Está en la página 1de 16

Artículo de Revisión

NUEVOS SISTEMAS VIRALES EN TERAPIA GÉNICA

A. Talavera 1 , H. Sánchez 2 1 Centro de Biología Molecular «Severo Ochoa» (CSIC-UAM). 2 Centro Nacional de Biotecnología.

INTRODUCCIÓN La transferencia génica, o transgénesis, consiste en la introducción de material genético en células apropiadas, con objetivos diversos. El más simple de éstos es la obtención de copias idénticas del material introducido, generalmente ADN, en cantidades adecuadas para su manejo, modificación o estudio de su estructura y expresión (1) . En su aspecto más prác- tico, modificación o estudio de su estructura y expresión (1) . En su aspecto más práctico, la transferencia génica busca la fabricación, con fines industriales o terapéuticos, de productos génicos por parte de las células receptoras del gen trans- ferido (denominado, en general, transgén), que pueden ser células en cultivo o bien formar parte de un organismo com- pleto modificado genéticamente, conocido como transgénico (2) . Dos aplicaciones de la transgénesis recientes y relacio- nadas entre sí son la terapia génica propiamente dicha (3, 4) , y la terapia celular (5) ; técnicas en las que se utilizan células propias del paciente o de un individuo donante capacitadas para producir y suministrar in vivo al paciente un producto génico curativo. La utilización de las células como factorías de productos terapéuticos ha requerido la optimización de los métodos de transferencia para poder aplicarlos con alta eficiencia y seguridad, así como con la menor dosis de invasividad posible. Mientras que los objetivos más primarios de la transgénesis pueden llevarse a cabo utilizando células en cultivo, con las cuales pueden usarse métodos tales como la electroporación o la coprecipitación del ADN con fosfato cálcico, la natu- raleza poco fisiológica y relativamente tóxica de estos procedimientos impide su uso en el cuerpo humano. Ha sido nece- sario encontrar, por lo tanto, vías alternativas de transgénesis que no opongan estos inconvenientes, lo que ha llevado al desarrollo de dos grandes tipos de vectores de transgénesis: los que utilizan macromoléculas basadas en lípidos o polí- meros orgánicos (lipoplejos y poliplejos, respectivamente), capaces de englobar ADN (6-9) , y los basados en la modifica- ción genética de virus. La idea de utilizar la capacidad natural que tienen los virus para introducir material genético en sus células huésped es anterior al nacimiento conceptual de la terapia génica, y ya se había aplicado a los demás objetivos de la transgéne- sis (10-12) . Sin embargo, la naturaleza clínica de la terapia génica condicionó la elección de capacidad de integrar el mate- rial genético viral en el celular (lo que prometía una estabilidad y permanencia del gen terapéutico) o la posibilidad de dirigir la transferencia a tejidos predeterminados. En una previa revisión (13) describíamos los principales tipos de vectores virales usados hasta ese momento en protocolos de terapia génica, es decir, vectores retrovirales, adenovirales, adenoa- sociados y basados en Herpesvirus. El paso del tiempo ha hecho que estos mismos vectores hayan sido modificados y mejorados, al tiempo que otros nuevos tipos se han ido incorporando al conjunto. La primera de estas irrupciones fue también objeto de un artículo en estas páginas (14) , y consistió en el uso de retrovirus que forman parte del género Lenti- virus, entre los que se encuentra el virus del SIDA. Este cambio, que indudablemente añadía en aquel momento el ries- go de utilizar como agente curativo elementos de un virus altamente patógeno, se debió a que estos retrovirus eran, a diferencia de los retrovirus clásicos (conocidos genéricamente como oncovirus), capaces de infectar y transducir células en reposo, estando en el que se encuentran normalmente las células más apropiadas para una terapia génica duradera, como son las células progenitoras de los diferentes tejidos somáticos. Cabría preguntarse sin esfuerzos que podrían ser aplicados a la mejora de los sistemas de vectores virales ya cono- cidos deben, en cambio, emplearse en desarrollar nuevos sistemas. La respuesta está en la gran diversidad de los virus y sus modos de replicarse, que abre la posibilidad de nuevos usos terapéuticos derivados de diferentes modos de repli- cación viral. En el desarrollo de nuevos sistemas pueden aparecer, por otra parte, nuevos problemas cuya solución requie- re estrategias diferentes a las usadas en los sistemas previos. A lo largo de esta revisión vamos a repasar, primeramente,

1

- 2ª PPT CTS ADN + + ADN «Normal» ADN «Secundario»
-
2ª PPT
CTS
ADN
+
+
ADN «Normal»
ADN «Secundario»

Nuevos sistemas virales en terapia génica

Figura 1. Estructura de la parte central del ADN del VIH. La cadena negativa del ADN presenta un tracto de polipurina extra (2ª PPT), del que se origina una cadena positiva de ADN (ADN+ secundario). Otra cadena positiva, originada en la PPT normal (fuera de los límites del esquema), termina su síntesis en la región CTS, ulterior a la 2ª PPT, la zona del ADN comprendida entre ambas regiones de origen y terminación es, por lo tanto, tricatenaria.

las modificaciones y mejoras aportadas a los sistemas «clásicos» de vectores virales de terapia génica; a continuación hare- mos una descripción de los fundamentos y aplicaciones de nuevos sistemas no tratados en las pasadas revisiones.

VECTORES RETROVIRALES

Lentivirus y entrada en el núcleo En la citada revisión del 2000 (14) se concluía que la entrada en el núcleo del complejo de preintegración del VIH venía posibilitada por la existencia de señales de localización nuclear en las diferentes proteínas que forman, junto con el ADN viral recién transcrito, el complejo de reintegración. Nuevos estudios completaron esta visión, al observarse que tanto en el VIH (15, 16) como en otros lentivirus (17, 18) existe una estructura de ADN tricatenario hacia la zona central del ADN, que contiene una secuencia rica en purinas (PPT) análoga a la que normalmente está presente en la zona subterminal del ARN viral y que sirve, durante la transcripción inversa, de cebador de la síntesis de la segunda cdena (cadena +) del ADN (13) . Esta secuencia, llamada «segunda PPT» sirve de cebador independiente de un ADN+, y está situada antes de la señal de terminación (CTS) del ADN+ normal, por lo que se da un solapamiento entre ambos ADN+, que da cuenta de la región de tres cadenas (Fig. 1). La conformación impuesta por esta estructura es lo que permite al ADN la entrada al núcleo a través de los poros nucleares. Como era de esperar, poco tiempo después de la descripción de este elemento apareció en la literatura su aplicación a nuevos vectores basados en lentivirus (19-22) .

Empaquetamiento transitorio La tecnología que conduce a la obtención de retrovirus recombinantes o transductores se basa en la coexistencia en una célula, en un momento determinado, de dos elementos genéticos (13) : a) Un provirus artificial que en el que los genes estructurales del retrovirus han sido sustituidos por el transgén que se desea transducir; el ARN transcrito a partir de este provirus ha de conservar, entre otros elementos retrovirales, la capacidad de ser encapsidado. b) Genes que expre- sen las proteínas virales necesarias para la formación de cápsidas donde el ARN del provirus artificial puedan ser encap- sidadas. Sin embargo, los ARNs mensajeros correspondientes a estos genes deben ser incapaces (o haber sido activamente incapacitados) para pasar a formar parte de las cápsidas virales que sus genes contribuyen a formar, ya que ello daría lugar a la aparición, junto a los deseados retrovirus transductores incapaces de formar nueva progenie, de retrovirus nor- males, que no sólo seguirían propagándose una vez que infectasen las células blanco, sino que ayudarían a los virus trans- ductores a propagarse con ellos, situación no deseada en el contexto de la terapia génica, cuyo objetivo es transportar el gen curativo a las células diana y no a sus vecinas. Normalmente, el primero de los elementos se halla en un plásmido retroviral genómico que contiene los LTR y otras regiones de control propias de un provirus, y en el que se ha insertado el transgén (13, 23) . Este plásmido se introduce en una estirpe celular, llamada empaquetadora (Fig. 2) en la que previamente, y de forma estable, se ha introducido el segun- do de los elementos, generalmente en dos plásmidos independientes, uno de ellos portador de los genes estructurales de la cápsida y nucleocápsida retroviral (genes gag y pol) y el otro portando los genes que dan lugar a las proteínas de la envuelta viral (gen env). La fracción de élulas empaquetadoras que han recibido el plásmido con el transgén, y que

2

VIROLOGÍA, Volumen 10, Número 1/2004

LTR Transgén LTR ψ env gag pol env gag pol L T R ψ Transg
LTR
Transgén LTR
ψ
env
gag pol
env
gag pol
L
T R
ψ
Transg é n
L
T R
ψ env Transgén LTR LTR ψ L T R env gag pol ψ Transg é
ψ
env
Transgén LTR
LTR
ψ
L
T R
env
gag pol
ψ
Transg é n
L
T R
gag-pol
ψ

Figura 2. Técnica clásica de preparación de retrovirus recombinantes. El vector retroviral genómico se introduce en las células empaquetadoras, que expresan estable y constitutivamente los genes estructurales del retrovirus. Las células obtenidas producen partículas de virus que empaquetan el ARN que contiene el transgén.

