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EL SISTEMA INMUNE

El sistema inmune es el responsable de que no nos enfermemos. Muchas veces, sin embargo, no gana el combate contra el agente agresor y necesita colaboración extra. Por ejemplo, en el caso de las infecciones por HIV se necesita administrar un agente antiviral para que el individuo no muera por la infección. A veces no se elimina el patógeno, como en la enfermedad de chagas, pero se puede controlar y evitar que se disemine. El sistema inmune es el responsable de que, a pesar de vivir en un ambiente plagado de agentes potencialmente patógenos, sólo en ocasiones desarrollemos procesos infecciosos evidentes desde el punto de vista médico. El sistema inmune reconoce como propio los componentes de nuestro organismo, porque se desencadenarían reacciones inmunológicas todo el tiempo. La vacunación permite que el sistema inmune adquiera experiencia en combatir un patógeno sin ocasionarle daños al individuo. Se logra entonces, en ese momento, un estado que se denomina inmunidad, sinónimo de la resistencia resultante entre las fuerzas que pone el agente agresor para enfermarnos y las fuerzas que ponemos nosotros para combatirlo. También es importante que no ataque al propio organismo.

AGENTE

AGRESOR

que no ataque al propio organismo. AGENTE AGRESOR REACCIÓN DEL HOSPEDADOR RESPUESTA INMUNE Inmunógeno:

REACCIÓN

DEL

HOSPEDADOR

organismo. AGENTE AGRESOR REACCIÓN DEL HOSPEDADOR RESPUESTA INMUNE Inmunógeno: cualquier sustancia que es

RESPUESTA

INMUNE

Inmunógeno: cualquier sustancia que es capaz de generar una respuesta inmune y reaccionar con los productos de esa respuesta.

TIPOS DE INMUNIDAD

NATURAL: Es la que se posee desde el nacimiento, influida por factores genéticos y raciales, la edad, factores hormonales y presencia de Ac naturales. (Por ejemplo:

isoaglutininasAc naturales contra ciertas moléculas de los GR).

ADQUIRIDA: Puede ser:

Activa: el hombre genera sus propios anticuerpos. (Primero se enferma y luego

se cura memoria). Puede ser espontánea como las infecciones, o artificial como las vacunas en las que se introducen Ag a propósito para generar Ac.

por

amamantamiento) o artificial (introducción de -globulinas que son Ac ya formados en otra especie, antitetánica). Adoptiva: artificial, se transfieren células y no Ac (transferencia de células inmunocompetentes).

Pasiva:

espontánea

(Ig

materna

que

atraviesan

placenta,

IgA

INMUNIDAD LOCAL: mediada por IgA secretora, muy abundante en mucosas.

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AGENTES POTENCIALMENTE PATÓGENOS

Las bacterias y los parásitos pueden ser intra o extracelulares, los virus tienen distinta forma de acción. Para cada uno de los patógenos el sistema inmune ha desarrollado mecanismos de defensa, cada mecanismo es distinto según de que patógeno se trate.

BARRERAS DE DEFENSA

Hay distintos tipos de mecanismos contra agentes agresores:

Barreras físicas (piel y mucosas). Contiene células que elaboran sustancias

microbicidas o bacteriostáticas y mediadores de la inflamación.

Mecanismos innatos o inespecíficos (fagocitos, complemento, células NK). Son los

primeros que actúan y de manera rápida, si no logran eliminar el agente actúan los mecanismos adaptativos.

Mecanismos adaptativos o específicos. Son más lentos porque los linfocitos

necesitan proliferar.

COMPONENTES DE LA RESPUESTA INNATA O INESPECÍFICA

Células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos)

Natural Killer (NK)

Mastocitos

Células dendríticas (Cd)

Células endoteliales

Sistemas moleculares: sistema complemento, fibrinolítico, de las quininas y de la

coagulación.

El complemento, en mecanismos innatos, se activa por la vía alterna y por la vía de las lectinas (vías independientes de Ac). El reconocimiento del agente extraño se hace a través de receptores que contienen los macrófagos, neutrófilos y NK en sus membranas que reconocen ciertos motivos particulares presentes en los patógenos llamados PAMPs (patrones moleculares asociados a patógenos). Los PAMPs no se encuentran en nuestras células. Cada tipo celular tiene distintos receptores. Hay receptores que reconocen residuos de manosa, lípidos, etc. Receptores Toll (TRL: Toll Like Receptors) reconocen distintas moléculas en los distintos patógenos, pueden reconocer DNA, lipopolisacáridos de las membranas bacterianas, etc. Una vez que los macrófagos reconocen al patógeno lo eliminan por fagocitosis, los neutrófilos también fagocitan o pueden liberar el contenido de sus granulaciones.

Los mecanismos innatos si no logran eliminar el agente agresor retardan la

diseminación de la infección convocando a las células de la respuesta adaptativa (LB y LT):

LB: diferenciación a plasmocito, producción de anticuerpos.

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LT: distintos perfiles fenotípicos permiten distintas funciones de acuerdo al marcador

molecular que tengan en su membrana.

CD4 + : Th1: activan macrófagos, activan y expanden CD8 + . Th2: colaboran con los LB. Tr: regulación de la respuesta inmune para que no sea excesiva. CD8 + : lisan células infectadas por virus (LT citotóxicos).

TH1 y TH2 se diferencian por las citoquinas que producen. TH1 actúan principalmente cuando el patógeno que ingresa es intracelular. TH2 actúan frente a patógenos extracelulares.

La presencia de IL-12 y citoquinas relacionadas promueve la diferenciación de los LTCD4+ en un perfil Th1,mientras que la presencia de IL-4 conduce a la diferenciación de los LTCD4+ en un perfilTh2.

¿Qué ocurre cuando se produce un foco infeccioso?

Las bacterias son reconocidas por los receptores de los macrófagos. Se activa el

complemento (C). El complemento es un sistema proteico de activación en cascada que tiene tres vías de activación:

Vía clásica: depende de que haya anticuerpos y se activa con complejos Ag-Ac.

Vía alterna

Vía de las lectinas

complejos Ag-Ac. ∑ Vía alterna ∑ Vía de las lectinas Actúa en los mecanismos innatos porque

Actúa en los mecanismos innatos porque no necesitan Ac.

Cuando el complemento se activa produce una serie de sustancias o de proteínas. Algunas van a tener la capacidad de opsonizar, son opsoninas que recubren al patógeno (que tiene receptores para ellas) y facilitan la fagocitosis por parte del macrófago. Otras moléculas del complemento como C 3a y C 5a anafilotoxinas y tienen la capacidad de atraer otras moléculas.

Cuando se genera el proceso de inflamación, las moléculas liberadas permiten que los neutrófilos que están circulando atraviesen los vasos, vayan al sitio de infección y comiencen su acción.

MECANISMOS ADAPTATIVOS O ESPECÍFICA

Las células que participan en los mecanismos adaptativos son los linfocitos B (LB) y linfocitos T (LT), también tienen receptores para reconocer patógenos. El receptor con el cual los LB reconocen patógenos es una inmunoglobulina (Ig) de membrana. Todas las Ig están formadas por dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas unidas por puentes disulfuro. La Ig está anclada en membrana, pero la porción transmembrana es muy cortita, entonces necesita de otras moléculas que le ayuden a transmitir las señales al interior de las células. El receptor T está constituido por dos cadenas. Se asocia en los LTCD4 + a la molécula CD4 y en los LTCD8 + a la molécula CD8. El LT necesita que el Ag le sea presentado por otra célula, esto quiere decir que el LT reconoce pequeños péptidos de un Ag que haya sido procesado previamente por otra célula.

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Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) son las encargadas de presentarle los péptidos a los LT. El CMH son moléculas de membrana que se expresan en todas las células, fueron descubiertas por primera vez en los leucocitos, por eso también se las llama HLA (antígeno leucocitario). Los MHC clase I están en todas las células del organismo, menos en los eritrocitos. Presentan péptidos a los LTCD8 + citotóxicos. Las células que las contienen participan en la presentación de todos los Ag que provengan del interior celular. Los MHC clase II están en algunas células, en particular en los LB, macrófagos y células dendríticas. Estas células se las llaman células presentadoras de antígenos (CPA) profesionales, porque son las únicas que pueden presentarle Ag a los LTh CD4 + . Presentan Ag que provengan del exterior celular, esto implica que los LB, macrófagos y células dendríticas tienen que haber captado esos Ag, degradado y presentado en membrana.

Una vez que el linfocito reconoce el Ag se activa y comienza a proliferar, esa proliferación se denomina expansión clonal, va a haber un montón de linfocitos que se originan a partir de uno que van a tener capacidad para reconocer al mismo Ag. En toda respuesta adaptativa hay una fase de reconocimiento, una fase de activación, luego una fase de proliferación y por último una diferenciación a célula efectora. Las células de la respuesta innata reconocen, se activan y ejercen su función, no necesitan proliferar como los linfocitos.

LT y LB se originan en la médula ósea. Una vez que salen de la médula ósea ya van a estar comprometidos a ser o T o B. El proceso de maduración de los LT se realiza en el timo y el de los LB ocurre enteramente en la médula ósea (en algunas otras especies animales los LB terminan de madurar en la bolsa de Fabricius).

En base al marcador molecular que expresen en su membrana los LT pueden ser de dos tipos:

CD4

LT helpers

LT helpers

LTh 1 (median la activación de los macrófagos y contrubuyen además a la activación y

LTh 1 (median la activación de los macrófagos y contrubuyen además a la activación y expansión de los LTCD8+ citotóxicos)

LT reguladores

LTh 2 (colaboran con los LB y permiten su correcta activación, expansión y diferenciación a plasmocitos productores de Ac. También participan en la inmunidad antiparasitaria en los tejidos periféricos al inducir la activación de los eosinófilos, basófilos y mastocitos.

CD8

LT citotóxicos

LT citotóxicos

Las poblaciones de los LB son responsables de producir los Ac naturales:

LB 1 : se encuentran en la cavidad peritoneal, producen IgM, se autorrenuevan. LB 2 : producen cinco tipos de Ac: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD . BZM: se encuentran en la zona marginal del bazo, se autorrenuevan, solamente producen IgM, actúan cuando hay un patógeno que ingresa por sangre.

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COMUNICACIÓN ENTRE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

La comunicación intracelular puede ser a través de:

CITOQUINAS: proteínas pequeñas, pueden tener efecto local (autócrino) o actuar sobre células más alejadas (parácrino). Se producen de novo cuando la célula se activa, tienen una vida media limitada y estimulan células que tienen receptores para ellas. Redundancia: varias citoquinas pueden tener el mismo efecto, por lo tanto si una falla otra la puede reemplazar. Las citoquinas van a recibir distinto nombre según la célula que las produzca. Los leucocitos producen citoquinas llamadas interleuquinas que regulan la proliferación y diferenciación celular.

QUEMOQUINAS: son proteínas pequeñas que participan en la conducción de los leucocitos (neutrófilos) a los sitios en los que se necesitan (de infección). Son agentes quimiotácticos. MOLÉCULAS DE ADHESIÓN: se expresan en la membrana, de forma constitutiva o por activación. Determinan la migración y salida del vaso sanguíneo de los neutrófilos.

- Selectinas: L-selectinas (leucocitos), P-selectinas (plaquetas), E-selectinas (células endoteliales).

- Integrinas.

- Moléculas de la superfamilia de las Igs.

- Sialomucinas.

- Cadherinas.

Una vez que los linfocitos reconocen al antígeno empiezan a proliferar, hay una “expansión clonal”: muchos linfocitos se originan a partir de uno y responden al mismo antígeno.

RECONOCI-

MIENTO

ACTIVA- PROLIFE- CIÓN RACIÓN
ACTIVA-
PROLIFE-
CIÓN
RACIÓN

DIFERENCIACIÓN A CÉLULA EFECTORA

Esto no ocurre en la respuesta innata, no necesitan proliferar. De los linfocitos que proliferan, algunos se mantienen como células de memoria: viven más tiempo y actúan cuando un antígeno ingresa por segunda vez, entonces se genera una respuesta más rápida y más eficaz. Entrada de Ag por primera vez respuesta primaria. Entrada de Ag por segunda vez respuestas secundarias mediada por linfocitos de memoria. Respuesta más rápida y eficaz. (Esto es lo que se busca con la vacunación).

ORIGEN DE LAS CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

Si bien las células del sistema inmune son muy diferentes y cumplen distintas funciones, todas tienen un origen común que va variando a lo largo del desarrollo del individuo.

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Cuando se forma el embrión, en los primeros días, las células son producidas por el saco vitelino. Después, el hígado y el bazo fetal, adquieren la función de producir células, hasta que se desarrolla la médula ósea y toma la posta en la producción de células hematopoyéticas. En el adulto la producción de células ocurre en la médula ósea del esternón, costillas, huesos largos, etc. La célula troncal hematopoyética es el progenitor común que va a dar origen a los distintos linajes celulares.

CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS

MACRÓFAGOS: se originan a partir de los monocitos circulantes y se diferencian a macrófagos cuando se establecen en los tejidos. Reciben distintos nombres de acuerdo al tejido en el que se encuentren:

-Hígadocélulas de Kupffer. -SNCcélulas de la microglía. -Huesoosteoclastos. Son células presentadoras de antígenos profesionales (APC). Tienen la capacidad de fagocitar agentes extraños que reconocen por sus receptores, procesarlos, degradarlos y presentarlos en MHC de clase II en la membrana. Producen citoquinas importantes en la respuesta inflamatoria. También producen IL-1, IL-6, TNF- que son citoquinas proinflamatorias. Producen también citoquinas antinflamatorias para regular la respuesta.

NEUTRÓFILOS: se originan en la médula ósea, necesitan entre 5 y 7 días para transformarse en maduros, no pueden volver a la circulación (recircular). Representan el 90% de los granulocitos. Ejercen su acción a través del reconocimiento de patógenos, fagocitosis y mecanismos citotóxicos (dependientes e independientes del oxígeno). Producen mediadores de la inflamación (prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos) y citoquinas (IL-1, IL-8, IL-10, IL-12, TNF- ). Sus granulaciones se tiñen con colorantes neutros. Neutrofilia es el aumento de neutrófilos en sangre, lo que es un indicio de inflamación.

CÉLULAS DENDRÍTICAS: nexo entre inmunidad adaptativa e inespecífica. Activan linfocitos T vírgenes. Son células presentadoras profesionales, contienen MHC de clase II. Tienen un aspecto estrellado. Reciben diferentes nombres de acuerdo al lugar donde se encuentran (piel Langerhans). Se encuentran en dos estadios:

-Inmaduros presentan una fagocitosis activa -Maduro luego de su maduración disminuye su actividad de fagocitosis pero aumenta la capacidad de presentación de Ag.

CÉLULAS NK: de origen linfoide, poseen receptores para IL-12, IL-2 y TNF- . Las células NK participan en la inmunidad antiviral. Presentan en la superficie celular moléculas de histocompatibilidad de clase I. Funciones:

- Cistólisis: a través de sus gránulos que contienen perforina y granzimas.

- Producción de IFN- , TNF- , GM-CSF e IL-3. Mecanismo de acción:

Anticuerpo dependiente (adaptativa): receptor para Fc

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Anticuerpo independiente (innata): MHC clase I: disminuye la expresión de MHC clase I en células infectadas por virus, así, las NK las detecta y las destruye.

CÉLULAS NKT: son LT. Reconocen Ag lipídicos presentados por las moléculas

CD1D.

LB1: cavidad peritonealIgMse autorrenuevanAc naturales.

LB2: producen Ac: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.

LBZM: zona marginal del bazo. Se autorrenuevan. Producen IgM. Actúan cuando el patógeno ingresa por sangre.

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ORGANOS LINFOIDES

La inmunidad innata es el primer mecanismo que se desencadena cuando ingresa un antígeno, y generalmente actúa de la misma manera ante una segunda entrada de ese mismo antígeno. Los mecanismos de inmunidad adaptativa están mediados por los LT y los LB. Los LB producen Ac y los LT producen citoquinas. Entonces, un animal frente a un antígeno genera tanto células específicas como moléculas. Las células serían los LT y las moléculas los Ac. Para un estudio más simple se dice que la inmunidad humoral es la que está mediada por Ac y la inmunidad celular es la que está mediada por LT, aunque están muy relacionadas una con otra. Las diferentes células del sistema inmune están comunicadas entre si por la liberación de citoquinas y moléculas de adhesión. Estas células se van a organizar en los órganos linfoides.

ORGANOS LINFOIDES

De acuerdo a su función se pueden clasificar en:

Órganos linfoides primarios o centrales que son los lugares donde se van a generar las células del sistema inmune. Estos órganos son: médula ósea, timo y bazo (en período fetal). Órganos linfoides secundarios o periféricos son el bazo, los ganglios linfáticos y todo tejido linfoide asociado a mucosas. En éstos se produce el encuentro entre los linfocitos y el antígeno.

Órganos primarios Se generan y maduran las células del sistema inmune LT y LB

Órganos secundarios Se encuentran los LT y los LB con los Ag, y donde tienen un microambiente adecuado para montar una respuesta inmune.

En el humano, los LB se agrupan y maduran en la MÉDULA ÓSEA. Todo el proceso de maduración de los LB se denomina ONTOGENIA B. Durante este proceso los LB van a ir expresando en su membrana diferentes moléculas, y van a ir ordenando los genes que codifican para el receptor B. En la médula ósea también sufren el proceso de TOLERANCIA CENTRAL: los LB que sean capaces de reconocer Ag propios van a ser eliminados (sus receptores reconocen Ag del propio organismo). Si algún linfocito B se escapa de este proceso, en el bazo se va a producir otro proceso que se denomina TOLERANCIA PERIFÉRICA que va a eliminar a los LB autorreactivos que se pueden haber escapado del primer punto de control.

Para los LT, en cambio, el sitio de maduración donde terminan de transformarse en linfocitos competentes es el TIMO. El timo es un órgano que está ubicado por detrás del esternón, es bilobulado y aumenta mucho de tamaño desde el nacimiento hasta la pubertad. Luego de la pubertad el timo comienza a involucionar. Se cree que esta involución se produce porque las células del timo carecen de ciertas enzimas del metabolismo de las hormonas esteroidales. Estas hormonas esteroidales que se generan en gran cantidad durante la adolescencia, son tóxicas para las células del timo. Sin

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embargo, los linfocitos que llegaron al timo alcanzan a ser suficientes para montar cualquier respuesta inmune a lo largo de toda la vida del individuo. El timo tiene un sitio entre la corteza y la médula en donde se va a producir un mecanismo de selección positiva y otro, luego de la médula, donde se va a producir la selección negativa. Esto va a permitir que salgan LT y que no reconozcan Ag propios. La maduración de los LT se denomina ONTOGENIA T, durante la cual los LT van a ir expresando distintas moléculas en su membrana. Estos serían los órganos primarios o centrales. Luego tenemos órganos secundarios o periféricos.

El BAZO está ubicado en la región abdominal, tiene una región que se denomina pulpa roja y es el lugar donde se eliminan los eritrocitos deteriorados. Tiene una zona de pulpa blanca donde predominan los linfocitos tanto T como B. El bazo es un órgano muy importante y es el primero que actúa cuando el Ag ingresa por vía sanguínea. En el bazo no hay circulación linfática, solamente sanguínea, y los linfocitos entran y salen por la misma vía.

Los GANGLIOS LINFÁTICOS están ubicados a lo largo de todo el organismo, cerca de los vasos sanguíneos más importantes del cuerpo, donde se forman las cadenas de ganglios linfáticos. Los ganglios tienen estructura ovoide y poseen también una zona cortical y una medular. Algunas zonas son específicas del los LT y otras son propias de los LB. En los ganglios es donde se produce el encuentro entre los LT y los LB, para que el LB se transforme luego en productor de anticuerpos. El ganglio es un órgano que tiene circulación linfática y sanguínea. Los linfocitos van a entrar al ganglio por vía sanguínea, los Ag van a provenir de distintas partes del cuerpo, por vía linfática entran al ganglio y se encuentran con los LT. Se le presentan los Ag a los LT, estos reconocen al Ag y comienzan a proliferar y van a poder contactarse con los LB. Los LB se van a diferenciar a plasmocitos y van a producir Ac.

Las mucosas son sitios muy importantes para el ingreso de Ag. Para controlar todos aquellos Ag que puedan ingresar hay TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A LAS MUCOSAS. Hay algunos tejidos asociados a la mucosa nasofaringea, a los ganglios mesentéricos, a todo el tracto gastrointestinal. Este tejido linfoide puede ser diferenciado en dos componentes: sitios inductores, donde se van a generar las células específicas, y los sitios efectores, que son donde van a ir a actuar esas células específicas. Para que un linfocito pueda ir a un determinado lugar necesita expresar un determinado receptor para quemoquinas.

DIFERENCIAS ENTRE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA

La inmunidad innata actúa desde el inicio del proceso infeccioso, mientras que la inmunidad adaptativa requiere varios días para generar sus mecanismo efectores. Difieren en las estrategias empleadas en el reconocimiento de microorganismos y sus productos. La inmunidad innata reconoce patrones moleculares asociados con patógenos (PAMPs) mediante receptores de reconocimiento de patrones (RRP), mientras que la inmunidad adaptativa reconoce epitopes antigénicos mediante receptores específicos distribuidos clonalmente en células B y T. La actividad de la inmunidad adaptativa conduce a la expansión de los clones reactivos y al desarrollo de la memoria inmuntaria, procesos que no se observan en la inmunidad innata.

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PIEL Y MUCOSAS: PRIMERA LÍNEA DE DEFENSA CONTRA LA AGRESIÓN

COMPONENTES DE LA INMUNIDAD INNATA

LA PIEL El ser humano posee entre 1,5 y 2 m 2 de piel. Está constituida por distintas capas, la más externa es la epidermis, la media es la dermis y la más profunda la hipodermis (tejido graso subcutáneo). En la epidermis se distinguen distintos tipos celulares

importantes para la inmunidad innata, entre ellos los queratinocitos. Los queratinocitos producen queratina la cual le da cierta dureza a la piel, la hace impermeable, la protege de los agentes físicos y químicos. Los queratinocitos se recambian constantemente cada 30 días y así se eliminan a los microorganismos que puedan haber quedado ahí, encima

de ellos.

Además de la función de barrera, los quertinocitos producen citoquinas y algunas quemoquinas. En algunos casos de dermatitis hay una excesiva actividad de los queratinocitos y los fenómenos que se observan se deben a esa gran cantidad de quemoquinas que producen. Otras células importantes presentes en la epidermis son las células de Langerhans, estas son células dendríticas que son muy importantes como células presentadoras de Ag, y son el nexo entre la inmunidad innata y la adaptativa. Tienen una gran capacidad endocítica, tienen muchos receptores para los distintos componentes de los agentes patógenos: para el lipopolisacarido bacteriano, flagelina, DNA y RNA viral, y también

tiene receptores para citoquinas: IL-1 y TNF- .

Si bien no son muy abundantes, las células de Langerhans tienen unas prolongaciones

muy largas que aumentan la extensión de la superficie que abarcan.

LAS MUCOSAS Tenemos 400 m 2 de mucosas. Tienen la característica de la continuidad epitelial, no solo se debe a las uniones que hay entre las células, sino a la unión que existe entre esas células y la matriz extracelular. Esa unión es fundamental para evitar el ingreso de microorganismos. Además de la continuidad epitelial, está la secreción de moco. Existen alrededor de 8 familias de mucinas diferentes. El moco se secreta de forma continua, se recambia muy rápidamente cada minuto. Tiene una permeabilidad selectiva, permite el pasaje de gases

y de nutrientes y evita el pasaje de los microorganismos con sus toxinas. Tiene

capacidad de adherirse a las células del epitelio de las mucosas, impidiendo la adherencia de microorganismos. Además producen muchas sustancias con actividad microbicida, por ejemplo la

lactoferrina tiene la capacidad de secuestrar el hierro, el cual es importante para el crecimiento de los microorganismos; la lisozima, que produce la alteración de la permeabilidad de las paredes de los microorganismos, lo mismo que las defensinas; las aglutininas que bloquean ciertos receptores de los microorganismos impidiendo que se unan a las células y de esa manera logren penetrarlas. Además de estas sustancias, muchos epitelios mucosales producen IgA secretora, que es un tipo particular de anticuerpo. También producen muchas citoquinas y quemoquinas.

El

espesor del moco es diferente en los distintos tipos de epitelios. Es mucho menor en

el

epitelio respiratorio (aprox. 2 m), en el epitelio digestivo es mucho mayor (aprox.

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100 m). El moco, junto con los microorganismos que pueden haber quedado adheridos se elimina en el tracto respiratorio a través de las cilias que poseen las células. En el tracto digestivo contribuyen los movimientos peristálticos. Otro mecanismo de defensa a nivel del tracto digestivo es la acidéz del jugo gástrico, que elimina cualquier microorganismo que pueda haber sido deglutido.

INFLAMACIÓN

Cuando todas estas primeras barreras de defensa son vencidas e ingresa un microorganismo, se produce entonces el fenómeno de INFLAMACIÓN. El objetivo de este fenómeno es facilitar el acceso de las células del sistema inmune al lugar de ingreso de un agente agresor. En la inflamación se van a producir cuatro signos característicos que son DOLOR, CALOR, RUBOR y TUMOR. Cuando se produce este fenómeno hay vasodilatación de los capilares y aumento del flujo sanguíneo, esto conduce al calor y al rubor. Cuando se produce esa vasodilatación sale líquido de los capilares y se produce el edema o tumor. Este edema puede generar compresión de los nervios y producir dolor. En la inflamación participan numerosos sistemas y también numerosas células. Dentro de los sistemas moleculares que van a participar es sumamente importante el sistema del complemento. El SISTEMA DEL COMPLEMENTO es un sistema de activación en cascada que va a generar distintos componentes, algunos de sus componentes participan en el proceso inflamatorio. Por ejemplo, C3a y C5a son anafilotoxinas, pueden inducir la liberación de gránulos de basófilos y mastocitos. C5a tiene actividad quimioatractante de neutrófilos. C3b tiene capacidad de opsonización (recubrimiento del patógeno con distintas moléculas para facilitar la fagocitosis). Luego está el SISTEMA DE LAS QUININAS, que va a producir bradiquinas en un sistema de activación en cascada, la cual participa en la alteración de la permeabilidad capilar. El SISTEMA FIBRINOLÍTICO y otros mediadores químicos, como las prostaglandinas, leucotrienos, óxido nítrico e histamina también participan en la respuesta inflamatoria. En la eliminación de NO participan dos enzimas, una constitutiva y una inducible, y el NO produce aumento de la permeabilidad capilar. La histamina también tiene el mismo efecto. Dentro de las CITOQUINAS son muy importantes TNF- , IL-1 e IL-6, las cuales estimulan el aumento de la temperatura corporal porque actúan a nivel del hipotálamo. Este aumento de la temperatura corporal reduce el crecimiento de los microorganismos

y favorece las reacciones inmunológicas.

