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Tecnologas de marcadores moleculares para estudios de diversidad gentica de plantas: Mdulo de aprendizaje

Tecnologas basadas en el ADN


Fundamentos del ADN

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 1

Contenido
La molcula de ADN:
Estructura y caractersticas Replicacin Empaquetamiento en el cromosoma Organizacin de las secuencias ADN citoplasmtico

Tecnologa del ADN:


Enzimas de restriccin Electroforesis de cidos nucleicos Polimorfismo de ADN

Procedimientos para el aislamiento del ADN, en imgenes


Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 2

La molcula del ADN: Estructura y caractersticas

El ADN y el ARN son molculas constituidas por filamentos de nucletidos Un nucletido consta de:
Un azcar pentosa Un grupo fosfato Una base nitrogenada

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 3

Los elementos fundamentales del cido desoxirribonucleico (ADN) y del cido ribonucleico (ARN) son los nucletidos. Un nucletido consta de: Un azcar pentosa: en el ADN es la desoxirribosa, y en el ARN es la ribosa Un grupo fosfato Una base nitrogenada, que puede ser (en el ADN y en el ARN): Bases pricas: adenina (A) o guanina (G) Bases pirimidnicas: citosina (C) o timina (T); el uracilo (U) reemplaza la timina en el ARN La molcula de ADN consta de una cadena constituida por cuatro elementos fundamentales sencillos (A, G, C y T) que se renen para formar una doble hlice. Una hlice consta de dos hebras, cada una con su soporte de azcar-fosfato, unidas por enlaces dbiles de hidrgeno entre las bases adenina-timina (dos enlaces de hidrgeno) y citosina-guanina (tres enlaces de hidrgeno). La conformacin de las bases A y T y la de las bases C y G son complementarias y esta es la razn por la que el ADN puede copiarse a s mismo. Dos cadenas de soportes y de bases, que corren en direcciones opuestas (antiparalelas) forman la estructura de la doble hlice. El orden o secuencia de estas bases a lo largo de la cadena forma el cdigo gentico que lleva las instrucciones genticas precisas para que el organismo funcione.

La molcula del ADN: Replicacin


3 3

3 5 5 3 5

5
Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 4

En ciertas circunstancias (es decir, durante la replicacin del ADN celular), las dos cadenas de la molcula de ADN se separan. La ARN polimerasa sintetiza un tramo corto de ARN complementario a una de las hebras de ADN en un sitio especfico, conocido como el sitio de inicio de la replicacin. Esta seccin corta de ARN acta como un patrn para que comience la rplica del ADN. Nuevas bases de ADN se acercan al extremo 3 y se adhieren a su pareja complementaria en la hebra del ADN patrn. Las nuevas bases se unen luego para hacer una cadena de ADN que es 'hija' del patrn anterior. Como los nucletidos siempre se agregan al extremo 3, la sntesis de ADN ocurre en la direccin que va de 5 a 3. Este proceso se presenta en cada una de las cadenas de la molcula de ADN original.

La molcula del ADN: Empaquetamiento en el cromosoma


20

110

14000 300
{ {

3000

= angstrom, una unidad de longitud que equivale a 1/109 m

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 5

Una molcula de ADN es mucho ms larga que un cromosoma, de manera que se necesita un mecanismo para plegar densamente y empaquetar la fibra de ADN. La mezcla del material del cual se forman los cromosomas se llama cromatina, y es la suma de la molcula de ADN ms algunas protenas. En los organismos eucariotas, el ADN se condensa con protenas histonas, con otras no histonas y con un poco de ARN. Las histonas se organizan en nucleosomas y dan al ADN enroscado una apariencia de cuenta de collar. El enroscado adicional de los nucleosomas produce una conformacin de solenoide, y todava hace falta otro nivel de empaquetamiento para llegar a la estructura cromosmica. Los cromosomas estn constituidos por regiones eucromticas, levemente empacadas y que contienen la mayora de los genes activos, y por regiones heterocromticas, densamente empacadas y que aparentemente desactivan los genes a su alrededor. Con frecuencia se encuentra heterocromatina alrededor de los centrmeros. [La definicin de Angstrom est modificada a partir del Merriam-Webster en lnea (http:/www.m-w.com)]