Figura 3. Empaquetamiento transitorio de retrovirus recombinantes. Una estirpe celular normal se

cotransfectan con el vector retroviral genómico y con plásmidos que contienen los genes virales estructurales. Las células cotransfectadas expresan transitoriamente los productos de todos los genes introducidos, produciendo partículas virales con el ARN recombinante requerido.

ahora pueden ya llamarse células productoras de retrovirus recombinantes, han de seleccionarse [usando para ello un gen selector que comúnmente acompaña al transgén (13, 24) ], y ser usadas como población general para la producción de virus o, de manera óptima, ser clonadas para elegir los clones que producen más cantidad de partículas virales recom- binantes, producción que depende, entre otros factores, del locus de la célula empaquetadora en el que el vector retro- viral ha quedado integrado (24, 25) . Todo el proceso arriba indicado es tedioso y extenso en el tiempo. La aplicación de genes selectores de acción rápi- da, como el gen de la proteína verde fluorescente (EGFP) de la medusa Aequorea victoria (26, 27) , ha posibilitado la pre- paración de células productoras mediante la técnica conocida como transfección transitoria (28) , que consiste en la intro- ducción simultánea en una población celular de todos los elementos necesarios para la producción de virus recombi- nantes (Fig. 3), cuya expresión transitoria es suficiente para la preparación, durante un tiempo limitado, de virus recom- binantes con títulos útiles para la mayoría de los experimentos. La cantidad de la transfección puede ser determinada, por medio de citometría, en una fracción de las células transfectadas al cabo de 24 o 48 horas después de la misma, de mane- ra que si la proporción de células transfectadas (fluorescentes) resultara ser reducida (lo que sería indicativo de una baja producción de virus) se procedería a una nueva transfección sin la larga espera inherente al procedimiento de trans-

3

Nuevos sistemas virales en terapia génica

fección estable. Para la transfección transitoria se utilizó en un primer momento la electroporación (28) . Sin embargo, se ha determinado que para la preparación de células empaquetadoras por transfección transitoria es más conveniente usar el procedimiento «clásico» de introducción de material genético en células animales, es decir, la coprecipitación de ADN con fosfato cálcico (29) , ya que produce menos mortalidad celular (30) .

Pseudotipaje La formación de partículas de retrovirus recombinantes exige la participación de un gen que codifique las proteínas de la envuelta viral. La tecnología primitiva utilizaba los genes env correspondientes a las estirpes ecotrópica (capaz de infectar exclusivamente ratones y ratas) o anfotrópica (capaz de infectar un rango más amplio de huéspedes, entre los que se cuenta la especie humana) del virus de la leucemia murina de Moloney, dependiendo, en líneas generales, del destino último pensado para los vectores y de la seguridad respecto al experimentador de que se les deseaba dotar (13). La fragilidad que presentan las envueltas que contienen este tipo de proteínas hacía imposible la concentración de virus por métodos mecánicos, tales como la precipitación y centrifugación. Este inconveniente, unido al desarrollo posterior de vectores basados en el VIH, condujo a la producción de partículas virales que contenían envueltas propias de otros virus, procedimiento al que (tomando la terminología propia de un fenómeno natural conocido durante largo tiempo, merced al cual el virus de determinado tipo serológico adquirían, independientemente de su genoma, características inmunoló- gicas de un tipo diferente) se le conoce como pseudotipaje. El gen normalmente elegido es el correspondiente a la pro- teína G de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular, que confiere a las partículas virales la resistencia mecánica sufi- ciente para que puedan ser sometidas a concentración por los métodos anteriormente apuntados (31-32) .

Problemas de mutagénesis integrativa Todas las revisiones sobre vectores retrovirales incluían, hasta ahora, una consideración teórica sobre la posibilidad de que la integración del provirus causase efectos inesperados e indeseados en el genoma celular, lo que frustaría y com- plicaría el propósito curativo perseguido, aunque en casi todos los casos se hacía énfasis en que estos efectos no habí- an sido nunca encontrados. La base principal para este toque de atención era doble: por una parte, la integración podía llevarse a cabo en un sitio que interrumpiese un gen esencial para la biología de la célula (13) . En general, este tipo de modificación implicaría únicamente que la supervivencia de la célula que habría recibido el gen terapéutico estaría seria- mente comprometida, conduciendo al fracaso de la terapia génica sin producir ningún perjuicio adicional al paciente. Sin embargo, si el gen inactivado fuese un gen supresor de tumor, la inactivación podría implicar la puesta en marcha de un proceso neoplásico. Por otra parte, el hecho de que los provirus retrovirales, naturales o recombinantes, contengan secuencias promotoras a ambos lados abre la posibilidad de que los genes contiguos al provirus, posteriores en cuanto a la dirección de transcripción de éste, puedan ser anómalamente activados por la propia integración proviral, lo que en el caso de protooncogenes podría implicar, de nuevo, el disparo de un proceso tumoral. Este efecto fue finalmente detectado en un experimento realizado a principios del 2002 en ratones, por un grupo de investigadores alemanes (33) que usaron un gen marcador, en principio inerte, para marcar células de médula ósea de ratón, que fueron transplantadas en animales irradiados sin producir ningún efecto adverso. Sin embargo, cuando las células de estos ratones primarios fueron transplantadas a ratones secundarios, muchos de éstos desarrollaron leucemia mieloide aguda. Un análisis exhaustivo llevó a los autores a concluir que la integración del provirus había activado el gen celular Evi1, que codifica un factor de transcripción que, en cooperación con el producto del transgén, contribuyó a la aparición de este tipo de leucemia. Los peligros de que avisaba este artículo se hicieron realidad pocos meses después en un experimento que implica- ba pacientes humanos, y precisamente en un programa terapéutico que había sido calificado como el primero (y por entonces único) experimento de terapia génica con éxito demostrable. El experimento, llevado a cabo por un grupo fran- cés liderado por A. Fischer, tenía por objeto la curación de un tipo de inmunodeficiencia severa combinada ligada al cro- mosoma X, en la que el gen inactivado codifica un receptor de citoquinas llamado γc, necesario para la diferenciación de

4

VIROLOGÍA, Volumen 10, Número 1/2004

Virus auxiliar Emp + Emp + Relleno Relleno Transgén Genes virales E1 - LoxP Transfección
Virus
auxiliar
Emp +
Emp +
Relleno
Relleno
Transgén
Genes virales
E1 -
LoxP
Transfección
Infección
Virus
auxiliar
Genes virales
Emp - E1 -
+
Emp
Transgén
Virus
recombinante

Figura 4. Empaquetamiento de seguridad de adenovirus recombinante. La estirpe celular 293 Cre se transfecta con un plásmido que contiene el transgén flanqueado por los extremos del ADN de adnovirus, incluyendo las ITR y las secuencias de empaquetamiento, además de secuencias de ADN no expresable cuya misión es que la distancia entre los extremos sea la apropiada para que el tamaño del ADN permita su encapsidación, las células

transfectadas se infectan con un adenovirus auxiliar cuyo ADN aporta todos los genes virales necesario para la formación de las cápsidas, pero cuya zona de empaquetamiento está contenida entre dos regiones IoxP. La recombinasa Cre expresada por las células promueve la recombinación entre ambas regiones IoxP, eliminando la región de empaquetamiento del ADN auxiliar, que no puede entrar a formar parte de

la progenie. En cambio, el ADN que contiene el

transgén el empaquetado normalmente para dar lugar

a partículas de virus recombinante.

ciertos tipos de linfocitos (34) . El gen terapéutico se suministraba ex vivo, a células madre hematopoyéticas de los pacien- tes por medio de un vector retroviral; los primeros resultados positivos, referidos a dos pacientes, fueron comunicados en el 2000. Sin embargo, unos dos años más tarde, cuando se habían tratado 10 (35) u 11 (36, 37) pacientes, apareció entre éstos un caso de leucemia, cuyo análisis demostró que era debida a proliferación desmesurada de los linfocitos T que habían recibido el transgén (35) , y en los cuales el provirus recombinante aparecía integrado en el cromosoma 11, cerca de un gen del que previamente se sabía que estaba implicado en la aparición de leucemias juveniles. A este caso se sumó poco más tarde otro con las mismas características (36) de entre el grupo de pacientes. Finalmente apareció un tercer caso que contenía el provirus integrado en el mismo sitio, aunque en este caso el paciente no exhibía síntomas de leu- cemia (37) . Afortunadamente, el seguimiento exhaustivo de todo el grupo de pacientes ha permitido el tratamiento inme- diato de aquéllos que han desarrollado leucemia, pero estos resultados han hecho reconsiderar, y aún detener, nume- rosos protocolos clínicos que implicaban el uso de vectores retrovirales.

