Vet Clin Small Anim 37 (2007) 203-219

CLNICAS VETERINARIAS
MEDICINA DE PEQUEOS ANIMALES

Obtencin y manejo de muestras: cmo conseguir resultados exactos

James H. Meinkoth, DVM, PhD*, y Robin W. Allison, DVM, PhD
Department of Veterinary Pathobiology, Center for Veterinary Health Sciences, Oklahoma State University, 250 McElroy Hall, Stillwater, OK 74078, USA

as pruebas de laboratorio forman parte de la medicina de pequeos animales; se han convertido en una parte habitual de la exploracin de bienestar, la exploracin preoperatoria y los procesos diagnsticos, y valoran la eficacia de un tratamiento o la progresin de la enfermedad. A menudo, se asume que los resultados de las diferentes pruebas realizadas son exactos y que los resultados anmalos indican un cambio fisiolgico en el paciente. Por desgracia, esta idea no siempre es cierta. Los resultados poco exactos, por muchas causas, son parte inherente de las pruebas diagnsticas (aunque se puede minimizar una parte). Los resultados poco exactos son, habitualmente, peores que no disponer de resultados, ya que pueden llevar a un diagnstico errneo o conducir a una prueba innecesaria y a prdida de los recursos econmicos del cliente (o a la exposicin del paciente a riesgos innecesarios) en la bsqueda de la causa de una anomala que no existe. La exactitud de los resultados de las pruebas es extremadamente importante, y limitar la frecuencia de los resultados no vlidos es un objetivo que se debe cumplir. Aunque los resultados anmalos se sealan bajo el ttulo de error de laboratorio, hay muchas posibles fuentes de error a lo largo del proceso de la prueba. ste comienza con cmo obtener la muestra, contina con cmo manejarla hasta que se realiza la prueba y, finalmente, surge la mecnica de cmo se procesa la prueba (por un laboratorio externo o en la propia clnica). Si se utilizan los servicios de un laboratorio externo para procesar las muestras, es responsabilidad del laboratorio garantizar que los mtodos por los que se obtienen resultados con las muestras sean exactos. Si elige pruebas de laboratorio en su clnica, pasa a ser su responsabilidad. La gente tiende a creer en las cifras que surgen de los instrumentos de laboratorio (especialmente, de los instrumentos caros); sin embargo, por desgracia, esto no siempre es correcto. Cuando se intenta mantener un laboratorio en la clnica, supone un importante esfuerzo garantizar resultados exactos. Existen dos artculos en esta publicacin que describen los analizadores de qumica y hematolgicos actualmente disponibles por el clnico (artculo de Weiser et al) y el proceso del control de calidad para garantizar resultados exactos en estos analizadores (artculo de Weiser y Thrall) en caso de que decida manejar estas pruebas en su

*Autor para la correspondencia. Direccin electrnica: james.meinkoth@okstate.edu (J.H. Meinkoth).

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clnica. Cuanto mayor es la experiencia que se tiene con los resultados de laboratorio, ms probable es que se los cuestione, especialmente si no parecen coincidir con el contexto clnico del paciente que tiene enfrente (cuadro 1).

Cuadro 1. Concepto general Las pruebas de laboratorio siempre deben interpretarse en el contexto de lo que ya se sabe sobre el paciente (p. ej., queja, hallazgos en la exploracin fsica). Si los resultados de laboratorio no encuadran en este contexto, no es inadecuado un poco de escepticismo. La primera actuacin es, habitualmente, repetir la prueba de la que se duda con una nueva muestra.

Incluso si elige un laboratorio profesional, sigue siendo responsabilidad del clnico recoger las muestras adecuadas y garantizar que se manejan adecuadamente hasta que las recibe el laboratorio. A menudo, las muestras que llegan al laboratorio no tienen la calidad suficiente para originar resultados exactos. A veces, se identifican estas muestras y no se procesan hasta que se contacta con el clnico; muchas veces, sin embargo, incluso as se procesan y se generan resultados. Por desgracia, los resultados no vlidos cuestan tanto como los resultados validados, y esto puede ser una gran fuente de frustracin. Dado el precio elevado de muchas pruebas, hay que tener esto en cuenta. Un pequeo esfuerzo y cuidado en este punto puede eliminar gran parte la frustracin generada cuando los resultados obtenidos no pueden ser interpretados o no responden a las preguntas que provocara la recogida de la muestra. El objetivo de este artculo es comentar algunos de los problemas frecuentes (y cmo evitarlos) relacionados con la realizacin de las pruebas solicitadas con mayor frecuencia: recuentos de clulas sanguneas (CBC) en sangre completa, perfiles bioqumicos, pruebas de coagulacin y muestras citolgicas. El artculo presenta un comentario general sobre la obtencin y el manejo de la muestra, y algunas consideraciones sobre el manejo de las pruebas antes mencionadas.

CONCEPTOS GENERALES SOBRE LA OBTENCIN Y EL MANEJO DE LA MUESTRA SANGUNEA Obtencin de la muestra Lo ideal es que el paciente ayune 12 horas antes de realizar la extraccin de sangre, para evitar la lipemia srica (la lipemia supone un aspecto blanco lechoso del suero o del plasma, provocado por el aumento de las concentraciones de lpidos). La lipemia transitoria es normal tras la ingesta de comida grasa, pero la magnitud y la duracin varan. La lipemia en ayunas puede producirse en ciertas enfermedades sistmicas que afectan al metabolismo de los lpidos (p. ej., diabetes mellitus, pancreatitis, hipotiroidismo), y ser as inevitable. En estos casos, el laboratorio an podra originar resultados tiles reduciendo la lipemia con la ultracentrifugacin o la adicin de sustancias diseadas para eliminar la lipemia de la mues-