La molcula del ADN: Organizacin de las secuencias

ADN de copia nica

Centrmero

ADN de copia mltiple

Telmeros

Adaptado de Flavell y Moore (1996)

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 6

El ADN eucaritico puede agruparse en diferentes tipos o clases: De copia nica, genes que codifican protenas ADN presente en copias mltiples: Secuencias con funcin conocida Codificantes No codificantes Secuencias con funcin desconocida Repeticiones (dispersas o en tndem) Transposones ADN espaciador Se pueden encontrar numerosas repeticiones en el ADN espaciador. Constan de la misma secuencia presente en muchas localizaciones, especialmente en los centrmeros y telmeros. Las repeticiones varan en tamao, en nmero y en distribucin en todo el genoma, lo que las hace sumamente apropiadas para su consideracin como marcadores moleculares. Referencia Flavell, R.B. y G. Moore. 1996. Plant genome constituents and their organization. En: Plant Genome Isolation: Principles and Practice (Foster, G.D. y D. Twell, eds.). John Wiley & Sons, Chichester, NY.

La molcula del ADN: ADN citoplasmtico


ADN citoplasmtico
ADN de los cloroplastos (ADNcp) ADN de las mitocondrias (ADNmt)

Caractersticas:
Herencia materna Tasas dispares de evolucin (orden de los genes vs. secuencia de los nucletidos) Acumulacin lenta de mutaciones

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Se encuentran cantidades pequeas de ADN en el citoplasma, fuera del ncleo: en los cloroplastos (ADNcp) y en las mitocondrias (DNAmt). Tanto los cloroplastos como las mitocondrias tienen su propio cromosoma, del cual hay varias copias. Sus genes codifican para la traduccin y la transcripcin de los componentes de los organelos, y tienen funciones altamente especializadas en la expresin del fenotipo del organismo a que pertenecen. El ADN citoplsmico se hereda comnmente, aunque no siempre, a travs del progenitor materno, un modelo conocido como herencia materna. Las secuencias del ADNcp y del ADNmt tienen sus peculiaridades. El ADNmt de las plantas parece evolucionar rpidamente en lo que se refiere al orden de los genes, y lentamente en la secuencia nucleotdica. La razn de que las mutaciones se acumulen lentamente no se conoce con certeza, pero podra ser un efecto de la presencia ya sea de un mecanismo sumamente eficaz de reparacin de daos del ADN o de un sistema de replicacin del ADN relativamente libre de errores. En cambio, la tasa de evolucin del ADNcp parece, en general, lenta, tanto en funcin de la secuencia nucleotdica primaria como del reordenamiento de genes.

Tecnologa del ADN


La tecnologa del ADN incluye los conceptos de: Enzimas de restriccin Electroforesis de cidos nucleicos Polimorfismo del ADN

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ADN 8

Enzimas de restriccin
Cada enzima de restriccin corta el ADN en fragmentos definidos, gracias a la accin que ejerce en secuencias especficas que son su objetivo Dan lugar a extremos pegajosos o romos Los enzimas de restriccin son de varios tipos:
Tipo I y III, que cortan el ADN de hebra o cadena doble por fuera de la secuencia de reconocimiento Tipo II, que identifican secuencias de 4, 5 6 pb y cortan por dentro de dicha secuencia
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T A G C

ADN 9

Las bacterias producen enzimas de restriccin como un mecanismo de defensa contra los bacterifagos. Estos enzimas pertenecen a una clase que parte (o corta) el ADN en posiciones internas especficas y nicas en toda su longitud. Por ello, tambin se los llama endonucleasas. Estas enzimas actan como tijeras y as cortan el ADN de los fagos y los desactivan. De los tres tipos de enzimas de restriccin, los tipos I y III cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia de reconocimiento. En cambio, los enzimas de tipo II identifican secuencias especficas de 4, 5 6 pares de bases y cortan por dentro de estas secuencias. Debido a sus caractersticas, estos tres tipos de enzimas se han tornado esenciales para la tecnologa del ADN recombinante. Los enzimas pueden cortar una secuencia dada de ADN, dejando extremos escalonados (o pegajosos) que permiten la creacin de puentes de hidrgeno con una secuencia complementaria (finales contusos). Cuando dos fragmentos de ADN se cortan con el mismo enzima, se producirn fragmentos que tendrn extremos pegajosos complementarios, y a ellos se podrn adherir, por tanto, fragmentos alternativos. Los enzimas de restriccin estn disponibles comercialmente y suelen venir con la solucin tampn apropiada y con las instrucciones acerca de las condiciones y las temperaturas de reaccin.