Dentro de las QUEMOQUINAS la IL-8 es muy importante porque favorece el pasaje de los neutrófilos desde los vasos sanguíneos hasta los tejidos infectados (CXCL8 = IL-

8).

Dentro de los COMPONENTES CELULARES están:

- Las células de primera línea: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y células NK. Algunas de estas células van a producir liberación de sus gránulos, otras son fagocíticas (neutrófilos), otras van a destruir directamente a las células infectadas (células NK).

- Las células de segunda línea son células que además de fagocitar pueden presentar antígenos (macrófagos y células dendríticas).

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NEUTRÓFILOS Los neutrófilos destruyen los agentes patógenos por mecanismos dependientes del O 2 o independientes del O 2 . Además de fagocitar producen muchas citoquinas, de las cuales las más importantes son IL-12 y el TNF- . Luego de la fagocitosis pueden liberar el contenido de sus gránulos y causar daño tisular.

MACRÓFAGOS Otras células que son claves en el proceso de inflamación son los macrófagos. Estos además de tener receptores para reconocer a los patógenos, producen muchísimas citoquinas: citoquinas inflamatorias (IL-1, IL-6 y TNF- ) y citoquinas antinflamatorias (IL-10 y TGF- ) para controlar y regular y así evitar excesos.

REACCIÓN DE FASE AGUDA

A pocas horas de haberse iniciado el proceso infeccioso, sobre todo en los de naturaleza bacteriana, los macrófagos incrementan de menera notable la producción de IL-1, IL-6 y TNF- en respuesta a su estimulación por PAMPs, citoquinas o componentes del complemento. Estas tres citoquinas median un conjunto de actividades tendientes al desarrollo de un cuadro inflamatorio agudo local y sistémico, denominado reacción de fase aguda, que intenta resolver el proceso infeccioso con la eliminación de su agente causal. Las acciones inflamatorias locales mediadas por IL-1, IL-6 y TNF- se ejercen sobre las diferentes poblaciones celulares en el entorno inmediato del foco infeccioso. Las acciones inflamatorias sistémicas mediadas por IL-1, IL-6 y TNF- se ejercen a tres niveles diferentes:

A) A nivel hepático van a producir la síntesis de las proteínas de FASE AGUDA.

Estas proteínas tienen como función proteger al organismo de las acciones nocivas.

Otras tienen función estimuladora de algunas vías de eliminación de patógenos, por ejemplo, la proteína C reactiva, que estimula la activación del complemento. Las proteínas de fase aguda median mecanismos antimicrobianos poderosos, y por otra parte, protegen al huésped de las posibles acciones perjudiciales asociadas con el desarrollo de las reacciones inflamatorias.

B) A nivel del hipotálamo estas citoquinas producen el aumento de la temperatura

corporal (se conocen como pirógenos endógenos). El aumento de la temperatura

corporal también puede producirse por componentes bacterianos (pirógenos externos).

C) A nivel de la médula ósea aumentando la producción de pirógenos endógenos

(neutrofilia).

Todos estos mecanismos se generan para que vallan mayor cantidad de células al sitio de infección.

La reacción de fase aguda aumenta la resistencia del huésped, disminuye la lesión tisular y favorece la reparación y resolución de la lesión.

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La respuesta inflamatoria se acompaña por cambios en el flujo sanguíneo local y en la permeabilidad vascular, que producen los signos clásicos de la inflamación:

tumor, rubor, clor y dolor. Los cambios vasculares permiten, además, que leucocitos circulantes se extravasen a los sitios de infección, destruyan a los patógenos, limpien los restos celulares y comience el proceso de reparación tisular. El incremento de la permeabilidad vascular, producto de la contracción que sufren las células endoteliales de las vénulas poscapilares en respuesta a mediadores como la histamina, produce un escape del líquido del vaso al tejido subyacente. Esto provoca hemoconcentración, lo que enlentece el flujo sanguíneo y en consecuencia, los leucocitos, que normalmente circulan en la corriente central del flujo sanguíneo laminar, se marginan y pueden contactarse con el endotelio, facilitando su posterior extravasación. El proceso de extravasación leucocitaria involucra la acción coordinada de moléculas de adhesión y quimioatractantes. Las moléculas de adhesión constituyen un conjunto de moléculas presentes en la superficie celular que median las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Existen cinco familias de moléculas de adhesión:

-selectinas (L-selectinas, P-selectinas y E-selectinas de los leucocitos, plaquetas y endotelio respectivamente): reconocen carbohidratos sobre glucoproteínas de la superficie celular. -integrinas:cumplen un papel crítico en la extravasación leucocitaria. -moléculas de adhesión que por su estructura se incluyen dentro de la superfamilia de las Ig: su expresión puede ser constitutiva o inducible. Por ejemplo ICAM-1 y VCAM-1 se expresan enniveles muy bajos en la mayoria de los lechos vasculares. Su expresión es mucho mayor en el endotelio de vasos que irrigan tejidos infectados o inflamados por la acción de citoquinas inflamatorias producidas localmente. -cadherinas: son moléculas responsables de mantener la integridad estructural de los tejidos. Estas moléculas se expresan como dímeros y establecen interacciones con otros dímeros de cadherinas expresados en células vecinas (ejemplo cadherinas expresadas en las células de Langerhans que se unen a cadherinas de los queratinocitos, y cuando la célula dendrítica reconoce algún Ag deja de expresar estas cadherinas para poder dirigirse a los ganglos linfáticos y presentarle el Ag a un LT). -sialomucinas.

ADHESIÓN Y PASAJE DE LOS NEUTRÓFILOS AL SITIO DE INFECCIÓN

Los neutrófilos para pasar de los vasos sanguíneos hacia los tejidos siguen un proceso de cuatro etapas. Va a estar mediado por moléculas de adhesión que tienen tanto los neutrófilos como las células endoteliales. 1 o PASO: RODAMIENTO. Los neutrófilos van como rodando por las células endoteliales. Las principales moléculas que intervienen son las selectinas. En este caso la unión que se produce entre el neutrófilo y la célula endotelial es débil. Se unen y se separan. 2 o PASO: ADHERENCIA ESTABLE. En este caso intervienen las moléculas de adhesión integrinas.

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3 o PASO: DIAPÉDESIS. Consiste en el pasaje del neutrófilo entre dos células endoteliales. En este caso también intervienen las integrinas y otra molécula que es la CD31. Una vez que pasó el neutrófilo libera proteasas que van a degradar la membrana basal. 4 o PASO: MIGRACIÓN. Se produce gracias a un gradiente de quemoquinas. Una quemoquina importante en este caso es la IL-8.

En la inflamación había una vasodilatación capilar, una disminución del flujo sanguíneo, y al enlentecerse todo el flujo, los neutrófilos que estaban circulando por el torrente empiezan a bajar y a acercarse cada vez más a las células endoteliales y así iniciar el paso 1.

CÉLULAS NK

Las CÉLULAS NK actúan en la inmunidad mediata, destruyendo células infectadas por virus. Las células infectadas por virus expresan menor cantidad de moléculas de histocompatibilidad de clase I, y estas células NK detectan estas diferencias de producción. Las células NK tienen un receptor, el NKG2D, que reconocen los Mic a y Mic b, que pertenecen al CMH, y estas moléculas se expresan de forma constitutiva en intestino y aumentan mucho en condiciones de estrés. Cuando estas células NK se unen a estas moléculas se activan. En la infección por virus se producen unos mecanismos innatos con la producción del interferón de tipo I por parte de las células infectadas. Estos dos interferones INT- e INT- , inhiben la replicación viral, y además estimulan la actividad de las células NK. Todas las células tienen capacidad de producir interferones.

INMUNIDAD MEDIADA POR LINFOCITOS T

Un linfocito T que no haya impactado con un Ag se denomina virgen o naive. Los LT se originan en la médula ósea, terminan de madurar en el timo y cuando salen del timo son linfocitos vírgenes. Estos tienen en su membrana un receptor T y pueden tener una molécula CD4 o una molécula CD8. Los que tienen la molécula CD4 se llaman helpers y los que tienen la molécula CD8 se llaman citotóxicos. Los linfocitos que salen del timo van a parar a un ganglio y ahí se encuentran con una célula dendrítica que llegó desde un tejido periférico cargada con algún Ag. Esta célula dendrítica le va a mostrar al LT ese Ag. Si se trata de un LT CD4 + , se lo va a presentar en el contexto de la molécula de histocompatibilidad de clase II. Esto no es suficiente para que el linfocito se active, necesita una señal más que va a estar dada por una molécula co-estimulatoria, la CD28 y la CD80 y CD86 de la célula dendrítica. Con esas dos señales el linfocito se activa y empieza a proliferar. Se transforma así en efector. Los LT helpers pueden ser de dos tipos: LTh 1 y LTh 2 . Esta diferenciación se produce por acción de distintas citoquinas. Las que favorecen la diferenciación a LTh 1 son INF- y la IL-12; las que favorecen los LTh 2 es la IL-4. Los dos LTh se diferencian en las funciones y en el patrón de citoquinas que producen. Los LTh 1 median respuestas contra microorganismos intracelulares, van a favorecer la fagocitosis, van a estimular a los macrófagos. Los LTh 2 colaboran con los LB y ayudan a producir anticuerpos.

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Las citoquinas que producen uno u otro se inhiben mutuamente. El LTh 1 secreta

principalmente INF- , que activa neutrófilos, macrófagos, células NK y a su vez inhibe

la proliferación de LTh 2 .

Los LTh 2 producen IL-10, TGF- que inhiben a los LTh 1 . De todos modos siempre se generan los dos tipos de respuesta, pero va a predominar una u otra, de acuerdo a que los patógenos sean intracelulares o extracelulares.

Si bien los LT se diferencian en el ganglio, los LTh 1 van a dirigirse a tejidos periféricos

que es donde tienen que efectuar su función. Los LTh 2 se quedan en el ganglio, porque en el ganglio están los LB con los que van a colaborar. También se producen unos LT de memoria. Algunos van a ser LTm centrales (LTmc)

y otros LTm periféricos (LTmp). Estos linfocitos se diferencian en receptores que

tengan para quemoquinas. Esto le permite a los LTmc volver a un ganglio linfático para ver si encuentra algún Ag,

mientras que los LTmp no pueden volver. Estos son fenómenos de recirculación de los linfocitos que permiten a un linfocito que no encontró a su Ag en el ganglio, volver a salir y hacer todo el circuito sanguíneo.

Por otro lado están los LT citotóxicos CD8 + . Reconocen Ag presentados por moléculas del CMH de clase I y actúan cuando hay células infectadas por virus. El mecanismo de acción puede ser por liberación del contenido de sus gránulos que contienen la enzima perforina, o pueden actuar a través del sistema FADD + ligando induciendo la apoptosis de la célula infectada. Para activarse necesitan mayores señales que los LTh. Los LT CD8 + se van a activar en el ganglio y después van a ir a los tejidos donde van a ejercer su acción.

Para que un LT se active necesita que el Ag se lo presente una célula dendrítica, porque necesitan señales co-estimulatorias de mayor intensidad. Los linfocitos efectores no necesitan señales tan fuertes y se pueden activar por macrófagos.

Hay una población de LT que se denominan LT reguladores (LTr). Los LTr se conocían antes como LT supresores. Hay dos tipos de LTr, unos que se originan como tales en la médula ósea y en el timo (LTr naturales), y otros que se inducen ante la presencia de determinados Ag (LTr inducibles). Estos linfocitos varían en las moléculas que expresan en sus membranas.

Los LT reconocen péptidos pequeños y los reconocen en el contexto de las moléculas del CMH de clase I o II, los citotóxicos de clase I y los helpers de clase II.

 
  Th1

Th1

LT

CD4+

CD4+

Th2

CD8+

Tr

INMUNIDAD MEDIADA POR LINFOCITOS B

Hay tres clases de linfocitos B. Los LB1 son muy poco abundantes en sangre, pero son los mayoritarios en las cavidades peritoneal y pleural. Pueden proliferar sin necesidad de estar en contacto con el Ag. Producen Ac contra distintos componentes bacterianos,

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y el principal Ac que producen es de tipo IgM. Estos son los Ac naturales del

organismo. Estos LB reconocen un Ag bacteriano a través del receptor B que es una inmunoglobulina con otras moléculas asociadas. Este linfocito se transforma directamente en plasmocito y produce Ac IgM. Esos Ac se van a ir a fijar a la bacteria que tenía los Ag que le dieron origen.

son los primeros que actúan contra

antígenos que llegan por vía sanguínea. Estos linfocitos pueden proliferar sin la necesidad de la presencia de Ag y también producen Ac de tipo IgM. Es la principal defensa contra bacterias que ingresan por sangre.

Los LB de la zona marginal del bazo (LBZM),

La población mayoritaria de LB son los LB2. Constituyen el 90% de los linfocitos que están en sangre periférica y necesitan de la colaboración de los LTh 2 para producir Ac. Por ejemplo, el LB2 tiene capacidad de fagocitar y degradar agentes patógenos. El LB fagocita al virus, lo internaliza, lo degrada y presenta pedacitos de este virus en las moléculas del CMH de clase II. Así interactúa con un LTh 2 , el cual lo reconoce, no necesariamente por la misma región antigénica que reconoce el LB2, luego el LTh 2 produce citoquinas y con ellas el LB2 se transforma en un plasmocito productor de Ac.

FUNCIÓN EFECTORA DE LOS ANTICUERPOS

Los Ac están constituidos por dos cadenas H y dos cadenas L. Las cadenas H son centrales y las más pesadas, y las L son periféricas y las más livianas. Existen cinco clases de Ac: G, A, M, D y E. La Ig G se va a producir después de que los linfocitos sufren un proceso dentro del

ganglio linfático llamado HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA y SWITCH de Ig; les va a permitir cambiar de IgM, que es la primera Ig que se producirá, a IgG. Esto se produce

en lo que se llama centro germinativo.

Los Ac tienen una función que está dada por una porción que se llama Fab y es el sitio

de unión a los Ag. Aquí la porción que específicamente se une al Ag se llama paratope.

El paratope se va a unir a una parte en particular del Ag que se llama epitope. Estas regiones de las Ig son muy variables. Esta variabilidad les permite reconocer los

diferentes Ag.

El receptor que tiene el LB es una IgM.

Otra parte del Ac que tiene importantes funciones es el Fc (región constante). Está formada por las dos cadenas pesadas. Hay muchas células que tienen receptores para los fragmentos Fc, como los macrófagos. Si hay un microorganismo que está recubierto por Ac y este Ac por el Fc se une al macrófago, el macrófago lo va a fagocitar más fácilmente.

Porción Fab reconoce al Ag por una parte de la cadena H y una parte de la cadena

L.

Porción Fc indica qué se va a hacer con el Ag unido.

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Entre sus funciones se pueden mencionar:

Sirven para reconocer al Ag en estado nativo, como la Ig de superficie de los LB

(receptor antigénico), es decir, reconoce Ag sin procesar.

Pueden activar el complemento, neutralizar a los patógenos y opsonizarlos.

Sirven para participar de un mecanismo de citotoxicidad anticuerpo dependiente.

Participan en los procesos inflamatorios.

Son los que dan inmunidad a las mucosas (IgA).

Dan inmunidad prenatal y neonatal (Ig G, la única que puede atravesar placenta, e

IgA).

Los linfocitos T vírgenes van a ir a los órganos linfáticos secundarios a través de la sangre. Los Ag van a venir por la linfa hasta los ganglios linfáticos. Ahí se van a encontrar, se va a producir la presentación, la proliferación, la diferenciación y después los linfocitos van a poder volver a la sangre a través del conducto torácico, saliendo de los ganglios linfáticos. Los linfocitos T vírgenes se unen a las moléculas L-selectina del endotelio vascular. En los ganglios linfáticos, en el área paracortical, se expresan unas quemoquinas: CCL19 y la CCL21. Los linfocitos T vírgenes tienen un receptor que es el CCR virgen, el cual reconoce a estas quemoquinas y así los linfocitos vírgenes pueden dirigirse hacia el área paracortical.

Cuando se producen los fenómenos inflamatorios, las citoquinas que se liberan estimulan la producción de estas quemoquinas. Las células dendríticas que han captado algún Ag expresan también este receptor y pueden dirigirse hasta los ganglios. Por ello en ese lugar se va a producir el encuentro entre la célula dendrítica con el LT. El LT virgen reconoce al Ag o no. Si hay reconocimiento, el LT se activa y pasa hacia el folículo linfoideo. Si no lo reconoce el LT sale del ganglio y pasa a circulación. Esta recirculación del linfocito permite que no se acumule un exceso de células en el ganglio y además que tengan la posibilidad de encontrar otros Ag.

(Los linfocitos T cuando se activan van a poder generar linfocitos de memoria (LTm). Estos linfocitos pueden ser centrales y otros periféricos. Los LTm periféricos (LTmp) no van a poder expresar más el receptor, por lo que no van a poder volver al ganglio. En cambio los LTm centrales (LTmc) van a seguir expresando este receptor, pareciéndose más a los vírgenes y por eso van a poder volver al ganglio).

Algo parecido ocurre con los LB. Los LB tienen otras quemoquinas que participan en su migración. Los LB vírgenes que circulan por sangre van a salir por las células del endotelio alto de las vénulas del área paracortical del ganglio linfático. Las células endoteliales de estas vénulas expresan quemoquinas que no expresan las células endoteliales de otros vasos. Los LB reconocen a las quemoquinas CXCL13 que se encuentran en el folículo linfoideo y salen del vaso ( por el receptor CXCR5 que tienen en su membrana que reconoce a CXCL13).

Cuando el LB virgen encuentra un Ag, disminuye la expresión de estos receptores CXCR5 y comienza a producir una mayor cantidad de receptores CCR7 para poder acercarse a los lugares donde están los LTh . Allí se encuentran con los LTh que se han encontrado con el Ag, se produce la cooperación T-B, se forma el foco primario que es donde hay proliferación de LB, algunos van a transformarse en células plasmáticas y van a producir Ac del tipo IgM, y otros van a formar el centro germinal donde van a seguir proliferando, se va a producir el switch y los linfocitos del centro germinal van a empezar a producir IgG, y se van a transformar en linfocitos de memoria.

Los linfocitos que van a generarse en tejidos asociados a mucosas van a poder dirigirse a distintos lugares de acuerdo a los receptores de quemoquinas que tengan y del quemoquinas que se generan. Por ejemplo en LB que se generó en la médula ósea va a poder ir al tracto respiratorio, al urogenital, a las glándulas salivales, dependiendo de qué receptores para quemoquinas expresa y qué quemoquinas esta expresando el tejido. Todo esto se denomina TRÁFICO LINFOCITARIO, y los receptores que le permiten a los linfocitos hacer el viaje se denominan receptores de Homing.

Tráfico de linfocitos vírgenes Cada linfocito T o B vírgen debe poder llevar a cabo la tarea de encontrar y contactarse con su Ag específico, en el momento en que éste ingrese en el organismo, cualquiera sea la vía a través de la cual acceda. De no existir mecanismos especializados de migración, la probabilidad de que estos linfocitos encuentren a su Ag sería casi nula. Los linfocitos no ocupan posiciones estáticas, sino que recirculan según patrones de tráfico definidos, que incrementan marcadamente la probabilidad de encuentro con sus Ag específicos. Los linfocitos nativos, una vez maduros, pasan a la circulación sanguínea, para luego extravasarse en los organos linfáticos secundarios (OLS). Estos órganos incluyen, entre otros, ganglios linfáticos, bazo, placas de Peyer del intestino, amigdalas y adenoides. Si no encuentran a su Ag específico en estos órganos, los linfocitos retornan a la circulación sanguínea a través de los vasos linfáticos eferentes y el conducto torácico. En menos de media hora, volverán a extravasarse en un nuevo OLS, para recomenzar la búsqueda de su Ag específico. Esta ruta migratoria favorece el encuentro entre linfocitos y Ag, dado que, las células dendríticas capturan Ag en los tejidos periféricos y los transportan a los OLS drenantes para presentarlos a los LT. Del mismo modo, el drenaje lnfático, incrementado como consecuencia de la inflamación que acompaña a los procesos infecciosos, asegura el transporte de Ag al OLS drenante. Ello permite su reconocimieto por los LB específicos que se hayan extravasado en ese órgano. Ante señales coestimulatorias apropiadas, los LT y LB que encuentren a su Ag específico se activarán, sufrirán expansión clonal y después de unos días adquirirán funciones efectoras particulares y patrones de migración característicos. Así los LT que se diferencien a perfil LTh1 abandonan el OLS a través del linfático eferente y por el conducto torácico pasan a la circulación, para luego extravasarse en los tejidos periféricos inflamatorios. Los que se diferencian a LTh2 puden colaborar con los LB, una vez que estos han reconocido ya a su Ag específico, o bien, abandonan el OLS a través del linfático eferente, acceden a la circulación y se extravasan en la periferia para participar en la respuesta inmune antiparasitaria o en fenómenos de alergia. La mayoria de los LT que han proliferado en respuesta al Ag mueren una vez eliminado éste. No obstante una pequeña proporción permanece como células de memoria para proporcionar protección duradera.

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Dos poblaciones de células T de memoria patrullan los distintos órganos para montar respuestas inmunes rápidas ante el reingreso del Ag. Las células T de memoria centrales inmunovigilan los órganos linfáticos secundarios, mientras que las células T de memoria efectoras custodian los tejidos periféricos. Los LB que son activados por su Ag específico en los OLS dan origen a plasmoblastos (precursores de células plasmáticas) y células B de memoria. Los plasmoblastos pueden diferenciarse localmente en células plasmáticas, que permanecen en los OLS o pueden abandonar el OLS a través del linfático eferente y por el conducto torácico ingresar en el torrente sanguíneo para poblar sitios distantes, como la médula ósea, la piel y las mucosas. Las células B de memoria también sufrirán recirculación entre la sangre, el OLS y la linfa.

Homing y activación de linfocitos vírgenes en el ganglio linfático Los LB2 y los LT vírgenes se extravasan en el HEV (vénulas del endotelio alto) de gánglios linfáticos merced a la expresión de CCR7 y L-selectina. Dado que los LB2 expresan también CXCR5, son reclutados a folículos linfoides por la quemoquina CXCL13. El reconocimiento del Ag incrementa su expresión de CCR7, lo que conduce a estas células a migrar hacia el área T en respuesta a CCL19 y CCl21. Los LT que son activados por el Ag en el área T neoexpresan CXCR5, el cual los conduce hacia el folículo. En el borde del folículo tiene lugar un primer evento de colaboración T-B, cuyo producto es un foco primario de proliferación. Algunas de las células allí generadas migran a los cordones medulares donde se diferencian a plasmocitos mientras otras migran al folículo donde fundan el centro germinal.

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ANTÍGENOS

CARACTERÍSTICAS GENERALES

La inmunogenicidad es la capacidad que tiene una sustancia de generar una respuesta inmune y también de interactuar con los productos de ella. La antigenicidad se refiere solamente a la capacidad de interacciones con los productos de una respuesta inmune, los productos de la inmunidad humoral y los productos de la inmunidad celular. Los productos de la inmunidad humoral son los Ac y los productos de la inmunidad celular van a ser los LT sensibles.

Inmunógeno: sustancia que introducida en un vertebrado adulto inmunológicamente maduro es capaz de generar una respuesta inmune y posterirmente raccionar con el producto de la misma.

El inmunógeno siempre es antígeno.

El antígeno no siempre es inmunógeno.

Antígeno: sustancia capaz de reaccionar con el producto de la respuesta inmune in vitro (en el laboratorio). Puede generar una respuesta inmune.

La alergenicidad es la capacidad de producir algún tipo de respuesta alérgica humoral o celular. La tolerogenicidad es la capacidad de una sustancia de inducir tolerancia. Muchas proteínas de la dieta son extrañas para el organismo e inducen tolerancia, es decir, hay mecanismos del sistema inmune que permiten ignorarlas.

Dentro de los Ag, hay un grupo muy particular de moléculas que se llaman haptenos. Son grupos químicos definidos, orgánicos: dinitrofenol, trinitrofenol, todos compuestos a base de anillos aromáticos. Los haptenos no generan respuesta inmune, pero si son antigénicos porque pueden interactuar con los Ac preformados. Un hapteno se transforma en inmunogénico si se lo une a una proteína carrier o transportadora. En ese contexto el hapteno puede ser inmunogénico. Cualquier proteína inmunogénica puede ser transportadora, como la seroalbumina humana (SAH) o seroalbumina bobina (SAB), a la cual se le puede adosar químicamente el hapteno. Un conejo inmunizado va a generar Ac tanto para el carrier como para el hapteno. Si el hapteno lo unimos a una proteína diferente, los Ac generados contra el primer carrier no interactúan con el segundo, porque es una molécula distinta. Para la detección de Ac no puedo usar el mismo carrier.

Inmunización

Buscamos

Cambio de soporte

los Ac:
los Ac:

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Es necesario siempre hacer un cambio de soporte o de carrier cuando se evalúa si se produjeron Ac contra el hapteno. Se evita así la detección de Ac anti-carrier.

Hapteno: sustancia de bajo PM que no induce respuesta inmunitaria, pero puede adquirir inmunogenicidad al unirse covalentemente a una proteína de mayor peso molecular (carrier).

ALGUNAS DEFINICIONES

DETERMINANTE ANTIGÉNICO: El determinante antigénico es una zona de la molécula de los Ag. Puede haber más de un determinante antigénico en una molécula, y pueden ser todos iguales o todos distintos. Pero puede haber un único determinante antigénico en una molécula. Es una zona restringida de la molécula antigénica que determina la especificidad.

EPITOPE / PARATOPE: El epitope pertenece al determinante antigénico, pero es un área más restringida. El epitope siempre está definido si existe un paratope para él. El paratope es el área del Ac que va a reconocer el epitope. En un mismo determinante antigénico puede haber varios epitopes que se superponen. A veces el determinante antigénico tiene un solo epitope. En una proteína, un epitope puede estar restringido a 5 o 6 residuos aminoacídicos. En un hidrato de carbono, en 5 o 6 unidades de glucosa, etc. Esos 5 o 6 aminoácidos que van a determinar el epitope pueden ser continuos en la sustancia acídica de la estructura primaria de la proteína: Epitopes continuos, secuénciales o lineales. Los Epitopes discontinuos o conformacionales están relacionados también pero en la estructura terciaria o cuaternaria de la molécula (están cerca en la estructura tridimensional pero lejos en la secuencia lineal).

VALENCIA FUNCIONAL: La valencia funcional se refiere a epitopes o determinantes antigénicos que están expuestos, se llaman funcionales porque son los que generan una respuesta inmune y provocan la síntesis de anticuerpos.

VALENCIA TOTAL: La valencia total se refiere a los epitopes expuestos y ocultos. Hay muchos epitopes que por la estructura y plegamiento de la molécula no están en la superficie. Si por alguna causa quedan expuestos también generarían una respuesta inmune.