ADENOVIRUS: NUEVAS GENERACIONES DE VECTORES

A lo largo de los últimos años se han desarrollado nuevas generaciones de vectores adenovirales:

a) Vectores con genes inactivados, también denominados vectores de primera generación, fue el primero en ser desarro- llado con esta clase de virus. En la anterior revisión (13) se trató de la base del diseño de vectores adenovirales de esta generación, consistente, originalmente en la deleción de la región temprana E1 del genoma. Más tarde se añadieron deleciones en otras regiones tempranas, principalmente la región E3, para aumentar la seguridad de estos vectores.

b) Vectores vacíos. Las deleciones citadas resultaron no ser suficientes para evitar el elevado riesgo de inmunotoxicidad de estos vectores, debido a la expresión remanente de proteínas virales. Consecuentemente se desarrollaron los deno- minados vectores vacíos en los que sólo se mantienen las secuencias necesarias en cis, incluyendo los dos orígenes de replicación en los extremos del genoma, así como las secuencias de empaquetamiento. La producción de estos vectores requiere el uso de adenovirus auxiliares, que pueden ser separados mediante técnicas biofísicas gracias a su diferente contenido en ADN. Un mecanismo adicional de seguridad que evita la produccióm de éstos consiste en el flanqueamiento de la región de empaquetamiento de los virus con la secuencia IoxP, que, en presencia de la recom- binasa Cre se escinde, evitando la encapsidación del genoma del virus auxiliar (38) (Fig. 4). En la actualidad, se están llevando a cabo mejoras en las líneas productoras de estos vectores que permitan su producción a gran escala en bio- rreactores (39) .

5

Nuevos sistemas virales en terapia génica

La eficacia de estos vectores está siendo evaluada en tratamientos tan diversos como la disfunción eréctil, mediante la transferencia del gen de la sintetasa de NO neuronal (nNOS) en el pene de ratas envejecidas (40) , o la hemofilia A con un vector que contiene el gen del factor de coagulación VIII y cuya administración intravenosa en ratones per- mite una expresión mantenida durante nueve meses frente a los tres obtenidos con un vector de primera genera- ción (41), así como la pérdida visual debida a retinopatías de origen diabético tras la inyección intraocular de adenovi- rus vacíos que expresan el gen de la endostatina, un inhibidor de la vascularización coroidal (42) .

c) Adenovirus oncolíticos. El descubrimiento en 1996 (43) de que ciertas estirpes de adenovirus con mutaciones en la zona E1B del genoma (gen que codifica una proteína capaz de inactivar el gen supresor de tumor p53), podían replicar y lisar células humanas deficientes en p53, condujo al desarrollo de nuevas estrategias antitumorales. Los éxitos obte- nidos con este nuevo tipo de virus denominado ONYX-015 (44) en ensayos clínicos de fase I y II ha permitido la rea- lización de ensayos clínicos en fase III para el tratamiento de carcinoma de células escamosas de cuello y cabeza (45). Sin embargo, no todos los protocolos clínicos ensayados han tenido el éxito que cabría esperar. Una de las razones de ello estriba en la ausencia de un receptor celular adecuado para estos vectores en las células tumorales (46) . Entre los tratamientos que sí parecen estar funcionando, cabe destacar los protocolos en fase II aprobados para pacientes de cáncer colorrectal (47) , con tumores hepatobiliares (48) , o con carcinomas pancreáticos no extirpables (49) .

VECTORES ADENOASOCIADOS Los vectores basados en virus adenoasociados (AAV) han sufrido en los últimos años un intenso desarrollo enca- minado a mejorar las ya de por sí ventajosas características que poseen, siendo una de ellas el alto contenido de par- tículas transductoras por unidad de volumen (título) que se puede conseguir en su preparación. En la citada publica- ción (13) se describe la estructura de los vectores basados en virus adenoasociados y la tecnología empleada para la obtención de virus recombinantes, que requiere el uso de adenovirus auxiliar. La dependencia de este último y el ries- go de contaminación que conlleva ha conducido al desarrollo de diferentes estrategias para conseguir su elimina- ción, una de las cuales se basa en sustituir el virus auxiliar por un plásmido que aporte exclusivamente los genes del adenovirus que realizan tal misión (E2a, E4orf6 y VA), conjuntamente con la utilización de la línea celular HEK293, que expresa los genes adenovirales E1a y E1b (50) . Se han desarrollado métodos que permiten incluso rastrear la pre- sencia de contaminantes, incorporando proteínas fluorescentes fusionadas a los genes auxiliares (51) . Otro de los pro- blemas asociado a este tipo de vectores es la dificultapara generar líneas productoras debido a la toxicidad de la pro- teína replicativa rep (13) en la mayoría de las líneas eucarióticas. Para solucionar este inconveniente se han desarrolla- do vectores basados en el virus herpes deficientes en replicación, que contienen los genes rep/cap de AAV; este sis- tema híbrido permite, tras la infección con el vector basado en herpes de una célula que contenga el genoma del AAV recombinante, la generación de los vectores buscados (52) . Aunque, tras la demostración de que es posible el empa- quetamiento in vitro de partículas AAV, es muy probable que, en el futuro, la generación de estas células empaque- tadoras/productoras sea innecesaria (53, 54) . Una de las grandes limitaciones de los vectores AAV es la cantidad de material genético que es capaz de albergar la cápsida (< 5kb). Para aumentar esta capacidad de empaquetamiento se ha hecho uso de la propia biología del virus, ya que su genoma es capaz de dimerizar y permannnecer en la célula transducida como concatémero (55) (Figs. 5, A y B). Este hecho ha permitido transducir genes de mayor tamaño dividiéndolos en dos mitadas para ser introducidos por sendos vectores. Para eliminar la ITR (repetición terminal invertida) del genoma del virus que queda entre los dos seg- mentos del transgén se puede hacer uso de secuencias de «splicing» de manera que se produzca el ARN mensajero bus- cado (56, 57) (Figs. 5, C y F). Esta estrategia ha sido probada recientemente para probar su eficacia en la retina. En la actua- lidad se conoce la base molecular de numerosas patologías oculares, lo que las convierte en candidatas a terapia géni- ca, mediante, por ejemplo, la transducción de fotorreceptores o pigmentos retinales. En experimentos preliminares se ha demostrado que la retina puede ser transducida con este tipo de vectores y de expresar el transgén al menos durante un mes (58) .

6

VIROLOGÍA, Volumen 10, Número 1/2004

SD SA A D Trans gén Promotor Transgén ITR ITR SD SA Trans gén E
SD
SA
A
D
Trans
gén
Promotor
Transgén
ITR
ITR
SD
SA
Trans
gén
E
B
ITR
ITR
ITR
ITR
ITR
Trans
gén
An
F
SD
SA
PollA
Promotor
Trans
gén
Transgén
C
An
ARNm
G
Figura 5. Vectores adenoasociados de capacidad aumentada. A) Vector adenoasociado. Todos los genes virales han sido sustituidos por el
transgén y su promotor, conservándose solamente las repeticiones terminales invertidas (LTR) y zonas adyacentes a éstas propias del
genoma viral. B) El ADN adenoasociado, tras replicarse forma concatémeros. Obsérvese que los monómeros pueden disponerse en tándem
o de modo opuesto entre sí. C) Vectores de capacidad aumentada, conteniendo, respectivamente, el promotor y la parte proximal del
transgén «Trans
»)
o la parte distal del mismo («
gén»)
seguida de una señal de poliadenilación. En sitios convenientes se han colocado
ITRITRITRITR

señales donante (SD) y aceptora (SA) de corte y empalme («splicing»). D) La coinfección con ambos vectores produce concatémeros; en ocasiones, dos monómeros contiguos corresponden a ambas mitades del transgén, dispuestas convenientemente (zona cercada y ampliada). E) ARN transcrito a partir del promotor, antes de sufrir el corte y empalme. F) El ARN mensajero, tras ser procesado contiene la secuencia ininterrumpida del transgén, de donde se traducirá el correspondiente producto génico.