Electroforesis de cidos nucleicos


Un mtodo para separar fragmentos de ADN y permitir su visualizacin o su identificacin (o ambos)
Fuente de energa elctrica

Gel

+
Unidad de electroforesis

Adaptado de Griffiths y col. 1996

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 10

Despus de la digestin a que es sometida por un enzima de restriccin, la molcula de ADN se convierte en una coleccin de fragmentos de restriccin. Estos fragmentos pueden separarse segn su tamao al hacerlos migrar en un gel de agarosa o de acrilamida. Para lograr esa separacin, la mezcla de fragmentos de ADN y del sobrante de enzima se coloca en pocillos formados cerca de un borde del gel. El gel se somete luego a un campo elctrico que hace migrar los fragmentos de ADN segn su tamao, de modo que los fragmentos grandes migran ms lentamente que los fragmentos cortos. Las molculas de ADN, que estn cargadas negativamente a pH neutro, migran hacia el nodo. Los geles de agarosa (de 0.8% a 2.0%) son muy tiles para separar fragmentos de ADN cuyo tamao est comprendido en el intervalo de 300 a 10.000 pb. Los geles de acrilamida (de 3.5% a 20%) son muy tiles para fragmentos cuyo tamao oscile entre 20 y 1000 pb. La visualizacin de los fragmentos de ADN, despus de la electroforesis, se logra mediante la tincin con bromuro de etidio; las molculas de esta sustancia se colocan entre las bases del ADN y producen una fluorescencia de color anaranjado bajo la luz ultravioleta. La distancia de migracin es proporcional al logaritmo del nmero de bases. Por consiguiente, el tamao real de los fragmentos obtenidos puede calcularse partiendo de la movilidad de los fragmentos de ADN de tamao conocido.

Polimorfismo del ADN


Diversos sucesos pueden causar variantes, ms o menos complejas, en la secuencia de nucletidos del ADN. Tales variantes se describen, generalmente, como polimorfismos El polimorfismo se manifiesta en diferencias del genotipo lo que se demuestra en los diversos perfiles de bandas que se detectan con un procedimiento apropiado y quizs del fenotipo Varios sucesos pueden producir polimorfismos:
Mutaciones puntuales Inserciones o deleciones Rearreglos
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Mutaciones puntuales
Las mutaciones puntuales ocurren cuando una base de la secuencia del ADN es reemplazada por otra. La longitud de la secuencia del ADN no cambia

Reemplazo

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ADN 12

Las mutaciones puntuales pueden ocurrir en una base solamente, o en unas pocas bases del mismo sitio. En el diagrama de la diapositiva, cuatro bases de la secuencia cromosmica original (parte superior) son reemplazadas por cuatro bases alternativas. Dado que el nmero original de bases no cambia, la longitud total de la secuencia no se altera.

Inserciones o deleciones
Las inserciones o las eliminaciones son el resultado de la adicin o la desaparicin de varias bases en la secuencia del ADN. La longitud de la molcula cambia
Delecin

Insercin

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ADN 13

La parte superior del diagrama ilustra una delecin: se pierden algunas bases y el fragmento de ADN resultante se vuelve ms corto. La mitad inferior del diagrama ilustra una insercin: se introducen algunas bases en una seccin de la secuencia del ADN. La secuencia original se torna, por tanto, ms larga segn el nmero de bases que se hayan insertado.

Rearreglos
Los reordenamientos cromosmicos ocurren como resultado de la recombinacin gentica o de la insercin de elementos transponibles. La longitud de la molcula puede cambiar o quedar igual

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Tambin pueden darse cambios en la secuencia del ADN debidos a los reordenamientos; por ejemplo, cuando un segmento se da la vuelta. En estos casos, aunque quizs no cambie la longitud de la secuencia del ADN, su composicin puede cambiar suficientemente para que se observe en este caso un polimorfismo.