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tra (p. ej., LipoClear; StatSpin, Norwood, Massachusetts) [1]. El uso de sustancias que eliminar los lpidos puede producir artefactos si los analitos que se miden estn unidos a lipoprotenas y se separan de ellas [2]. Por el contrario, la lipemia pospandrial se resuelve mejor con la obtencin de una nueva muestra. A menudo, el animal es trado a la clnica sin ayunar debido a que la necesidad de obtener muestras para las pruebas de laboratorio no estaban previstas. Muchas veces, la muestra es satisfactoria segn la cantidad y el tipo de comida ingerida y el intervalo de tiempo transcurrido. Si se quiere obtener un perfil bioqumico, es preferible dejar que la muestra coagule, y centrifugarla entonces; de este modo se puede analizar el suero para garantizar que es claro y no lipmico (o hemolizado) antes de enviarlo al laboratorio. Si la muestra es lipmica, se debe informar al propietario de que su animal debe ayunar y volver ms tarde, o si el animal va a ser hospitalizado, se obtendr otra muestra ms tarde. La hemlisis es otra fuente habitual de artefacto. Se reconoce la hemlisis por una decoloracin roja del suero o del plasma, resultado de un filtrado de los componentes intracelulares procedentes de los eritrocitos lisados. La hemlisis de la muestra puede ser el resultado de un proceso patolgico del paciente (p. ej., anemia hemoltica intravascular), pero es ms frecuente que sea el resultado de la lisis in vitro de los glbulos rojos. La hemlisis puede conducir a artefactos en diferentes analitos y por diferentes mecanismos. Primero, la hemlisis puede aumentar la concentracin en suero de cualquier sustancia que est presente en concentraciones mayores en los eritrocitos que en el suero. Este tipo de artefacto no depende del analizador ni de la metodologa empleada, pero vara segn las especies e incluso la raza analizada. Un ejemplo clsico es el efecto de la hemlisis sobre el potasio srico. Los caballos tienen una concentracin de potasio ms alta dentro de los glbulos rojos, mientras que no es as en perros y gatos. As, la hemlisis puede inducir a una hipercalemia artefactal en muestras equinas, pero no en las muestras caninas o felinas. Se sabe que algunas razas de perros (p. ej., Akita, Shiba Inu) tienen un potasio eritrocitario alto, y as, puede aparecer el mismo artefacto que en las muestras equinas debido a una hemlisis importante. En segundo lugar, la hemoglobina libre liberada por los eritrocitos puede interferir con un analito si la metodologa empleada mide longitudes de onda a las cuales tambin absorbe de manera importante la hemoglobina. Por otro lado, las sustancias liberadas por los eritrocitos pueden interferir con las reacciones qumicas intermedias empleadas para determinar la concentracin del analito. Estas ltimas formas de interferencia son bastante variables segn el analizador y la metodologa. Como se coment previamente, la hemlisis es, con mayor frecuencia, el resultado de una lisis in vitro que sucede durante la obtencin de la muestra o el transporte de sta al tubo de sangre, o al laboratorio. Las buenas noticias son que la lisis in vitro puede evitarse empleando calibres de agujas ms grandes para obtener la muestra; as se evita demasiada presin negativa durante la venopuncin; rellenando los tubos de sangre con suavidad sin forzar la muestra en el tubo; protegiendo la muestra de temperaturas extremas, y minimizando el tiempo de transporte al laboratorio, o, para las muestras de perfil bioqumico, separando el suero o el plasma de los glbulos rojos antes del transporte al laboratorio. Ya que los efectos de la lipemia y la hemlisis dependen a menudo del analizador y del mtodo empleado, es difcil sugerir guas rpidas del efecto sobre un analito en particular. Los laboratorios profesionales pueden aportar informacin respecto al efecto de estos artefactos en determinadas pruebas para sus analizadores y metodologa. En general, los ana-

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lizadores de qumica seca resultan mucho menos afectados por la lipemia que los analizadores qumicos que emplean reactivos lquidos. Muchos instrumentos en la clnica emplean la qumica seca (vase el artculo de Weiser et al en esta publicacin) y ofrecen un buen resultado frente a una lipemia o hemlisis moderadas. Adems, la forma ms fiable de garantizar que un resultado no se ha visto afectado artificialmente es evitar la hemlisis o la lipemia cuando sea posible. La venopuncin debera ser limpia, con un mnimo de pesca alrededor de la vena. Es difcil obtener cantidades adecuadas de sangre en un tiempo razonable (frecuente en gatos y otros animales con venas pequeas), y la muestra puede coagularse antes de introducirse en los tubos. La existencia de pequeos cogulos en la muestra es ms un problema para los resultados hematolgicos (p. ej., recuento plaquetario) que para los resultados qumicos. Los tubos de muestra (tubos de sangre) deben rellenarse de forma adecuada. Generalmente, el grado de vaco en el tubo lo llena automticamente a un nivel adecuado, pero es una buena idea comprobar y asegurarse de que los tubos se rellenan con facilidad. Los tubos pueden no llenarse adecuadamente si la muestra ha comenzado a coagularse en la jeringa y tapona la aguja, o si se ha destapado el tubo y liberado el vaco. Muchos tubos tienen una lnea de llenado trazada a travs de la etiqueta para mostrar cunta sangre debe introducirse en el tubo. Hay que permitir a los tubos de vaco que se rellenen naturalmente, o extraer el tapn del tubo y la aguja, y suavemente rellenar el tubo directamente desde la jeringa. No se debe forzar la sangre a travs de la aguja con demasiada presin, porque puede producir hemlisis. Si se extrae el tapn del tubo, hay que asegurarse de que se coloca bien de nuevo en el tubo. Tambin parece sensato emplear una jeringa y una aguja que creen el vaco en el tubo, para evitar que el tapn se salga durante el proceso (fig. 1). Si se obtienen muestras de diferentes tubos, hay que rellenar los tubos anticoagulantes primero y los tubos de suero (coagulacin) al final.