VECTORES BASADOS EN EL VIRUS DE LA VACUNA Y OTROS POXVIRUS Entre los grupos de virus que recientemente han ingresado en las filas de los vectores de transgénesis aplicados a la terapia génica se encuentran los Poxvirus, cuyo representante más utilizado es el virus Vaccinia, o virus vacunal. Este virus tiene una larga historia terapéutica, al ser el primero que se usó con tal fin, aún antes de conocer su existencia como tal virus. La técnica de vacunación, ideada por Edward Jenner a finales del siglo XVIII con el fin de defender a la pobla- ción humana frente a la viruela, consistía en la inoculación en humanos de exudados de pústulas de viruela vacuna (que sólo causa en nuestra especie infecciones localizadas). La infección conseguida, cuyo efecto desaparecía en una sema- nas, causaba, debido a lo que hoy se conoce como una reacción inmune cruzada entre virus emparentados, la inmuni- dad de los individuos tratados frente a la viruela humana, enfermedad que en aquellos momentos era causa de gran mos- talidad y de graves secuelas. Esta técnica se utilizó durante más de siglo y medio en todo el mundo hasta que la Orga- nización Mundial de la Salud declaró la enfermedad erradicada en 1979. A esta erradicación contribuyó España con la vacunación llevada a cabo por la Real Expedición de la Vacuna por todos los territorios hispanos de Ultramar entre 1803 y 1810, es decir, pocos años después del descubrimiento de la vacuna. El segundo centenario de esta Expedición se celebra este año, pudiéndose obtener información sobre la misma en la página de Internet: http://www2.cbm.uam.es /sev/WEBVAVI/CartaPresen.htm.

A lo largo de todo ese período, en que los procedimientos de preparación y conservación de la vacuna eran empíri-

cos, el virus original presente en las pústulas del ganado vacuno debió acumular o, en algún momento, contaminarse con algún otro tipo de poxvirus, ya que una vez desarrollada la virología y analizado el virus vacunal resultó, por una parte, no ser igual al de la viruela vacuna, siendo incluso más semejante, aunque no idéntico, al de la viruela equina. De todos modos, no se ha encontrado en la naturaleza un virus idéntico al vacunal, que puede ser así considerado un virus

«cultivado» (59-61) de la misma manera que, por ejemplo, el maíz o la alpaca, especies domésticas cuyo antecedente silves- tre se ha extinguido.

El virus Vaccinia tiene una estructura compleja, oblongo, cuyo eje mayor mide unos 300 nm, mientras que su anchu-

ra es de 180-230 nm (Fig. 6A). Es un virus con envuelta, dentro de la cual se encuentra un nucleoide rodeado de una membrana, y el conjunto, a su vez, está rodeado por una capa lipídica; entre ambas capas se hallan unas estructuras lla-

7

A
A

Nuevos sistemas virales en terapia génica

B

RTI RTI
RTI
RTI

Figura 6. A) Micrografía electrónica del virus Vaccinia, obtenida por F. Fenner (ICTVdB - The Universal Virus Database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb /ICTVdB/). B) Esquema del ADN de Vaccinia, mostrando la polaridad de las cadenas y su unión en horquilla por los extremos. RTI: repeticiones terminales invertidas.

madas cuerpos laterales, cuya función es desconocida. El nucleoide contiene el material genético, un ADN de 180.000 pares de bases (pb) en el que las dos cadenas se hallan conectadas entre sí por lazos terminales formados por unas pocas bases no apareadas, en ambos extremos (Fig. 6B). Los 10.000 pb de ambos extremos son idénticos, pero dispuestos inver- samente, por lo que esas secuencias reciben el nombre de repeticiones terminales invertidas (RTI), que contienen, a su vez, secciones repetidas en tándem, con una misión específica en la replicación del ADN viral. El ciclo completo del virus Vaccinia tiene lugar en el citoplasma, lo que implica que la partícula viral haya de apor- tar los enzimas necesarios para la expresión temprana del genoma viral de manera independiente del núcleo. Los pro- ductos de los genes tempranos son responsables de la replicación del ADN viral como de la expresión de los genes tar- díos, que incluyen las proteínas estructurales. Éstas se ensamblan entre sí y con el nuevo ADN viral, en unas estructuras perinucleares llamadas «factorías virales», para dar lugar al virus progenie. A principios de los años 1980, dos grupos (62, 63) abordaron la tarea de adaptar este virus para su utilización como vector infectivo de clonaje y expresión de genes exógenos, con la idea de que el virus que había dado la vacuna de la viruela sirviese también para vacunar contra otros microorganismos, ya fuese por expresión de los correspondientes antí- genos en las células infectadas por el vector recombinante, como por la posibilidad de que las propias partículas virales fuesen portadoras de los antígenos de interés. Más tarde, los vectores basados en Vaccinia se han usado para otros pro- pósitos, tales como identificación de receptores o correceptores para otros virus (64) o el efecto antiviral de algunas cito- quinas (65) . La inserción de un transgén en un genoma tan complejo como el de Vaccinia no es posible in vitro, y es necesario usar técnicas de recombinación in vivo (Fig. 7): un plásmido en el que se ha insertado el transgén en el centro de un gen viral previamente clonado [el gen temprano tk que codifica una timidina kinasa (TK) es muy conveniente para este fin], se introduce por transfección en células que subsiguientemente se infectan con Vaccinia. Mediante recombinación homó- loga se logra así que algunos de los virus progenie contengan el transgén interrumpiendo el gen viral elegido para tal fin. En el caso del gen tk estas partículas virales recombinantes pueden ser seleccionadas por formación de placas sobre monocapas de células TK en presencia de 5-bromodeoxiuridina, que mata las células infectadas por virus normal, pero no las no infectadas ni las infectadas por virus recombinante, que son, por lo tanto, los únicos capaces de formar placas de lisis de las que se pueden extraer virus recombinantes puros (59, 66) . La aplicación de Vaccinia a la terapia génica se ha centrado principalmente en su vertiente antitumoral. Los prime- ros éxitos se consiguieron transduciendo genes de citoquinas en tumores murinos (67, 68), lo que llevó a efectuar un ensa- yo clínico en fase I (69) en pacientes con melanomas, consiguiéndose regresión total de los tumores en algunos casos.

8

VIROLOGÍA, Volumen 10, Número 1/2004

Transgén
Transgén
Transgén

Figura 7. Obtención de virus Vaccinia recombinante. Una estirpe celular capaz de ser infectada por el virus se transfecta con un plásmido que contiene el transgén, flanqueado por secuencias de un gen viral dispensable. Las células transfectadas se infectan con virus Vaccinia. Las ADNs plasmídico y viral recombinan por las zonas de homología, con lo que el transgén se inserta en el ADN viral, que es empaquetado en las cápsidas virales producidas por la propia infección.

