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PRODUCCIN Y PROPIEDADES DE LOS SURFACTANTES OBTENIDOS A TRAVS DEL Bacillus subtilis CULTIVADA EN LOS LQUIDOS RESIDUALES DE LA YUCA COMO

SUSTRATO Resumen La produccin y las propiedades de los biosurfactantes, sintetizados por la cepa de LB5a usando las aguas residuales de la yuca como sustrato que fueron investigados. El microorganismo fue capaz de crecer y producir surfactante en las aguas residuales de la yuca, reduciendo de la tensin superficial del medio a 26,6 nM/m y dando una concentracin de surfactante en bruto de 3.0 g/L despus de 48 hr. La superficie del compuesto activo retenido conserva sus propiedades durante la exposicin a elevadas temperaturas (100 C), alta salinidad (20 %NaCl) y un amplio rango de valores de pH. El surfactante es capaz de formar una emulsin estable con diversos hidrocarburos. La caracterizacin qumica preliminar revelo que el surfactante revel que el tensoactivo tiene una composicin de lipopptidos con valor CMC de aproximadamente 33 mg/L. Las aguas residuales de la yuca ha demostrado ser un sustrato adecuado para la biosntesis de biotensoactivo, proporcionando no slo el crecimiento de bacterias y la acumulacin de producto, sino tambin un agente tensoactivo que tiene propiedades interesantes y tiles con potencial para muchas aplicaciones industriales. 1. Introduccin Los Biosurfactantes son compuestos de superficie activa producidos por microorganismos. La mayora de surfactantes microbianos son molculas complejas, comprenden diferentes estructuras que incluyen lipopptidos, glicolpidos, polisacrido, protenas complejas, cidos grasos y fosfolpidos. En las ltimas dcadas, los biosurfactantes han ganado la atencin porque presentan algunas ventajas, tales como la biodegradabilidad, bajas toxicidad, aceptabilidad ecolgica, capacidad de ser producida a partir de fuentes renovables, y sustratos ms baratos (Desai y Banat, 1997: Rosenberg y Ron, 1999). El campo de aplicacin industrial de biotensoactivo incluye la recuperacin mejorada de petrleo, extraccin de petrleo crudo, lubricantes, biorremediacin de contaminantes, cuidado de la salud, procesamiento de alimentos (Banat et al 2000). Entre las muchas clases de biosurfactantes, los lipopptidos de Bacillus subtilis, son particularmente interesantes debido a su alta actividad superficial y potencial teraputico (Besson y Michel, 1992: Sandrich et al 1990). Aunque los biosurfactantes exhiben tales ventajas importantes, no han sido an utilizados ampliamente en la industria debido a los costos de produccin

relativamente altos, una estrategia posible para reducir los costos es la utilizacin de sustratos alternativos tales agrodesechos industriales. El principal problema relacionado con el uso de sustratos alternativos como medio de cultivo es encontrar un residuo con el equilibrio correcto de nutrientes que permite el crecimiento celular y la acumulacin de producto. La melaza, hidrolizado de turba, y los efluentes de proceso de patata son ejemplos de sustratos alternativos que se han sugerido para la produccin de biosurfactante por B. subtilis. El establecimiento de los residuos de medio a base para la produccin de biosurfactante tambin se enfrenta a otro problema, una vez que el tipo y las propiedades del producto final dependen de la composicin del medio de cultivo El Agua residual de la yuca es un residuo rico en carbohidratos, genera en grandes cantidades durante la produccin de harina de yuca un ingrediente muy comn que se utiliza en la cocina brasilea. Los principales nutrientes presentes en los residuos de yuca son el azcar y sales minerales. El desechable de este residuo causa problemas medioambientales debido a su alta carga orgnica, sin embargo, es un sustrato muy atractivo para los procesos biotecnolgicos. El trabajo previo mostr que este residuo podra ser un sustrato potencial para la produccin de biosurfactante. En este estudio, se presenta la produccin de yuca biosurfactante utilizando aguas residuales de B. subtilis LB5a. Las propiedades y caracterizacin qumica inicial del producto obtenido tambin se presentan. 2. Mtodos 2.1 microorganismos La B. Subtilis LB5a de la coleccin de cultura de laboratorio de bioqumica (Nitschke y 2003 pastore), fue mantenido sobre la sustancia nutritiva agar (Difco) inclinaciones en 4C. 2.2 preparacin de sustrato El efluente de yuca obtenido de la fabricacin de la harina de yuca fue recogido y almacenado a -18C hasta que se necesite. El medio se prepar por calentamiento de los residuos hasta la ebullicin para facilitar la eliminacin de material slido insoluble. Despus de enfriar, el sustrato se centrifug a 8000 g durante 20 min (modelo Beckman J2-21).