Procedimiento de aislamiento del ADN en imgenes

Las siguientes fotografas ilustran los diversos pasos del procedimiento para aislar ADN

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ADN 15

Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003

ADN 16

El tcnico de laboratorio est recolectando unas pocas hojas, muy jvenes, de tomate para hacer una extraccin pequea de ADN. Para una extraccin grande, se recolectaran muchas ms hojas y ms grandes (cerca de 10 g) de plantas ms viejas.

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ADN 17

El tejido de la hoja (para las extracciones pequeas de ADN) y la solucin tampn se convierten en una mezcla homognea en un tubo de centrfuga de 1.5 ml, empleando un taladro equipado con un vstago de plstico. Para aumentar la eficiencia, se pueden usar dos taladros simultneamente, que pueden ser controlados con pedales como los usados en las mquinas de coser.

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ADN 18

Para extracciones grandes de ADN, el tejido de la hoja se homogeneiza con una solucin tampn de extraccin en batidoras estndar de cocina. Aunque no sean necesarios por razones de seguridad, s conviene usar guantes y un delantal de laboratorio para proteger la ropa y la piel, ya que puede haber salpicaduras durante el procedimiento.

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ADN 19

La mezcla del tejido foliar y solucin tampn se vierte de la batidora, a travs de una gasa, en botellas de centrfuga colocadas sobre un lecho de hielo. Se exprime la gasa para obtener tanto lquido como sea posible reteniendo en el filtro los pedazos grandes de tejido foliar, que luego se descartan junto con el filtro.

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ADN 20

Despus de centrifugar y resuspender la bolita (pellet) de ADN (que es todava verde y contiene algo de material foliar), la mezcla se transfiere a un tubo nuevo al que se le agrega cloroformo. Este paso debe realizarse en una campana extractora con ventilacin, y deben usarse guantes de seguridad y una bata de laboratorio.

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ADN 21

Los tubos se invierten primero para mezclar suavemente el cloroformo y luego se centrifugan para separar el ADN.

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ADN 22

La capa ms clara, que contiene el ADN, est ahora en la parte superior y puede ser transferida a un tubo limpio. La capa inferior contiene tejido foliar no deseado, paredes celulares y otros residuos, y se descarta.

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ADN 23

Se agrega alcohol para precipitar el ADN, el cual, mediante una inversin suave, se congrega generalmente como una sustancia filamentosa. Este ADN puede ser retirado con un gancho o centrifugado. Luego se lava y se resuspende.

En resumen
Los elementos fundamentales del ADN son los nucletidos, que se unen haciendo una doble hlice con la que se forma la cadena del ADN La molcula del ADN se pliega cada vez ms a medida que la secuencia de los nucletidos le da forma al cromosoma El ADN se organiza en diferentes clases: de copia nica, de copia mltiple y espaciador Las mitocondrias y los cloroplastos tienen su propia molcula de ADN Varios sucesos causan polimorfismos en la molcula de ADN: las mutaciones puntuales, las inserciones, las deleciones y los rearreglos
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Hasta el momento usted debera saber


Los componentes de un nucletido De qu modo los nucletidos forman la doble hlice del ADN Las diferentes clases de ADN Las caractersticas principales del ADN citoplasmtico Lo que es un enzima de restriccin La forma en que se producen los polimorfismos en la cadena de ADN
Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 25

Referencias bsicas
Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart. 1996. An introduction to genetic analysis (6a. ed.). W.H. Freeman, Nueva York. Lewin, B. 1994. Genes V. Oxford University Press. Schleif, R. 1993. Genetics and molecular biology (2a. ed.). Johns Hopkins University Press, Baltimore, MD, E.U. Singer, M. y P. Berg. 1991. Genes and genomes. University Science Books, Mill Valley, CA, E.U. Watson, J.D., N.H. Hopkins, J.W. Roberts, J.A. Steitz y A.M. Weiner. 1987. Molecular biology of the gene (4a. ed.). Vol. I: General principles. Benjamin/Cummings Publishing, Menlo Park, CA, E.U.

A continuacin Tecnologas basadas en el ADN


Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP) Tecnologas basadas en el ADN
Tecnologas basadas en la PCR

Tecnologas complementarias Consideraciones finales Glosario


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