Manejo de la muestra: tubos de obtencin de sangre Existen diferentes tubos disponibles en el mercado que pueden emplearse para recoger las muestras. La principal diferencia entre ellos es que contengan o no anticoagulante para evitar que la muestra se coagule, y si lo tienen, de qu anticoagulante se trata. La mayora son tubos de vaco con un tapn. El color del tapn suele indicar el tipo de anticoagulante aadido, y es bastante constante en los diferentes fabricantes, aunque existen ciertas diferencias. El siguiente apartado comenta los tubos de sangre empleados con mayor frecuencia y algunos factores que se deben tener en cuenta cuando se emplean. Tubos de coagulacin (tubos de suero, tubos de tapn rojo) Cuando se coloca la sangre en un tubo de suero, puede derivarse al laboratorio tal y como est o puede centrifugarse, recoger el suero y transferirlo a otro tubo para el transporte al laboratorio. Se recomienda separar el suero si el transporte es prolongado (al da siguiente o ms) para evitar cambios por artefacto en ciertos analitos, y lo que es an ms importante, evitar la hemlisis de la muestra. Esto se comenta posteriormente en el apartado de perfiles bioqumicos. Para recoger el suero, es importante dejar que la sangre repose durante 15 o 20 minutos (preferentemente, a 37 C en un bloque de calor o bao de agua calentada) antes de la centrifugacin. Esto permite tiempo suficiente para que el cogulo se forme y

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Fig. 1. Muestra remitida para CBC. Se extrajo el tapn para rellenar el tubo y no se volvi a colocar adecuadamente hasta que se envi la muestra. (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

se retraiga bien. Si se centrifuga la muestra antes de la retraccin adecuada del cogulo, se puede formar un cogulo de fibrina en el suero, originando un gel en vez de suero lquido. En este momento, es difcil conseguir suficiente suero, y siempre se tendr que obtener una nueva muestra. Algunos tubos de tapn rojo contienen un activador de la coagulacin para acelerar el proceso de coagulacin y reducir el tiempo necesario para procesar la muestra. El suero es la muestra estndar para los perfiles bioqumicos, aunque tambin puede emplearse para ttulos serolgicos, electroforesis de protenas sricas y algunas pruebas endocrinas, entre otras. Los tubos de tapn rojo se emplean a veces para muestras de cultivos. En estos casos, es importante observar que algunos tubos de tapn rojo tienen un interior estril, aunque otros no.

Tubos de cido etilendiaminotetraactico (tubos de tapn morado) El cido etilendiaminotetraactico (EDTA) es un anticoagulante que acta uniendo calcio (y otros cationes divalentes), lo que requiere muchas de las reacciones enzimticas de la cascada de la coagulacin. La mayora de los anticoagulantes, excepto la heparina, funcionan de este modo. El EDTA es el anticoagulante de eleccin para la mayora de la hematologa ordinaria. Adems de sus efectos anticoagulantes, el EDTA ayuda a conservar la morfologa celular (ideal para los frotis sanguneos) e inhibe la proliferacin bacteriana. Por ello, el EDTA

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debera emplearse cuando se requiere un anlisis citolgico de la muestra. Adems de los CBC, ejemplos frecuentes son la valoracin de los derrames pleurales, pericrdicos o peritoneales. El plasma de las muestras con EDTA puede emplearse para ciertos parmetros bioqumicos, como el nitrgeno de urea sanguneo (BUN), la glucosa y las protenas totales. Aunque se prefieren las muestras sricas o heparinizadas para perfiles bioqumicos completos, muchas pruebas de rpida valoracin bsicas pueden realizarse en plasma EDTA en pacientes en los que la obtencin de grandes volmenes de sangre es difcil (p. ej., gatos pequeos). Esto puede ser suficiente para un examen prequirrgico en un paciente sano joven. Obviamente, el plasma de las muestras anticoaguladas con el EDTA no puede emplearse para medir la concentracin de calcio (Ca++) srico. Adems, la concentracin de potasio (K+) no puede medirse con exactitud, ya que el EDTA en los tubos con anticoagulante est en forma de sal de potasio (K2-EDTA o K3-EDTA). La concentracin de potasio est muy aumentada si se compueba la muestra con EDTA (p. ej., a veces > 20 mEq/l) [3]. El EDTA tambin puede interferir con las actividades enzimticas, provocando resultados falsamente disminuidos para la fosfatasa alcalina, la lipasa y la creatina cinasa [3]. Por tanto, el EDTA no es adecuado en estas pruebas. A diferencia de Ca++ y K+, los efectos sobre los ensayos enzimticos parecen depender del analizador y de la metodologa empleada [3].

Tubos de heparina (tubos de tapn verde) La heparina es otro anticoagulante, y es el nico anticoagulante comn que no funciona quelando el calcio. La heparina potencia la actividad de la antitrombina, un anticoagulante natural que se encuentra en la sangre. La antitrombina se une e inactiva no slo a la trombina (factor II) sino tambin a la mayora de los factores enzimticos de la coagulacin. La heparina no quela el calcio, y no interfiere con el calcio ni con las enzimas que requieren cationes divalentes. As, el plasma heparinizado puede emplearse para un perfil bioqumico completo. Aunque el plasma heparinizado y el suero producen resultados parecidos en la mayora de analitos, en un perfil bioqumico ordinario se observan algunas diferencias, como el aumento de albmina y la disminucin del potasio y del calcio ionizados [3]. La principal ventaja de emplear plasma heparinizado en vez de suero es que la sangre obtenida en el tubo de tapn rojo debe reposar aproximadamente 20 minutos para garantizar la formacin del cogulo, mientras que el plasma heparinizado puede ser centrifugado inmediatamente y extrado el plasma, permitiendo un proceso ms rpido. Existen varias sales de heparina (p. ej., heparina sdica, heparina de litio) que se emplean comercialmente en los tubos de sangre. Se prefiere la heparina de litio para la mayora de indicaciones, ya que no altera la concentracin de los electrlitos que se valoran normalmente. Aunque el EDTA se emplea tpicamente para los CBC, ya que conserva mejor la morfologa celular, EDTA provoca hemlisis en las muestras sanguneas de algunas especies de pjaros y reptiles. En estos casos, las muestras sanguneas para los CBC se recogen con heparina. Tubos de citrato (tubos de tapn azul) El citrato es otro anticoagulante habitual que tambin acta mediante su unin al calcio. El citrato se emplea para la obtencin de muestras para pruebas de coagulacin ordinarias que se basan en la medicin del tiempo de formacin del cogulo, ya que sus efectos anticoagulantes