El sobrenadante se distribuye en frascos y se esteriliza en autoclave a 1 atm. Y 121 C durante 15 min. El PH natural del medio fue de 5,9 y no se ajust. El mismo lote de aguas residuales de yuca se utiliz para todos los experimentos y su composicin se ha resumido tabla 1. 2.3 inculo y condiciones de cultivo Las cepas bacterianas se sembraron en estras en un medio inclinado de agar nutriente y se incub durante 24 horas a 30 C. Dos bucles de cultivo se inocularon en 20 ml de caldo nutritivo en un Matraz Erlenmeyer de 50 ml y se incubaron en un agitador a 150 rpm a 30 C durante 8-12 horas hasta alcanzar un nmero de clulas de 108 ufc / ml. Una parte de alcuota de 5 ml de inculo se transfiri a 75 ml de medio de efluentes de yuca contenidos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se incub a 30 C y 150 rpm en un agitador rotatorio. Se recogieron muestras a intervalos de tiempo definidos y sometidos a anlisis. 2.4 mediciones analticas El nmero de clulas viables: Las muestras se sometieron a diluciones en serie y recuento de viables se realizaron por la tcnica de propagacin placa. Hidratos de carbono: carbohidratos totales se estimaron utilizando el ensayo fenol sulfuro. El azcar presente en el sustrato de yuca (glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa) se midieron por HPLC usando unas aguas de alto rendimiento de cromatografa lquida equipado con un detector de ndice de refraccin de una YMC una Pack Polyamine II columna (4,6 x 250 mm). Una mezcla de acetonitrilo: agua (75:25) fue utilizado como disolvente con un caudal de 1 ml / min a 25 C. Las muestras se identificaron comparando los tiempos de retencin con los de los estndares de hidratos de carbono. Superficie medida de la actividad. Muestras de cultivo se centrifugaron a 8.000 g durante 20 min para eliminar las clulas y el sobrenadante se someti a mediciones de actividad de la superficie. Tensin superficial e interfacial se determinaron con un tensimetro de Krss procesador (modelo K12 T Krss, Alemania), utilizando el mtodo de la placa. La tensin interfacial se realiz frente a hexadecano. CMD-1 y CMD-2 se realiza mediante la medicin de la tensin superficial de 10-veces y 100 veces de caldo de cultivo diluido en agua destilada. La CMC se determina por medidas de la tensin superficial de muestras seriadas de caldo diluido como anterior inform (Sheppard y Mulligan, 198), el factor de dilucin obtenido (CMC-1) se relaciona con la concentracin de tensoactivo en bruto (3 g / l despus de 48 h). Desviacin estndar mxima admitida para mediciones de la actividad de superficie era 0,20.

Aislamiento biotensoactivo: El tensoactivo se obtuvo de caldo exento de clulas mediante el ajuste del pH del caldo a 2,0 utilizando HCl 6N y mantenerla a 4 C durante la noche. El precipitado as obtener fue expulsado a 8.000 g durante 20 min, secado y pesado. Para la purificacin adicional, el tensoactivo crudo se disolvi en agua destilada a pH 7,0 y se sec a 60 C. El producto seco se extrajo con cloroformo metanol (65, 15), se filtr y el disolvente evapored. El producto as obtenido se utiliz para TLC, la composicin bioqumica y la emulsificacin anlisis. Caracterizacin qumica de biosurfactante. Prelimiary caracterizacin del biotensoactivo hecho por la delgada La cromatografa de capa (TLC). Los componentes de cloroformo / metanol extracto fueron separados en placas de gel de slice 60 (Merck) utilizando como sistema disolvente CHCl3: CH3OH: H2O (65:15:1). Los componentes fueron detectado por pulverizacin de la placa con agua destilada y calentando a 110 C durante 5 min (Makkar y cameotra, 1997a) surfactina (Sigma) se utiliz como estndar. El anlisis bioqumico. El contenido de protena de tensoactivo se estim utilizando el mtodo de Biuret y el contenido de lpidos por la mtodo de Bligh y Dyer (1959). El anlisis de aminocidos. La composicin de aminocidos de la tensoactivo se determin en un analizador de amino cido pickering tras la hidrlisis total de la muestra en HCl 6 N a 105 C durante 24 h, Los estudios de estabilidad. Los estudios de estabilidad se realizaron utilizando caldo exento de clulas obtenido despus de 48 h de cultivo. caldo Las muestras se calentaron en un bao de agua hirviendo durante el tiempo diferente intervalos y se enfri a temperatura ambiente. La estabilidad del pH se realiz mediante el ajuste el caldo a valores diferentes. Para estudiar el efecto de sal de adicin de biosurfactivo, diferentes concentraciones de NaCl fueron aadido a muestras de caldo y se mezcla hasta disolucin completa. Los valores de tensin superficial y CMD de cada tratamiento fueron realiz como se describi anteriormente. Actividad de emulsificacin se realiza de acuerdo a Cooper y Goldenberg (1987), 6 ml de hidrocarburo se aadi a 4 ml de solucin acuosa de biotensoactivo (I mg / ml). en un tubo de tapn de rosca, y vrtex a alta velocidad durante 2 min. La estabilidad de la emulsin se determin despus de

24 h, y el ndice de emulsificacin (E24) se calcul dividiendo la altura medida de la capa de emulsin dividiendo la altura medida de la capa de emulsin de la altura total de la mezcla de la capa de emulsin por el total de la mezcla altura y multiplicando por 100. Anlisis estadsticos. los datos se presentan en trminos de promedios aritmticos de al menos tres se replica y las barras de error indican las desviaciones estndar. Los anlisis se llevaron a cabo utilizando el software MicroCal origing,versin 6.0