También se ha aplicado Vaccinia en la técnica antitumoral de suicidio por sistemas enzima-prodroga. Naturalmente, esta técnica requiere un direccionamiento previo del vector, para no comprometer la supervivencia de tejidos ajenos al tumor. Afortunadamente, Bartlett y colaboradores describieron en el 2000 que una estirpe de Vaccinia que había sido des- provista del gen de la timidina kinasa viral se replicaba selectivamente en células tumorales (70) . Esta estirpe fue, por lo tanto, provista de los genes de enzimas correspondientes a dos sistemas enzima-prodroga: 1) citosina deaminasa, que metaboliza la prodroga 5-fluorocitosina (71) ; 2) purina nucleótido fosforilasa que metaboliza la prodroga 6-metilpurina deso- xirribósido (72) . Este grupo está, por otra parte, utilizando este mismo tipo de mutantes de Vaccinia con el fin de desarro- llar virus de naturaleza oncolítica, análogos a los adenovirus citados anteriormente (44,61,73) . Un direccionamiento Vaccinia de diferente naturaleza, aplicado a la potenciación del sistema inmune contra células tumores, ha sido desarrollado por el grupo de Kieny (74) , mediante inserción en Vaccinia del gen de un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer antígenos presentes en la superficie de células de tumor de carcinomas gastrointestina- les. En este caso, las células infectadas con el virus recombinante no eran las del tumor, sino células efectoras del siste- ma inmune (macrófagos y linfocitos T citotóxicos), cuya acción citolítica se redirigía hacia las células cancerígenas. La permanencia en la población mundial de individuos que fueron sometidos a la vacunación contra la viruela ha hecho temer que Vaccinia no pueda ser usado en estos pacientes con otros fines, debido a un rechazo inmune. Por ello se ha comenzado a investigar sobre la posibilidad de usar poxvirus alternativos. Uno de ellos es el virus de la enferme- dad «Yaba-like» o «análoga a Yaba» detectaba en humanos que actuaban como cuidadores de primates en centros de inves- tigación en 1965, y que causaba, como Vaccinia, una enfermedad breve y benigna (75) . El virus ha sido clasificado en el género Yabapoxvirus, donde se encuentran otros virus Yaba de tumores de monos.

VECTORES BASADOS EN ALFAVIRUS Los alfavirus son virus con ARN monocatenario de polaridad positiva (es decir, la misma polaridad que el ARN mensajero) como material genético, incluido en una nucleocápsida sencilla, formada por una sola proteína viral. Es un virus con envuelta, que incluye, en forma de espículas, dos proteínas, asimismo, codificadas por el virus. Se trata de virus esféricos de unos 60 nm de diámetro, y constituyen un género dentro de la familia de los Togavirus. El prototipo de los

9

RNA Genómico (Cadena Positiva)

P

cap

RNA Gen ó mico (Cadena Positiva) P cap PollA Genes Genes no estructurales estructurales RNA copia
RNA Gen ó mico (Cadena Positiva) P cap PollA Genes Genes no estructurales estructurales RNA copia
RNA Gen ó mico (Cadena Positiva) P cap PollA Genes Genes no estructurales estructurales RNA copia
RNA Gen ó mico (Cadena Positiva) P cap PollA Genes Genes no estructurales estructurales RNA copia

PollA

Genes Genes no estructurales estructurales RNA copia (cadena negativa) RNA genómico (cadena positiva) RNA
Genes
Genes no estructurales
estructurales
RNA copia (cadena negativa)
RNA genómico (cadena positiva)
RNA subgenómico
Empaquetamiento
Proteínas estructurales
A

Nuevos sistemas virales en terapia génica

B Promotor Transgén Genes no estructurales
B
Promotor
Transgén
Genes no estructurales

Figura 8. Vectores basados en alfavirus. A) Mapa genético de un alfavirus. Los genes no estructurales se traducen directamente del ARN viral a su entrada en la célula para dar lugar a los componentes de la replicasa, que se encarga de la síntesis de la forma replicativa del ARN y del ARN subgenómico, que es traducido en componentes de la cápsida viral. B) Vector basado en alfavirus. La construcción contiene, en forma de ADN, los genes de la replicasa, precedidos de un promotor y, sustituyendo a los genes estructurales, el transgén. Cuando este ADN es introducido en las células la replicasa es traducida inmediatamente, produciendo gran cantidad de ARN subgenómico, de donde se traduce el producto del transgén.

alfavirus es el virus Sindbis, pero entre ellos se encuentran otros como el del Bosque de Semliki y el de la encefalitis equi- na venezolana (76) . El genoma viral contiene dos fases abiertas de lectura (open reading frames-ORF); la más próxima al extremo 5' (ORF de genes no estructurales o de la replicasa), ocupa los 2/3 de la longitud, situándose en el tercio restante la segunda ORF, o estruc- tural (76, 77) . La entrada del virus en la célula es mediada por receptor, y tiene lugar por un endosoma que al acidificarse permi- ten la fusión de la envuelta viral con la membrana del endosoma, con lo que la nucleocápsida ingresa en el citoplasma. Allí el ARN genómico, en su calidad de ARN mensajero, traduce, a partir de la ORF de la replicasa (en forma de una poliproteína que se autoprocesa proteolíticamente), 4 proteínas que se ensamblan para ejercer diversas funciones, entre las que se encuen- tra la que da el nombre a la ORF, ya que copia el ARN genómico para dar formas replicativas de ARN de doble cadena (Fig. 8A). Estos ARNs presentan, en la zona que separa ambas ORFs, un promotor (P, en la figura) de donde la replicasa copia peque- ños ARNs de polaridad positiva y de secuencia idéntica al tercio 3' del ARN genómico, conteniendo, por lo tanto, la ORF estruc- tural, de donde se traducen (y de ahí el nombre) las proteínas estructurales del virión, tanto las de la nucleocápsida como las de la envuelta. Aquéllas se ensamblan en nuevas partículas que engloban ARNs positivos de longitud genómica, también sin- tetizados por la replicasa, y que, a diferencia de los ARNs subgenómicos poseen una secuencia empaquetadora. El virus emer- ge de la célula por gemación, en sitios de la membrana plasmática en donde previamente se acumulan proteínas virales de la envuelta, que han sido procesados a lo largo de su paso por el retículo endoplasmático. Una copia en forma de ADN bicatenario puede servir como vector basado en alfavirus una vez clonada en un plás- mido y provista de un promotor capaz de ser reconocido por la ARN polimerasa II celular. La parte correspondiente a los genes estructurales es sustituida por el transgén (Fig. 8B). A la entrada de este ADN en la célula se transcribe un ARN autorreplicativo capaz de expresar el transgén muy activamente merced al efecto amplificador de la replicasa, que sin- tetiza gran cantidad de ARNs subgenómicos a partir del promotor P, conservado en la construcción plasmídica, de los cuales se traduce el transgén.

REDIRECCIONAMIENTO DE VECTORES La terapia génica in vivo, sea cual sea el tipo de vector usado, se enfrenta con el problema de que el transgén puede ser introducido en células diferentes de aquéllas en que su acción ha de ejercerse de manera óptima (78) . Por una

10

VIROLOGÍA, Volumen 10, Número 1/2004

parte, la transducción de células inespecíficas puede tener efectos inesperados debidos a la expresión ectópica del gen terapéutico. Esto es especialmente cierto cuando la terapia génica consiste en la introducción de un gen suicida, bus-

cando eliminar selectivamente células tumorales o infectadas por virus, por ejemplo. En este caso, la desviación del gen

a otros tejidos podría causar la innecesaria y contraproducente destrucción de éstos (79) . Por otra parte, lo bajo de los bajos títulos de virus recombinantes a menudo alcanzados hacen deseable que la mayoría de éstos alcancen las células blan- co deseadas, sin que haya una diseminación estéril de los mismos. Aunque en algunos casos el tropismo natural de un vector determina que la administración sistémica del mismo sea suficiente para que alcance mayoritariamente el tejido deseado (como es el caso de los adenovirus y los hepatocitos o los AAV y el músculo esquelético) (80) , la situación nor- mal es que los vectores virales sean capaces de infectar un amplio rango de tejidos, por lo que conviene que sean manipulados a fin de que esta capacidad quede restringida (81) . Los esfuerzos encaminados a limitar la expresión del transgén portado por un vector viral a un tejido determinado han tomado dos vías alternativas. La primera de ellas (direccionamiento transduccional) se basa en dirigir la infectividad del vector hacia las células deseadas; la segunda, o direccionamiento transcripcional, limita la transcripción del transgén

a una estirpe celular determinada, sin tratar de evitar que sea introducido en otros tejidos en los que su transcripción y,