Ovoalbúmina: 30 epitopes funcionales Bacilo tífico: 5,5 x 10 5 determinantes antigénicos

ANTÍGENOS HETERÓLOGOS: Son antígenos que se dan entre especies diferentes.

ANTÍGENOS ISÓLOGOS: Son antígenos de una misma especie.

ANTÍGENOS AUTÓLOGOS: Son antígenos propios del individuo. El sistema inmune tiene mecanismos para no reaccionar contra estos Ag, salvo en las enfermedades autoinmunes. En estos casos hay un desconocimiento de lo propio que

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provoca que se genere una respuesta inmune humoral o celular contra estos Ag autólogos.

La respuesta inmune humoral posee Ac que reconocen a la proteína nativa. Si la proteína nativa se desnaturaliza, se procesa y se presenta a los LT se genera la respuesta inmune celular.

Un Ag multivalente puede tener determinantes antigénicos o epitopes diferentes o con todos los epitopes iguales. Un Ag multivalente con epitopes diferentes va a generar distintos tipos de Ac, cada uno de ellos para cada determinante antigénico. Esta es una respuesta poliespecífica. En cambio en un Ag multivalente con todos los epitopes iguales, la respuesta va a ser monoepecífica. Un Ag monovalente también generará una respuesta monoespecífica.

RESPUESTA MONOESPECÍFICA

una respuesta monoespecífica. RESPUESTA MONOESPECÍFICA Antígenos multivalentes con epitopes todos iguales.

Antígenos multivalentes con epitopes todos iguales. Antígenos monovalentes.

RESPUESTA POLIESPECÍFICA

iguales. Antígenos monovalentes. RESPUESTA POLIESPECÍFICA Antígeno multivalente con epitopes diferentes. Ag

Antígeno multivalente con epitopes diferentes.

Ag monoespecífico:

posee todos los epitopes idénticos.

Ag monoespecífico: posee todos los epitopes idénticos. Ag poliespecífico: posee epitopes a repetición pero no

Ag poliespecífico:

posee epitopes a repetición pero no todos idénticos. Cada tipo de epitope genera un paratope distinto.

CARACTERÍSTICAS QUE DETERMINAN LA INMUNOGENICIDAD

FACTORES DE LA MOLÉCULA

La naturaleza de la molécula se refiere a si es una proteína, o un hidrato de carbono,

o un lípido, o un ácido nucleico. Por excelencia las proteínas son las que generan la mejor respuesta inmune. Los polisacáridos también son inmunogénicos aunque en menor cuantía. En cambio los lípidos y los ácidos nucleicos son más difíciles como inmunógenos, sólo si forman parte de una estructura más compleja. El DNA monohebra generalmente es más inmunogénico que la doble hebra. El problema de los ácidos nucleicos es que generan Ac contra las bases y los azúcares, por lo que pueden dar reacciones cruzadas con otros Ac que no fueron generados por ese DNA sino por otro.

El carácter de no propio significa que la proteína o el hidrato de carbono es extraño

al sistema inmune. Que sea extraño quiere decir que el organismo lo desconoce, porque

proviene de otro organismo alejado filogenéticamente de nosotros.

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Con respecto al tamaño molecular, mientras mayor sea el tamaño más inmunogénica será la molécula. Pesos mayores a 10 KDa van a mermar la respuesta y proteínas o azucares menores a 4 KDa ya no generan respuesta inmune.

La heterogeneidad de la composición química, se refiere a cuán compleja es la molécula. Esta va a estar dada por las ramificaciones y plegamientos de las moléculas. La configuración óptica también influye, al igual que la rigidez de la molécula. Generalmente los anillos aromáticos les confieren una rigidez a la molécula que las hace buenas inmunógenas. Los ácidos grasos, en cambio, tienen una cadena de hidrocarburos más o menos larga que le confiere cierta inestabilidad a la molécula.

La degradabilidad: las proteínas están compuestas por L-aminoácidos, aunque hay sustancias en la naturaleza que son dextrógiras. Esas moléculas son poco inmunogénicas en vertebrados. Este hecho se debe a que no hay sistemas enzimáticos capaces de degradarlos, y la degradación de la molécula es una vía importante para llegar a la inmunidad celular. Por lo tanto cuanto menor degradabilidad, menor inmunogenicidad.

OTROS FACTORES

Otros factores que afectan a que una molécula sea más o menos inmunogénica es el genotipo del receptor. Hay unas moléculas que son muy necesarias para el procesamiento y presentación del Ag a los LT que se llaman moléculas del COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (CMH). Estas moléculas son el lugar donde se van a montar los péptidos para ser presentados a los LT. El

receptor del LT (TCR) reconoce tanto al péptido como a la molécula del CMH. Esta es

la señal para que el linfocito T se active.

La expresión de las moléculas del CMH va a depender mucho del genotipo del receptor

de los linfocitos, TCR para los LT y BCR para LB, del genotipo de las moléculas del CMH, y también de los genes que codifican para las IL, que van a orquestar toda la respuesta inmune.

Las dosis y las vías de administración (oral o parenteral) también son importantes. Las dosis altas y las dosis bajas generan tolerancia, que es una inactividad del sistema inmune.

La concurrencia de antígenos se refiere a cuando hay más de un Ag en un inóculo. Esto es bueno cuando uno de los Ag actúa como adyuvante de los otros. Lo ideal es inocular Ag por Ag para evitar interferencias negativas. En algunos casos la interferencia puede ser positiva y uno de los inmunógenos potencia la respuesta inmune del otro, entonces de los utiliza como adyuvantes. Ejemplo: vacuna triple: Difteria, Bordetella pertusis y Tétanos. La Bordetella pertusis

tiene una actividad adyuvante intrínseca. Esta vacuna tiene el toxoide de la Difteria, el toxoide del Tétanos y Bordetella pertusis, que actúa como adyuvante de los otros dos, mejorando así la respuesta inmune.

A veces la concurrencia de Ag es mala, sobre todo dependiendo de la dosis con que se

inoculan cada uno de los componentes del inóculo. Puede ser que se genere un fenómeno que se llama DOMINANCIA CLONAL, en el cual se va a activar predominantemente un solo clon con LB sobre el resto, con lo cual se van a tener

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muchos anticuerpos contra un solo Ag, el que domina, y muy pocos Ac contra los restantes Ag que componen el inóculo. Esto es muy importante en las vacunas, donde se intenta que el número de inoculaciones disminuya. Por lo que empiezan a aparecer vacunas triples, cuádruples, quíntuples, que reúnen distintos inmunógenos. En las vías de inoculación se ha visto que la subcutánea tiene mejores resultados que la intraperitoneal, y muchos mejores de resultados que las intravenosas. Esto se debe a que en la inoculación subcutánea, las células de Langerhans que son células dendríticas, toman el Ag y lo llevan al ganglio para presentarlo a los LT y a los LB. En la inoculación intravenosa, el inóculo va por sangre y termina en el bazo. Se usa mucho la vía intramuscular (casi todas), y también se está buscando la vía oral. Con ella se estimula el MALT (tejido linfoide asociado a mucosas). En un principio esto genera la producción de un Ac en particular que protege las mucosas, pero después termina produciendo IgG que son las más importantes y son las que confieren inmunidad de por vida. Este es el ejemplo de la Sabin.

Modificadores de la inmunogenicidad:

Dosis de inmunógeno.

Cocurrencia de Ag.

Tipo de animal inmunizado (existen animales ideales para determinados Ag y viceversa)

Adyuvantes.

ADYUVANTES

Mejora la presentación del Ag, a que acudan al lugar células inmunocompetentes. Por ejemplo: el adyuvante de Freud incompleto, que es una emulsión de aceite en agua, y el adyuvante de Freud completo es el que tiene el macerado de bacilos tuberculosos. El mecanismo de acción de la mayoría de los adyuvantes puede ser centrado en el efecto de depósito, lo que favorece la liberación retardada del Ag. Muy poco eficiente va a ser la respuesta inmune si el Ag se degrada rápidamente, por eso la vía intravenosa para muchos de los Ag solubles es contraindicada, porque el catabolismo los elimina de la circulación mucho antes de que lleguen a impactar con el sistema inmune. El efecto de depósito proporciona un lugar a partir del cual el Ag se libera lentamente. Esto produce estímulos a repetición. Cuando se inyecta un adyuvante de tipo oleoso, en la zona de inoculación se forma un granuloma, el cual es una estructura que forman los macrófagos al rodear al inóculo y puede en un futuro llegar a producir un absceso, sobre todo si el adyuvante es completo. Va a ser un absceso estéril porque no tiene el patógeno, pero provoca las mismas reacciones de tipo inflamatorias que van acompañadas por el acudimiento al lugar de macrófagos, células dendríticas, que toman el Ag y lo llevan al ganglio regional para ser procesado por los LT. Es una manera de asegurarse la eficiencia del sistema.

Freud con MDP (muramildipéptido), es el componente activo que se ha sido aislado de la pared de Micobacterium tuberculosis.

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El hidróxido de aluminio es otro de los adyuvantes que se usan y es uno de los pocos que pueden usarse en seres humanos, a veces acompañado con Burdetella pertusis atenuada.

Otros enfoques de los adyuvantes:

Las citoquinas: las IL participan desviando la respuesta inmune hacia humoral o celular. El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos y la IL-2 se utilizan mucho para favorecer la respuesta LTh2, y la IL-12 para los LTh1. La respuesta por LTh2Ac (humoral), la respuesta por LTh1celular. Los liposomas también se usan (membranas fosfolipídicas con el Ag), favorecen el depósito y la liberación lenta del Ag. Los ISCOMs (complejos inmuno estimuladores) se hacen con un surfactante, que van a formar micelas en las cuales uno puede introducir un Ag. Así la liberación del Ag es más lenta y a pulsos. Hay vacunas de uso veterinario cuyo adyuvante se llama Qui A, es un derivado de la saponina.

Adyuvantes: son sustancias que incentivan la respuesta inmune de otras: hacen que inmunógenos débiles induzcan una respuesta inmune adecuada o convierten sustancias no inmunogénicas en inmunogénicas. Por si mismas no intervienen en la respuesta inmune. Algunos exaltan la inmunidad humoral y otros la inmunidad celular. La respuesta inmune se exacerba de modo que:

Es más rápida en el tiempo. Es más prolongada. Existe producción de distintos isotipos de Ig.

ALTERACIÓN DE LOS ANTÍGENOS

Se puede hacer por adición de anillos aromáticos para favorecer la rigidez de la molécula, siempre y cuando la idea sea mejorar la inmunogenicidad de esa molécula y no se estén alterando los epitopes que interesan. Lo mismo ocurre cuando a los anticuerpos o a los antígenos se le adicionan marcas:

fluorocromos, átomos radiactivos, enzimas, etc. La marca no debe alterar epitopes ni paratopes.

ANTÍGENOS TIMO-DEPENDIENTES Y TIMO-INDEPENDIENTES

La colaboración de las células T es importante para una buena respuesta inmune, con lo cual la mayoría de las proteínas antigénicas y los haptenos unidos a carriers generan una respuesta de tipo T-dependiente. Existe una clase particular de Ag que no necesitan de los LT. Hay dos clases de antígenos T-independientes: los de clase I y los de clase II. Los de clase I son mitogénicos, esto es, activan a los LB inespecíficamente, produciendo una cantidad de clones indefinida de LB con muchas especificidades diferentes. Se tiene así una respuesta poliespecífica a partir de un solo Ag. No necesariamente entre los clones va a

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estar el que genera Ac específicos para ese Ag. Un ejemplo es el LPS que interacciona con receptores de la membrana que no son BCR, pero que terminan llevando a la activación del LB. Los Ag T-independientes de tipo II generalmente son Ag con secuencias repetidas, entonces lo que hacen es entrecruzar los BCR. Esto lleva a la activación del LB, y en este caso sí es específico porque entrecruzan los BCR que lo reconocieron. El ejemplo es el polisacárido del neumococo. Los Ag T-independientes se descubrieron en ratones nude, que tienen aplasia tímica (sin timo y sin LT) y aún así respondían al polisacárido del neumococo. Los Ag T-independientes I generalmente llevan a una producción de Ac IgM, que es el primer Ac que se genera y no necesita colaboración T para secretarse. Mayoritariamente se produce IgM en los Ag T-independientes II, aunque se ha visto pequeñas cantidades de IgG.

PROPIEDAD

Ag T-DEPEN-

Ag T-INDEPEN-

Ag T-INDEPEN-

DIENTES

DIENTES I

DIENTES II

Respuesta de Ac en ausencia de LT

     

NO

SI

SI

Producción de Ac en individuos congénita- mente atímicos

     

NO

SI

SI

Activa LT

SI

NO

NO

Activación de LB no Específicos

     

NO

SI

NO

Requiere epitopes

 

NO, LPS bacteria Brucella abortus

SI, polisacarido del neumococo, flagelina polimerizada (Salmonella)

Repetidos

NO

 

Ag T- dependientes: necesitan la colaboración de los LT para inducir la respuesta inmune sobre los LB. Son mooléculas complejas que poseen determinantes a repetición y de todo tipo. Generan IgG e IgM. Ag T-independiente: inducen la respuesta inmune directamente sobre los LB. Poseen determinantes antigénicos lineales. Generan respuesta inmune del tipo IgM. Se agrupan en dos categorias:

-Tipo I: Son mitogénicos de los LB, inducen respuesta policlonal de Ac, son activadores de macrófagos e inducen la producción de IL, INF y PG. -Tipo II: Son polímeros de polisacáridos que necesitan de factores solubles para inducir respuesta inmune. Favorecen la polimerización de los recptores antigénicos de los LB (Ig de membrana) iniciando la transducción de señales que llevan a la activación de la célula.

ANTÍGENOS BACTERIANOS

Las bacterias son cúmulos de Ag.

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VENENOS ANIMALES Y VEGETALES

Los venenos vegetales y animales generalmente se transforman en toxoides con el tratamiento con formol. La diferencia entre el toxoide y el veneno es la inactividad de la molécula del toxoide. Por ejemplo, el veneno de serpiente es neurotóxico, el toxoide no es neurotóxico, pero sí genera respuesta inmune. (Este es el fundamento para la generación de suero antiofídico).

ANTÍGENOS DE ESPECIE Y DE ÓRGANOS

Hay Ag que se encuentran en una especie y no en otra (Ag de especie). Los Ag de órganos (privilegiados) están aislados del organismo y el propio sistema inmune no conoce (gónadas, ojos).

ANTÍGENOS COMPARTIDOS

Los Ag compartidos son los que se encuentran en varias especies vertebradas o no y pueden estar muy dispersados en la naturaleza. Los Ag heterófilos son Ag que se encuentran en la mucosa del estómago de especies como porcinos, bovinos, en GR de carnero. Cuando se los descubrió vieron que los GR de carnero se lisaban cuando se inyectaban con un suero obtenido de un conejo que fue inoculado con un riñón de cobayo. Estos se denominaron ANTÍGENOS DE FORSSMAN. Están en la superficie de los GR de carnero y en el riñón de cobayo. Los GR de carnero son muy importantes para técnicas serológicas. En el sistema ABO hay tres genes que codifican para la adición de azúcares en la membrana de los GR. La única diferencia que existe entre la sustancia A y la B es una N-acetilgalactosamina en el A y una galactosa en el B. El resto del esqueleto es el mismo para los tres Ag. El esqueleto no está codificado por el gen del sistema ABO, el gen A o B solo lleva a la adición de un residuo sobre ese esqueleto. Hay 8 genotipos posibles pero solo 4 fenotipos:

GENOTIPOS AA o Ai BB o Bi AB ii

GENOTIPOS AA o Ai BB o Bi AB ii
GENOTIPOS AA o Ai BB o Bi AB ii
GENOTIPOS AA o Ai BB o Bi AB ii
GENOTIPOS AA o Ai BB o Bi AB ii

FENOTIPOS

A

B

AB

O

Repasando:

Un hapteno se caracteriza por no generar una respuesta inmune por sí mismo, pero sí puede generarla si se une químicamente con un carrier o proteína transportadora. Para evaluar la respuesta anti-hapteno se debe cambiar el soporte. Esto es porque en la respuesta inmune se generan Ac tanto para el hapteno como para la proteína carrier. Si se quiere evaluar si en verdad se produjeron Ac anti-hapteno debemos usar un carrier diferente para no estar obteniendo un falso positivo.

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Los antígenos T-dependientes necesitan de los linfocitos T para orquestar la respuesta inmune. Los antígenos T-independientes generan una respuesta inmune sin la colaboración de los LT. Hay dos clases: los T-independientes I interactúan con receptores distintos de los BCR, se unen a otros receptores que terminan igualmente activando al LB. Los Ac que se van a producir del LB no van a ser específicos contra el Ag T-independiente I, y como activa muchos clones de LB, se van a obtener muchos tipos de Ac, cada uno proveniente de un LB diferente, pero activado por el mismo Ag inespecífico. Los Ag T-independientes II sí interactúan con los BCR, son generalmente Ag con epitopes repetidos, como los polisacáridos, que lo que hacen es entrecruzar los receptores y van a hacer que el LB se active. En este caso la especificidad va a ser contra el Ag T-independiente II, ya que el Ag se une a su receptor y hay un reconocimiento. En ambos casos, tanto para los del tipo I como para los del tipo II, los Ac que se producen son IgM.

Ag T-i I

Ag T-i II BCR LB IgM LB Ac no anti-Ag T-i I muchos tipos de
Ag T-i II
BCR
LB
IgM
LB
Ac
no anti-Ag T-i I
muchos tipos de Ac
Ac específicos
para Ag T-i II

De los venenos vegetales y animales generalmente la toxina se inactiva con un tratamiento con formol para poder inocularla en un animal para poder obtener un suero anti-veneno.

MITÓGENOS

Los mitógenos son sustancias que inducen la división de los LT y LB, inespecíficamente, por lo que las especificidades de los Ac y las células que se generan van a ser variadas. Esto es porque se activan muchos clones de LB y muchos de LT, es una activación poliepecífica. Ejemplo: concavalina A y fitohemaglutinina, son dos lectinas, son mitógenos de LT; el mitógeno de fitolaca (planta) activa LT y LB, el LPS es un mitógeno de los LB.

(planta) activa LT y LB, el LPS es un mitógeno de los LB. No todos los

No todos los mitógenos son antígenos T-independiente II (hay mitógenos que activan LT).

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SUPERANTÍGENOS

Son activadores policlonales de LT, con lo cual algunos superantígenos son mitógenos. Pero el superantígeno tiene un mecanismo particular de estimular al LT. El mecanismo que lleva a la activación del LT es por una unión lateral del superantígeno al complejo TCR-péptido-CMH clase II, con la salvedad que al superAg no le interesa el péptido presentado. El LT necesita que una célula le presente el péptido contra el cual es específico el LT, sobre las moléculas del CMH. El péptido proviene del Ag. Este péptido es el que le va dar especificidad a la célula que se activa. Se llegan a activar hasta el 20% de la población de LT totales que circulan. La activación de los LT puede llevar a la liberación de muchas sustancias que pueden llevar a un shock y a la muerte. Cuando ocurre dentro de una respuesta inmune normal, es un mecanismo regulado. Este es el mecanismo que tiene el síndrome del shock tóxico del Stafilococus aureus.

LOS ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD

Se descubrieron con el rechazo de trasplantes e injertos. Analizando por qué un tejido era rechazado en un individuo de una misma especie fue como se lograron detectar por primera vez en la membrana de los linfocitos unas moléculas. Éstas eran blanco del sistema inmune del aceptor del transplante. Se los vio por primera vez en la membrana de los linfocitos, por lo que se los llamó HLA: Human Leukocyte Antigens. Después de 50 años de ser descubiertos se comprendió la verdadera función de las HLA, la cual es intervenir en el procesamiento y la presentación de Ag a los LT, evento necesario para la activación del LT. Se descubrió que hay una gran variedad de moléculas de HLA con gran homología entre si pero que igualmente se podían subdividir. Las moléculas del CMH de clase I y clase II son las que tienen que ver con el procesamiento y la presentación del Ag. Los de clase III, algunos están relacionados con la respuesta inmune y otras no. Este CMH está codificado por el cromosoma 6 humano, donde están todos los loci para cada una de las moléculas de clase I, II y III.

El CMH clase I carga el péptido sobre dos de los dominios que tiene la molécula. En el CMH de clase II dos dominios de dos moléculas diferentes contribuyen a cargar el péptido.

CARACTERÍSTICAS DEL CMH Se le dice “complejo” porque abarca muchos genes y comparten ciertas características. Una de ellas es el poligenismo, es decir, hay genes para varias moléculas HLA (varios genes para varias moléculas). El polimorfismo del complejo se refiere a que en los distintos individuos no todas las HLA son iguales, esto es lo que termina con el rechazo de un transplante o injerto. La codominancia del complejo indica que se expresa tanto el haplotipo paterno como el haplotipo materno, entonces por cada molécula de HLA hay dos genes alelos que se expresan.

El polimogenismo se refiere a que existen varios genes y moléculas lase I y II dentro del CMH. Cada uno de estos genes a su vez son polimórficos, entonces la secuencia de

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genes, y por lo tanto, de proteínas codificadas por ellos, difiere entre individuos y es responsable de la histocompatibilidad. La codominancia se debe a la expresión simultánea de genes paternos y maternos.

MAPA GENÉTICO DEL BRAZO CORTO DEL CROMOSOMA 6 Entre los genes del CMH clase I y clase II están los genes de clase III. Las principales HLA del humano son:

 
  HLA-A HLA-DP

HLA-A

  HLA-A HLA-DP

HLA-DP

CMH clase I

HLA-B

CMH clase II

HLA-DQ

HLA-C

HLA-DR

Como expresamos tanto el haplotipo paterno como el materno, expresamos al menos 12 moléculas de HLA diferentes expresadas en la membrana de las células.

Con el tiempo se han ido secuenciando todas estas moléculas del CMH. Al principio se hacía por serología. Usar un Ac es algo inespecífico para reconocer una molécula, ya que reconoce una partícula de la molécula, y puede darse que esa partícula esté repetida en muchas moléculas de HLA.

En workshop internacionales científicos se reúnen y presentan las secuencias de HLA que ellos han logrado aislar. La nomenclatura comienza con el nombre del complejo:

HLA, después el locus al cual pertenece, a continuación se coloca un asterisco que indica que ha sido reconocida en un workshop o taller internacional, luego viene un número de cuatro dígitos de los cuales los dos primeros corresponden a la especificidad, que es la clase de HLA que se logró distinguir mediante Ac. Cada especificidad puede contener muchas HLA homólogas que por serología no se podrían distinguir, pero sí por técnicas del DAN recombinante, con lo cual se agregan lo dos últimos dígitos para la variante. Ejemplo: HLA - A * - 0102

Los HLA-A, HLA-B y HLA-C tienen una sola cadena codificada en el complejo, y forman la molécula uniéndose a otra molécula codificada fuera del complejo.

ESTRUCTURA DE LAS MOLÉCULAS DEL CMH CMH clase I: está compuesta por dos cadenas, una y una . La cadena no está codificada dentro del complejo y se la conoce como 2 - microglobulina. Las cadenas tienen un PM=44 KDa y la cadena 2 - microglobulina un PM=12 KDa. La cadena es muy polimorfa y la 2 - microglobulina es la misma para todas las HLA clase I. La característica más importante es el plegamiento. Los dominios 1 y 2 , que son los más alejados de la membrana forman una hendidura o ranura producto del plegamiento de la molécula. El dominio 1 forma a través de un plegamiento hélice- una de las paredes de esa ranura, el dominio 2 forma la otra pared de esa ranura. El piso de la ranura está formado por 8 láminas de plegamiento , 4 aportados por el dominio 1 y 4 aportados por el dominio 2 . El dominio 3 es el que se une a 2 - microglobulina no covalentemente, y es el más conservado de los tres dominios . El polimorfismo va a estar ubicado en la ranura, que es el lugar donde va a estar el péptido. Hay 20 lugares críticos aportados por el

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dominio 1 y 2 que fundan la ranura y son determinantes de la especificidad de los péptidos que se van a presentar. CMH clase II: la estructura es bastante similar en cuanto a los plegamientos. Está formada por una cadena de 34 KDa y una cadena de 29 KDa. Las cadenas y , ambas, pertenecen al complejo. El dominio 1 es el que contribuye a la formación de la ranura junto con el dominio 1 . El dominio 2 y 2 aportan la base para los dominios 1 y 1 . El plegamiento para formar la ranura es el mismo que para la clase I: lámina plegada para el piso y hélice- para los costados. Lo que sí es diferente es la forma de la ranura de los HLA clase I y clase II. En la clase II la ranura es más abierta hacia los extremos.

1

Clase I

Clase II

2 1 2
2
1
2

Ranura cerrada hacia los extremos. La carga está limitada al tamaño del péptido.

Ranura abierta hacia los extremos. El péptido se puede acomodar por los extremos.

Hay un grupo de HLA no clásicas (o lb). Hay codificados genes para la repuesta inmune, por ejemplo para las moléculas MIC-A y MIC-B, que son ligandos para receptores que tienen las células NK, son receptores de citotoxicidad. Hay otras moléculas dentro de las HLA-lb que se conocen como: HLA-F, HLA-G, HLA-E, HLA- H o HFE. No interaccionan con el TCR. La HLA-H o HFE tiene que ver con el metabolismo del hierro.

Los genes de clase III codifican para TNF-

hay enzimas, como la 21-hidroxilasa, que no tienen que ver con la respuesta inmune.

y TNF- , para factores del complemento, y

En los genes de clase II, entre DO y DQ hay dos genes que codifican para unas moléculas que no presentan péptidos: TAP, TAPASINA, LMP2, LMPZ, que son moléculas que tienen que ver con la presentación antigénica.

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Tipos de Ag:

Xenoantígenos o Ag heterólogos: son Ag que originan Ac en una especie distinta de la que ellos derivan. Dan lugar a inmunidad específica isotípica. Aloantígenos o Ag isólogos: son Ag que originan Ac en individuos de la misma especie pero genéticamente distintos. Dan lugar a especificidad alotípica. Autoantígenos o Ag autólogos: se hallan presentes en todas las células del individuo pero no se producen Ac contra ellos ya que son reconocidos como propios. Ag heterófilos: son Ag similares presentes en varias especies diferentes (hongos, parásitos, bacterias, vertebrados, vegetales). Pueden reaccionar con Ac de otras especies. Ag órgano-específicos o secuestrados: son propios de un órgano, están encerrados en él y no toman contacto con el sistema inmune. Si se liberan el organismo no los reconoce como propios. Ej: proteínas del cristalino del ojo. Ag tumorales: son moléculas específicas expresadas en la superficie de tumores las cuales pueden ser reconocidas por el sistema inmune. Pueden ser utilizados como blanco de Ac monoclonales en inmunoterapia. Superantígenos: son proteínas capaces de estimular a los LT sin procesamiento y degradación. Se unen a las moléculas del CMH-II por una zona distinta a la normal. La respuesta inmune generada es menor. Ag de los GR humanos: los determinantes antigénicos sobre los GR permite su división en grupos sanguíneos. Ag de leucocitos (HLA): Los leucocitos poseen en sus membranas Ag que sí están presentes en otras células pero que no están en los GR (Ag del CMH). Son importantes en la propagación de la respuesta inmune.

