismo anticuerpo)

Ambos poseen ventajas e inconvenientes Tabla 1:

ANTICUERPOS MONOCLONALES vs . POLICLONALES

ANTICUERPOS MONOCLONALES vs. POLICLONALES

POLICLONALES

Mezcla heterogénea Variación lotes Irrepetibles Se necesitan antígenos puros Baratos Fácil producción

MONOCLONALES

Químicamente puros Predecibles Producción ilimitada No se necesitan antígenos puros Caros Producción costosa y larga Demasiado específicos A veces isotipo inadecuado

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ANTICUERPOS MONOCLONALES

La descripción de la técnica de producción de anticuerpos monoclonales supuso la concesión del premio Nobel de Medicina (1984) a: oducción de anticuerpos monoclonales supuso la concesión del premio Nobel de Medicina (1984) a:

César Milstein

del premio Nobel de Medicina (1984) a: César Milstein George Köhler CONSIDERACIONES INICIALES La mayoría de

George Köhler

CONSIDERACIONES INICIALES

a: César Milstein George Köhler CONSIDERACIONES INICIALES La mayoría de los antígenos poseen multitud de

La mayoría de los antígenos poseen multitud de determinantes antigénicos que desencadenan la producción de anticuerpos específicos frente a ellos que desencadenan la producción de anticuerpos específicos frente a ellos

El organismo reacciona frente a todos, por lo que en el suero se encontrará una mezcla heterogénea de anticuerposla producción de anticuerpos específicos frente a ellos Frente a antígeno inoculado Frente a otros antígenos

Frente a antígeno inoculado Frente a otros antígenos

PROTOCOLO

(SISTEMA TRADICIONAL)

PRODUCCIÓN

DE

ANTICUERPOS

MONOCLONALES

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PASOS

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1. Inmunización

Del mismo modo que en la obtención de suero, el primer paso es el de inmunizar al animal con el antígeno deseado

La fuente de células productoras de anticuerpos es el bazo:

o

Tras inmunización el animal es eutanasiado y se extrae el bazo

o

El bazo se macera y se obtienen los linfocitos.

o

Los linfocitos mueren en cultivo tras 8 días (aproximadamente)

linfocitos mueren en cultivo tras 8 días (aproximadamente) 2. Células de mieloma • En el laboratorio

2. Células de mieloma

En el laboratorio se dispone de líneas estables de mieloma (en definitiva linfocitos tumorales que, actualmente no secretan anticuerpos completos ni ninguna de sus partes).

Estas células se multiplican de forma continua.

Se han seleccionado líneas de mieloma incapaces de producir el enzima Hipoxantina-Guanosina-Fosforribosil-Transferasa (son por lo tanto HGPRT -) (característica muy importante en las posterior selección celular)

o

Este enzima es esencial en la ruta exógena o “de salvamento” para la producción de ácidos nucleicos en el caso en que se bloquee la vía tradicional (endógena)

o

Cuando se bloquea la ruta principal (con aminopterina por ejemplo) la célula recurre a la vía de salvamento empleando las enzimas HGPRT y timidina quinasa para producir ácidos nucleicos.

HGPRT y timidina quinasa para producir ácidos nucleicos. • Sólo existen líneas de mieloma de ratón

Sólo existen líneas de mieloma de ratón y de rata adecuadas para la producción de anticuerpos monoclonales. Las líneas humanas hasta el momento no son adecuadas

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3. Fusión

Deseamos obtener una célula con las características de los tipos celulares descritos en los pasos 1 y 2:

o

Producción de anticuerpos (linfocitos B)

o

Multiplicación in vitro (célula de mieloma)

Para ello realizamos la denominada fusión

Históricamente han existido multitud de agentes fusionantes

Hoy día: electrofusión y, sobre todo, POLIETILÉNGLICOL (PEG)

PEG:

o

Gran afinidad por el H 2 O

o

Cuando se añade a la mezcla de linfocitos y células de mieloma secuestra el agua

o

Sin agua se produce la desorganización de la membrana celular

o

Al rehidratar se produce la verdadera fusión, las membranas de las células adyacentes se pueden unir formando una célula híbrida.

o

se pueden unir formando una célula híbrida. o o El proceso de fusión no es sele
se pueden unir formando una célula híbrida. o o El proceso de fusión no es sele

o

El proceso de fusión no es selectivo ni tiene una eficacia del 100%, por lo que tras la fusión existe una mezcla de poblaciones celulares (citamos las que nos interesan para este tema):

a. Linfocitos sin fusionar

b. Células de mieloma sin fusionar

c. Híbridos linfocito x linfocito

d. Híbridos mieloma x mieloma

e. Híbridos mieloma x mieloma

o

Las poblaciones a) y c) morirán tras 8 días de cultivo

o

La población e) es la que nos interesa

o

Debemos eliminar las poblaciones b) y d) ya que al estar “acostumbradas” a crecer “in vitro” pueden “sobreponerse” a la población de interés (e)