por lo tanto, expresión es imposible. El mecanismo de redireccionamiento más sencillo se basa en el pseudotipaje, ya mencionado en una sección pre- via, aunque, en general, lo que hace este tipo de redireccionamiento es extender, en lugar de restringir, el rango de tejidos que puede infectar un determinado vector viral. Se ha usado, de todos modos, con el propósito de dotar a los vec- tores basados en el virus de Moloney de la especificidad por las células que presentan en superficie el receptor CD4 (lin- focitos T4 y macrófagos, principalmente), es decir, la especificidad propia del VIH (82) . El redireccionamiento de la infectividad requiere la manipulación del mecanismo de entrada en los virus, que puede conseguirse o bien mediante la manipulación genética de los componentes virales encargados del mismo, tales como el pen- tón en adenovirus (83, 84) o la proteína de superficie de la envuelta de los retrovirus (81, 82) , incluyendo en ellos péptidos espe- cíficos de determinados ligandos (85) o anticuerpos de cadena simple (pequeñas moléculas proteicas que comprenden la parte del anticuerpo que reconoce y se une al antígeno) (86) , de manera que, en lugar de reconocer el receptor que les es propio, reconozcan componentes que sólo estén presentes en la célula blanco elegida. Es necesario resaltar en este punto que el mecanismo de entrada de los virus no consiste, de ordinario, en una simple aproximación de las partículas virales a la super- ficie celular, sino que en muchos casos cuenta, para la internalización, la presencia de otros componentes celulares, tales como correceptores, etc., por lo que el cambio de receptor no siempre garantiza la infectividad del vector manipulado. Un método alternativo de cambiar la especificidad del ligando lo ofrece el uso de moléculas bifuncionales que, por un extremo se unan a éste (e impidan, de paso, la interacción de éste con su receptor natural) y por el opuesto a una proteína de la superficie de la célula blanco. Este tipo de moléculas pueden ser parejas de anticuerpos monoclonales bio- tinilados, capaces de unirse entre sí por medio de estreptavidina (87) , o bien proteínas de fusión (química o producto de

manipulación genética) que contengan los dos sitios de unión requeridos (83) . Una extensión de este método se basa en la presencia de proteasas en ciertos tejidos. En este caso se utiliza una molé- cula bifuncional que ligue el virus a un componente de la membrana celular cercano al receptor natural, pero que le impi- da unirse a él, a menos que en la superficie del tejido haya una proteasa capaz de romper la molécula bloqueante y dejar el ligando viral libre para unirse al receptor (88) . El segundo tipo de direccionamiento se consigue acompañando el transgén de elementos que le impidan expresar- se en las células no deseadas. Se han usado para este fin dos tipos de elementos genéticos de control: promotores y regio- nes de control de locus (LCR) (89) . Un ejemplo de los primeros lo constituye el promotor del gen de la alfa-fetoproteína, que no se expresa en el tejido adulto, pero sí en muchos tipos de tumores, lo que hace de este promotor un elemento idóneo para dirigir la expresión del transgén en la terapia génica tumoral de suicidio. En lugar de usar un promotor específico de tejido, puede conseguirse un efecto análogo mediante modifica- ción de los promotores propios del vector. Así, Vile y colaboradores (90) sustituyeron las secuencias promotor-inten-

11

Nuevos sistemas virales en terapia génica

sificador propias del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV) por secuencias de acción análoga corres- pondientes al gen de la tirosinasa, consiguiendo que el transgén transducido mediante el vector modificado (el gen de la interleuquina 2) se expresase preferentemente en células de melanoma, respecto a su expresión en célu- las normales. En un enfoque análogo se ha reemplazado la misma zona del Mo-MLV con un intensificador autorre- gulativo del gen del factor de transcripción específico de células eritroides GATA-1, consiguiéndose este tipo de especificidad de expresión (91) . En cuanto a las LCR, se trata de regiones que suelen estar situadas distantes al gen que controlan, pero su presencia determina que la expresión de éste sea independiente de su localización en el genoma, y proporcional al número de copias translucidas. Las LCR confieren, además, especificidad de tejido, que es lo más relevante en cuanto al contexto que nos ocupa. La LCR más conocida y primeramente estudiada (92) es la que corresponde al gen de la ß-globina que, con- secuentemente, ha sido incluida en vectores retrovirales y adenoasociados, consiguiéndose expresión específica en teji- do eritroide (89) . Ambos tipos de direccionamiento, transduccional y transcripcional, pueden, por supuesto, ser combinados, como demostraron Reynolds y colaboradores (93) usando un vector adenoviral que fue dirigido por medio de un anticuerpo mono- clonal a un marcador de superficie exclusivo de células endoteliales pulmonares. En este caso, el gen testigo usado (el correspondiente a la luciferasa) fue dotado del promotor del gen fit-1, que codifica un receptor específico de células endoteliales. Este doble direccionamiento consiguió una expresión del gen esencialmente nula en el hígado, que es el órgano en que usualmente los vectores adenovirales quedan secuestrados.

SISTEMAS VIRALES MIXTOS Cada grupo de virus presenta, a la hora de diseñar vectores, características diferentes que pueden ser ventajosas o desventajosas respecto al tipo de terapia génica deseada (13) . En un intento de optimización, se han abordado repetida- mente el diseño de sistemas de vectores que combinan aspectos ventajosos de dos grupos de virus, habiéndose llega- do, como enseguida veremos, a la incorporación de elementos virales en vectores no basados en virus. Un sistema híbrido es el citado anteriormente para evitar, en el proceso de producción de vectores adenoasociados, la citotoxicidad debida a la proteína rep (52) . Sin embargo, el sistema mixto desarrollado primeramente (94) , utilizó vectores adenovirales para transducir, in vivo, los elementos constitutivos de un empaquetamiento retroviral transitorio (Fig. 3):

un adenovirus recombinante aportaba en su genoma los genes gag, pol y env retrovirales. Otro adenovirus recombinan- te transducía, del mismo modo, el conjunto de LTRs, zona de empaquetamiento y transgén característicos del vector retro- viral genómico (Fig. 9). Cuando ambos adenovirus infectaban simultáneamente in vivo una célula, ésta se constituía en empaquetadora de retrovirus recombinantes capaces de transducir las células contiguas. Este doble sistema reúne las ven- tajas de la estabilidad integrativa propia de los retrovirus con la alta capacidad de transducción de los adenovirus (mucho más eficiente, desde luego, que la transfección con ADN desnudo utilizada en los sistemas clásicos de empaquetamien- to de vectores retrovirales). El papel que juegan en este sistema mixto los adenovirus puede ser desempeñado, sin embar- go, por otros tipos de vectores, como Vaccinia (95) , alfavirus (96) o herpes (97) . Aparte de los sistemas referidos, en los que el vector final es un retrovirus, otros sistemas híbridos combinan adeno- virus y adenoasociados (98, 99) , o éstos o baculovirus (100, 101) . El diseño de sistemas compuestos o híbridos no se ha limitado al uso conjunto de componentes de diferentes grupos de virus, sino que ha aplicado las posibilidades de direccionamiento de vectores propias de los virus al suministro de genes mediante vectores de naturaleza artificial. De esta manera, se ha añadido a liposomas catiónicos componentes de la envuelta del paramixovirus hemaglutinante del Japón, también llamado virus Sendai, para formar los que han sido denominados virosomas (102) , que al dirigir al liposoma directamente al citoplasma, evitando la endocitosis, impide la destrucción del ADN a su entrada en los lisosomas. Otros sistemas análogos han usado componentes del virus Influen- za, la proteína G del virus de la estomatitis vesicular e incluso con componentes de la envuelta del VIH, o del virus de la hepatitis B (102, 103) .

12

VIROLOGÍA, Volumen 10, Número 1/2004

P Transgén gag-pol env LTR LTR ψ ITR ITR ITR ITR Proteínas retrovirales U5Ψ Transgén
P
Transgén
gag-pol env
LTR
LTR
ψ
ITR
ITR
ITR
ITR
Proteínas
retrovirales
U5Ψ Transgén U3
Retrovirus
recombinante
RNA retroviral

Figura 9. Sistema viral mixto Adenovirus- Retrovirus. Dos vectores adenovirales diferentes, uno de ellos conteniendo el transgén en una construcción análoga a un vector retroviral genómico, y el otro los genes estructurales de un retrovirus bajo el control de un promotor, se usan para infectar simultáneamente, in vivo un conjunto de células, en las que transitoriamente se expresan tanto los genes estructurales, dando proteínas retrovirales, como el ARN retroviral con el transgén. Todos estos productos interactúan para dar lugar a retrovirus recombinantes que emergen de las células doblemente infectadas para transducir las células vecinas.