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PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE ANTÍGENOS

La inmunidad adaptativa humoral lleva a la producción de Ac contra un patógeno que van a provocar la eliminación del mismo, y la celular lleva a la activación de LT, sensibilizados contra ese Ag en particular. Los dos procesos son necesarios en una respuesta inmune porque muchos de esos procesos se ven beneficiados con la ayuda de los LT. La manera que tienen los linfocitos de reconocer y de activarse es diferente en tanto sea un LT o un LB. El LB tiene, para reconocer al patógeno y desencadenar la respuesta inmune humoral, un receptor que se llama BCR. El BCR reconoce a la molécula nativa, al Ag de una molécula nativa. Para que un LT se active y genere la respuesta celular, tiene un TCR. El TCR tiene un modo diferente de ver al Ag patógeno. No reconoce la molécula nativa, sino pequeños péptidos de ella, pero no péptidos solubles en solución. Los reconoce montados sobre las moléculas del CMH.

Los LT reconocen péptidos lineales derivados del antígeno y montados en moléculas del CMH. Esto último se logra a través del procesamiento y presentación del Ag.

CÉLULA PRESENTADORA DE ANTÍGENOS (CPA)

Es la que procesa y presenta el Ag sobre las moléculas del CMH a los LT. Esta es la única manera que tiene el LT para activarse. Para poder llevar una proteína nativa a pequeños péptidos se necesitan de la actividad de proteasas. Las CPA tienen proteasas. Se requiere que se unan los péptidos a las moléculas del CMH a medida que se van sintetizando. Una vez que está cargado el péptido sobre el CMH debe expresarse en membrana. Todos estos eventos ocurren dentro de la CPA.

CMH

CPA
CPA

PÉPTIDO

TCR

LT
LT

TODAS LAS CÉLULAS CON NÚCLEOS PUEDEN SER CPA.

Las CPA se las puede subdividir en profesionales o no profesionales. Las CPA PROFESIONALES son aquellas células nucleadas capaces de poder expresar las moléculas del CMH de clase II. Son sólo una pequeña fracción:

Macrófagos

Células dendríticas

LB

LT activados

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Todas las células del organismo son capaces de montar el péptido en moléculas del CMH de clase I, salvo las anucleadas: GR. Son CPA NO PROFESIONALES y utilizan una vía endógena.

PRESENTACIÓN

POR

MOLÉCULAS

DEL

CMH

DE

CLASE

I

(VÍA

ENDÓGENA O BIOSINTÉTICA)

Generalmente los péptidos provienen de proteínas endógenas, del citosol de la célula. Estas proteínas provienen de patógenos intracelulares como virus o cualquier patógeno cuya parte del ciclo celular pase por el citosol. También provienen de proteínas endógenas del citosol (hsp, histonas, péptidos líderes). Estos péptidos pueden encontrarse montados en moléculas del CMH de clase I. Las proteínas propias no deben generar respuesta inmune.

EL PROTEASOMA Es una estructura compleja que se encuentra en el citosol de todas las células. Tiene un core (núcleo) y dos casquetes regulatorios. Es un complejo multimérico, pesa en conjunto 2000 KDa, los casquetes pesan 700 KDa cada uno y el núcleo, que es donde se encuentran las enzimas proteolíticas, pesa 650 KDa. El núcleo está compuesto por cuatro anillos apilados de los cuales, los anillos centrales son los que tienen la actividad proteolítica. Son los anillos , los no tienen actividad proteolítica. La proteína para poder entrar al proteosoma y ser degradada, debe ser reconocida por el proteosoma. Para ello la proteína debe ser poliubiquitinada. Hay enzimas E 1 , E 2 y E 3 que se encargan de adosarle a la proteína unidades de ubiquitina. La proteína poliubiquitinada es reconocida por los casquetes regulatorios, pasa al core y es degradada a péptidos. Solamente el 10% de los péptidos que se generan tienen el tamaño adecuado para montarse en las moléculas del CMH de clase I. Ciertas subunidades del proteosoma (del core) pueden ser sustituidas por:

- LMP2 1 - 10 - INF- LMP7 5 LMP10
-
LMP2
1
- 10
-
INF-
LMP7
5
LMP10

Estas proteínas están codificadas dentro del CMH. Estas moléculas LMP tienen actividad enzimática más eficiente para los péptidos que se cargaran en el CMH clase I. Es decir, se hace más eficiente el proceso para generar péptidos con longitudes apropiadas para el CMH clase I. Al producirse el reemplazo la estructura pasa a llamarse INMUNOPROTEOSOMA.

TRANSLOCADOR TAP Son las proteínas encargadas de translocar los péptidos del tamaño adecuado producidos por el proteosoma hacia el retículo endoplasmático (RE). En el RE están las moléculas del CMH clase I. Las TAP pertenecen a la familia de transportadores ABC (ATP binding cassette), son proteínas que unen ATP para poder realizar el pasaje del citosol al lumen del RE.

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EN EL INTERIOR DEL RE La calnexina es una chaperona, ayuda a un buen plegamiento de la proteína, en este caso de la cadena del CMH clase I. La calnexina es una chaperona de membrana, está anclada a membrana y promueve también la unión de 2 -microglobulina ( 2 m). Una vez unido el complejo 2 -m, la calnexina se separa y se une la calreticulina al mismo. Esta es una chaperona soluble, ayuda al buen plegado del complejo 2 -m. La calreticulina con la molécula del CMH clase I aún no totalmente plegada forma un complejo con tapasina y con el translocador TAP. Tapasina se ubica entre TAP y el complejo, haciendo de puente de unión. El CMH clase I no está correctamente plegado hasta que se une el péptido. El péptido induce un cambio conformacional en la molécula. Entonces los péptidos que salen del proteosoma pasan por TAP y son cargados sobre el CMH clase I. Una vez unido el péptido se pliega correctamente el complejo, se desprende calreticulina, tapasina y TAP, y el CMH clase I pasa a Golgi y de Golgi a membrana.

En la unión de los péptidos a los CMH clase I es muy importante la interacción que ocurre en los extremos ya que esto estabiliza mucho la unión. Hay interacciones entre el péptido y residuos aminoacídicos de la ranura: los extremos N y C terminales del péptido se unen a residuos de aminoácidos conservados en la ranura.

PRESENTACIÓN CRUZADA En algunos casos péptidos de microorganimos o patógenos endocitados pueden pasar desde el endosoma al citosol, o bien, una proteína exógena puede acceder al citosol, esto permite que Ag que penetraron a la célula por vía exógena sean presentados a los LT citóxicos por el CMH clase I.

PÉPTIDOS QUE SE UNEN A LAS MOLÉCULAS DEL CMH DE CLASE I Las moléculas del CMH-I unen péptidos compuestos por 8 a 12 residuos de aminoácidos. Los extremos N y C terminales se unen a residuos de aminoácidos conservados en la ranura: posiciones de anclaje definidas. Los péptidos presentados derivan de la degradación de: proteínas endógenas propias (histonas, hsp, secuencias líderes) o patógenos intracelulares.

PRESENTACIÓN

POR

MOLÉCULAS

DEL

CMH

DE

CLASE

II

(VÍA

EXÓGENA O ENDOCÍTICA)

Las CPA toman proteínas del medio extracelular, las endocita y se forma así un endosoma temprano. El pasaje a endosoma tardío se caracteriza por la disminución del pH para activar enzimas que van a degradar la proteína fagocitada a sus péptidos. El endosoma tardío es el que se va a encontrar con el CMH clase II. La molécula del CMH clase II es sintetizado en el RE, donde ocurre el correcto plegado de la misma. Se sintetizan las cadenas y por separado, se pliegan por acción de las chaperonas con la particularidad de que participa un tercer componente llamado cadena invariante (li). La cadena invariante va a tapar el sitio de unión al péptido. Esto es porque en el lumen del RE van a estar los péptidos que se van a unir a las moléculas del CMH de clase I. La proteína li, además, hace a veces de chaperona,

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de péptido líder que va a guiar a la molécula del CMH clase II hacia las vesículas que “finalmente” se van a unir con los endosomas tardíos. Una vez producida la fusión del endosoma tardío con la vesícula que trae la molécula del CMH clase II, esta nueva vesícula va a contener las enzimas del endosoma, el pH bajo, y los péptidos junto con el CMH clase II con su li. Gracias a las catepsinas y al pH que hace que se activen esas catepsinas, la li va a ser clivada, pero no en su totalidad, queda un pequeño péptido en la ranura, llamado CLIP. La carga del péptido está mediada por dos componentes. La HLA-DM promueve la remoción del CLIP. Tiene sitios de alta afinidad que enseguida remueven al CLIP de la ranura y cargan un péptido. Si el péptido no tiene la afinidad suficiente es removido inmediatamente por DM y reemplazado por otro, y así hasta encontrar un péptido con la afinidad suficiente. A DM también se la conoce como proteína editora. Luego la molécula del CMH clase II con su péptido es llevado a membrana La proteína HLA-DO inhibe a DM. Ambas son dímeros con una cadena y otra .

PÉPTIDOS QUE SE UNEN A LAS MOLÉCULAS DEL CMH DE CLASE II Las moléculas del CMH-II unen péptidos compuestos por 8 a 30 residuos de aminoácidos. Las posiciones de anclaje no están claramente definidas. Los péptidos presentados derivan de la degradación de: proteínas propias que se expresan en membrana (receptores, CMH- I o II, etc.) o son secretadas (hormonas, albúmina, etc.) o proteínas extrañas de patógenos extracelulares fagocitados o de patógenos que se alojan en compartimentos endosómicos.

PRESENTACIÓN POR MOLÉCULAS NO CLÁSICAS DEL CMH-I

Las moléculas del CMH clase I clásicas son HLA-A, HLA-B y HLA-C; las no clásicas también presentan Ag, pero son incapaces de interaccionar con el sistema inmune (HLA-E y HLA-G). Hay otras moléculas que presentan Ag que son las CD1. Forman parte del complejo CMH Ib, CD1 junto con FcRn (receptor para Fc neonatal). Son moléculas que están asociadas a los CMH I, pero no están en el mismo cromosoma. Su estructura es muy similar: una cadena de tres dominios que se unen a 2 –m y tienen la capacidad de formar una ranura que va a estar bastante tapada. Con esto la entrada va a estar bastante reducida. El interior de la ranura está tapizada por aminoácidos hidrofóbicos, esto la hace una molécula muy buena para fijar glucolípidos. La parte hidrofóbica entra en la ranura y la parte polar queda hacia afuera.

Presentación de Ag mediada por CD1:

Presenta glucopéptidos, cosa que no hace ninguna otra molécula dl CMH. Presenta derivados de micobacterias y péptidos hidrófobos.

Estos compuestos son reconocidos por los LT con el TCR

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, con TCR

y por NKT.

LAS INMUNOGLOBULINAS

PASOS PARA GENERAR UNA RESPUESTA INMUNE Ingresa un Ag, un agente extraño actúan los mecanismos innatos. Los mecanismos innatos son inespecíficos, inmediatos, no tienen memoria y siempre van a actuar igual ante entradas sucesivas del mismo Ag. Se produce la inflamación. Participan muchas células, entre las cuales está el macrófago. Produce muchas cosas, entre ellas la IL-1, IL-6 y TNF- . Si no se elimina el Ag con todos estos mecanismos, comienzan a desarrollarse otros mecanismos que se llaman adaptativos o mecanismos específicos. Son un poco más lentos porque tardan un poco más en desarrollarse, son específicos y tienen memoria. Las células más importantes en estos mecanismos son los LT y los LB. Estos dos linfocitos van a reconocer a esos Ag extraños. El LT reconoce solo pequeños péptidos del Ag, presentados por las CPA sobre las moléculas del CMH. Una vez que el LT reconoce al Ag se va a activar, va a proliferar y va a comenzar a ejercer sus funciones

efectivas. De aquí van a salir LT efectores y LTm. El LT tiene un receptor que se llama TCR.

El LB también reconoce al Ag que entró pero lo reconoce solo y reconoce al Ag en

forma nativa. Tiene también un receptor, el BCR. Dependiendo de cual es el Ag que entró, el linfocito va a diferenciarse a plasmocito y producir Igs (Ag T I), o va a precisar que lo ayude un LT (Ag T D) Algunos LT, en particular los LTh2, van a ayudar a los LB para que se diferencie a plasmocito y produzca los anticuerpos o inmunoglobulinas. Algunos LB van a ser LBm. Depende de qué Ag sea, se va a favorecer un mecanismo u otro.

El estudio de las inmunoglobulinas comenzó en el año 1939. Un científico descubrió

que cuando inmunizaba un animal con un Ag, le sacaba sangre, aislaba el suero y hacía una corrida electroforética de ese suero, separando las proteínas por la movilidad que

tienen, encontró una fracción que era la correspondiente a la fracción , que estaba muy aumentada. Después se dio cuenta de que si hacía este mismo procedimiento a lo largo

de las inmunizaciones, esta fracción aumentaba más.

Entonces se le ocurrió ver que pasaba si enfrentaba el suero de ese animal con el Ag que

había usado para inmunizarlo, e hizo una corrida electroforética. Observó que esta fracción estaba muy disminuida. Esto pasó porque todos los Ac se habían pegado a sus Ag. Entonces dedujo que la actividad Ac se localizaba en esta fracción. Es por esta razón que a los Ac se los denomina muchas veces gamaglobulinas.

A los Ac le fueron dando distintos nombres de acuerdo a las reacciones que podían

realizar in vitro. Por ejemplo, se llamaban precipitinas a los que precipitan un Ag soluble; se llamaban aglutininas cuando aglutinaban a los Ag particulados; se llamó hemolisinas a los Ac anti-GR que producían la lisis de los GR cuando se agregaba el complemento. Es importante tener en cuenta que el Ac solo se fija o liga pero no pueden destruir por sí solo una célula, necesita de otros mecanismos, en este caso el complemento.

Después vieron los investigadores que un mismo Ac puede tener varias funciones, es por esto que los términos anteriores se dejaron de utilizar.

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Entonces las inmunoglobulinas o anticuerpos son toda una familia, porque son producidos por el mismo tipo celular. El plasmocito es el que produce el Ac, el cual deriva de un LB.

Ac LB DIFERENCIACIÓN PLASMOCITO Ac Ac El plasmocito va a secretar a las Igs. El LB tiene como receptor, anclado en la membrana plasmática para el Ag, a una Ig, entonces el LB produce Igs ancladas a membrana.

a una Ig, entonces el LB produce Igs ancladas a membrana. LB Igs ancladas a membrana
a una Ig, entonces el LB produce Igs ancladas a membrana. LB Igs ancladas a membrana

LB

Igs ancladas a membrana (BCR)a una Ig, entonces el LB produce Igs ancladas a membrana. LB PLASMOCITO Igs secretadas Las

PLASMOCITO

a membrana. LB Igs ancladas a membrana (BCR) PLASMOCITO Igs secretadas Las inmunoglobulinas las podemos encontrar

Igs secretadas

Las inmunoglobulinas las podemos encontrar de dos formas: ancladas a la membrana del LB constituyendo su receptor antigénico, o secretados en el medio por los plasmocitos. Las Igs tienen función anticuerpo. Todas las Igs que hay en un suero normal tienen una especificidad determinada, es decir, son capaces de reconocer un Ag determinado. Esta especificidad es desconocida para nosotros. Cuando inmunizamos con un Ag vamos a tener una mayor cantidad de inmunoglobulinas específicas para ese Ag que sí conocemos. Todos nosotros tenemos Igs, cada una de esas Igs tiene su especificidad o sitio de reconocimiento para un Ag determinado.

Todos los sueros obtenidos al inmunizar un animal son policlonales. Esto quiere decir, que como los Ag tienen muchos determinantes antigénicos, cada uno de esos determinantes antigénicos puede ser reconocido por un linfocito distinto, cada linfocito puede producir Ac, entonces vamos a tener muchos clones de linfocitos que se van a activar ante un mismo Ag. todos los antisueros utilizados comúnmente y obtenidos en el laboratorio son policlonales.

ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Las inmunoglobulinas están constituidas por 4 cadenas. Las dos más largas se denominan CADENAS PESADAS o CADENAS H. Estas cadenas son iguales entre si y están unidas por puentes disulfuro. Las otras dos cadenas son las CADENAS L o CADENAS LIVIANAS, son iguales entre si y están unidas a las cadenas H por puentes disulfuros.

Hay distintos tipos de cadenas H que permite clasificar a las Igs en clases, y hay dos tipos de cadenas L: pueden ser o , pero siempre son iguales en la misma Ig, es decir, si una Ig tiene una cadena L de tipo , la otra también será .

Estas cadenas de inmunoglobulinas se organizan en dominios, que son estructuras constituidas por alrededor de 100 a 110 aminoácidos y tienen una conformación secundaria de estructura –plegada o lámina- .

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Estos dominios no están solamente en las moléculas de Igs, sino en muchas otras moléculas y todas ellas se denominan superfamilias de las Igs.

Cuando los investigadores hicieron la secuenciación de los dominios de las Igs vieron que cerca de la región N-terminal, estos dominios tienen una mayor variabilidad. Se denominaron entonces dominios variables, V L para la cadena L y V H para la cadena H. Hacia el extremo C-terminal la composición de aminoácidos es más constante, por lo que se llaman dominios constantes. Tenemos C L para la cadena L y para la cadena H hay tres dominios C H : C H 1, C H 2 y C H 3. La IgM y la IgE tienen un cuarto dominio: C H 4.

El lugar por el cual la inmunoglobulina reconoce al Ag se ubica en la parte variable, que es el sitio de combinación para el Ag. Va a estar formado por las partes variables de las cadenas pesadas y livianas. Cuando hicieron los estudios de secuencia descubrieron que dentro de las regiones variables hay zonas de alrededor de 10 aminoácidos que varían mucho más aún, por lo que se las llamó regiones hipervariables: CDR (regiones determinantes de complementariedad). Son los CDR los que se unen a los epitopes del Ag y se llaman por eso paratopes. Rodeando a las CDR hay zonas que son más constantes y se denominan FR o secuencias marco. Son secuencias más conservadas y ayudan a los CDR a la interacción con el Ag. Con ellos los CDR se proyectan hacia el exterior.

Todas las Igs, excepto la E y la M, tienen una región rica en aminoácidos Pro, que no tienen una estructura globular y es lo que le va a dar la sensibilidad a las Igs. Permite que los dos brazos puedan rotar y unirse a los Ag.

Las inmunoglobulinas al ser proteínas son antigénicas también, es decir, que pueden actuar como Ag. Si se inoculan a un animal se van a obtener Acs. Esta antigenicidad está dada por la secuencia de aminoácidos que tienen las Igs. Podemos distinguir entonces en esa secuencia tres tipos de variables:

Variaciones isotípicas que están en todas las Igs de una misma clase de todos los individuos de una misma especie. Estas variaciones son las que nos permiten clasificar a las Igs en cinco clases; están en los dominios C H y nos permiten clasificarlos en: IgM, cuando la cadena H es de tipo ; IgG cuando la cadena H es de tipo ; IgA cuando la cadena H es de tipo ; IgE cuando es ; IgD cuando es . Entonces todas las IgM tienen las mismas cadenas H de tipo . Para la IgG a su vez, hay cuatro subtipos, y para IgA hay dos subtipos. Variaciones alotípicas que se encuentran en algunas inmunoglobulinas de algunos individuos de una misma especie. Estas variaciones alotípicas se conocen como marcadores genéticos. Se denominan GM y KM. Las vamos a encontrar en la IgG (GM) y en las cadenas K (KM) Variaciones idiotípicas que son propias de cada Ig y están relacionadas con la especificidad que tiene la Ig. Están ubicadas en las regiones de mayor variabilidad. No siempre la variación idiotípica coincide con el paratope.

Todas estas variaciones contribuyen a la heterogeneidad de las inmunoglobulinas. El estudio de las Ig se efectúa muchas veces tratando a las Ig con distintas enzimas. Las que más se usan son la PAPAÍNA y la PEPSINA. Si tratamos a una Ig con papaína se van a clivar por encima de la región de la bisagra, y se va a generar un fragmento denominado Fc, que va a estar constituido por las partes constantes de las cadenas H, y dos fragmentos que se denominan Fab (fragmentos de

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unión al antígeno). Estos dos fragmentos mantienen el sitio de unión al Ag, pero se comportan como univalentes, no van a dar reacciones de interacción secundaria.

LAS CINCO CLASES DE INMUNOGLOBULINAS

INMUNOGLOBULINA G (Ig G) Es la que se encuentra en mayor concentración en el suero, entre 8 – 10 mg/ml. Es la que tiene mayor tiempo de vida media. Tiene capacidad de neutralizar agentes patógenos, de activar el complemento por la vía clásica. El complemento es un conjunto de proteínas que se activan en cascada, y si el complejo Ag-Ac que lo activó está formado por un Ag particulado, una célula o GR, tiene la capacidad de destruirlo. Es la principal Ig que se produce en una respuesta secundaria. En las respuestas primarias, que se producen cuando entra por primera vez un Ag, la principal Ig que se produce es la IgM, y en las respuestas secundarias, cuando entra el Ag por segunda vez, la principal que se produce es la IgG, porque los linfocitos ya hicieron el switch para poder producir otro tipo de Ig. La IgG es la que transfiere inmunidad al feto ya que es la única que atraviesa placenta. Siempre es monomérica.

La estructura de la IgG es también de dos cadenas H y dos cadenas L. Las cadenas H son del tipo , las cadenas L son de tipo o . En el hombre la mayoría de las cadenas L son de tipo (70% de las IgG son y un 40% del tipo ).

Clivaje de IgG con distintas proteasas:

Si se tratara a la IgG con papaína se va a producir el clivaje y se van a generar dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. Tienen una movilidad electroforética lenta. En el fragmento Fab va a estar el sitio de unión al Ag, los determinantes antigénicos que se han compartido por todas las Ig ubicadas en las cadenas L. Si el tiempo de digestión con la papaína es más largo el fragmento Fc se va a dividir en otros fragmentos más pequeños que se llaman Fc`. Entonces, en el Fab tenemos el sitio de unión al Ag y los determinantes compartidos por las Ig. En Fc están los determinantes propios de las Ig porque están formadas por cadenas H que son distintas para cada Ig, van a estar los marcadores genéticos KM, y esta región Fc es muy importante para todas las funciones efectoras que tienen los Ac. Existen muchos receptores para esos segmentos en distintas especies. Los fragmentos Fab van a poder unirse al Ag pero no darán interacción secundaria porque son monovalentes. El PM de la IgG es alrededor de 150 KDa, las cadenas H pesan 50 KDa y las cadenas L alrededor de 25 KDa.

Si clivamos con otra enzima, la pepsina, corta por detrás de los puentes disulfuro, y va a quedar un fragmento que se denomina F(ab`)2, porque va a tener a los dos fragmentos Fab juntos. Este fragmento sí dará las reacciones de interacciones secundarias porque se comporta como bivalente. Con pepsina el fragmento Fc se degrada en pequeños péptidos, pero si se hace el tratamiento por menor tiempo se puede formar un fragmento pFc` que es parecido al que se generaba con la papaína.

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Si tratamos a la IgG con 2-mercaptoetanol, iodoacetamida y ácido propiónico, vamos a poder escindir las cadenas H de las cadenas L. Las cadenas se pueden separar por filtración con geles porque tienen distintos PM. Las cadenas H son las más estudiadas, se pueden dividir en dos fragmentos: Fd, que a su vez tiene una parte más variable y una parte constante, y un fragmento Fc constituido por dos dominios constantes de las cadenas H. El dominio variable de las cadenas H es el que se une al Ag. Con otros estudios se comprobó que la mayor participación en el sitio de combinación con el Ag lo tiene la cadena H.

Las Ig tienen hidratos de carbono porque son glucoproteínas, se ubican el las cadenas H. En la IgG están ubicadas en el dominio C H 2 del fragmento Fc. La IgG tiene alrededor de 2,5% de hidratos de carbono. Algunos autores consideran que los hidratos de carbono serían como protectores de las Ig para evitar su degradación. Otros autores dicen que solo participan en los procesos de secreción.

En condiciones especiales de clivaje se puede generar un fragmento que se denomina Fv. El fragmento Fv estaría formado por el fragmento variable de la cadena L y por el fragmento variable de la cadena H. Sería la pequeña porción de la molécula que es capaz de unirse al Ag. En el espacio, los dominios V L y V H se superponen, los C L y C H 1 ayudan a mantener la unión de los dominios V L y V H . Los últimos dominios C H 3 también se superponen, dándole una cierta rigidez a la molécula. Los dominios C H 2 en cambio están separados por los hidratos de carbono.

Subclases de IgG: se subdividen por la cantidad de puentes disulfuro que hay entre las dos cadenas H. Esto le va a conferir a cada subtipo de Ig una distinta funcionalidad o actividad.

- La IgG 1 tiene capacidad opsonizante, puede recubrir a un patógeno para el cual tiene los sitios específicos de reconocimiento y a través de su fragmento Fc puede ser reconocido por un macrófago y ser fagocitado.

- La IgG 2 no se fija a piel heteróloga, es decir, que no se fija a células que provengan de animales de otra especie.

- La IgG 3 es la que tiene mayor cantidad de puentes disulfuro entre sus cadenas H, tiene capacidad opsonizante, fija el complemento y tiene un menor tiempo de vida media, porque es más fácilmente degradable por todas esas uniones que presenta.

- La IgG 4 no es capaz de fijar el complemento.

INMUNOGLOBULINA M (IgM) Es la inmunoglobulina que se produce mayoritariamente en las repuestas primarias. Es la única que se produce para los Ag TI. Es pentamérica o hexamérica, es decir, que los monómeros de Ig están unidos por un péptido que se llama J de alrededor de 15 KDa, que se une al fragmento Fc. En la estructura pentamérica, si bien presenta 10 sitios de unión al Ag, se comporta como pentavalente. Esto es porque uno de los sitios de combinación no funciona por impedimentos estéricos. Si tratamos a la IgM con 2-mercaptoetanol, la vamos a clivar en los monómeros que la constituyen, pero esos monómeros siguen teniendo una actividad monovalente. Es decir uno de los brazos sigue sin funcionar por impedimento estérico. El tratamiento con 2-mercaptoetanol es muy importante para poder diferenciar un proceso agudo de un proceso crónico, y es muy útil en la clínica.