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son fcilmente reversibles cuando se aade calcio a la muestra [4]. Estas pruebas incluyen el tiempo de protrombina (PT), el tiempo parcial de tromboplastina (PTT), el tiempo de trombina (TT), y la determinacin cuantitativa de fibringeno. El plasma con citrato puede emplearse tambin en ensayos para las concentraciones de dmero-D, factores de coagulacin especficos (p. ej., la concentracin de factor VIII), o el factor de Von Willebrand. Cuando se obtiene sangre para cualquier prueba de coagulacin es importante realizar una venopuncin limpia, de forma que la sangre no se contamine con el factor tisular de los tejidos que rodean la vena. La contaminacin de las muestras con el factor tisular puede iniciar la coagulacin y acortar los tiempos de coagulacin. En comparacin con otros tubos, existe una cantidad relativamente mayor de anticoagulante en los tubos de citrato. Por ello, es fundamental que estos tubos se rellenen hasta un nivel adecuado. Debe existir una ratio de 9:1 de sangre respecto a citrato. Si estos tubos se rellenan menos de lo adecuado, existe un relativo exceso de anticoagulante en la muestra, lo que podra prolongar el PT y el PTT. Un fenmeno parecido aparece en animales con policitemia (eritrocitosis). Si un paciente tiene un hematocrito muy elevado, existe menos plasma para un determinado volumen de sangre total. Un menor volumen de plasma provoca de nuevo un exceso relativo de anticoagulante. Se observan ligeras prolongaciones de PT y PTT en animales con un hematocrito aumentado.

Tubos de tiempo de coagulacin o activacin de la coagulacin (tubos de tapn gris) ACT representa el tiempo de coagulacin activado, una prueba de coagulacin relativamente sencilla. Los tubos de ACT contienen tierra de diatomeas, que activa la cascada de coagulacin intrnseca. Al colocar sangre en un tubo de ACT y midiendo cunto tiempo tarda en coagular, se estn valorando los factores de las vas intrnseca y comn de la coagulacin. El tubo de ACT comprueba fundamentalmente los mismos factores que el PTT, pero puede realizarse en la clnica sin requerir instrumentos especializados. Como en cualquier prueba de coagulacin, es importante realizar una venopuncin limpia. El fabricante recomienda un mtodo de dos tubos empleando un sistema de tubo de vaco en el que los primeros 2 ml de sangre se guardan en un tubo que se descarta, y un segundo tubo se rellena entonces con 2 ml de sangre para la valoracin de ACT. El motivo de descartar los primeros 2 ml de sangre es eliminar cualquier sangre que se haya contaminado con factor tisular durante la venopuncin. Un estudio en gatos no encontr diferencias en el ACT empleando el sistema de un tubo (en el que la primera muestra de sangre se valora) respecto al sistema de dos tubos [5]. El sistema de un tubo es ms sencillo de realizar tcnicamente, especialmente en pacientes poco colaboradores o pacientes pequeos. Dado que el tubo de ACT inicia la va de coagulacin intrnseca, esta prueba debe llevarse a cabo inmediatamente tras la obtencin de la muestra sangunea. El tubo debe mantenerse a 37 C, colocndolo idealmente en un bloque de calor o en un bao de agua, aunque puede ser una alternativa mantenerlo bajo la axila del profesional. Tras la incubacin inicial de 45 a 60 segundos, el tubo se vuelca cada 10 segundos y se comprueba la formacin del cogulo. Un perro normal coagula en menos de 120 segundos [6]. Los gatos normales coagulan en menos de 165 segundos [5].

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Tubos de fluoruro de sodio (tubos de tapn gris) Estos tubos contienen fluoruro de sodio (NaF) y oxalato de potasio (Ox). El Ox es un anticoagulante que funciona quelando el calcio. El NaF es un producto qumico que inhibe muchas de las enzimas involucradas en la gluclisis, lo que paraliza el metabolismo de la glucosa por las clulas de la muestra de sangre. Las muestras sanguneas obtenidas en tubos de NaF se emplean para obtener una medicin exacta de la glucosa sangunea sin tener que separar el suero o el plasma de las clulas. Adems de inhibir el empleo de glucosa, el NaF inhibe la produccin de lactato. Por tanto, los tubos de NaF/Ox tambin se emplean cuando se busca una determinacin de lactato srico. La sangre obtenida en un tubo de fluoruro mantiene una concentracin de glucosa estable durante por lo menos 24 horas a temperatura ambiente, y 48 horas en el frigorfico [4]. El lactato mostr ser estable a temperatura ambiente en muestras felinas durante por lo menos 8 horas [7]. Los tubos de fluoruro son ms tiles para realizar una curva de glucosa en un paciente diabtico. Se pueden obtener varias muestras en un perodo de horas, y enviarlas entonces al laboratorio para las determinaciones de glucosa de una sola vez. Es importante fijarse en que aunque las concentraciones de glucosa permanecen estables en los tubos de NaF, las concentraciones de glucosa medidas en los tubos de fluoruro son artificialmente menores que las concentraciones medidas en el suero de muchas especies [7]. La obtencin de sangre en tubos de fluoruro origina una reduccin y lisis de los eritrocitos. El paso de lquido intraeritroctico a plasma origina una disminucin en el hematocrito y, consecuentemente, la dilucin de algunos analitos sricos, como la glucosa. En un estudio en gatos, las concentraciones de glucosa medidas en plasma con NaF/Ox fueron un 12% inferiores a las obtenidas en muestras sricas de animales normoglucmicos [7]. La magnitud de esta diferencia fue mayor en los animales hiperglucmicos, con una media del 14% inferior en el grupo de gatos diabticos [7]. Esta diferencia debe tenerse en cuenta cuando se emplean tubos de NaF/Ox. Las concentraciones de glucosa en muestras obtenidas del mismo paciente en varias veces no deberan emplearse para comparaciones, si se emplearon diferentes tipos de muestra para la glucosa. Manejo de la muestra: derivacin Es importante garantizar que el tubo est debidamente etiquetado. Generalmente, debe incluirse el nombre y apellidos del paciente, y el nombre de la clnica o del clnico. La fecha en que se obtuvo la muestra tambin debe registrarse, y la forma de derivacin en caso de que exista un retraso en la entrega al laboratorio. A menudo, se reciben en el laboratorio muestras etiquetadas slo con el nombre del paciente o incluso sin ninguna etiqueta, lo cual aumenta la posibilidad de confusin o de resultados mal informados. Si se separa el plasma anticoagulado de los glbulos rojos y se transfiere a un tubo de suero, el tipo de anticoagulante empleado debera marcarse para evitar artefactos inducidos por el anticoagulante en las bioqumicas del suero. Cuando la muestra de suero o de plasma se enva a un laboratorio exterior, es preferible centrifugar la muestra y extraer el suero o el plasma y colocarlo en un tubo limpio aparte, para evitar cambios artificiales. Para algunas pruebas, las muestras deben congelarse o enviarse en un bloque de hielo. Es mejor comprobar con el laboratorio las instrucciones especficas cuando se solicite un resultado que no se realiza de forma ordinaria.