CONCLUSIONES Desde la última revisión aparecida en estas páginas, hace ya siete años, la evolución de la virología aplicada a la trans- génesis clínica, es decir, a la terapia génica, ha experimentado, lógicamente, una profunda evolución debida al progre- so en el conocimiento de la biología de los diferentes virus. El cambio ha afectado principalmente al aspecto técnico de la vectorología viral pero, aunque en menor medida, también al aspecto conceptual, lo que se refleja, por ejemplo, en el desarrollo de vectores adenovirales oncolíticos, o en el regreso al estudio y desarrollo de vectores virales capaces de replicación, cualidad que había sido precisamente considerada como la principal característica que era preciso abolir antes de que el uso de un vector viral fuese aceptable en aplicaciones clínicas de la terapia génica.

AGRADECIMIENTOS Los autores desean mostrar su agradecimiento a la Fundación Ramón Areces por la ayuda institucional concedida al Centro de Biología Molecular «Severo Ochoa».

BIBLIOGRAFÍA

1. Milller JH. Introduction: Development and uses of gene transfer vectors. En: Gene transfer vectors for mammalian cells. Miller JH y Calos MP (eds). Cold Spring Harbor Laboratory. N.Y. 1987.

2. Westfal H. Transgenic animals and biotechnology. FASEB J 1989;3:117-120.

3. Friedman T. En: The development of human gene therapy. T. Friedman (ed). Cap. 1, pp. 120: The origins, evolution, and directiosn of human gene therapy. CSHL Press. Cold Spring Harbor. N.Y. 1999.

4. Dyer MR, Herrling PL. Progress and potential for gene-based medicines. Mol Ther 2000;1:213-224.

5. Gage FH. Cell therapy. Nature 1998;392(Suppl):18-24.

6. Pouton CW, Seymor LW. Key issues in non-viral gene delivery Adv Drug Delivery Rev 2001;46:187-203.

7. Ludo D, Saltzman WM. Synthetic DNA delivery systems. Nature Biotechnol 2000;18:33-37.

8. Schmidt GD, Schmidt-Wolf GH. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update. Trends Mol Med 2003;9:67-72.

9. Wiethoff CM, Middaugh CR. Barriers to non-viral gene delivery. J Pharmaceut Sci 2003;92:203-217.

10. Hamer DH, Leder P. Expression of the chromosomal mouse beta-maj-globin gene cloned in SV40. Cell 1979;21:35-40.

13

Nuevos sistemas virales en terapia génica

11.

Sarver N, Grus P, Law M-F, Khoury G, Howley PM. Bovine papilloma virus DNA: a novel eukaryotic cloning vector. Mol Cell Biol 1981;1:486-496.

12.

Shimotohno K, Temin HM. Formation of infectious progeny virus after insertion or Herpes simplex thymidine kinase gene into DNA of an avian retrovirus. Cell 1981;26:67-78.

13.

Talavera A, Martín F, Sánchez H. Los virus en la terapia génica. Publicación Oficial de la Sociedad Española de Virología 1996;4:3-15.

14.

Talavera A, Liras A, Fuentes L, Sánchez H. El VIH y otros retrovirus complejos en la terapia génica de células en reposo. Virología 2000;7:2-15.

15.

Zennou V y cols. HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 2000;101:173-185.

16.

Fuentes L, Sánchez H. La importación al núcleo del genoma del VIH-1 está mediada por una solapa central de ADN. Comentario a (15). Virología

 

1999;8:37-38.

17.

Whitwam T y cols. Identification of a central DNA flap in feline immunodeficiency virus. J Virol 2001;75:94017-9414??.

18.

Talavera A. Identificación de una solapa central de ADN en el virus de la inmunodeficiencia felina. Comentario a (17). Virología 2002;9:84-86.

19.

Park F, Kay MA. Modified HIV-1 based lentiviral vectors have an effect on viral transduction efficiency and gene expression in vitro and in vivo. Mol Ther 2001;4:164-173.

20.

De Felipe P. La modificación de vectores lentivirales basados en el VIH-1 afecta a la eficiencia de transducción viral y a la expresión génica in vitro

e

in vivo. Comentario a (19). Virología 2002;9:35-37.

21.

Van den Driessche T y cols. Lentiviral vectors containing the human immunodeficiency virus type-1 central polypurine tract can efficiently trans- duce non-dividing hepatocytes and antigen-presenting cells in vivo. Bloood 2002;100:813-822.

22.

Bravo JJ, Talavera A. Los vectores lentivirales que incluyen el tracto central de polipurina del virus de la inmunodeficiencia humana tipo-1 trans- ducen eficientemente hepatocitos que no se encuentran en división, así como células presentadoras de antígeno in vivo. Comentario a (21). Viro- logía 2003. En prensa.

23.

Talavera A, Bueren JA. En: Virus patógenos. J.M. Almendral y L. Carrasco (eds). Cap. 28: Vectores virales en terapia génica: diseño, aplicaciones y perspectivas. Editorial Hélice, año??. En prensa.

24.

Andreadis S y cols. Large-scale processing of recombinant retroviruses for gene therapy. Biotechnol Progr 1999;15:1-11.

25.

Daly G, Chernajosvsky Y. Recent developments in retroviral-mediated gene transduction. Mol Ther 2000;2:423-434.

26.

Prasher DC y cols. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 1992;111:229-233.

27.

Green BJ, Rasko JEJ. Rapid screening for high-titer retroviral packaging cell lines using in situ fluorescence assay. Human Gene Ther 2002;13:1005-

 

1013.

28.

Persons DA y cols. An improved method for generating retroviral producer clones for vectors lacking a selectable marker gene. Blood Cells Mol Dis 1998;24:167-182.

29.

Graham FL, Van der Ebb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 1973;52:456-467.

30.

Naviaux RK y cols. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high titer recombinant retroviruses. J Virol 1996;70:5701-5705.

31.

Chen ST y cols. Generation of packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors of the G protein of vesicular stomatitis virus by using a modified tetracycline inducible system. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:10057-10062.

32.

Sepiegel M y cols. Pseudotype formation of Moloney murine leukemia virus with Sendal virus glycoprotein. F J Virol 1998;72:5296-5302.

33.

Li

Z y cols. Murine leukemia induced by retroviral gene marking. Science 2002;296:497-498.

34.

Cavazzana-Calvo M y cols. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 2000;288:669-672.

35.

Marshall E. Gene therapy a suspect in Leukemia-like disease. Science 2002;298:34-35.

36.

Check E. Second cancer case halts gene-therapy trials. Nature 2003;421:305.

37.

Kaiser J. RAC Hears a plea for resuming trial, despite cancer risk. Science 2003;299:991.

38.

Hardy S y cols. Construction of adenovirus vectors through Cre-Iox recombination. J Virol 1997;71:1842-1849.

39.

Sakhuja K y cols. Optimization of the generation and propagation of gutless adenoviral vectors. Hum Gene Ther 2003;14:243-254.

40.

Magee T y cols. Gene therapy of erectile dysfunction in the rat with penile neuronal nitric oxide synthase. Biol Reprod 2002;67:1033-1041.

41.

Reddy P y cols. Sustained human factor VIII expression in the hemophilia A mice following systemic delivery of a gutless adenoviral vector. Mol Ther 2002;5:63-73.

42.

Takahashi K y cols. Intraocular expression of endostatin reduces VEGF-induced retinal vascular permeability, neovascularization, and retinal detach- ment. FASEB J 2003;17:896-898.

43.

Bischoff JR y cols. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science 1996;274:373-376.

44.

Heisse C y cols. ONYX-015 an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents. Nat Med 1997;3:639-645.

14

VIROLOGÍA, Volumen 10, Número 1/2004

45. Nemunaitis J, O'Brien J. Head and neck cancer: gene therapy approaches. Part II: genes delivered. Expert Opin Biol Ther 2002;2:311-324.

46. Douglas JT y cols. Efficient oncolysis by a replicating adenovirus (ad) in vivo is critically dependent on tumor expression of primary ad receptors. Cancer Res 2001;61:813-817.

47. Hamid O y cols. Phase II trial of intravenous Cl-1042 in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2003;21:1398-1504.

48. Makower D y cols. Phase II clinical trial of intralesional administration of the oncolytic adenovirus onyx-015 in patients with hepathobiliary tumors with correlative p53 studies. Clin Cancer Res 2003;9:693-702.

49. Hecht JR y cols. A phase I/II trial of intratumoral endoscopic ultrasound injection of onyx-015 with intravenous gemcitabine in unresectable pan- creatic carcinoma. Clin Cancer Res 2003;9:555-561.