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En un proceso agudo vamos a tener mucha cantidad de IgM. Si hacemos una reacción de interacción secundaria vamos a poder determinar un título de Ac para un determinado sistema. Este título es una medida de la cantidad de anticuerpos que hay. Por ejemplo, para un sistema Brucella abortus/ anti-Brucella abortus obtuve un título igual a 200. Si ahora deseamos saber si esto se debe a un proceso agudo o a un proceso crónico, puedo tratar al suero con 2-mercaptoetanol. Este va a actuar sobre la IgM y la escindirá en los monómeros. Esos monómeros, como se comportan como univalentes, no pueden dar las reacciones de interacción secundaria (de aglutinación). Si vuelvo a hacer la prueba con este suero y 2-mercaptoetanol y obtengo un titulo igual a 50, con el tratamiento escindí las IgM. Si el título baja es que en verdad escindí a las IgM. El individuo está produciendo un proceso agudo. El título era mayor antes del tratamiento con 2-mercaptoetanol, luego del tratamiento (las IgM son destruidas) el título baja. El proceso es agudo porque las IgM son las primeras Ig que se producen.

Las cadenas H de la IgM son propias de ellas. No tiene marcadores genéticos en su cadena H. Tiene un PM de alrededor de 970 KDa por ser pentamérica. Este PM impide que pueda extravasar a los tejidos. La IgM es netamente vascular y es fundamental para defendernos contra los agentes que ingresan por vía sanguínea. Tiene capacidad aglutinante y también capacidad fijadora de complemento. Su actividad es pentavalente y si está escindida sus monómeros se comportan como monovalentes. No se sabe si hay en las células receptores para el fragmento Fc de la IgM. Su contenido en hidratos de carbono es de alrededor de 12%. Pueden dar reacciones cruzadas con IgG debido a las cadenas L.

La IgM es la primera que se produce y es la más importante en la respuesta primaria. La IgG es la mayoritaria en las respuestas secundarias.

INMUNOGLOBULINA A (IgA) La cadena H de la IgA es de tipo , y hay dos tipos: 1 y 2 . La cadena 1 tiene un residuo de galactosamina, que no tiene la 2 . No se sabe mucho sobre la IgA, todos los estudios que se han hecho fueron sobre inmunoglobulinas provenientes de mielomas. Los mielomas son tumores de células LB, donde la célula B produce una gran cantidad de Ig monoespecífica. La IgA se la puede encontrar en forma de monómero, o en forma de dímero o trímero. En el caso de dímero o trímero están unidas por el péptido J, que es el mismo péptido que unía a la IgM. La IgA es muy importante en las secreciones mucosas, donde se encuentra en la forma de dímero, por ejemplo en la saliva, en la mucosa intestinal, etc. En estas secreciones está asociada a un componente secretor, que tiene unos 70 KDa de PM. La IgA adquiere este componente secretor después que es producida. La IgA es secretada por el plasmocito que está ubicado en el subepitelio de la mucosa intestinal, por ejemplo, y esa IgA secretada se va a unir a un receptor (que contiene al componente secretor) que se llama poli-Ig, que es un receptor que específicamente va a fijar a la IgA. Se va a endocitar, se va a formar una vesícula, y esa vesícula con la IgA va a ser transportada hacia el otro extremo de la célula epitelial. Este proceso, que es un transporte a través de un receptor con formación de vesícula, se llama TRANSCITOSIS. Cuando la IgA llega al otro extremo de la célula se corta parte del receptor, y le queda una porción que es el componente secretor.

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IgA da básicamente inmunidad mucosal. La IgA está en forma monomérica en circulación y en forma dimérica en las secreciones. Conforman entre el 15 al 20% de las Ig séricas. Activan complemento por vía alterna. Las IgA secretoras no necesariamente destruyen al patógeno, sino que inhiben su adhesión al epitelio.

INMUNOGLOBULINA D (IgD) No se sabe muy bien que función tiene. Parecería ser que interviene en el proceso de maduración del LB, y se encuentra en la membrana junto con la IgM, en los LB vírgenes. Representan menos del 1% de las Ig plasmáticas.

INMUNOGLOBULINA E (IgE) Las cadenas H de la IgE son del tipo , el PM es de alrededor de 185 KDa. La concentración en suero es baja porque esta Ig está unida fundamentalmente a células por su porción Fc. Hay muchas células como los mastocitos y los eosinófilos que tienen receptores para el Fc de IgE, que se nombran FcR . Estos receptores tienen una muy alta afinidad por la IgE, sin necesidad que esta Ig esté unida a un Ag. Esto es una diferencia con los receptores FcR , cuya afinidad aumenta cuando la Ig está unida a su Ag.

Los receptores para IgG en las distintas células tienen baja afinidad por la IgG que no está unida a Ag, y la afinidad aumenta cuando la IgG se une a los Ag. En el caso del receptor de la IgE tienen muy alta afinidad por la Ig sin Ag.

Su participación en la respuesta inmune se centra en inducir la degranulación de mastocitos uniéndose a estos a través de su Fc.

La IgE es responsable de las acciones de hipersensibilidad y también participa de forma muy importante en las respuestas contra infecciones parasitarias. Tienen la particularidad de fijarse a piel homóloga, es decir, se fija a piel de individuos de la misma especie, no de otras especies. La IgG se puede fijar a piel de individuos de otras especies.

RECEPTORES PARA LAS INMUNOGLOBULINAS

No alcanza con que los Ac reconozcan al Ag, sino que deben hacer algo para poder eliminarlos. Lo que hagan con el Ag va a depender de la porción Fc, es decir, de donde esa Ig se vaya a unir. Para esto las células tienen receptores. Se nombran FcR y luego se indica la cadena a la cual se unen. Hay receptores para la IgG, para la IgE y la IgA. Dependiendo en qué células estén estos receptores va a ser la función que va a mediar la Ig. Cuando los receptores están en los macrófagos, si tenemos una bacteria que está recubierta de IgG, mediante el segmento Fc se va a poder unir y así se va a favorecer la fagocitosis de esa bacteria. Si los receptores están en un eosinófilo, la Ig se unirá y este eosinófilo se degranularía.

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Entonces la unión de las Ig a sus receptores puede producir fenómenos de endocitosis fagocitosis; o fenómenos de exocitosis liberación del contenido de las granulaciones. Pero para que esto ocurra siempre tiene que ocurrir lo que se llama ENTRECRUZAMIENTO DE RECEPTORES. Es decir dos Ig adyacentes se tienen que unir a dos determinantes antigénicos de un mismo Ag.

que unir a dos determinantes antigénicos de un mismo Ag. Una Ig se fija con un

Una Ig se fija con un brazo al Ag y la otra Ig se fija con el otro.

Debe ocurrir esto para que se puedan transmitir las señales al interior celular. Hay un receptor que se llama Receptor de Brambell, que es el receptor que le permite a la IgG atravesar placenta. Es un receptor diferente, está constituido por unas cadenas de tipo que son parecidas a las del CMH y se unen dos moléculas del receptor por cada Fc de IgG. Entonces, este receptor le permite a la IgG atravesar placenta, le permite salir a los tejidos y permite el pasaje por las células endoteliales. También puede llamarse FcRn, que se ve en ratones. FcRn: Receptor de Brambell

FUNCIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Los Ag van a ser reconocidos por un lado, por las Ig de la membrana del LB vírgen (BCR) y por otro lado, por los Ac secretados por los plasmocitos.

Pueden neutralizar patógenos, pueden recubrir bacterias y evitar así que penetren en células. Las Ig que pueden hacer esto son las IgM, IgG y la IgA sobre todo en el tracto digestivo.

Pueden activar el sistema complemento. Cuando se forman complejos Ag-Ac se puede activar el complemento que conduce a la lisis celular. Pueden activar el complemento las IgM, IgG y la IgA algunas veces.

Pueden actuar como opsoninas y favorecer la fagocitosis (la IgG y la IgA).

Pueden actuar mediante un mecanismo llamado ADCC: citotoxicidad anticuerpo dependiente. Dentro de los LT están los LT citotóxicos que tienen la capacidad de destruir células, pero no solo ellos. A través de los Ac las células NK, que tienen receptores para las Ig, pueden destruir patógenos. También pueden hacerlo los macrófagos y los eosinófilos. En el caso de los eosinófilos interviene la IgE, y en el caso de las NK y los macrófagos es la IgG.

Pueden neutralizar toxinas. Las toxinas entran a la célula a través de receptores. Si se consigue un Ac que neutralice el sitio por el cual la toxina se une al receptor, se evita la entrada de la toxina y por lo tanto la enfermedad. Esto se busca con algunas vacunas. Por ejemplo con el toxoide de la difteria. En este caso es necesario que los Ac sean de muy alta afinidad porque las toxinas se encuentran en una proporción muy pequeña.

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Pueden actuar en fenómenos inflamatorios o alérgicos, en la degranulación de los mastocitos. Los mastocitos se encuentran en los epitelios respiratorios y digestivos, y tienen la capacidad por sus receptores de fijar IgE sin unión a Ag. Entonces la mayoría de las IgE van a estar fijadas por su receptor a los mastocitos. Cuando entra un patógeno que es específico para usar IgE, se va a unir, se va a producir el entrecruzamiento de receptores y ese mastocito o ese eosinófilo va a liberar el contenido de sus gránulos. El principal mediador químico que tienen los mastocitos es la histamina, que es un potente vasodilatador. Entonces participa en los procesos inflamatorios. Muchas veces estos procesos de degranulación son perjudiciales para el organismo, como en la alergia. Pero en otros casos, como las infecciones parasitarias pueden ser beneficiosas, porque el contenido de los gránulos, sobre todo los eosinófilos, pueden llegar a destruir la membrana de los parásitos, sobre todo aquellos muy grandes que no pueden ser fagocitados.

Participan en la inmunidad de los recién nacidos o del feto. La que participa en la fase embrionaria es la IgG y después en la lactancia participa la IgA. Toda la defensa del recién nacido va a estar dada por la IgG de la madre, pero llega un momento luego del nacimiento que esa IgG empieza a ser catabolizada, y los niveles de IgG que produce el bebé todavía no son suficientes. Entonces se produce un período de los 3 meses hasta casi el año donde los niños se enferman seguido porque no tienen aún el sistema inmune totalmente activo, y las Ig que les pasó la mamá fueron catabolizadas.

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ANTICUERPOS CO-PRECIPITANTES

Se empezaron a estudiar en el año 1935. Son anticuerpos que se generan en todas las respuestas inmunes y pertenecen a la clase de IgG. Los investigadores inmunizaron a una oveja con DNP (dinitrofenol) unido a un carrier. Obtuvieron un suero anti-DNP proteína. Hicieron una curva de precipitación (TP N˚3) y fueron agregando distintas cantidades del Ag soluble a volúmenes constantes de suero, y obtuvieron la siguiente curva:

constantes de suero, y obtuvieron la siguiente curva: x e Ag Determinaron el punto “x” que
x e
x
e
constantes de suero, y obtuvieron la siguiente curva: x e Ag Determinaron el punto “x” que

Ag

Determinaron el punto “x” que es la zona de equivalencia donde la concentración de Ac es máxima. Sacaron también a partir de la curva la cantidad de Ag que se tenían que agregar para precipitar la máxima cantidad de Ac. Luego pensaron que ocurriría si a esa cantidad de Ag la iban agregando de forma repetida y de a poco al suero. Entonces, en un tubo donde estaban los Ac anti-DNP le agregaron una cantidad menor a esa cantidad máxima de Ag, una cantidad 20 veces menor. Vieron un precipitado.

1/20 e precipitado
1/20 e
precipitado

Separaron el sobrenadarte y le volvieron a agregar la misma cantidad de Ag (1/20 e) y se volvió a formar precipitado.

cantidad de Ag (1/20 e) y se volvió a formar precipitado. 1/20 e nuevo precipitado Así

1/20 e

de Ag (1/20 e) y se volvió a formar precipitado. 1/20 e nuevo precipitado Así sucesivamente

nuevo precipitado

Así sucesivamente hasta que llegó un punto en donde no vieron más precipitado. Con este sobrenadante repitieron la curva de precipitación pero esta vez agregándole a cada tubo este último sobrenadante. Cada tubo tendrá: suero de la oveja, Ag y sobrenadante. Observaron que la curva nueva era más alta:

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e’ x’ En el punto “x’” tenían una mayor cantidad de Ac. Dijeron que había

e’

x’
x’
e’ x’ En el punto “x’” tenían una mayor cantidad de Ac. Dijeron que había Ac

En el punto “x’” tenían una mayor cantidad de Ac. Dijeron que había Ac en el suero que no alcanzaban a precipitar, pero que sí podían unirse a los complejos ya precipitados. Los llamaban anticuerpos co-precipitantes. Lo que siguió es averiguar por qué estos anticuerpos co-precipitantes se comportaban de esta manera, no tenían la capacidad de precipitar sino la capacidad de pegarse a un precipitado. Entonces, a partir del último sobrenadante donde no hubo precipitado lo pasaron por una columna de afinidad, que se la había preparado con el Ag DNP. Aislaron así los Ac co-precipitantes. De todos los precipitados, los disolvieron y obtuvieron los Ac precipitantes. Ambos eran anti-DNP, es decir tenían la misma afinidad. Ahora, lo que hicieron fue inmunizar un ratón con ambos Ac. Las Ig al ser proteínas también se comportan como Ag. Obtuvieron Ac que eran anti-Ac-precipitantes y otros Ac que eran anti-Ac-coprecipitantes. Utilizaron una reacción de interacción secundaria que se llama (TP N˚4) INMUNODIFUSIÓN. Se hace un agar, se prepara la placa de agar en un portaobjeto, por ejemplo, se le hacen agujeritos y se siembra el Ag y el Ac en las concentraciones óptimas, precipitan formando una línea. Estas bandas que se observan son bandas de identidad. En nuestro caso quiere decir que el Ac estudiado reconoce los mismos determinantes antigénicos en ambos Ag.

Ac coprecipitante Ac precipitante
Ac coprecipitante
Ac precipitante
antigénicos en ambos Ag. Ac coprecipitante Ac precipitante Anti-Ac precipitante Repitieron la experiencia pero en vez

Anti-Ac precipitante

Repitieron la experiencia pero en vez de poner el Ac anti-Ac-precipitante pusieron el anti-Ac-coprecipitante, y obtuvieron el mismo resultado:

Ac coprecipitante Ac precipitante
Ac coprecipitante
Ac precipitante
el mismo resultado: Ac coprecipitante Ac precipitante Anti-Ac-coprecipitante Esto indicaba que no había

Anti-Ac-coprecipitante

Esto indicaba que no había diferencias en el isotipo de los Ac, eran iguales.

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Esto llevó a que si el problema no era el Fc, entonces era el Fab. Para estudiar las valencias da los Ac están las técnicas de interacción primaria. Con estas técnicas se dieron cuenta que los Ac coprecipitantes tenían dos sitios de combinación para el Ag, es decir eran Ac completos, pero esos dos sitios tenían distinta afinidad. Cuando hicieron una cromatografía gaseosa vieron que los Ac coprecipitantes tenían más hidratos de carbono que los precipitantes. Entonces cortaron al Ac coprecipitante con papaína para obtener los fragmentos Fab. Al Ac precipitante lo trataron de igual manera. Pasaron una columna de afinidad con el Ag DNP y vieron que para el Ac precipitante todos los Fab eran retenidos, pero para el coprecipitante el 50% era retenido y un 50% fluía. Esto ya indicaba que la afinidad era diferente. Ahora usaron una columna de afinidad que ligara residuos de hidratos de carbono como sepharosa-concavalina A. Esta columna es capaz de retener moléculas que están glucosiladas con residuos de manosa. Pasaron los Fab por esta columna. El 50% de los Fab de los Ac coprecipitantes eran retenidos en la columna. Cuando investigaron cómo estos Fab se fijaban al Ag se dieron cuenta que el 50% que quedaba retenido en la columna sepharosa-concavalina A tenía una baja afinidad por el Ag y el resto una alta afinidad.

Conclusión: los ANTICUERPOS COPRECIPITANTES o ASIMÉTRICOS tienen un sitio de combinación de baja afinidad que se debe a la presencia de residuos ricos en manosa. Si se emplea una enzima capaz de remover esos residuos de manosa los Ac coprecipitantes se transforman en precipitantes, ya que al no tener ese residuo los dos sitios tendrían la misma afinidad.

Los investigadores buscaron si había alguna diferencia en cuanto a si para generar esos Ac se usaban Ag solubles o particulados. Entonces, siguieron durante un año un plan de inmunización. Para el caso de los Ag solubles, se generaban esos Ac coprecipitantes pero en una proporción que iba del 1 al 10-15%. Si inmunizaban con Ag particulados, las concentraciones de los Ac coprecipitantes iba aumentando hasta llegar a un 70%, es decir, que había mayor cantidad de Ac coprecipitantes que de precipitantes. Esta es una característica de la multiestimulación con antígenos particulados. Los Ac coprecipitantes compiten por masa con los Ac precipitantes.

CARACTERÍSTICAS

Tienen un fragmento Fab glicosilado, por eso se llaman asimétricos, no activan el complemento, son citofílicos, es decir, tienen la capacidad de fijarse a células por el Fc ya que no está afectado. No tienen igual poder protector que los precipitantes y aglutinan GR de carnero sensibilizados. Esta aglutinación de los GR no se debe a la formación de la red, se debe a que los GR de carnero tienen receptores para el Fc de IgG. Entonces, si a un GR de carnero le pegamos el Ag DNP y lo enfrentamos a un suero con Ac asimétricos específicos para el Ag, algunos Ac se van a unir por el Fab con el Ag, y se van a unir por el Fc a otro GR pero por el receptor para Fc. Las redes que se van a formar se van a producir por la unión específica del Fab al Ag y por la unión del Fc a su receptor. En el caso de GR humanos, hay que hacerles un tratamiento previo con tripsina para que expongan los receptores Fc.

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FUNCIONES

Aparecen en las infecciones por Ag particulados, las multiestimulaciones generan estos Ac, pero no son protectores. Pueden aparecer frente a tumores, muchos de los Ag tumorales inducen la producción de estos Ac que hacen que se evite la eliminación de ese tumor (protegen al tumor). Pueden aparecer Ac coprecipitantes anti-insulina, se unen a la insulina y la protegen, evitan que se degrade y entonces baja la glucosa. Pero también tienen una función de protección en las enfermedades autoinmunes. Hay muchos Ag propios que generan este tipo de Ac coprecipitantes y, como no pueden activar una función importante que es la activación del complemento, evitan que estos Ag propios sean destruidos. Podrían participar en mecanismos regulatorios de la respuesta inmune idiotipo-anti idiotipo. Parece ser que son muy beneficiosos en la preñez: los Ac que se generan contra los Ag paternos que porta el feto son de este tipo, coprecipitantes, y se evita que se agreda al feto. Se tratan de inducir en terapias anti alérgicas.

Hay una interleuquina que parece ser la que favorece la producción de Ac coprecipitantes que el la IL-6. En mujeres embarazadas esta IL-6 está muy aumentada. Algunos autores creen que esto también puede depender de células presentadoras de Ag (CPA) y de cómo las células procesan a los Ag. También puede ser que haya estimulación de las enzimas que participan en los procesos de síntesis de los hidratos de carbono de las Ig.

Para investigar la presencia de estos Ac incompletos se utiliza la Reacción de Coombs, otras son las Reacciones de interacción primaria, como la inmunofluorescencia o el ELISA. Para estas reacciones no es necesaria la formación de ningún tipo de red. Es importante tener en cuenta estos Ac incompletos en el momento de hacer un diagnóstico, sobre todo en brucelosis. La brucelosis es una patología donde se producen una gran cantidad de estos Ac y muchas veces las reacciones de aglutinación dan negativas. Esto no quiere decir que el individuo no tiene Ac, sino que tienen estos Ac coprecipitantes.

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ANTICUERPOS MONOCLONALES

Si inmunizamos a un conejo con ovoalbumina (OA), por ejemplo, obtenemos un suero policlonal. En ese suero va a haber muchos Ac que tengan distinta especificidad y que reconocen a ese Ag. Entonces, va a haber muchos clones de LB que produzcan distintos Ac, pero cada uno de estos Ac es producido por un solo tipo de célula. Esta es la TEORIA DE LA SELECCIÓN CLONAL. Por ejemplo, si inmunizamos con OA a un conejo A y obtenemos un suero A; luego inmunizamos a un conejo B y obtenemos el suero B; y con un conejo C obtenemos el suero C, estos sueros A, B y C son diferentes porque los animales son diferentes, y se van a comportar de manera distinta. Los investigadores querían tratar de encontrar un Ac que se comportara de la misma manera, es decir, que el suero reconociera un solo epitope. En una experiencia inmunizaron un ratón con un Ag y le sacaron el bazo. A ese bazo lo disgregaron y se lo inyectaron a otro ratón que previamente había sido irradiado, con lo cual se había inhibido todo su sistema inmune. A este ratón irradiado, luego de inmunizarlo con el bazo disgregado del primer ratón, también le inyectaron el Ag. A este ratón también le sacaron el bazo y repitieron el proceso con otro ratón. Siguieron así hasta que obtuvieron los LB que ellos buscaban. Este era un proceso bastante tedioso de realizar.

Luego se descubrió que se podían fusionar células somáticas y se podían producir mielomas, que son los tumores de los LB que producen Ig de una sola clase. Milstein, en 1975 ideó la técnica de producción de Ac monoclonales. Las células de mieloma, que tienen la capacidad de crecer indefinidamente, van a fusionarse con un LB específico para el Ag. El mieloma no debe ser cualquiera, ya que los mielomas producen inmunoglobulinas. Se usan mielomas que no produzcan Ig, y como se va a necesitar luego seleccionar las células de alguna forma, tiene que ser mielomas deficientes en una enzima, son hipoxantina guanil fosfato tibosil transferasa negativas: HPGRT (-). Esta enzima es necesaria para que se sinteticen las bases púricas. Estos mielomas HPGRT (-) no van a poder crecer en un medio HAT, que es el que se utiliza para seleccionarlos. El medio HAT tiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina inhibe la síntesis de novo de nucleótidos. Los mielomas que tienen estas características se llaman NSO y son de ratón.

El LB a utilizar debe ser también de ratón, al cual se lo inmunizó con el Ag específico. (Funcionan mejor los híbridos que pertenecen a la misma especie). Milstein utilizó GR de carnero. Se sigue un plan de inmunización común, por ejemplo inoculaciones una vez por semana durante un mes, y se observa si el animal produce o no Ac. Tres días antes de observar la fusión se le vuelve a inyectar el Ag, esto es para que haya una mayor cantidad de LB específicos. Se extrae el bazo, se disgregan las células y se realiza la fusión.

Para la fusión se utilizan distintos agentes, el más usado es el polietilen glicol (PEG). No se conoce muy bien el mecanismo de la fusión, ni qué es lo que hace el PEG. Algunos creen que son las impurezas del PEG las que actúan. En fin las células se fusionan y se forman los HIBRIDOMAS. Ahora viene la selección.

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La selección es en medio HAT, en el cual solo van a poder crecer los hibridomas. Los linfocitos no sobreviven porque no crecen durante mucho tiempo en cultivo. Los mielomas no son capaces de sobrevivir en el medio HAT.

La siguiente etapa es saber si los hibridomas producen o no el Ac buscado. Como es muy probable que la concentración de Ac sea muy poca, se debe usar un método de muy alta sensibilidad. Conviene usar una Inmunofluorescencia o una técnica de ELISA. Si algunos hibridomas producen los Ac buscados, hay que clonarlos. Hay dos formas:

uno es el CLONADO EN AGAR y otra es el CLONADO POR DILUCIÓN LÍMITE. Se asegura así que los Ac provengan de una sola célula. Luego de la clonación hay que purificarlos. Para obtenerlos en gran cantidad se pueden hacer cultivos masivos o se puede obtener el líquido ascítico en un ratón. La producción de líquido ascítico permite obtener una gran cantidad de Ac monoclonal. Para ello se inyecta intraperitonealmente el hibridoma al ratón. El hibridoma dentro del ratón comienza a producir los Ac que se van a encontrar dentro del líquido ascítico.

Los Ac monoclonales luego de obtenerlos deben ser purificados, usando, por ejemplo, columnas de afinidad.

La técnica de Milstein para la obtención de Ac monoclonales requiere el uso de LB de un animal previamente inmuizado con el Ag de interés, y una célula plamática maligna (mieloma) que son capaces de crecer bien en cultivo. Se procede a la fusión de ambas células, mediada por el PG. Los híbridos se seleccionan en un medio selectivo que contiene: aminopterina, la cual es un inhibidor que bloquea la ruta normal de biosíntesis de nucleótidos, hipoxantina y timidina (HAT). Por consiguiente, las células deben utilizar una ruta paralela para poder sintetizar sus ácidos nucleícos, siendo esta vía defectuosa en la línea celular mutante a la que se fusionan los LB normales. Una célula B es incapaz de crecer bien en cultivo por si sola por largos períodos. Durante la fusión, los cromosomas de las células se mezcla, resultando células híbridas con capacidad de crecer en cultivo y de producir Ac. Las células del hibridoma pueden crecer ya que las células B contribuyen con enzimas que pueden sintetizar nucleótidos por una ruta paralela a la bloqueada por aminopterina y por poseer las propiedades de crecimiento de las células de mieloma. Como el hibridoma deriva de una sola célula B, su Ac está restringido a una sola forma molecular, es decir, es un Ac monoclonal (Ac idénticos con un centro de unión al Ag idéntico).

DIFERENCIAS

ENTRE

ANTICUERPOS

POLICLONALES

Y

MONOCLONALES

La primer diferencia es que los Ac monoclonales son homogéneos, mientras que los Ac policlonales son heterogéneos. Como los Ac policlonales son muchos Ac distintos, sus propiedades van a ser un promedio de las propiedades de cada uno de ellos. En cambio, en el caso de los Ac monoclonales las propiedades van a depender de esa única molécula.

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Los Ac monoclonales son más lábiles a los procesos de congelación y descongelación, menos resistentes a variaciones de pH. La avidez es un término que se relaciona con la fuerza de unión y la afinidad. En el caso de los policlonales va a depender del promedio de todas las afinidades de todos los Ac. En los monoclonales va a depender de esa única molécula. Los Ac monoclonales solamente van a dar interacción secundaria si el epitope está repetido muchas veces en el Ag. Solo de esta manera va a poder formarse la red.

en el Ag. Solo de esta manera va a poder formarse la red. No hay formación

No hay formación de red

Hay formación de red

Los Ac policlonales, en cambio, igual forman la red, porque tienen distintos Ac para distintos epitopes en el Ag.

En cuanto a la especificidad, no importa en qué momento se produzcan, los Ac monoclonales tendrán siempre la misma especificidad. Los policlonales no, porque al ser producidos en distintos animales van a depender de la variabilidad individual de cada animal. Los Ac policlonales pueden dar más reacciones cruzadas, sin embargo los monoclonales, si el mismo epitope está en otra molécula diferente también van a poder dar una reacción cruzada.