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Se aconseja buena calidad en los frotis sanguneos para los CBC. Pueden producirse cambios celulares con el tiempo, incluso si se recogen en EDTA. Conseguir frotis sanguneos secados con aire fresco evita estos artefactos. Se comentan en un apartado posterior los CBC (vase el artculo de Allison y Meinkoth en esta publicacin). Si va a existir un retraso importante desde que se obtiene la muestra hasta que se deriva al laboratorio, el tubo de EDTA debe conservarse en el frigorfico (pero no congelarlo nunca). Los frotis sanguneos no deben conservarse en el frigorfico. La calidad de los frotis no fijados no cambia de forma importante durante das o semanas. Si se envan las muestras a travs de un servicio de correo, se debe garantizar un empaquetado correcto para garantizar que las muestras lleguen al laboratorio sin que se rompan. Los porta de cristal deben colocarse en contenedores de plstico rgido (fig. 2) o en espuma de poliestireno (fig. 3). Los guardaporta de cartn plano normal (fig. 4) no protegen adecuadamente los porta, y stos suelen llegar al laboratorio rotos, a menos que se hayan empaquetado en un contenedor rgido. De forma parecida, los tubos de sangre deben guardarse en un contenedor rgido, como una caja de cartn o de espuma de poliestireno.

Fig. 2. Los contenedores rgidos de porta de plstico pueden contener de cinco a seis porta y suponer una proteccin adecuada durante el envo.

La mayora de los servicios de correo tiene formas de empaquetado especficas para manejar muestras biolgicas, como la sangre animal. El empaquetado debe consistir en un receptculo principal a prueba de fuga (a menudo el tubo sanguneo), un segundo empaquetado a prueba de fuga, y un empaquetado externo rgido. Adems, las muestras de lquido deben rodearse con suficiente material absorbente para que absorba totalmente el contenido en caso de que suceda cualquier fuga o liberacin del lquido. La mayora de servicios de correo de ms de 24 horas tienen sobres de plstico claro marcado con muestra clnica o muestra biolgica que deben emplearse en vez de los sobres normales utilizados para material impreso. Es mejor contactar con el transportista en el caso de necesidades especficas.

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Fig. 3. Los contenedores de espuma de poliestireno suponen una proteccin adecuada para los porta o los tubos durante el envo, y pueden contener hasta 10 porta (2 porta pueden colocarse en cada hueco). Estos contenedores tambin son lo suficientemente grandes para guardar tubos de EDTA pequeos o de suero que contengan una muestra lquida.

Fig. 4. Los guardaporta de cartn finos no suponen una proteccin correcta durante el envo. Los porta suelen llegar rotos.

OBTENCIN DE MUESTRA Y MANEJO PARA PRUEBAS ESPECFICAS Recuentos completos de clulas sanguneas Cogulos y agregados plaquetarios Como se indic previamente, es fundamental evitar cogulos y agregados de plaquetas para obtener unos resultados de CBC exactos. Las agregaciones plaquetarias y los microcogulos pueden alterar de forma importante los resultados de los CBC. El artefacto ms habitual es un recuento plaquetario falsamente disminuido (que puede estar muy reducido). Cuando existe un recuento plaquetario bajo (especialmente en los gatos), el recuento plaquetario cuantitativo