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o Para ello añadimos tras realizar la fusión un suplemento al medio de cultivo de los productos de la fusión que contiene Hipoxantina-Aminopterina-Timidina (HAT). La aminopterina bloquea la síntesis endógena de ácidos nucleicos. Las poblaciones b) y d) morirán al carecer de enzima HGPRT. La población e) sobrevive al aportar el linfocito B la capacidad de sintetizar esta enzima

el linfocito B la capacidad de sintetizar esta enzima 4. Selección de hibridomas de interés •

4. Selección de hibridomas de interés

Tras distribuir los productos de la fusión (en medio selectivo) en placas de cultivo de 96 pocillos (similares a las de ELISA que se utilizan en prácticas), y dejar que las células se multipliquen, debemos localizar en qué pocillos existen híbridos que secretan anticuerpos frente al antígeno con el que se realizó la inmunización

Para ello se recurre a técnicas inmunológicas habituales como, por ejemplo, un ELISA indirecto similar al que se realiza en las prácticas de la asignatura, brevemente:

o

Las placas están tapizadas con el antígeno

o

Posteriormente se añade el sobrenadante (medio de cultivo) del pocillo donde hay crecimiento celular, donde se encontrarán los anticuerpos en el caso de que haya híbridos productores de anticuerpos específicos frente al antígeno

o

Si los hay se unirán al antígeno, y al añadir posteriormente el conjugado (anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa) y más tarde el sustrato, aparecerá color

con peroxidasa) y más tarde el sustrato, aparecerá color Dpto. de Sanidad Animal. www.ucm.es/info/saniani Página -
con peroxidasa) y más tarde el sustrato, aparecerá color Dpto. de Sanidad Animal. www.ucm.es/info/saniani Página -

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5. Clonación

o

Aunque hayamos detectado los pocillos donde hay células productoras de anticuerpos de interés, no sabemos si con ellas existen otras células que secretan otro tipo de anticuerpos. Debemos separar las que buscamos

o

Para ello se realiza la clonación, que consiste, básicamente, en realizar diluciones hasta que, estadísticamente, tengamos una alta probabilidad de que en algunos pocillos sólo se encuentre una célula. Por lo tanto todas las que se deriven de ella secretarán el mismo anticuerpo. Este proceso (de clonación) se repite 2 ó 3 veces, con la necesaria prueba de detección por ELISA (tal y como se ha descrito más arriba) entre clonación y clonación. Tras clonar ya podemos hablar de anticuerpo monoclonal, antes no.

6. Caracterización y producción en gran escala

o

Una vez caracterizados los anticuerpos (determinación isotipo, afinidad por el antígeno, reactividades cruzadas con otros antígenos, etc.) se debe producir en gran escala

o

Existen dos métodos principales:

o

Cultivo in vitro: se hace crecer clones en botellas de cultivo o en biorreactores y en el medio de cultivo se encontrarán los anticuerpos

o

Producción in vivo: se inoculan los clones en la cavidad abdominal de ratones previamente tratados intraperitonealmente con una sustancia irritante. En la ascitis que se produce se encuentran los anticuerpos mucho más concentrados que en el caso anterior

anticuerpos mucho más concentrados que en el caso anterior ¿QUÉ MEJORA CON EL EMPLEO DE ANTICUERPOS
anticuerpos mucho más concentrados que en el caso anterior ¿QUÉ MEJORA CON EL EMPLEO DE ANTICUERPOS

¿QUÉ MEJORA CON EL EMPLEO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES?

¿QUÉ MEJORA CON EL EMPLEO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES? En principio todo lo que se base en

En principio todo lo que se base en una reacción antígeno-Anticuerpo:

Sistemas de detección de base inmunológica

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¿Terapia frente al cáncer? Falta de Anticuerpos monoclonales de origen humano

Estudios en microbiología Etc.

PREGUNTAS

1. ¿Qué es un anticuerpo monoclonal?

2. ¿Por qué las células de mieloma empleadas para la obtención de hibridomas son HGPRT-?

3. ¿Por qué es necesario clonar?

4. ¿Por qué existen problemas para el empleo de anticuerpos monoclonales con fines terapéuticos en medicina humana y veterinaria?

BIBLIOGRAFÍA

1. Abbas, A.K. Inmunología Celular y molecular. 2002. Traducción de la cuarta edición en inglés (Cellular and molecular immunology). McGraw- Hill-Interamericana, Madrid.

2. Kuby, J. Immunology. 1992. W.H. Freeman and Company, Nueva York.

3. Sánchez-Vizcaíno, J.M. Curso de introducción a la inmunología porcina. http://www.sanidadanimal.info/inmuno/inicio.htm

4. Fuente de imágenes: http://www.whfreeman.com/kuby

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