APLICACIONES

Como los Ac monoclonales son más homogéneos y son monoespecíficos, pueden servir para purificar proteínas que están formando una mezcla compleja. Se utilizan para identificar y aislar ciertas poblaciones celulares. Se usan mucho en citometría de flujo, para identificar los TCD4, TCD8 y para inmunofluorescencia. Sirven para detectar y tratar los tumores. En ciertos tumores hay expresión de Ag que no se expresan en las demás células. En investigación se han utilizado mucho para estudiar los sitios de combinación y para estudiar de terminados epitopes. Se pueden usar Ac catalíticos si se consigue un Ac monoclonal que sea capaz de interactuar con algún producto de alguna reacción química, acelerando la reacción.

DESVENTAJAS

Si se los utilizan como terapéuticos hay que tener en cuenta que son Ac producidos en ratones. Si la inyectamos a un humano vamos a provocar una respuesta inmune contra esa molécula de otra especie.

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Se ha querido solucionar este problema. Se probó creando un hibridoma humano-ratón, pero son muy inestables y no sobreviven en cultivo. Quisieron fusionar un LB humano con una célula de mieloma humano, pero los mielomas humanos siempre producen Ac y además tampoco viven. Gracias a la tecnología del ADN recombinante se pudo fabricar un Ac que tuviera la mayor parte de la molécula de origen humano, y que solo las regiones variables provinieran de ratón. Estos Ac se llaman ANTICUERPOS QUIMÉRICOS.

Anticuerpos quiméricos

se llaman ANTICUERPOS QUIMÉRICOS . Anticuerpos quiméricos Fab de ratón, se trata de que solo el

Fab de ratón, se trata de que solo el Fv sea de ratón

Fc humano

Uno de los Ac que se está usando en algunas enfermedades es el Rituximab, que reconoce el CD20 del LB. El CD20 se expresa en todos los LB, pero se expresa en mucha mayor cantidad en cierto tipo de linfoma. Entonces, el Ac rituximab estaría interactuando directamente con la molécula CD20 y desencadenaría algún tipo de mecanismo que lleva a la destrucción de esa célula B.

de mecanismo que lleva a la destrucción de esa célula B. In vitro se sabe lo

In vitro se sabe lo que pasa, se genera un mecanismo de destrucción por activación del complemento, pero in vivo se desconoce. Otro Ac monoclonal que se utiliza en terapéutica es el simulet, que es un Ac contra el receptor de IL-2 y se usa en transplantes para generar inmunosupresión. También se han podido expresar Ac monoclonales en plantas, usando plásmidos que codifican para las Ig que se quieren expresar. Se lo puede introducir en una bacteria que transforme a la célula vegetal y se han generado plantas que expresan cadenas H con una determinada especificidad, y plantas que expresan cadenas L. Después cruzaron estas plantas y obtuvieron una planta que expresaba el Ac y lo extraían de las hojas.

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INMUNIZACIÓN

La inmunización en el hombre tiene como objetivo conferir una inmunidad protectora contra una enfermedad. Esto es, productos de una respuesta inmune que nos protejan contra la entrada de un patógeno. La inmunización así entendida se puede adquirir de dos maneras: una forma pasiva y una forma activa. A su vez la forma pasiva se puede adquirir artificialmente como naturalmente.

INMUNIZACIÓN PASIVA O SEROTERAPIA

La forma natural es el pasaje de los Ac IgG que la madre le pasa al feto a través de la placenta. Esto es la causa de que los recién nacidos tengan un repertorio de especificidad muy similar al de la madre. Esto asegura que en los primeros meses de vida tenga una protección. Además de la transferencia placentaria está la transferencia a través del calostro y la leche materna. Estos Ac son principalmente del tipo IgA, que dan protección en las mucosas. También a través de la leche materna puede haber una transferencia de LT. Se denomina transferencia pasiva porque el niño no fue quien generó estas especificidades de Ac. Una forma artificial de adquirir inmunidad es a través de los antisueros, ya sean heterólogos u homólogos (distinta o misma especie respectivamente). Los antisueros específicos heterólogos están en desuso, sobre todo aquellos que son para una enfermedad. Es decir, son sueros generados en una especie distinta a la del hombre y transferidas al hombre. Sí se siguen usando los sueros antiofídicos que se producen en caballos, lo máximo que se ha avanzado mediante un tratamiento enzimático para escindir la porción de ese gen. Los antisueros homólogos son los producidos en el hombre, que pueden ser específicos contra una enfermedad, o directamente preparados de sueros. Se busca la gammaglobulina humana obtenida de dadores sanos. La gammaglobulina humana es una fracción del suero que contiene los Ac. También puede usarse gammaglobulina humana inmune. En ello se inicia un plan de inmunización a dadores voluntarios para obtener Ac sobre todo contra algo en especial. En este caso el suero va a estar enriquecido en los Ac que necesitemos. Las gammaglobulinas se usan generalmente en personas que sufren inmunodeficiencia, las gammaglobulinas inmunes, por ejemplo, se usan para mujeres sensibilizadas con el Rh. Las complicaciones con la seroterapia provienen sobre todo con los antisueros heterólogos, ocurren reacciones de hipersensibilidad, sobre todo las alergias producidas por la IgE, que pueden llevar a que cuando vuelve a ingresar al organismo el mismo suero se produce un shock anafiláctico que lleva a la muerte. La “enfermedad del suero” ocurría con los heterólogos, que como perduran durante un tiempo en el organismo, el paciente genera Ac contra esos Ac. Se forman complejos Ag-Ac, que a su vez fijan complemento y pueden depositarse en piel, riñón y desatar una serie de síntomas. La transmisión de enfermedades con el tiempo ha desaparecido por los extensos controles que se le hacen a los sueros.

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La transferencia adoptiva de células T citotóxicas es más complicada porque debe existir una compatibilidad de las moléculas del CMH I. Si no hay alelos compartidos la transferencia no será exitosa por producirse rechazo.

INMUNIZACIÓN ACTIVA O VACUNOTERAPIA

La inmunización activa tiene como objeto establecer niveles adecuados de Ac y generar una población programada de células de memoria tanto T como B capaces de expandirse rápidamente y producir Ac ante un segundo encuentro con el Ag, y para poder así eliminar más rápidamente y eficientemente el patógeno.

Para que una vacuna sea exitosa debe:

Activar las CPA y la producción de IL y otros factores necesarios para que se activen los LT y LB, es decir, que se generen Ac a partir de los LB y se generen células de memoria tanto B como T. El inmunógeno debe persistir en su conformación nativa en las células foliculares, para poder así mantener un estímulo perdurable en el tiempo. Debe se fácil de obtener, ser estable, económica y segura. El primer contacto no debe ser nocivo.

TIPOS DE VACUNAS

Las vacunas virales son las que se van a inocular para obtener una inmunidad contra ese virus, ya sean a través de Ac o células, en este caso la inmunidad humoral es muy importante para la neutralización del virión. Las vacunas virales pueden estar compuestas por los virus vivos atenuados, es decir, se trata del mismo virus que ocasiona la enfermedad. La atenuación se logra generalmente en cultivos de tejidos de especies no humanas, aunque también se pueden generar cepas atenuadas en el hombre. De vez en cuando por mutación del virus en el contagio de persona a persona puede generarse una cepa atenuada. Si se recupera esa cepa atenuada puede utilizársela para inmunizar. Una cepa atenuada mantiene su capacidad infectiva intacta, va a poder ingresar a la célula y replicarse, pero no tiene el efecto patogénico, no va a desatar la enfermedad en el hombre. Ejemplo: la vacuna de la viruela estaba compuesta por un virus pariente de la viruela humana que era la viruela bovina, llamada vaccina. Comparte determinantes antigénicos con la viruela humana.

Los virus inactivados están muertos, no conservan su capacidad de replicarse. Se los puede inactivar con agentes físicos como la radiación, el calor, o químicos como tratamientos con formol. Aún conservan la capacidad de generar una respuesta inmune protectora.

Con virus atenuados inmunidad

celular

humoral

por lo tanto el numero de inoculaciones

es menor (generalmente una sola dosis).

Con virus inactivados solo inmunidad humoral, por lo tanto el número de inoculaciones debe ser mayor.

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De acuerdo al mecanismo infectivo del patógeno va a ser la estrategia de vacunación. Con los virus atenuados, como van replicándose hay una estimulación del sistema inmune a responder. El problema es también la posible reversión a la virulencia que puede sufrir la cepa. Ejemplo: Sabin, anti poliomielítica, es a virus vivos y contiene tres cepas, todas son necesarias para adquirir invasibidad. Una de ellas tiene mayor posibilidad de revertir y así desatar la enfermedad. Estas cepas tienen solamente 10 mutaciones en su genoma que la hacen no patogénica para el hombre. Con una reversión de alguna de estas mutaciones es suficiente para que la cepa retome su virulencia. Las otras dos cepas también son mutadas pero tienen mayor número de mutaciones.

Lo que más se utilizan son vacunas de subunidades virales. Son las subunidades importantes para poder generar Ac solamente para esa subunidad. Debe generar Ac con capacidad neutralizante. Ejemplo: HBs Ag contra la hepatitis B, solamente contiene Ag de superficie del virión.

En cuanto a las vacunas bacterianas se tienen las mismas consideraciones. Ejemplo de bacterias vivas atenuadas es la BCG que es para la tuberculosis. Se inocula una cepa atenuada de Mycobacterius tuberculosis bovino. Para las cepas inactivadas se utilizan los mismos métodos de inactivación que en virus. Los toxoides bacterianos también pueden ser utilizados para generar una respuesta inmune y producción de Ac, por ejemplo el de la difteria y el tétanos, que componen la doble.

El TOXOIDE es la toxina inactivada, tratada con formol generalmente.

Los polisacaridos bacterianos son generalmente Ag T-I, generan una respuesta de tipo inespecífica. Generan igualmente una respuesta inmune con sus Ac efectores, pero no perdurable en el tiempo ya que no generan LBm y LTm. Hay una estrategia de vacunación que es la de los polisacaridos bacterianos conjugados a toxoides como la difteria o tétanos y así en el contexto de respuesta frente a un Ag de tipo T-D, logre convertir a los linfocitos que se activan en linfocitos de memoria. Ejemplo: la cuadruple: Difteria

en linfocitos de memoria. Ejemplo: la cuadruple: Difteria Tétanos B. pertusis Haemophylus influenzae triple La

Tétanos

B. pertusis Haemophylus influenzae

triple

La inmunidad en general cuando es a virus vivo es de por vida, no así la de virus muertos, que requieren refuerzos. En la de virus vivos es posble la reverción a la virulencia, no así en la de virus muertos o inactivados.

Los adyuvantes más utilizados en el hombre son el hidróxido de aluminio y el MF59 que también es una mezcla de aceite-agua.

Las vacunas ADN y vectores microbianos aún es un campo nuevo en las estrategias de vacunación. Se inocula directamente con el ADN.

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VACUNAS COMO AGENTES TERAPEÚTICOS

Es utilizar el Ac generado fuera del hombre, en una especie diferente, que serán anti- idiotipos específicos, por ejemplo.

ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPICOS Las regiones de unión al Ag son los idiotipos del Ac. Son regiones variables, entonces se puede generar Ac contra esta parte, por eso se los denomina anti-idiotipo.

idiotipos

Fc
Fc
Fc
Fc

Anti-idiotipo

Por ejemplo si un LB tiene una Ig de una determinada especificidad, hay muchos tumores de LB que van a expresar muchos Ac iguales con una determinada especificidad. Si se dispone de un Ac anti-idiotipo que reconozca el idiotipo de la Ig de superficie, se va a poder desencadenar algunos mecanismos que lleven a la destrucción de la célula. Este es un uso con fines terapéuticos, no para prevenir.

Este es un uso con fines terapéuticos, no para prevenir. LB ANTICUERPOS ANTI-RECEPTORES O ANTI-MOLÉCULAS SOLUBLES

LB

ANTICUERPOS ANTI-RECEPTORES O ANTI-MOLÉCULAS SOLUBLES Se usan para el tratamiento contra el HIV. El HIV infecta a las células a través de la unión a una molécula CD4. Si se tiene un Ac anti-CD4 se puede bloquear ese sitio e impedir que se una el virus.

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GENÉTICA Y DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS

Siempre se trató de explicar la gran diversidad de Ac. Existían dos teorías a principios de siglo que trataban de explicar esta diversidad:

TEORÍA DE LA LINEA GERMINAL Esta teoría decía que en el genoma estaban todos los genes que se necesitaban para codificar todas las inmunoglobulinas de todas las especificidades que pudieran existir. Postulaba que había un gen para cada tipo de Ig, o sea que el repertorio de Igs era hereditario.

TEORÍA DE LA VARIACIÓN SOMÁTICA O DE LA RECOMBINACIÓN Decía que si bien había muchos genes de inmunoglobulinas, estos genes podían mutar o recombinarse de tal manera de obtener una mayor variabilidad. Para su momento estaba la teoría que decía que cada proteína era codificada por un solo gen.

1 gen

que cada proteína era codificada por un solo gen. 1 gen una proteína La teoría de

una proteína

La teoría de la diversificación somática postulaba que el repertorio se generaba de un conjunto de genes hereditarios que codificaban la porción V de las Ig, los cuales se modificaban de manera particular en cada una de las células B.

Estas se empezaron a complicar cuando se empezaron a secuenciar las Ig. Se vio que las Ig tenían una parte que era muy variable y otra parte muy constante.

una parte que era muy variable y otra parte muy constante. La generación de diversidad se

La generación de diversidad se produce por rearreglos o reordenamientos del DNA que codifican los dominios V de las Ig, proceso que ocurre durante la maduración de los LB. Esta divesidad se incremente aún más por el proceso de hipermutación somática que sufren los LB maduros activados

MODELO DE DREYER Y BENNET (1965) Entonces apareció la hipótesis de que las cadenas H y las cadenas L eran codificadas por dos tipos de genes, uno que codificaba para la parte variable y otro para la parte constante. Estos genes estaban separados en la línea germinal y después se unían para formar un gen que se podía expresar en un LB. También decía que había varios genes que codificaban para la parte variable, y algunos genes que codificaban para la parte constante.

Las cadenas H y L de las Ig están codificadas por distintos grupos de genes. En tods las células, salvo en los LB, los genes que codifican el dominio V de las Ig están muy lejos de los que codifican la porción C. En los LB maduros, los genes V están mucho más

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cerca de los genes que codifican la porción C, como consecuencia de rearreglos de material genético producidos durante la maduración B. Las células cuyos genes de Ig no sufren este arreglo (todas las células, salvo los LB) poseen los genes de Ig en una coniguración denominada “configuración germinal” mientras que los LB maduros poseen los genes de las Ig “ rearreglados”. Este proceso de rearreglo génico se conoce con el nombre de RECOMBINACIÓN SOMÁTICA.

Los genes que codifican para las cadenas H están codificadas en el cromosoma 14. Las cadenas L pueden ser de dos tipos, las y las . Los genes para estas cadenas están en cromosomas diferentes, los genes que codifican para la cadena están en el cromosoma22, y los de la cadena en el cromosoma 2. Para las cadenas L, los genes que van a participar son:

Genes L: codifican para el péptido líder Genes V: codifican para la parte variable. Genes J: codifican para la unión. Genes C: codifican para la parte constante.

Recordar que hay dos alelos para cada gen. Las cadenas H además de contener los genes anteriores, tienen un segmento más:

Segmento de diversidad (solo para las cadenas H).

Cada dominio está codificado por un segmento génico. Por ejemplo para la IgM, la cadena H tiene 4 dominios, entonces van a haber 4 genes. Estos genes están separados en la línea germinal y no se expresan. Tampoco se expresan en ninguna célula del organismo, solo en los LB. En los LB estos genes sufren un procesamiento que es un REORDENAMIENTO GÉNICO que permite que estos genes se expresen. Cada segmento a su vez tiene variantes, por ejemplo para los genes V de la cadena hay 30 variantes, para los segmentos J hay 4. Esto da muchas posibilidades de recombinantes.

Para un proceso de recombinación son necesarias enzimas y SSR o secuencias señal de reconocimiento. Las secuencias SSR están ubicadas en los extremos 3`de todos los genes V, en el extremo 5`y 3`de los genes D, y en el extremo 5`de los genes C. Hay dos tipos de SSR, uno formada por un heptámero palindrómico (7pb) separados por 12 pb de una secuencia monomérica (9pb). El otro tipo de SSR está formado por 23 pb del monómero. Esto se conoce como “regla del 12 + 23”. Estas secuencias son el sitio de reconocimiento de las enzimas y permiten que el reordenamiento se lleve a cabo en forma correcta. Siempre se va a combinar una secuencia con un separador de 12 pb con una secuencia con un separador de 23 pb.

Dentro del conjunto de enzimas que participan hay dos propias de los LT y los LB. Se llaman RECOMBINASAS, están codificadas por dos genes el RAG1 y el RAG2. Las demás enzimas son las mismas de todas las células eucariotas: DNA ligasa, proteín quinasa, etc

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RECOMBINACIÓN

Dos complejos de estas enzimas RAG se unen uno a una SSR separada por 23pb y el otro a otra SSR separada por 12 pb. Las secuencias se van a alinear, se va a formar un loop de ADN y se van a cortar. Se generan así dos segmentos que después tienen que ser unidos. Esos fragmentos que se generan tienen extremos palindrómicos. Para unirlos se deben adicionar nucleótidos que se llaman NUCLEOTIDOS P por enzimas que reparan el DNA. En ese momento también puede actuar otra enzima que se conoce como TdT: DEOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASA TERMINAL. Esta enzima adiciona más nucleótidos. Los nucleótidos que adiciona esta enzima se denominan NUCLEOTIDOS N. Este es otro evento que conduce a generar una mayor diversidad. Se agregan nucleótidos que no están codificados por la línea germinal.

Un evento que contribuye a la diversidad es la adición de nucleótidos P y N.

Esta adición de nucleótidos se produce en la región más hipervariable de la Ig. Entonces tenemos dos factores que generan la diversidad:

Múltiples segmentos génicos para los distintos dominios. Adición de nucleótidos P y N.

Como se sabe las Ig pueden presentarse unidos a las membranas o pueden ser secretadas. Las primeras Ig que se van a sintetizar son la IgM y la IgD. Estas dos se sintetizan de forma simultánea. Para que se sintetice la IgD no se necesita un reordenamiento genético, se sintetiza por un splicing alternativo del ARN transcripto primario. Entonces a partir del mismo ARN transcripto primario se van a generar dos ARNm diferentes, uno lleva a la síntesis de IgM y otro a la síntesis de IgD.

En los LB ocurre también un proceso que se denomina de EXCLUSIÓN ALÉLICA. Cada linfocito debe expresar una Ig de una sola especificidad, pero cada gen está codificado por dos alelos. En todos estos procesos de reordenamiento, si el reordenamiento es productivo, esto quiere decir que se puede sintetizar la proteína, entonces el otro alelo no se reordena.

Reordenamiento productivo en un alelo el otro alelo no se reordena.

En cambio, si el reordenamiento en un alelo es no productivo, se intenta reordenar el otro, si ocurre otro reordenamiento no productivo en el otro alelo la célula induce apoptosis y muere.

Reordenamiento no productivo se reordena el

en un alelo

otro alelo

si vuelve a ser no productivo APOPTOSIS

La adición de los nucleótidos P y N pueden ocasionar el corrimiento del marco de lectura, esto anula la síntesis de una proteína funcional y conduce a un reordenamiento no productivo.

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Supongamos que ya se reordenaron los genes y se está sintetizando la IgM. Para que

esta vaya a membrana necesita asociarse a otras dos proteínas que se van a llamar Ig e

Ig

.

Ig

e Ig son necesarias para que la IgM pueda expresarse en la membrana del LB. Son

proteínas constantes, sin variaciones. Son las encargadas también de transmitir las señales de activación al linfocito. Esto es porque la porción citoplasmática de la IgM de

la membrana es muy corta, las Ig

les es más fácil transmitir señales.

e Ig tienen una porción citoplasmática más larga y

Una vez que el LB se encuentra con el Ag, la IgM que estaba en membrana se comienza

a secretar.

el Ag, la IgM que estaba en membrana se comienza a secretar. Para que la IgM

Para que la IgM se pueda secretar se va a dejar de expresar los genes que le permitía anclarse a la membrana y se van a empezar a expresar otros genes que codifican para secuencias de secreción. Para este proceso no hay reordenamiento genético, sino splicing alternativo del ARNm transcripto primario.

A medida que se va avanzando en un plan de inmunización, si se pudieran separar los

Ac y secuenciarlos (por ejemplo una IgM), a la semana se observarán las secuencias de las partes variables de las Ig, y se verán ciertas regiones con mayor variabilidad. Esto ocurre tanto para las cadenas H como para las cadenas L. Dos semanas después se observará que la variabilidad aumenta muchísimo más. Estas variaciones se producen por un fenómeno de HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA. Todos los genes pueden tener una determinada tasa de mutación. En los genes de Ig, y

en estas zonas en particular de hipervariación, estas mutaciones están muy elevadas.

Estas hipermutaciones pueden generar Ac que pueden tener mayor afinidad por el Ag o que pueden tener menor afinidad. Por un proceso se van a ir seleccionando los Ac que tengan mayor afinidad, y se conoce como MADURACIÓN DE LA AFINIDAD. Se produce a lo largo de una respuesta inmune. La enzima que participa en el proceso de hipermutación se llama histidina deaminasa (AID) y es inducible por activación.

Existe otra variación que se puede producir en las Ig que se llama CAMBIO DE CLASE o CAMBIO DE ISOTIPO. Las IgM y la IgD se sintetizan en conjunto y no necesitan de un reordenamiento de genes para poder expresarse las dos. Para poder expresar las otras Ig (IgG, IgE e IgA) se necesita un proceso de recombinación que se produce gracias a unas secuencias que hay en las cadenas H que se denominan secuencias S o de Switch. Son motivos repetitivos de nucleótidos. Se ubican en la región 3`de los genes de cadena , y en la región 3`de cada uno de los otros genes de la cadena H. No en el gen de la cadena .

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La enzima que participa es la misma que produce hipermutación somática. No se sabe el mecanismo que le permite a esta enzima actuar en dos procesos distintos. Entonces, cuando se unen una de estas dos secuencias repetidas S se forma una horquilla de ADN que después es cortada. De esta manera se pierde la expresión de las IgM e IgD y se puede empezar a expresar las otras cadenas H. Este proceso depende de las citoquinas que produzca el LT y se produce a lo largo de una respuesta inmune activa. Entonces, se van a poder expresar las distintas Ig que van a tener la misma especificidad por el antígeno pero que van a tener distintas regiones constantes y por lo tanto van a poder ejercer distintas funciones.

Recordando como es una molécula de Ac:

distintas funciones. Recordando como es una molécula de Ac: Tiene cuatro cadenas, dos cadenas pesadas H

Tiene cuatro cadenas, dos cadenas pesadas H y dos cadenas livianas L. Cada una de estas cadenas tiene una parte constante y una parte variable. La parte que se une al Ag es la parte variable. En la parte variable hay una zona que son los CDR que son las regiones determinantes de complementariedad y hay tres: CDR 1 , CDR 2 y CDR 3 en cada cadena, tres en las H y tres en las L. Son las zonas de unión al Ag. La más variable es la región CDR 3 . Las cadenas H pueden ser de 5 clases: , , , y . Las cadenas L pueden ser de dos clases: o . Las más comunes en el hombre son las cadenas . Estas Ig están codificadas por distintas familias de genes, que en la línea germinal tenían un cierto orden. Para que se puedan expresar en los linfocitos esos genes tienen que reordenarse o recombinarse. Las enzimas que participan se llaman recombinasas, la RAG1 y la RAG2. Estas también participan en la recombinación del receptor de los LT. Además hay unas secuencias señal de recombinación o SSR que le indican a las enzimas donde deben unirse. Para cada cadena se producen distintos procesos. Cuando se unen los segmentos se produce la adición de nucleótidos con la enzima deoxinucleotidil transferasa terminal o TdT. Esta enzima agrega los nucleótidos N y los nucleótidos P en los puntos de corte, lo que aumenta la diversidad. Entonces la diversidad se genera antes que el linfocito se encuentre con el Ag y después. Los eventos que ocurren antes del encuentro con el Ag son la recombinación de los genes VDJ y la adición de nucleótidos N y P. Los eventos que ocurren después de encuentro con el Ag son la hipermutación somática, en la cual se generan mutaciones en las regiones hipervariables de las Ig; y el otro fenómeno es el cambio de isotipo, que se conoce como Switch. Para este switch se debe producir una recombinación, participa la enzima citidil deaminasa inducida por activación y participan unas secuencias de reconocimiento que se conocen como secuencias S.

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Rearreglos de la porción variable de las cadenas liviana (VL) y pesada(VH):

El dominio V de la cadena L está codificado por dos genes diferentes: el primer gen (V L ) codifica la mayor parte del dominio variable. El segundo gen (J L ) codifica los restantes aminoáciodos del dominio V. La asociación de un gen V L con un gen J L produce un exón continuo que codifica todo el domio VL. Una vez que se produjo la asociación V L -J L este segmento queda seprado de la región CL por un intrón y es esta configuración la que se trascribe al RNAm. Para producir una cadena liviana completa, luego de la transcripción, el intrón que separa al fragmento VL-JL del gen CL se elimina por corte y empalme del RNAm (splicing). El dominio V de la cadena H está codificada por tres genes diferentes denominados V H , D H y J H . El proceso de recombinación somática que produce un dominio VH involucra dos etapas. En la primera se produce la asociación del gen

D H con el J H y, luego, la porción D H -J H rearreglada se asociará con el gen V H para

generar el exón completo (V H D H J H ) que codifica el dominio VH. Al igual que para la cadena L la asociación de la región VH con la región CH vecina se produce por corte y empalme del RNAm. El DNA en configuración germinal contiene múltiples genes V, D y J. La selección de un segmento u otro hace la posible la gran diversidad de dominios V en las Ig. Es posible generar distintas porciones variables de las Ig gracias a la selección de alguno de los múltiples genes V, D y J para la cadena H, o V y J para la cadena L:

-Para la cadena L existen al menos 40 genes funcionales V y 5 genes J

- Para la cadena L existen 30 genes funcionales V y cuatro genes J

- Para la cadena H humana existen 65 genes V H funcionales, aproximadamente 27

genes D H y 6 genes J H . Durante la ontogenia B se produce en primera instancia el rearreglo de la cadena H. Luego la célula comienza varios ciclos de proliferación y posteriormente, cada una de las células hijas cuyas cadenas H ya fueron rearregladas, comienza un arreglo independiente de la cadena L. La diversidad es aún mayor devido a la unión impresisa de los segmentos génicos y al proceso de hipermutación somática que sufren los LB maduros activados.