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del analizador automtico debe compararse con cifras plaquetarias estimadas procedentes de un frotis sanguneo bien realizado, adems de una valoracin de la presencia de agregados plaquetarios (este proceso se describe en el artculo de Allison y Meinkoth en esta publicacin). Los microcogulos en la muestra pueden originar un recuento de glbulos rojos falsamente reducido, lo que disminuye el hematocrito (el hematocrito se calcula con el recuento de glbulos rojos y el volumen celular medio en la mayora de los analizadores automticos). Los cogulos mayores invalidan el recuento leucocitario, o peor an, bloquean el tubo de hematologa del analizador. Si se llevan a cabo recuentos celulares completos en la clnica con un analizador automtico, hay que comprobar siempre con cuidado la muestra, desplazando suavemente el tubo hacia atrs y hacia delante mientras se observa si hay presencia de cogulos, antes de introducir la muestra en el instrumento. Para evitar estos problemas, la muestra para recuento celular completo debe obtenerse con una venopuncin limpia, en un perodo de tiempo mnimo, el tubo de EDTA debe rellenarse primero si la sangre se ha obtenido para varios tubos mediante una jeringa en vez de con tubos de vaco directamente, y la mezcla debe mezclarse total pero suavemente con el anticoagulante justo despus de rellenar el tubo. Es fcil recomendar una venopuncin limpia, pero puede ser difcil o imposible de conseguir en pacientes no colaboradores o pequeos. Adems, puede ocurrir un importante agregado plaquetario en recuentos celulares felinos incluso con las mejores venopunciones. En un artculo, el 71% de los recuentos celulares felinos realizados empleando un contador de impedancia durante un ao tenan los recuentos plaquetarios reducidos, mientras se crea que slo el 3,1% de dichos animales era realmente trombocitopnico, segn la estimacin de los recuentos plaquetarios de los frotis sanguneos [8]. Dada la alta tasa de artefactos, la estimacin del recuento plaquetario con frotis sanguneo es una medida de control de calidad importante en las muestras felinas (vase el artculo de Allison y Meinkoth en esta publicacin). Si la sangre se tiene que obtener tanto para qumica clnica como para hematologa, pero el proceso de obtener la sangre suficiente nos lleva ms tiempo de lo esperado, puede ser beneficioso acabar la venopuncin cuando exista suficiente sangre tan slo para el recuento celular completo. El tubo de EDTA puede llenarse, y la muestra para bioqumica clnica se puede obtener de una venopuncin diferente. Finalmente, es importante una mezcla adecuada de la sangre con el anticoagulante. Los tubos de EDTA pueden contener EDTA lquido o EDTA en polvo esparcido sobre la superficie interior del tubo. La mezcla debe realizarse varias veces por inversin del tubo, o si se han obtenido pequeas cantidades, debe hacerse rodar el tubo de forma que la muestra recorra toda la superficie interior del tubo. Esto debe hacerse suavemente; nunca debe agitarse el tubo.

Tubos con llenado insuficiente El llenado inadecuado de los tubos de EDTA es un problema frecuente, especialmente cuando se obtiene sangre de perros pequeos o gatos. Los tubos disponibles en el mercado pueden variar de capacidad desde menos de 1 ml hasta 10 ml. Si se llena menos de lo adecuado un tubo, pueden provocar cambios artificiales en varios parmetros. Con los tubos de EDTA, existe cierto grado de artefacto en la dilucin. Adems, el EDTA es hipertnico y hace que el agua abandone los glbulos rojos, provocando una reduccin de las clulas. Esto puede originar una reduccin importante del volumen celular aglomerado aparente (PCV) si el tubo se rellena slo con una parte de la cantidad requerida. La reduccin celular provocada por el tubo poco lleno puede originar una disminucin de PCV en las concentraciones del hematocrito y en el volu-

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men corpuscular medio (MCV) junto con un incremento de la concentracin de hemoglobina corpuscular media (MCHC). La mayora de los laboratorios necesita que los tubos de EDTA se rellenen hasta el 50% por lo menos del volumen posible. Se han diseado microcontenedores para tan slo 0,25 ml (250 l) de toda la sangre disponible. stos se recomiendan si el tamao de la muestra es limitado, para evitar los artefactos previamente comentados. La tabla 1 muestra el efecto de varios grados de llenado insuficiente en un tubo de EDTA con sangre de un perro normal. Los efectos son an ms evidentes en un animal anmico.

Tabla 1 Efecto del infrallenado de un tubo de cido K3-etilendiaminotetraactico lquido sobre ciertos parmetrosa Volumen de la muestra (en un tubo de 4 ml) Parmetro Hct (%) RBC (3 106 clulas/l) Hgb (g/dl) MCV (fl) MCHC (g/dl) 4 ml 56,3 7,61 18,3 74 32,5 1 ml 52,8 7,30 17,8 72,3 33,7 0,5 ml 51,9 7,36 17,7 70,5 34,2 Cambio (en muestra de 0,5 ml) 7,8% 3,2% 3,2% 4,7% 5,2%

Hct: hematocrito; Hgb: hemoglobina; MCHC: concentracin de hemoglobina corpuscular media; MCV: volumen corpuscular medio; RBC: glbulos rojos. aLa muestra sangunea era de un perro donante con sangre clnicamente normal, y el anlisis se realiz en un analizador de hematologa automtico Cell-Dyn 3500 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). Obsrvese que la concentracin del hematocrito calculado est relativamente ms afectada que el recuento de RBC o la concentracin de Hgb, ya que la concentracin del Hct se afecta por la dilucin de la muestra en el EDTA y la reduccin de los RBC, debido a la hipertonicidad de la solucin de EDTA, mientras que el recuento RBC y la concentracin de Hgb se afectan slo por la dilucin de la muestra.

Artefacto por la antigedad de la muestra Si las muestras de hematologa se procesan en 1 o 2 horas tras su obtencin, no suele ser un problema el artefacto del procesado de una muestra retrasada. Pero si las muestras se envan con un correo nocturno, o an peor, por correo normal, pueden suceder importantes cambios durante este tiempo. Si las muestras no van a procesarse en una hora, los frotis sanguneos deben prepararse y el resto de la muestra debe mantenerse en el frigorfico. Los frotis sanguneos no fijados secados al aire deben enviarse sin teir al laboratorio, obtenindose una muestra con buena morfologa celular incluso si se retrasa el proceso. Los frotis sanguneos no deben mantenerse en el frigorfico. Si esto ocurriera, puede aparecer condensacin en los porta y provocar la lisis celular. Los artefactos relacionados con un procesado retrasado son especialmente llamativos en la valoracin cuantitativa del frotis sanguneo. Los leucocitos sufren un artefacto de la edad que, cuando es ligero, puede hacer difcil la evolucin de cambios txicos y desviaciones a la izquierda, pero cuando son pronunciados, puede imposibilitar la identificacin de leucocitos. El ritmo al que degeneran las clulas vara mucho, y parece depender del tipo de clulas exis-

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tentes, adems de la temperatura ambiente. Los blastocitos inmaduros de un animal con neoplasia hematopoytica pueden sufrir una importante degeneracin en tan slo 24 horas. La figura 5 muestra este efecto en un animal con un linfoma en estadio V. Este animal tena un recuento de clulas nucleadas total de 74.000 clulas/l. En los frotis realizados justo despus de la obtencin, se vean muchos linfoblastos grandes en cada campo. En frotis realizados cuando se recibi la muestra sangunea con EDTA (menos de 24 horas despus), existan neutrfilos y muchas clulas degeneradas, pero ya no se apreciaban clulas neoplsicas.