50. Grimm D, Kleinschmidt J. Progress in adeno-associated virus type 2 vector production: promises and prospects for clinical use. Hum Gene Ther

1999;10:2445-2450.

51. Grimm D y cols. Helper virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of serotypes 1 to 6. Mol Ther 2003;7:839-850.

52. Conway J y cols. High-titer recombinant adeno-associated virus production utilizing a recombinant herpes simplex virus type I vector expressing AAV-2 Rep and Cap. Gene Ther 1999;6:986-993.

53. Ding L y cols. In vitro packaging of and infectious recombinant adeno-associated virus 2. Gene Ther 1997;11:1167-1172.

54. Zhou X, Muzyczka N. In vitro packaging of adeno-associated virus DNA. J Virol 1998;72:3243-3247.

55. Sun L y cols. Overcoming adeno-associatedd virus vector size limitation through viral DNA heterodimerization. Nat Med 2000;6:599-602.

56. Duan D y cols. Expanding AAV packaging capacity with trans-splicing or overlapping vectors: a quantitative comparison. Mol Ther 2001;4:383-391.

57. Yan Z y cols. Trans-splicing vectors expand the utility of adeno-associated virus for gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:6716-6721.

58. Reich S y cols. Efficient trans-splicing in the retina expands the utility of adeno-associated virus as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther

2003;14:37-44.

59. Talavera A, Rodríguez JM. Vaccinia virus as an expression vector. En: Methods in Molecular Biology, vol 8; Practical molecular virology: Viral vec- tors for gene expression. M. Collins (ed). Cap. 20, pp. 219-233; 1991. Humana Press.

60. Fenner F. En: Fields Virology. Fields BN, Knipe DM, Howley PM (eds). 1996, pp. 2673-2700.

61. Zeh HJ, Bartlett DL. Development of a replication-selective, oncolytic poxvirus for the treatment of human cancers. Cancer Gene Ther 2002;9:1001-

1012.

62. Panicali D, Paoletti E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus in to the DNA of infection Vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci USA 1982;79:4927-4931.

63. Mackett M, Smith GL, Mos B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc Natl Acad Sci USA 1982;79:7415-7419.

64. Feng Y y cols. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane G protein-coupled receptor. Science 1996;272:872-877.

65. Kapuiah G y cols. Immunobiology of infection with recombinant Vaccinia virus encoding murine IL2. J Immunol 1991;147:4327-4332.

66. Talavera A, Rodríguez JM. Isolation and handling of recombinant Vaccinia viruses. En: Methods in Molecular Biology, vol. 8; Practical molecular virology: Viral vectors for gene expression. M. Collins (ed). Cap. 21, pp. 235-248; 1991. Humana Press.

67. Lee SS y cols. In-vivo gene therapy of murine tumors using recombinant Vaccinia virus encoding GM-CSF. Proc Am Assoc Cancer Res 1995;36:248.

68. Gnant MFX y cols. Sensitization of tumor necrosis factor alpha-resistant human melanoma by tumor-specified in vivo transfer of the gene encoding endothelial monocyte-activating polypeptide II using recombinant Vaccinia virus. Cancer Res 1999;59:4668-4674.

69. Mastrangelo MJ y cols. A pilot study demonstrating the feasibility of using intratumoral Vaccinia injections as a vector for gene transfer. Vaccine Res

1995;4:55-69.

70. Puhlmann M y cols. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinase-delected mutant. Cancer Gene Ther

2000;7:66-73.

71. Gnant MFX y cols. Systemic administration of a recombinant Vaccinia virus expressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with 5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongation of survival in mice. Cancer Res 1999;59:3396-3403.

72. Puhlmann M y cols. Thymidine kinase-delected Vaccinia virus expressing purine nucleoside phosphorylase as a vector for tumor-directedd gene therapy. Human Gene Ther 1999;10:649-657.

73. Paul S y cols. Redirectedd cellular cytotoxicity by infection of effector cells with a recombinant Vaccinia virus encoding a tumor-specific monoclo- nal antibody. Cancer Gene Ther 2000;7:615-623.

74. McCart JA y cols. Systemic cancer therapy with a tumor-selective Vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and Vaccinia growth factor genes. Cancer Res 2001;61:8751-8757.

75. Hu Y y cols. Yaba-like disease virus: an alternative replicating poxvirus vector for cancer gene therapy. J Virol 2001;75:10300-10308.

76. Rayner JO y cols. Alphavirus vectors and vaccination. Rev Med Virol 2002;12:279-296.

15

Nuevos sistemas virales en terapia génica

77. Leitner WW y cols. DNA and RNA-based vaccines: principles, progress and prospects. Vaccine 2000;18:765-777.

78. Paillard F. Cell-specific targeting with retroviral vectors. Human Gene Ther 1998;9:767-768.

79. Dranof G. Targeting gene therapy: a reality? Mol Ther 2000;1:117-118.

80. Baker AH. Targeting AAV vectors. Mol Ther 2003;7:433-434.

81. Peng K-W, Russell SJ. Viral vector targeting. Curr Op Biotech 1999;10:454-457.

82. Thalar S, Schnierle BS. A packaging cell line generating CD4-specific retroviral vectors for efficient gene transfer into primary human T-helper lymp- hocytes. Mol Ther 2001;4:273-279.

83. Wickham TJ. Targeting adenovirus. Gene Ther 2000;7:110-114.

84. Kranish VN y cols. Genetic targeting of adenovirus vectors. Mol Ther 2000;1:391-405.

85. Gollan TJ, Green MR. Redirecting retroviral tropism by insertion of short, non-disruptive peptide ligands into envelope. J Virol 2002;76:3558-3563.

86. Jiang A. Cell-type-specific gene transfer into human cells with retroviral vectors that display single-chain antibodies. J Virol 1998;72:10148-10156.

87. Russell SJ, Cosset F-L. Modifying the host range properties of retroviral vectors. J Gene Med 1999;1:300-311.

88. Nilson BHK y cols. Targeting of retroviral vectors through protease-substrate interactions. Gene Ther 1996;3:280-286.

89. Miller N, Whelan J. Progress in transcriptionally targeted and regulatable vectors for genetic therapy. Human Gene Ther 1997;8:803-815.

90. Vile RG y cols. Tissue-specific gene expression from Mo-MLV retroviral vectors with hybrid LTRs containing the murine tyrosinase enhancer-pro- moter. Virology 1995;214:307-313.

91. Grande A y cols. Transcriptional targeting of retroviral vectors to the erythroblastic progeny of transduced hematopoietic stem cells. Blood 1999;93:3276-

3285.

92. Grosveld F y cols. Position-independent, high-level expression of the human b-globin gene in transgenic mice. Cell 1987;51:975-985.

93. Reynolds PN y cols. Combined transductional and transcriptional targeting improves the specificity of transgene expression in vivo. Nature Bio- tech 2001;19:838-842.

94. Bilbao G y cols. Adenoviral/retroviral vector chimeras: a novel strategy to achieve high-efficiency stable transduction in vivo. FASEB J 1997;11:626-634.

95. Holzer GW y cols. Poxviral/retroviral chimeric vectors allow cytoplasmic production of transducing defective retroviral particles. Virology 1999;263:107-

114.

96. Garoff H, Li K-J. Recent advances in gene expression using alphavirus vectors. Curr Op Biotech 1998;9:464-469.

97. De Felipe P y cols. Integrating retroviral cassette extends gene delivery of HSV-1 expression vectors to dividing cells. Bio Techniques 2001;31:394-405.

98. Recchia A y cols. Site-specific integration mediated by a hybrid adenovirus/adeno-associated virus vector. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:2615-2620.

99. Shayakhmetov DM y cols. A high-capacity, capsid-modified hybrid adenovirus/adeno-associated virus vector for stable transduction of human hema- topoietic cells. J Virol 2002;76:1135-1143.

100.Palombo F y cols. Site-specific integration in mammalian cells mediated by a new hybrid baculovirus-adeno-associated virus vector. J Virol 1998;72:5025-

5034.

101.Sollerbrant K y cols. A novel method using baculovirus-mediated gene transfer for production of recombinant adeno-associated virus vectors. J Gen Virol 2001;82:2051-2060.

102.Kaneda Y. Virosomes: evolution of the liposome as a targeted drug delivery system. Adv Drug Delivery Rev 2000;43:197-205.

103.Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf GH. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an update. Trends Mol Med 2003;9:67-72.

16