El proceso de recombinación somática está guiado por secuencias señales de recombinación e involucra distintas enzimas:

Debe existir un sistema que asegure el ensamblado correcto de los distintos fragmentos génicos durante el proceso de recombinación somática, de manera que un fragmento V se asocie con uno D o J, pero no con otro gen V. La recombinación solo ocurre entre fragmentos génicos que se encuentran en el mismo cromosoma y está guiada por secuencias conservadas de DNA no codificante denominadas secuencias señales de recombinación (SSR). Estas se encuentran adyacentes a los puntos donde se lleva a cabo la recombinación. La recombinación somática está guiada por secuencias conservadas de DNA no codificante. Esta secuencias consisten en un bloque de 7 nucleótidos (heptámero), contiguo a la secuencia codificante, seguido por otro bloque de 9 nucleótidos (nonámero). Mientras que los heptámeros y nonámeros presentan una secuencia conservada, los espaciadores varían en su secuencia pero conservan su longitud (12 o 23 nucleótidos). La región heptámero-espaciador-nonámero recibe el nombre de secuencia señal de recombinación (SSR).

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La recombinación somática suele seguir la “regla 12+23”. Esto es, que un segmento génico flanqueado por una SSR que integra une espaciador de 12 nucleótidos se podrá unir a otro segmento flanqueado por una SSR con espaciador de 23 nucleótidos. Para la cadena H, esta regla asegura la asociación correcta de fragmentos V H -D H -J H , ya que los genes V H y J H (flanqueados por SSR con espaciadores de 12 pb) pueden asociarse con los fragmentos D H (flanqueados por SSR con espaciadores de 23 pb), pero no pueden asociarse entre sí. Los mecanismos por los cuales se produce la recombinación somática que dará lugar a la cadena H son similares a los utilizados para generar la cadena L. la forma más común de recombinación involucra la formación de un bucle (loop) de DNA y la pérdida posterior de material genético que se encuentra entre los fragmento recombinados en forma de DNA circular La unión entre los fragmentos recombinados (V L -J L , o V H -D H -J H ) es imprecisa y esta característica representa una fuente adicional de variabilidad para la porción variable de las Ig. El complejo enzimático que actúa para producir la recombinación V(D)J se conoce con el nombre recombinasa V(D)J. Los productos de los genes RAG-1 y RAG-2 forman parte de esa recombinasa y solo se expresan en linfocitos en desarrollo. Estas enzimas poseen actividad de endonucleasa y son las responsables del corte de la cadena de DNA. Por el contrario, el resto de las enzimas que forman parte de las recombinasas presentan una expresión ubicua y están involucradas en la reparación, modifcación y plegado del DNA de todas las células. Las enzimas de reparación de las cadenas de DNA incrementan aún más la diversidad, ya que son capaces de agregar o eliminar nucleótidos al azar en los sitios de unión de los fragmentos génicos. Los nucleótidos adicionados se conocen como nucleótidos P y N. Los nucleótidos P se adicionan por las enzimas responsables de la reparación del DNA y reciben este nombre debido a que generan secuencias palindrómicas. Los nucleótidos N son adicionados sin molde por la enzima TdT, y se encuentra principalmente en las uniones V H -D H y D H -J H . La presencia de nucleótidos N en la cadena L es menos común porque la enzima TdT, en los LB, solo se expresa durante el rearreglo de la cadena H que es previo al rearreglo de la cadena L. Los nucleótidos también pueden ser eliminados por mecanismos no muy bien definidos hasta el momento, que involucran enzimas con actividad exonucleasa. Como el número de nucleótidos eliminados y adicionados por estos mecanismos es al azar, en el cambio de lectura que lleven a la reducción de proteínas no funcionales (rearreglos no productivos). Para que un LB pueda desarrollarse normalmente debe lograr un rearreglo productivo de su Ig, de no ser así, no podrá continuar con su desarrollo y morirá por apoptosis.

Resumiendo:

La generación de diversidad en el repertorio de Ig se produce por los siguientes mecanismos:

-La existencia de distintos segmentos V, (D )y J de H y L. Mientras que un LB durante su ontogenia utiliza un determinado conjunto de segmentos génicos para la generación de sus dominios variables, otro LB utilizará un conjunto diferente y generara diferentes dominios VH y VL. -La asociación de la cadenas H y L. El paratope o sitio de reconocimiento del Ac involucra los dominios variables de las cadenas H y L, cada una de las cuales se rearregla en forma independiente.

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-La unión imprecisa de los segmentos génicos, que produce diversidad por la adición y sustracción de nucleótidos. -La hipermutación somática, que incrementa el repertorio de Ig luego del reconocimiento antigénico.

Un mismo exón VH puede asociarse con distintos genes CH durante el curso de la respuesta inmune:

El cluster de la cadena H presenta distintos sets de regiones C H , cada uno de los cuales corresponde a un diferente isotipo de Ig. Todos los linfoncitos comienzan expresando un BCR que contiene IgM, esto ocurre en el estadío de LB inmaduro, lo que implica que el exón del dominio VH debe asociarse, en primera instancia, con el gen C . Inmediatamente después del gen C se encuentra el gen C , el cual codifica la porción constante de la cadena H de la IgD. Los LB maduros coexpresan en la membrana Ig de isotipo IgM e IgD, como parte del BCR. Ambas Ig presentan una única especificidad ya que comparten los mismos dominios V tanto en la cadena L como en la cadena H. Esto se explica gracias a que el exón VH generado por recombinación somática puede ser transcripto junto con los genes C o C . La asociación de un mismo dominio VH con la región C o C se produce por corte y empalme alternativo del RNAm. Los LB activados pueden realizar un cambio o switch de isotipo, en donde también un mismo dominio VH se asocia con distintos isotipos. Sin embargo, los mecanismos responsables de este proceso son distintos de los responsables de la coexpresión de IgE IgD en los LB maduros.

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VIDA DE UN LINFOCITO B

Se puede dividir en 4 etapas:

1˚ etapa: producción y maduración en la médula ósea. 2˚ etapa: eliminación de LB que reconozcan Ag propios. 3˚ etapa: activación del LB por el encuentro con el Ag. 4˚ etapa: diferenciación a célula plasmática productora de Ac.

PRIMERA ETAPA: ONTOGENIA B

Todas las células hematopoyéticas se originan de un precursor común, esta es una stem cell o célula troncal que tiene la capacidad de multiplicarse independientemente. La célula troncal en la médula ósea tiene los genes de las cadenas H y cadenas L en la configuración de la línea germinal, es decir, que no va a expresar ni cadenas H ni cadenas L, por lo tanto ninguna Ig. Esta célula se va a transformar en una célula pro-B temprana cuando empiece a reordenar los genes de la cadena H. Entonces, los primeros genes que se reordenan son los de la cadena H, sus segmentos DJ. En este estadio las cadenas L siguen estando en la configuración de la línea germinal y todavía no se expresa ninguna proteína. Cuando se comienzan a reordenar los genes V de la cadena H, el LB pasa a llamarse célula pro-B tardía. Todavía no se reordenan los genes de la cadena liviana, y aún no se expresa ninguna proteína. Cuando terminan de reordenarse los genes de cadena H, el LB se llama célula pre-B grande. Este linfocito ya reordenó los genes VDJ de cadena H, todavía no reordenó los genes de la cadena L, empieza a producir muchas cadenas H. La primera Ig que se produce es la IgM, es decir, que las primeras cadenas H que se producen son de tipo , pero para que estas cadenas H se puedan expresar, deben estar asociadas a una cadena

L. Como los genes de cadena L aún no se reordenaron se sintetiza una cadena liviana

sustituta. Así, en el estadío de célula pre-B grande se expresan cadenas H asociadas a unas cadenas L sustitutas. Para que la Ig se pueda expresar en la membrana debe asociarse a otras dos proteínas que se llaman Ig e Ig . Estas dos proteínas siempre se asocian cuando la Ig se expresa en membrana, y forman parte del receptor B (BCR). En esta etapa de célula pre-B grande se inhiben las enzimas de la recombinación y la célula

se multiplica, es decir, la célula empieza a proliferar. Se generan así alrededor de 30 a 70 células pre-B pequeñas. En el estadio de célula pre-B pequeña comienzan a reordenarse los genes de las cadenas

L. Las cadenas H se siguen sintetizando, pero no se van a expresar, se almacenan en el

RE. También se sintetizan las moléculas Ig e Ig . El próximo estadío, cuando ya se reordenan los genes de cadena L, se llama célula B inmadura. Esta célula B inmadura ya puede expresar una IgM entera en su membrana. La IgM junto con la Ig e Ig conforman el BCR. Para que el linfocito pase a célula B madura debe expresar además la IgD en membrana. La IgM y la IgD se expresan simultáneamente sin necesidad de

reordenamiento genético, sino solo un splicing alternativo del mismo ARN transcripto

primario.

El reordenamiento de los distintos segmentos con la adición de los nucleótidos puede generar secuencias que no estén en el correcto marco de lectura. Cuando se generan ese

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tipo de secuencias se dice que el reordenamiento es un REORDENAMIENTO NO PRODUCTIVO. La célula B tiene la posibilidad de reordenar los genes de ambos cromosomas. En el LB existe la EXCLUSIÓN ALÉLICA, es decir, que solo se expresan genes de un cromosoma. El LB en su estadio de pro-B temprano reordena los genes de cadena H de los dos cromosomas.

El primer reordenamiento D-J se produce en los dos cromosomas.

En el estadio de célula pro-B tardía, cuando ya se produjo el reordenamiento V-D-J en uno de los cromosomas, si ese reordenamiento es productivo, la célula continúa la evolución. Si no es productivo, es decir, si se generó alguna secuencia que no estaba en el marco de lectura adecuado, la célula intenta reordenar el otro cromosoma. Si este nuevo reordenamiento es productivo la célula sigue, si no es productivo la célula muere por apoptosis. Supongamos ahora que la célula reordenó las cadenas H de forma correcta. Llegamos al estadio de célula pre-B, donde comienzan a reordenarse los genes de la cadena L. El reordenamiento comienza siempre por las cadenas . Entonces, comienzan a reordenarse las cadenas de un cromosoma. Si el reordenamiento es productivo la célula sigue, si no es productivo la célula intenta reordenar los genes del otro cromosoma. Si este reordenamiento es productivo se llega a un LB inmaduro que va a expresar una IgM que va a tener las cadenas H de tipo y las cadenas L de tipo . Si el reordenamiento de las cadenas no fue productivo, comienzan a reordenarse las cadenas . Se reordena la cadena de un cromosoma, si es productivo la célula sigue y se obtiene un LB que va a expresar una IgM con cadenas pesadas y cadenas livianas . Si el reordenamiento no fue productivo la célula trata de reordenar el otro cromosoma, si no es productivo se muere por apoptosis, y si es productivo se tiene un LB inmaduro que está expresando una IgM con cadenas L .

Para que todo esto se lleve a cabo de forma ordenada y semicojugada, el linfocito tiene que saber cuando tiene que dejar de expresar las enzimas de la recombinación, sino se estarían recombinando las cadenas indefinidamente. Entonces, hay puntos de control para que el linfocito deje de expresar las recombinasas y cesen los procesos de recombinación. Los puntos de control van a estar dados en el estadío de célula pre-B grande, cuando el linfocito expresa la IgM con la cadena sustituta. La expresión de esta molécula en membrana le envía señales al linfocito para que deje de sintetizar recombinasas. En esta etapa en que no hay recombinación el linfocito prolifera. El otro punto para que el linfocito deje de recombinarse es cuando ya está en el estadio de célula B inmadura. Ya produjo la IgM correcta. La expresión de este producto en membrana también le indica al linfocito que debe dejar de recombinarse.

La cadena L sustituta esta formada por una región que se llama V pre B y otra 5 555 , que sería la parte constante. La IgM es el receptor de los LB vírgenes, los LB de memoria pueden tener otros isotipos, fundamentalmente IgG.

Durante todo este proceso de ontogenia B, que la célula pluripotencial se empieza a diferenciar, participan de manera muy activa las células del estroma de la médula ósea. Entonces, es importante la interacción entre el linfocito y las células estromales de

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médula ósea. Y no solo es importante la interacción, sino también los factores que estas células producen. Un factor muy importante en el inicio de esta transformación es la IL- 7. A medida que el linfocito va evolucionando se va haciendo menos dependiente de todos estos factores hasta que puede salir de la médula ósea y dirigirse hacia los órganos linfoides secundarios.

Todos estos procesos deben estar muy bien regulados y la expresión de los genes para las distintas enzimas también tiene que estar controlado. La enzima TdT se expresa siempre que se reordenen las cadenas H, cuando se reordenan las cadenas L esta enzima no se expresa. Por eso en el reordenamiento de las cadenas L no hay adición de nucleótidos.

Antes de que se produzca cada evento de recombinación, se produce una pequeña transcripción de los elementos que se van a recombinar. Esto se hace para que las enzimas recombinasas se dirijan hacia los genes de las Ig y no hacia los genes del receptor T. Todo esto es para un tipo particular de linfocito: LB2. Hay tres tipos de linfocitos B:

LB1, LB2 y LBZM. Los LB2 son los mayoritarios. La otra población, los LB1, que son los primeros que se producen durante el desarrollo embrionario (por eso se llaman LB1), tiene un BCR que es menos diverso. Los primeros que se producen durante la vida fetal tienen muy poca diversidad en las uniones, y en esa época no se expresa la enzima TdT. Por lo tanto no se adicionan los nucleótidos N. Entonces, estos receptores de estos linfocitos tienen una menor variabilidad. Después del nacimiento aumenta la variabilidad porque sí se expresa la enzima TdT. Pero de todos modos la variabilidad es menor que para los LB2. Este tipo de linfocito va a producir solamente IgM en su mayoría y muy poca cantidad de IgG. Son células que no van a generar células de memoria y son linfocitos donde tampoco se va a producir el fenómeno de hipermutación somática. Después del nacimiento se produce durante algún tiempo en la médula ósea, pero llega un momento en que la médula ósea no la produce más. Se mantienen por autorrenovación. Estos linfocitos producen Ac contra polisacáridos y contra ciertos hidratos de carbono. Estos son Ag TI-2. Como los Ac que producen son de menor afinidad se pueden unir a una gran cantidad de Ag, entonces se dice que son poliespecíficos. Los LB1 se localizan principalmente en la cavidad peritoneal y pleural, en cambio los LB2 están en los órganos linfoides. La autorrenovación de los LB1 parece que depende de IL-10.

SEGUNDA ETAPA: SELECCIÓN Y DESARROLLO ADICIONAL DE LB

El receptor de los LB debe ser capaz de no reconocer a los Ag propios. Los Ag propios se denominan autoantígenos. Estos autoantígenos pueden ser glucoproteínas, proteoglicanos o glucolípidos de las membranas celulares. Otro tipo de autoantígeno pueden ser proteínas que se encuentren en elevada concentración en el plasma o en la linfa. Este reconocimiento de autoantígenos se puede dar en el estadio de LB inmaduro. Entonces, en el estadío de LB inmaduro, que tiene Ig en su membrana con las otras dos moléculas asociadas, el LB va a sufrir un proceso que se puede denominar como INDUCCIÓN DE TOLERANCIA CENTRAL, que se produce en la médula ósea,

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aunque también puede ser cuando el linfocito recién haya salido de la médula ósea. Este proceso va a hacer que los LB que reconozcan Ag propios mueran por apoptosis o se transformen en anérgicos. Que ocurra una cosa u otra va a depender del tipo de autoantígeno con el que se encuentren y del tipo de señal que reciban. Si el linfocito no recibe ninguna señal, no reconoce ningún Ag, entonces va a transformarse en un LB maduro que expresa las dos Ig: la IgM y la IgD. Si el linfocito se encuentra con un Ag multivalente recibe una señal muy fuerte e intensa, entonces este linfocito muere por apoptosis. Si en cambio el linfocito recibe una señal débil, como las que dan las proteínas que están en concentración elevada en plasma o en linfa, el linfocito no muere sino que entra en estado de anergia o no respondedor. Este linfocito deja de expresar la IgM y empieza a expresar más IgD. Este linfocito no va a poder después activarse.

célula B anérgica: expresa poca IgM y mucha IgD.

Así este linfocito por más que valla a un órgano linfoide secundario no va a responder. Pero los LB tienen una propiedad que les permite volver a sintetizar un nuevo receptor, que se conoce como RE-EDICIÓN DEL RECEPTOR B. Si el LB se une a un autoantígeno multivalente y lo reconoce con una intensidad fuerte, antes de entrar en apoptosis intenta reordenan otra vez los genes de cadena L. Entonces se activan nuevamente las recombinasas, se reordenan los genes de cadena L y se intenta sintetizar una nueva cadena L. Si la nueva Ig de membrana no reconoce ningún Ag propio, el linfocito sigue su curso. Si lo reconoce muere por apoptosis. Esto es una particularidad de los LB que se llama re-edición del BCR, y les da una nueva posibilidad de continuar el proceso de maduración. Las cadenas L nuevas que se sintetizan reemplazan a las otras y se expresan en membrana. Ese linfocito inmaduro que expresa la IgM, que no reconoce ningún Ag propio se transforma en linfocito maduro y puede quedar en médula ósea o salir de ella. Cuando el LB maduro sale de médula ósea puede ir al ganglio linfático. Es decir, que los LB maduros van a los órganos linfoides secundarios. Pueden ubicarse algunos en los tejidos linfoides asociados a mucosas, pueden ubicarse en el bazo o en los ganglios. Prácticamente ocurre lo mismo en los tejidos linfoides secundarios. El LB maduro entra al ganglio por la sangre, y sale de los vasos sanguíneos por las vénulas del endotelio alto. Estas vénulas tienen características especiales que no tienen las otras células endoteliales del resto del organismo. Los LB a través de las moléculas de adhesión van a entrar en contacto con las moléculas de adhesión que expresan estas células endoteliales y van a poder salir. En el ganglio va a haber algunas zonas donde van a predominar los LT y otras donde van a predominar los LB. El linfocito que salió del vaso sanguíneo se va a ubicar en un folículo primario o FOLÍCULO LINFOIDE PRIMARIO. En este folículo van a estar los LB vírgenes que nunca se contactaron con un Ag, va a haber macrófagos y va a haber un tipo particular de célula dendrítica llamada célula dendrítica folicular (CDF). Esta CDF no fagocita ni presenta Ag. Es decir, que no tiene la misma función que las otras células dendríticas. Todos los LB para poder sobrevivir deben pasar por el folículo linfoide primario. Si no encuentran ningún Ag están un tiempo en este folículo primario y después salen, y vuelven a circular. Continuamente en el folículo primario están ingresando LB vírgenes, hay un continuo recambio de linfocitos. Los LB salen del ganglio por un vaso linfático eferente.

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Si el linfocito contacta a un Ag lo va a reconocer a través de la Ig que tiene en su membrana. Este reconocimiento le va a mandar una serie de señales hacia el interior

celular, pero a su vez este LB, para poder seguir montando la respuesta inmune necesita encontrarse con un LTh que previamente fue activado con el mismo Ag. El LB así activado comienza a proliferar. Algunos LB que proliferan van a transformarse rápidamente en PLASMOCITOS y van a producir Ac. Los plasmocitos se van hacia la médula del ganglio, algunos salen del ganglio y van a la médula ósea. Estos primeros Ac que se producen son del tipo IgM. Siempre en una respuesta primaria lo mayoritario que se produce es IgM. La respuesta primaria es la reacción ante la primera entrada del Ag al organismo. Otra parte de los LB que proliferan comienzan a formar un FOLÍCULO LINFOIDE SECUNDARIO. Los folículos secundarios son simplemente LB proliferantes, con macrófagos y CDF. Así, después del contacto con el Ag y con el LTh se generan una mayor cantidad de LB específicos para el mismo Ag. Los LB en proliferación se llaman centroblastos y forman lo que se conoce como CENTRO GERMINAL. Los centroblastos son LB que ya reconocieron al Ag, no son vírgenes. Por ello los centroblastos no expresan Ig en su membrana.

A los centroblastos les ocurre la hipermutación somática y el cambio de clase o isotipo

(switch). Estos dos procesos ocurren mientras los linfocitos están dividiéndose. Estos linfocitos van a producir Ac de mayor afinidad, porque sufrieron hipermutación somática, y que pueden ser de distinta clase: IgG, IgA o IgE. El cambio de clase depende de citoquinas producidas por los LTh.

Los centroblastos dejan de dividirse en algún momento y se transforman en centrocitos. Los centrocitos ya sufrieron la hipermutación somática y el cambio de isotipo. Pero cuando se produce el fenómeno de hipermutación somática se pueden generar receptores que tengan mayor afinidad por el Ag o menor afinidad por el Ag. Esto es porque las mutaciones son al azar. Es por eso que se produce un proceso de selección de los centrocitos. Por supuesto que sobreviven los más fuertes, por lo que quedan los que tengan mayor afinidad. Para esta selección tienen que interactuar con el Ag. El Ag va a estar pegado a la CDF. Las CDF tienen receptores para el complemento, receptores para el Fc de las Ig, o receptores que pegan al Ag solo. Los Ag pegados a la membrana de las CDF forman como perlitas que se denominan icosomas: acumulo de Ag en la membrana de las CDF. Entonces, el LB a través de su receptor tiene que contactarse con el Ag que está pegado a la CDF. Las que tengan un receptor de alta afinidad se van a contactar fuertemente al Ag. Los de baja afinidad no. Los LB de mayor afinidad se seleccionan y van a poder transformarse en células B de memoria o en plasmocitos de larga vida. Para que puedan hacer esto también necesitan el contacto con los LTh.

En resumen, una parte de la vida del linfocito es independiente del Ag, que va desde la célula troncal al LB maduro virgen. Es independiente porque nunca se contacta con ningún Ag.

A

partir del LB maduro comienzan fases que dependen del Ag.

Si

un LB no reconoce a ningún Ag tiene un tiempo de vida de 3 a 4 semanas y después

muere.

-no expresan Ig en su membrana Células plasmáticas -no expresan MHC solo secretan Ac. -no presentan Ag

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Las células de memoria pueden quedarse en los órganos linfoides secundarios o pueden recircular y volver a otros órganos linfoides secundarios. Estas células de memoria son las primeras que actúan cuando ingresa un Ag por segunda vez y producen sobre todo IgG. Esta es una característica de la respuesta secundaria.

Los linfocitos que reconocían al Ag proteicos propios recibían una señal de baja intensidad y se transforman en LB anérgicos. Los LB anérgicos no responden porque no pueden entrar en los folículos primarios; otras teorías dicen que necesitan más concentración de los factores necesarios para que se activen. Uno de ellos se llama BAFF.

Hipermutación somática y aumento de la afinidad de los Ac:

La hipermutación somática (HS) es un mecanismo por el cual la porción variable de las cadenas pesadas y livianas de las Ig sufren mutaciones puntuales con una tasa muy alta. Como consecuencia, luego de cada mitosis, la células hijas expresan porciones V(D)J diferentes del LB que les dio origen. Ninguna otra célula somática posee un nivel de mutaciones tan alto como los centroblastos. Este mecanismo constituye la base molecular de un proceso muy ventajoso para el organismo: la generación de Ac de mayor afinidad a medida que progresa la respuesta inmune humoral. Los centrocitos, que se originan de los centroblastos, expresan en su membrana Ig mutadas. Esto significa que expresan Ig distintas de las del LB que reconoció por primera vez al Ag. Como las mutaciones se producen al azar, muchas de ellas son perjudiciales para el LB que las porta ya que, por ejemplo, pueden impedir la expresión de la Ig en la membrana, lo que conduce a apoptosis de la célula B. Otras mutaciones disminuyen la capacidad de reconocimiento del epitope antigénico, lo que provoca también apoptosis celular. Las mutaciones nocivas son frecuentes y por ello en el centro germinal también se encuentran numerosos macrófagos que son los encargados de fagocitar a los centrocitos apoptóticos que se generen. Algunas mutaciones de las porciones V(D)J van a incrementar la afinidad del la Ig por el Ag y serán los LB que han sufrido estas mutaciones los que sean seleccionados en el centro germinal.

TERCERA ETAPA: ACTIVACIÓN DE LOS LB

Para que un LB se active debe reconocer al Ag y necesita un entrecruzamiento de receptores. Esta interacción envía señales al interior celular. Esta interacción aún no es suficiente, se necesitan señales de otras moléculas que también están insertas en la membrana y que son la CD19, el receptor CR2 y la molécula CD81. En particular, el CR2 es un receptor para una fracción del complemento, la fracción C3d. Si algún microorganismo tiene fijada esta fracción C3d, el LB necesita menos cantidad de Ag para activarse porque estará recibiendo mayores señales. Este receptor es importante en la activación de los LBZM y responde rápidamente a Ag que entran por sangre. Estos LBZM no necesitan de la colaboración T. La activación del LB va a depender del tipo de Ag. Algunos Ag no necesitan la colaboración T, estos son los Ag TI de los cuales hay dos tipos: los Ag TI-1 y los Ag TI-2. De los Ag TI-1 el más conocido es el LPS (el lipopolisacarido) de la pared

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celular de la bacteria. Este Ag puede ser reconocido tanto por otros receptores de la

célula B, como por una molécula que se llama CD14. Esta se une a otra que es ligadora de LPS, la LBP, y si el LB tiene su BCR específico para el LPS estas interacciones hacen que se activen, proliferen y produzca IgM específica para el LPS.

A su vez, el LPS puede inducir la activación de un linfocito que tenga un receptor para

un Ag diferente en esa misma bacteria. Otra vez no es necesario la colaboración T porque las señales que provee el LPS intensifica el resto de las señales. Entonces el LB se activa y puede producir Ac que no son específicos para el LPS, sino para otra proteína de la bacteria. Así, el LPS induce la producción de Ac específicos contra Ag sin necesidad de colaboración T. Los Ag TI-2 son los que tienen epitopes repetitivos, de hidratos de carbono por ejemplo. Pueden ser polisacáridos, fosfatidilcolina, etc. Como tienen muchos epitopes repetidos producen una fuerte señal en el LB y lo activan. Esto es, porque tienen capacidad de inducir entrecruzamiebto del BCR en la superficie del LB1.

Los LB que se activan por este tipo de Ag son los LB1. Los LB1 que se activan proliferan y se diferencian a plasmocitos para producir fundamentalmente IgM.

Los otros Ag son TD, por ejemplo las proteínas. Los principales linfocitos que responden a este tipo de Ag son los LB2 que sí necesitan la colaboración del LTh.

Entonces, el LB2 reconoce al Ag en forma nativa a través de su Ig de membrana. Esto

ya le provee al linfocito una primer señal, pero que no es suficiente.

El LB2 además tiene la capacidad de poder endocitar el Ag que tiene unido, lo puede

degradar y lo puede presentar a un LT. Así, la Ig de membrana del LB2 tiene dos

funciones: por un lado reconocer al Ag con entrecruzamiento de receptores necesaria para la activación, y por otro lado lo puede endocitar, procesar y presentar en el contexto de una MHC-II.