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Fig. 5. Los frotis sanguneos de un perro con linfoma en estadio V (recuento leucocitario = 74.000 clulas/l) muestran la importancia de enviar portas prefabricados junto con muestras de CBC (o muestras citolgicas fluidas). (A) Porta realizado por el clnico a la vez que se obtuvo la muestra. La mayora de los leucocitos son clulas linfoides grandes inmaduras. (B) Porta realizado cuando la misma muestra lleg al laboratorio mediante un correo del da siguiente (< 24 horas ms tarde). Se identifican neutrfilos, pero las clulas neoplsicas aparecen slo como ncleos de clulas rotas (flechas). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

Cabe destacar otro artefacto que aparece con el almacenamiento de sangre: ciertos hemoparsitos se disocian de los glbulos rojos. La figura 6 muestra frotis sanguneos realizados inmediatamente y 24 horas despus de la obtencin de sangre de un gato con una infeccin por Mycoplasma haemofelis (Hemobartonella felis). En los frotis inmediatos a la obtencin de la muestra, se pueden relacionar las clsicas cadenas y anillos de parsitos basoflicos con muchos de los eritrocitos. En los frotis realizados cuando la muestra de sangre con EDTA se recibi en el laboratorio, los parsitos no slo se haban desprendido de los eritrocitos sino que tambin haban cambiado su aspecto. Aunque pueden producirse muchos otros cambios morfolgicos, estos ejemplos muestran el beneficio de preparar frotis sanguneos en cuanto se obtiene la sangre. Mantener en el frigorfico la muestra sangunea con EDTA enlentece pero no evita estos cambios. Adems de los cambios morfolgicos, pueden aparecer cambios cuantitativos con el tiempo. Las plaquetas pueden agregarse, provocando un recuento plaquetario falsamente disminuido. Adems, los eritrocitos pueden hincharse mucho, aumentando el MCV y el hematocrito y disminuyendo la MCHC en 24 horas [9,10]. Los cambios en los leucocitos

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Fig. 6. Frotis sanguneos de un gato con una infeccin por Mycoplasma haemofelis que muestra el artefacto relacionado con el tiempo de almacenamiento de la muestra en algunos hemoparsitos. (A) Frotis sanguneos realizados inmediatamente despus de la obtencin de la muestra, que evidencian numerosos parsitos, incluyendo anillos (punta de flecha) y cadenas (flechas) asociadas con los eritrocitos. (B) Frotis sanguneo realizado de la misma muestra, cuando se recibi en el laboratorio en menos de 24 horas despus de haberse obtenido. No se evidencian parsitos en los eritrocitos. Se observan organismos extracelulares como agregados de material granular rosa (flechas). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

son ms variables, pero los leucocitos viejos pueden lisarse, originando recuentos leucocitarios bajos.

Perfiles bioqumicos Si el suero no se separa de las clulas del cogulo, pueden aparecer cambios artefactales con el tiempo. Uno de los ms habituales es que la concentracin de glucosa disminuye debido al empleo de la glucosa por parte de los eritrocitos y los leucocitos para obtener energa. La concentracin de glucosa disminuye aproximadamente un 10% por hora a temperatura ambiente si se deja el suero en contacto con las clulas sanguneas [4]. El Pi srico (fosfato inorgnico, fsforo) puede aumentar con el tiempo cuando las clulas metabolizan el ATP a ADP y Pi, siendo liberado el Pi formado al suero. Tambin pueden aparecer otros cambios, pero son ms variables. Otro problema importante relacionado con dejar en contacto el suero con las clulas sanguneas es que los eritrocitos se lisan, originando la hemlisis de la muestra. Dado que la mayora de los ensayos se basan en la absorbancia de la luz transmitida a travs de la muestra, la hemlisis puede interferir de forma importante con muchas pruebas, dependiendo del tipo de analizador y de la metodologa empleada. La hemlisis casi siempre se produce en muestras no separadas a tiempo, pero ocurre ms rpidamente cuando la temperatura ambiente es alta (p. ej., en las muestras enviadas en verano). La hemlisis tambin parece suceder ms rpidamente en algunos animales gravemente enfermos. En general, es mejor separar el suero nosotros mismos y transferirlo a otro tubo de tapn rojo si la muestra se va a enviar al laboratorio. No slo se ayuda a evitar la hemlisis asociada al transporte de la muestra sino que se puede valorar la lipemia de la muestra y la hemlisis previa en la obtencin de la muestra.

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Si se separa el suero de los glbulos rojos y se mantiene en el frigorfico, la mayora de los analitos de un perfil bioqumico ordinario se mantienen estables de 24 a 48 horas.

Prueba de coagulacin Dos recomendaciones relacionadas con el manejo de muestras para las pruebas de coagulacin son un llenado adecuado del tubo y, de nuevo, el procesamiento a tiempo de las muestras. Como se coment previamente, los tubos de citrato tienen un volumen relativamente grande de anticoagulante. Es importante que los tubos de citrato se rellenen hasta el volumen adecuado para evitar una prolongacin artificial de los resultados de la prueba. Los factores de coagulacin tambin son lbiles, y se degradan in vitro con el tiempo. Se recomienda con frecuencia que el plasma con citrato empleado para la prueba de coagulacin se mantenga fro, separado de los glbulos rojos, y que se estudie de 30 minutos a 4 horas tras la obtencin [11-13]. Si no se puede realizar el estudio en este tiempo, se debe congelar el plasma separado (nunca hay que congelar la sangre completa) y enviar al laboratorio en un paquete fro. Aunque estas recomendaciones son de sentido comn y son probablemente la forma ms segura de garantizar la calidad de la muestra de todas las especies, varios estudios de muestras humanas y caninas sugieren que la mayora de las muestras para PT y PTT pueden permanecer estables durante perodos mucho ms largos [14-17]. Los estudios en muestras caninas sugieren que se pueden obtener resultados vlidos de PT y PTT con plasma con citrato (separado de los glbulos rojos) almacenados menos de 48 horas si se mantiene en el frigorfico [14] o incluso a temperatura ambiente [15]. Muestras citolgicas Existe actualmente un autntico debate respecto a la obtencin y derivacin de muestras citolgicas. Otros comentarios ms detallados estn disponibles en la publicacin anterior de Clnicas Veterinarias de Norteamrica: Medicina de pequeos animales [18]. Sin embargo, pocos puntos merecen ser comentados. Los porta secados al aire para la valoracin citolgica ordinaria obtenidos con aspiracin con aguja fina o impresin de frotis se mantienen relativamente estables durante varios das sin ningn manejo especial. Los porta no deben fijarse con calor o alcohol antes de ser derivados al laboratorio. La principal recomendacin respecto al manejo de muestras es la proteccin de los porta durante el transporte, como se ha comentado previamente. Adems, es importante que las muestras no teidas (de cualquier tipo) se protejan de los gases de la formalina, lo que puede evitar una tincin adecuada y hacer que la valoracin de la muestra sea imposible. Por ello, los porta no teidos nunca deben guardarse en el mismo paquete que la muestra fijada con formalina, incluso cuando est dentro de supuestos contenedores de aire comprimido. Las muestras lquidas para citologa (peritoneal, pleural y pericrdicas) tienen una mayor tendencia a artefactarse que los porta obtenidos de lesiones tisulares slidas. Todos los lquidos previstos para el anlisis citlogico deben derivarse en EDTA y mantenerse en el frigorfico hasta que sean enviados. Muchas muestras lquidas derivadas en los tubos de suero son ininterpretables. La valoracin de muestras lquidas comprende la determinacin del recuento de clulas nucleadas, la concentracin proteica y el anlisis citolgico. Si la lesin es inflamantoria, los lquidos colocados en los tubos de suero pueden coagular, invalidando los recuentos celulares. Adems, sin conservantes, pueden aparecer importantes cambios morfolgicos en tan slo

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24 horas (dependiendo de varios factores, como el tipo de clulas existente o la temperatura ambiente). Incluso si las clulas no se han lisado abiertamente, la valoracin de las clulas para los criterios neoplsicos puede dificultarse por los artefactos debidos al envejecimiento de la muestra que pueden aparecer en las clulas existentes. Finalmente el EDTA puede ayudar a evitar el sobrecrecimiento bacteriano (patgenos o contaminantes) durante el transporte. Si se desea realizar un cultivo bacteriano, una parte de la muestra debe mantenerse en un tubo estril o medio de transporte, adems de la parte destinada a la citologa colocada en el tubo con EDTA. Incluso cuando las muestras se colocan con EDTA, las clulas se degeneran con el tiempo. Como con las muestras sanguneas, conseguir frotis desde el fluido en el momento de la obtencin es la mejor forma de conservar la morfologa celular. A diferencia de la sangre completa, la celularidad de las muestras de citologa puede ser extremadamente variable, y esto afecta a cmo realizar los porta. Las muestras que son turbias probablemente tienen una mayor celularidad. En este ejemplo, es adecuado realizar frotis directos (igual que con los frotis sanguneos), ya que la densidad celular debe ser suficiente para la valoracin. Si la muestra es relativamente clara, sin embargo, probablemente la celularidad de la muestra es baja, y es importante realizar algn mtodo para concentrar las clulas. Si se obtiene suficiente lquido, las preparaciones concentradas pueden conseguirse centrifugando una parte de la muestra a baja velocidad, trasvasando la mayora del sobrenadante, resuspendiendo el sedimento, y realizando entonces frotis directos con la suspensin obtenida (similar a la preparacin del sedimento urinario). Es importante obtener uno o dos frotis directos desde los que se pueda valorar la celularidad de la muestra. Los recuentos celulares obtenidos con analizadores hematolgicos automticos de muestras de derrames en cavidades corporales son a veces equvocos debido a las propiedades fsicas de la muestra, y siempre es importante comparar los recuentos celulares automticos con una valoracin de la celularidad a partir de un frotis directo. Los frotis directos y concentrados deberan derivarse al laboratorio sin teir, junto con el fluido en EDTA.

RESUMEN Los resultados de muchos estudios ordinarios de laboratorio proporcionan informacin diagnstica importante y son una parte importante del cuidado del paciente en muchas situaciones. Garantizar la precisin de estos resultados no slo es importante desde el punto de vista diagnstico, sino que puede evitar la frustracin tras el esfuerzo de obtener y derivar muestras que no producen resultados interpretables. Afortunadamente, la mayora de las fuentes habituales de artefactos son fcilmente evitables. Las recomendacionas ms importantes comentadas son la seleccin de los tubos adecuados en los que derivar la muestra, minimizar el tiempo de transporte, y realizar los pasos adecuados (mantener en fro, preparacin de frotis prefabricados, empaquetado adecuado) para minimizar los artefactos cuando un tiempo de transporte prolongado no es evitable. Finalmente, la valoracin de la calidad de la muestra (p. ej., comprobar los cogulos en las muestras con EDTA, valorar la hemlisis o lipemia en suero) puede ayudar a la obtencin de muestras extras mientras el paciente an est disponible. Bibliografa

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