El

LTh está activado porque ya reconoció antes al mismo Ag, aunque no precisamente

el

mismo epitope que reconoció el LB. El LTh reconoce al Ag que le muestra el LB2 a

través del receptor TCR, pero no es suficiente, debe haber interacción con otras moléculas de membrana. Una de ellas, muy importante para todo el proceso es la CD40 del LB2. Esta tiene un ligando en el LTh llamado CD40L.Esta interacción es la que envía la segunda señal al LB2 y es la que hace que en el LB se comience a expresar la molécula IKAM 1. IKAM 1 favorece el contacto con el LTh.

El linfocito también va a producir citoquinas durante el contacto que van a actuar sobre

receptores del LB. Una citoquina muy importante del proceso es la IL-4. Esta hace que

el LB empiece a proliferar: una parte se diferencia a plasmocitos para producir IgM y la

otra parte forma el centro germinal. Los LTh también proliferan después del contacto y migran con el LB al centro germinal y se ubican en la periferia.

Las citoquinas que intervienen en el cambio de isotipo son IL-5, IL-6 y TGF- . Estas IL favorecen que se empiece a sintetizar otras Ig.

Los centrocitos deben volver a encontrarse con un LTh. Los centrocitos toman el Ag de los CDF, lo procesan otra vez y se lo presentan al LTh. Se vuelven a producir las mismas interacciones: CD40-CD40L, y el centrocito va a poder diferenciarse a célula de memoria o a célula plasmática.

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Parece ser que las interleuquinas que tienen que ver en esto son la IL-4 y la IL-10. La IL-4 favorece a las células de memoria y la IL-10 a los plasmocitos. Las interacciones entre el LB y el LT a través de las moléculas de adhesión es la que se conoce como SINAPSIS INMUNOLÓGICA.

Los LB como tienen la capacidad de expresar las moléculas del CMH-II se llaman células presentadoras de antígeno profesionales.

Repasando:

Vimos que la producción del LB maduro se produce en la médula ósea. Durante todo el proceso el LB va reordenando los genes de las Ig. Reordena primero los genes de la cadena H y después los genes de la cadena L. De los de la cadena L reordena primero los y luego los . En los LB hay exclusión alélica y siempre se intenta el reordenamiento en un cromosoma y si no es productivo se intenta en el otro. En estos procesos actúan las recombinasas, las SSR, las enzimas TdT que participa solo en las

cadenas H. El LB recibe la señal para dejar de reordenar sus genes cuando se comienza

a expresar una molécula de membrana. Cuando el LB expresa el receptor pre-BCR cesa

el reordenamiento y comienza a proliferar. El receptor pre-BCR está formado por las cadenas pesadas de tipo y la cadena liviana sustituta, siempre acompañado por Ig e Ig . El otro momento donde cesa el reordenamiento es cuando se expresa el BCR que es una IgM acompañado por una Ig e Ig . En este momento es un LB inmaduro. En el estadío inmaduro se produce una selección para solo sobrevivir aquellos LB que no reconozcan Ag propios. Entonces, si no reciben ninguna señal a través de su BCR pasan a sen LB maduros. Estos van a expresar la IgM y la IgD. Los LB inmaduros que reciben señales muy fuertes e intensas que provienen de Ag propios multivalente de tipo particulado directamente mueren por apoptosis. Pero estos LB tienen la posibilidad de reeditar su receptor: antes de morir pueden intentar un nuevo reordenamiento de sus cadenas L para que no reconozcan Ag propios. Si la señal era débil, producida por los autoantígenos de tipo proteína, el LB se transforma en LB anérgico, un linfocito que no es capaz de responder ante una respuesta inmune.

El LB maduro sale de la médula ósea y se dirige a los órganos linfoides secundarios, por ejemplo un ganglio. Aquí puede ser que se encuentre con un Ag o no. Si no se encuentra con ningún Ag permanece un tiempo en el ganglio y luego sale y recircula. Si reconoce

a un Ag se activa: por un lado se une al Ag y esto ya le da una señal, y después necesita entrar en contacto con un LTh2, el que le dará la segunda señal para ayudar en la activación. El LB endocita al Ag, lo degrada y lo presenta en una MHC-II, así el LTh lo puede ver. El LTh2 previamente había sido activado por el mismo Ag. Pero para que el LB se active no solo se necesita de la colaboración del LTh, necesita que el LT tenga otras moléculas. Una de ellas es la CD40 del LB que va a interactuar con una CD40L que está en el LT. Cuando se produce esta interacción el LT empieza a producir citoquinas que se llaman interleuquinas. Una importante es la IL-4 que induce la proliferación del LB. El LB prolifera, algunos van a diferenciarse en plasmocitos y van a producir un Ac de clase IgM. Esto es la respuesta primaria. Algunos LB que proliferan van a formar el centro germinal y se van a empezar a dividir otra vez. Se los llama centroblastos, que no tienen Ig en la membrana porque se están dividiendo. Los centroblastos sufren el fenómeno de hipermutación somática y el cambio de Ig o switch. Luego de estos dos

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fenómenos se transforman en centrocitos, que ya no se dividen y van a tener una alta afinidad por el Ag y otros pueden llegar a tener una baja afinidad. En este momento se seleccionan por contacto con el Ag. El Ag va a estar en las CDF de los centros germinales. Las CDF no procesan al Ag, solo lo tienen pegado a la membrana. Este Ag puede estar pegado junto a Ac que lo reconocieron o recubierto por el complemento. El Ag pegado forma los icosomas de la CDF.

Los LB que tengan la mayor afinidad por el Ag se lo van a sacar a la célula CDF, lo van a procesar y se lo van a poder presentar a un LTh. Estos son los que van a sobrevivir. Los LB de baja afinidad no van a poder sacar el Ag de la CDF y van a morir por apoptosis. Cuando el LB se contacta con el LTh pueden transformarse en células plasmáticas productoras de Ac o en células de memoria. Las células de memoria pueden salir y volver a entrar al ganglio linfático, las células plasmáticas no pueden recircular. Las células B de memoria son las que actúan ante una segunda entrada del Ag, producen más rápidamente Ac que tienen una mayor afinidad por el Ag, y generalmente son del tipo IgG. Estos LB van a tener como BCR una Ig distinta de la IgM, porque sufrieron el cambio de isotipo.

Activación del los LB2 por los Ag TD: El LB2 para activarse necesita la colaboración T-B, esto se produce mediante reconocimiento ligado. Para la activación del LB se necesitan dos señales:

-Primera señal: El LB se une al Ag por el BCR, lo endocita, lo procesa y presenta sus péptidos en el CMH II. -Segunda señal: colaboración T-B. Para que este proceso se produzca los LB y Th2 deben reconocer epitopes antigénicos en el mismo Ag. Esto se denomina reconocimiento ligado. Esto no significa que el LB y LTh2 reconozcan el mismo determinante Ag, de hecho en la gran mayoria de los casos se trata de epitopes diferentes, ya que el LB reconoce el epitope en conformación nativa, mientras que el LT reconoce péptidos presentados y procesados por CMH. Los LTh2 que han sido previamente activados por células dendríticas con el mismo Ag, reconocen el péptido presentado por el CMH II del LB. Este reconocimento se produce gracias a que el LTh2 activado expresará en su membrana CD40L (tipo de TNF-α) que reconocerá de CD40 (tipo de receptor TNF- ) en la membrana del LB. Al producirse la unión LT-LB, el LTh2 va a secretar IL-4 necesaria para la activación del LB. Por lo tanto la activación del LB y el LTh2 es mutua.

Cooperación del LTh2- LB en el ganglio. Formación del centro germinal:

Los Ag que ingresan en el organismo a través de los tejidos periféricos son endocitados por CPA profesionales, en particular por células dendríticas, que luego los transportan a los ganglios drenantes a través de los linfáticos aferentes. Por su parte, los LT vírgenes ingresan en la zona paracortical de los ganglios atravezando las vénulas del endotelio alto (HEV) y los que reconocen el péptido antigénico presentado adecuadamente por la CPA son retenidos y activados, produciéndose la expansión clonal de estos linfocitos. Los LB vírgenes que ingresan en el ganglio atravezando las HEV son atraidos hacia los folículos primarios por la quemoquina CXCL13 secretada por las células foliculares dendríticas. Cuando el LB virgen del folículo primario entra en contacto con el Ag a través de su BCR, aumenta la expresión del receptor CCR7, específico para las quemoquinas CCL19 y CCL21 predominantes en la zona paracortical T del ganglio linfático e inicia por consiguiente la migración hacia esa región.

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En ausencia de IL-12 en su entorno, los LT que se activaron en respuesta al Ag presentado por la CPA se diferencian a LTh2 y migran hacia el borde del folículo primario. En este sitio interactuan col los LB específicos, se produce la colaboración TB y ambas poblaciones linfocitarias proliferan durante varios días. Alguno de los LB abandonan este primer foco de prliferación y se dirigen a la médula del ganglio linfático diferenciándose en plasmocitos. Estos producen los primeros Ac de la respuesta humoral, que son clase IgM. Otros LB del foco de proliferación migran hacia el exterior del folículo primario ataridos por la quemoquina CXCL13. Una vez en el interior del folículo primario, los LB siguen proliferando en forma muy activa y dan lugar al centro germinal. A estos LB proliferantes se los conoce como centroblastos. Debido a su rápida expansión, desplazan a los LB en reposo que conforman el folículo primario, los cuales se disponen formando la zona del manto alrededor del núcleo de células proliferantes. Los centros germinales están compuestos mayoritariamente por los centroblastos que se disponen formando lo que se conoce como zona oscura. También integran parte del centro germinal LTCD4+ (denominados también LT foliculares) y células foliculares dendríticas (CFD) que proveen las señales estimulatorias necesarias para la expansión y diferenciación de los LB. Las CFD no están relacionadas con las células dendríticas presentadoras de Ag. Cuando los centroblastos dejan de proliferar, se transforman en centrocitos, que junto con los LTCD4 y las CFD conforman la zona clara del centro germinal. Si bien los Ac producidos por el LB del foco primario cumplen un papel protector importante, la diferenciación de los LB en el centro germinal provee al organismo de Ac más eficaces para el control de los patógenos, de mayor afnidad por el Ag y diferente isotipo: hipermutación somática y cambio de isotipo (switch).

Diferenciación de los centrocitos en LB de memoria o en plasmocitos:

Los centrocitos que han sobrevivido al proceso de selección da lugar a dos tipos de células: plasmoblastos, que abandonan el centro germinal para completar su diferenciación a células plasmáticas productoras de Ig de alta afinidad, y los LB de memoria (LBm). En la diferenciación del centrocito en uno u otro inciden varios factores:

1) La afinidad del BCR por el Ag: a mayor afinidad de la unión tiende a diferenciarse a plasmoblasto. 2) Interacciones entre células T y B durante el proceso de colaboración T-B. 3) Las citoquinas producidas por las células T: IL-10 favorece la diferenciación a célula plasmática, e IL-4 favorece la diferenciación hacia LBm. Los plasmocitos que abandonan el centro germinal migran a la médula ósea y dan lugar a plasmocitos de vida media corta (días) o vida media larga (meses). En una respuesta inmune secundaria, la mayor parte de los Ac séricos provienen de los plasmocitos de vida media larga que siguen produciendo Ac, aún cuando el Ag no esta presente. Los LBm que abandonan el centro germinal recirculan por los tejidos linfáticos secundarios, o hacen homing en estos tejidos y quedan retenidos transitoriamente. La reexposisción al Ag induce una rápida y masiva expansión clonal de los LBm, generándose entre 8 a 10 vaces mayor número de plasmocitos que en la respuesta primaria. Los LBm expresan BCR de alta afinidad por el Ag como consecuencia de su paso por el centro germinal y niveles incrementados de moléculas de clase II del CMH.

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Ambas características contribuyen a que los LBm contacten más rápidamente con los LTh2 activados en comparación con los LB vírgenes en la respuesta primaria. Esto contribuye a que la producción de Ac sea más rápida en la respuesta secundaria. Si los niveles de Ac que persisten en la circulación son suficientemente altos, el reingreso del Ag al organismo no genera una respuesta secundaria, ya que los Ac son capaces de neutralizar al Ag favoreciendo su inmediata depuración por el sistema mononuclear fagocítico. Si los niveles de Ac no son suficientes para neutralizar por completo al Ag, los LBm que expresan BCR de mayor afinidad son los primeros en activarse por el Ag. Esta activación puede dar lugar a una nueva respuesta del centro germinal.

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EL RECEPTOR DEL LT

El TCR siempre va a estar en membrana, nunca se va a secretar como la Ig de membrana del LB. Está constituido por dos cadenas. Hay dos tipos de TCR. Los LT

, que está constituido por una cadena y una cadena .

Estas cadenas tienen una región variable y una región constante, también una región transmembrana y una pequeña porción citoplasmática. La región transmembrana es muy rica en cargas positivas (+). Las regiones de combinación con el Ag son regiones hipervariables que se encuentran en las regiones variables de las cadenas. Son como las de las Ig: CDR1, CDR2 y CDR3. Son regiones determinantes de complementariedad que les permiten al TCR interactuar con el Ag. Si se compara el TCR se parece al fragmento Fab de las Ig, pero el TCR no está compuesto solo por estas dos cadenas, necesita de una molécula que se llama CD3. El CD3 está compuesto por varias moléculas a su vez. Hay dos heterodímeros que se llaman y , y un homodímero constituido por una molécula llamada . Estas moléculas neutralizan las cargas positivas que tenían las dos cadenas y y le permiten una mayor estabilidad. Entonces la función que tienen las moléculas CD3 es la de dar estabilidad al TCR y la de transmitir las señales. El TCR tiene una cola citoplasmática muy corta, entonces la molécula de CD3 va a ayudar a transmitir las señales al interior celular. Hay otros LT que son minoritarios que tienen un TCR de tipo . Estos LT no reconocen a los Ag en el contexto de las moléculas del CMH I y II clásicas; parece ser que reconocen Ag presentados por moléculas no clásicas I b. Estos LT están ubicados en piel, en el epitelio respiratorio, en el epitelio del aparato reproductor y en epitelio intestinal. Actúan ante condiciones de estrés. Se postula que reconocen a las proteínas del shock térmico, que son proteínas que se incrementan en condiciones de estrés. Son los LT que primero se producen en la vida embrionaria y muchos autores postulan que actúan en los mecanismos innatos de la respuesta inmune. Son los análogos a los LB1.

tienen en su mayoría el TCR

Los genes que codifican para estos receptores tienen una determinada estructura en la línea germinal. Después se van reordenando como los genes de las Ig. En estos reordenamientos participan las mismas enzimas recombinasas y también tienen las mismas SSR. Los genes de la cadena están codificados en el cromosoma 14, y los genes de la cadena están codificados en el cromosoma 7. Hay genes que codifican para la parte variable y un gen que codifica para la parte constante. Hay también segmentos J que van a estar en las cadenas y en la cadena están además los segmentos D. Existen muchísimas más variantes para estos genes que las que existían para los genes de las Ig. Entonces la variedad de receptores TCR es mucho mayor que la variedad de Ig que se pueden producir. Los procesos de reordenamiento se van a producir en forma similar a los genes de Ig. En la cadena existe el mecanismo de exclusión alélica, si se reordena el gen de un cromosoma no se reordena el gen del otro, pero para las cadenas no. En las cadenas se pueden reordenar los genes de las dos cadenas. El reordenamiento empieza por los genes de cadena , y cuando se reordena este gen en forma exitosa se expresa un receptor que se llama pre-TCR. Este receptor va a estar constituido por una cadena y por una cadena sustituta. Cuando se expresa este pre- TCR el LT prolifera, dejando de reordenarse.

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Todos estos procesos ocurren en el TIMO. Si bien los LT se originan en médula ósea, van a migrar al timo, que es un órgano linfoide primario porque en él se produce la maduración de los linfocitos. En el timo no entran Ag extraños, es decir, no es un lugar donde se genera una respuesta inmune. El timo tiene solo circulación sanguínea, no hay circulación linfática.

Luego, se reordenan los genes de cadena .

Los genes de cadena están ubicados en el mismo cromosoma que en el que se encuentran los genes de cadena , y están en el medio de esos genes.

Si se reordenan primero los genes se excluyen los genes .

Además del TCR y la molécula CD3, el LT tiene otras moléculas de membrana que son muy importantes para su función. Una de ellas es la CD4 y la otra es la CD8. La molécula CD4 está formada por cuatro dominios semejantes a los de Ig, y la molécula CD8 está formada por dos cadenas: y .

En estos procesos de recombinación para generar los receptores van a estar los mismos eventos que ocurren en el LB para generar la variabilidad.

VARIABILIDAD EN EL TCR

Están las distintas posibilidades de recombinación por la gran variedad de segmentos V,

D y J. También participa la enzima TdT, es decir, hay adición de nucleótidos en los

sitios de unión, pero lo que no ocurre es hipermutación.

Entonces, el CD4 se va a unir a las MHC-II, y el CD8 se va a unir al MHC-I. Esto es importante en el proceso de activación de linfocito. El dominio del CD8 interacciona con el dominio 3 del CMH-I. Estos linfocitos CD8+ son LT citotóxicos. La molécula CD4 va a estar presente en los LTh. El dominio D1 del CD4 interacciona con la cadena 2 del CMH-II. Estas son moléculas co-receptoras que va a ayudar a la activación del LT.

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ONTOGENIA T

El LT se produce en médula ósea y luego va al timo. En el timo se forman LT maduros que pueden ir a los órganos linfáticos secundarios. El timo aumenta mucho de tamaño durante la niñez y al llegar a la pubertad comienza a involucionar. La involución del timo no afecta a la inmunidad porque ya se produjeron los LT necesarios para actuar ante la entrada de cualquier agente al organismo. El timo está formado por muchos lóbulos y cada uno tiene una corteza y una médula. La corteza es una zona mucho más compacta, mientras que la médula es más laxa. En la corteza hay células epiteliales corticales y LT en proceso de maduración. En la médula hay células dendríticas, macrófagos y células epiteliales medulares. Las células epiteliales, tanto medulares como corticales, se originan en el propio timo, los macrófagos y las células dendríticas provienen de la médula ósea. En el proceso de maduración de LT se va a producir una migración de los mismos por todos los sectores del timo: por corteza y médula.

Durante el proceso de maduración, los LT se van a nombrar según expresen determinados marcadores en su membrana. Cuando no expresan ni CD4 ni CD8 se llaman dobles negativos (DN). El LT va a pasar por tres estadíos de DN hasta que empieza a expresar una parte del TCR en su membrana. En el primer estadío expresa la molécula CD2: DN1. Luego pasa al estadío de DN2, donde sigue expresando la molécula CD2 y empieza a expresar la CD25. La CD25 es la cadena del receptor de IL-2. Después el LT pasa por el estadío DN3, donde comienza a reordenar los genes de la cadena . Cuando pasa al estadío DN4 ya expresa el pre-TCR. En este estadío el LT prolifera y reordena los genes . En este momento empieza a expresar CD4 y CD8: doble positivo (DP). En el estadío DP se expresa CD4, CD8 y un TCR. En este momento el LT sufre unos procesos que le permiten reconocer MHC propias, y que no reconoce Ag propios. Son procesos de SELECCIÓN POSITIVA Y NEGATIVA. En el estadío DP, cuando expresan CD4 y CD8, sufren una selección positiva que le permitirá al LT reconocer MHC propias, condición para que el LT se active. Esta MHC se las muestran las célula de la corteza tímica. Le muestra péptidos propios, provenientes del propio timo, los que las reconocen van a sobrevivir, los que no mueren por apoptosis. Aquellos DP que reconocen un péptido en el contexto del CMH-I dejan de expresar la CD4, y expresan solo CD8. A partir de este momento pasan a ser simples positivos (SP). Los DP que reconozcan al péptido presentado en el CMH-II dejan de expresar CD8 y solo expresan CD4. Van a ser LTh. Luego se produce el proceso de selección negativa, por el cual los SP que reconozcan Ag propios son eliminados por apoptosis. Los que no los reconocen sobreviven. Las teorías sobre estas selecciones positivas y negativas postulan que hay diferencias en la intensidad del reconocimiento. Cuando el reconocimiento es muy fuerte, el LT es seleccionado en forma negativa. Cuando hay pocos péptido el LT se selecciona de forma positiva. Otros autores indican que dependen de las señales que se transmiten al interior celular, o al péptido al cual se unen.

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ACTIVACIÓN DEL LT

Los LT maduros salen del timo y se dirigen a un ganglio linfático. Entran por las

vénulas del endotelio alto y se ubican en una zona propia de los LT. Si el LT no encuentra ningún Ag en esa zona sale por los vasos linfáticos y vuelve a circular. Si encuentra algún Ag, se va a activar, va a proliferar y se va a transformar en LT efector. Para salir de los vasos sanguíneos, los LT sufren los mismos procesos que los macrófagos. Es un proceso de varias etapas en el que intervienen varias moléculas que tiene el LT en su membrana y moléculas que van a expresar las células endoteliales. Las células endoteliales de los vasos del endotelio alto tienen una molécula llamada GlyCAM 1 y la CD34. Estas dos moléculas reciben la denominación de adhesinas vasculares. Las adhesinas vasculares no aparecen en otros endotelios. Estas permiten el pasaje solo de linfocitos. Las moléculas del LT que interactúan con las adhesinas vasculares son las L-selectinas. La L-selectina uniéndose a una u otra de estas moléculas hace que el LT ruede por el endotelio.

A su vez el LT tiene receptores para factores quimioatractantes. Un receptor se llama

CCR7, que se une a las quemoquinas que está produciendo la célula endotelial. Esta quemoquina es la CCL21. Cuando interactúa CCR7 con CCL21, se produce una adhesión más fuerte del LT con la célula endotelial, que está mediada por otras moléculas: la LFA-1 del LT y la ICAM-1 de la célula endotelial. En este momento el LT se frena y empieza a pasar por células endoteliales por diapédesis y migra hacia el interior del ganglio. Esto está todo mediado por las quemoquinas que están produciéndose en el ganglio. Dentro del ganglio si el linfocito se topa con un Ag para el cual tiene un receptor lo va a reconocer. Este Ag va a estar presentado por macrófagos, células dendríticas y los LB. Las células dendríticas son muy importantes en la activación, porque estas células pueden migrar, así pueden llegar al ganglio desde otros lugares del cuerpo. Por ejemplo, las células de Langerhans en la piel son células dendríticas, si algún Ag entra por la piel, estas células lo pueden captar y lo pueden llevar hasta el ganglio. Estas células son inmaduras al captar el Ag, luego de capturarlo lo procesan y llegan al ganglio donde se transforman en células maduras que tienen disminuida la capacidad de captar Ag, pero tienen muy aumentada la capacidad de presentarlos, expresando muchas moléculas del CMH tanto de clase I como de clase II. Estas células también pueden ser infectadas por virus, entonces van a presentar Ag virales en el contexto de las MHC-I. Los macrófagos, que son muy buenos para presentar Ag a los LT vírgenes, son los que están en el ganglio. Los macrófagos que están en los tejidos periféricos son células residentes, no pueden migrar, entonces solo van a actuar con LT efectores.

Entonces las células más importantes para presentar Ag a los LT vírgenes son las células dendríticas. Se necesita una colaboración estrecha entre el LT y la célula que

le presenta el Ag. Esta unión estrecha se produce a través de distintas moléculas de

adhesión. La célula dendrítica expresa varias moléculas que se tienen que unir a varias moléculas del LT. Estas uniones son necesarias para que el LT pueda “inspeccionar” toda la membrana de la célula dendrítica o de la CPA buscando si hay algún complejo

de MHC que pueda reconocer. Por lo tanto, primero se tiene que producir la interacción

entre las moléculas de adhesión de la CPA y del LT. Así, el LT puede “ver” si en la

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CPA hay algún Ag que él pueda reconocer. Si hay algún complejo MHC-péptido, se une. Esta unión envía señales al interior celular. Si el LT es un CD4+ o helper se va a unir la molécula de CD4 a la MHC-II. Pero esto no alcanza para que el LT se active, se necesita otra interacción más, mediada por otra molécula que es la molécula CD28 que está en el LT. Se tiene que unir a una molécula que está en la CPA que se llama B7. La B7 puede denominarse también CD80 o CD86, o B7.1 o B7.2. Sin la señal de la molécula B7 el linfocito no se activa. Las moléculas B7 normalmente no se expresan. Para que se expresen el macrófago o la célula dendrítica debe haber reconocido algún agente extraño. Esto es una manera de control de la activación, sino los LT se estarían activando continuamente.

Esto, de que se necesitan tantas señales pasa con los LT vírgenes, es decir, LT que nunca vieron un Ag. Para los LT efectores que se generan después del proceso de activación, las señales que se necesitan no son tan fuertes, y no se necesita de la molécula B7.

Repasando:

Los LT maduraban en el timo para que al salir fueran LT capaces de reconocer las MHC propias, que es la condición necesaria para que se genere la respuesta inmune, pero que no reconocieran Ag propios. Para que se logre esto a los LT les pasaba dos cosas:

primero un proceso de selección positiva y después un proceso de selección negativa. En la selección positiva seguían madurando los que reconocían MHC propias, y en la selección negativa morían por apoptosis los que reconocían Ag propios. Durante el proceso de maduración en el timo los LT van expresando distintas moléculas en sus membranas, pasando por distintos estadíos: cuando no expresaban ni CD4 ni CD8 se llaman DN, después empiezan a expresarse las dos, entonces se llaman DP. Cuando experimentan el proceso de selección positiva, donde reconocen MHC propias, dejan de expresar una de las dos moléculas. Las que reconocen el CMH-I dejan de expresar CD4 y expresan solo CD8. Los que reconocen el CMH-II dejan de expresar CD8 y solo expresan CD4.

CMH-I

expresa CD8CMH-I

CMH-II

expresa CD4CMH-II

Durante este proceso de maduración se van recombinando los genes para poder expresar el TCR. En este proceso participan las mismas enzimas que participan en el LB: las recombinasas. Las cadenas que componen el TCR también tienen una parte constante y una parte variable. También existen mecanismos que permiten aumentar la diversidad de estos receptores. Por ejemplo, hay muchos segmentos que codifican para cada gen, se adicionan nucleótidos por la TdT, todo esto aumenta la variabilidad. Después de todo el proceso de maduración en el timo, que se van produciendo en las distintas zonas del timo, algunas se producen en la corteza y otras en la médula, se generan entonces LT capaces de reconocer Ag.

Los LT maduros van a los órganos linfoides secundarios, por ejemplo el ganglio linfático, al cual entran a través de las vénulas del endotelio alto. Este es un mecanismo de reconocimiento sobre las células endoteliales y que los LT expresan en su membrana,

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después la diapédesis y la migración. Una vez en el ganglio linfático, si el LT encuentra un Ag se puede activar. Este Ag debe estar presentado por una CPA: células dendríticas, macrófagos o los LB. Para que el LT se active es necesario el contacto con la célula que le presenta ese Ag, y ese contacto se hace a través de moléculas de membrana del LT y de la CPA.

LT

CPA

CD2

LFA-3

LFA-1

ICAM-1

LFA-2

ICAM-2

ICAM-3

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