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MICROBIOLOGIA.

EFECTOS DE LOS AGENTES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE LA VIDA BACTERIANA Todos los microorganismos son afectados por diferentes factores fsicos, entre ellos el ms importante es la temperatura, pero tambin la presin y otros elementos del medio. Los microorganismos se clasifican en tres categoras en cuanto a la temperatura ptima que requieren para llevar a cabo su actividad metablica para su crecimiento: Psicrfilos: se desarrollan mejor a 10C (+- 5C) Mesfilos: crecen mejor a 35C (+- 5C) Termfilos: con ptimo crecimiento a 60C (+- 10C) Cualquier derivacin de su temperatura ptima de crecimiento, para arriba o para abajo, lo perjudica. Las temperaturas bajas slo detienen el metabolismo, pero las altas temperaturas, desarticulan la actividad metablica por afectar la estructura funcional de sus enzimas. Es por esto por lo cual se usan tanto las altas temperaturas para destruir la vida microbiana. La temperatura, el agua y la vida estn articuladas entre s, debido a que la vida depende de todas las reacciones qumicas que constituyen el metabolismo celular, sin embargo, todas ellas ocurren en un medio acuoso, ya que gran parte del citoplasma celular es agua, y las reacciones qumicas ocurren en el agua y su eficiencia depende de la temperatura en que se presenten. La temperatura, la presin, las radiaciones ionizantes, el pH entre otros factores, controlan las poblaciones de microorganismos del ecosistema, y estos factores tambin pueden ser usados para controlarlos. La mayora de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio, manteniendo al mismo tiempo su pH interno ptimo prcticamente constante. Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor. Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, stas se pueden clasificar en: Neutrfilas: si crecen de modo ptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8) Acidfilas: si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.. Alcalfilas: si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5. La mayor parte de las bacterias son neutrfilas. Muchas bacterias neutrfilas modifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente cidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan cidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminacin de aminocidos. Por otro lado, la mayor parte de los hongos y levaduras requieren pHs ligeramente cidos (en torno a 4-5). Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen ms o menos amplio de pH (alrededor de un ptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplsmico cae rpidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir. En muchas circunstancias es necesario e indispensable trabajar con o en medios libres de microorganismos vivos, es decir en ambientes estriles. Se entiende por esterilizacin la eliminacin completa de todos los microorganismos vivos que se encuentren en un objeto o material, de tal manera que decir estril es decir sin vida. Para esterilizar pueden usarse diferentes procedimientos. El proceso de esterilizacin sirve slo para objetos inanimados, pero no para organismos vivos, puesto que stos no se pueden liberar de microorganismos, ya que los procedimientos que acaban con la vida microbiana, tambin acaba con las clulas de ese organismo. La temperatura es la que mas se utiliza para producir efectos esterilizantes, tanto calor seco (estufas de esterilizacin, flameado) como calor hmedo (autoclave). Existen distintos procedimientos de esterilizacin por calor: estufa, flameado, ebullicin, autoclave y pasteurizacin

(aunque esta no logra la esterilizacin total). Otros procedimientos de esterilizacin son el uso de filtros y las radiaciones. La desinfeccin es la destruccin o eliminacin de microorganismos peligrosos por agentes qumicos, desde lavar con agua y jabn y luego aplicar un producto qumico como puede ser alcohol, soluciones de yodo o soluciones de sales orgnicas de mercurio, como el merthiolate. Undesinfectante es un producto que destruye o elimina microorganismos en superficies inanimadas, por otro lado, un antisptico es un producto que destruye la vida de una bacteria o un virus pero que se puede aplicar en superficies vivas. La antisepsia es el procedimiento por el cual se detiene el crecimiento bacteriano en una superficie viva. Asepsia es la ausencia de organismos potencialmente patgenos. Existen ciertas sustancias qumicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes: bactericida: frmaco que destruye microorganismos dentro de un husped bacteriosttico: producto que inhibe el crecimiento de los microorganismos en el husped Se entiende por quimioterpico al producto resultado de la sntesis qumica que es capaz de matar microorganismos dentro de un paciente, mientras que un antibitico es el producto de origen microbiano que es capaz de matar microorganismos dentro de un husped. Es decir que la diferencia entre un agente quimioterpico y un antibitico es que el quimioterpico es sintetizado en un laboratorio, mientras que el antibitico es producido por un microorganismo y mata otros microorganismos. Existen una gran variedad de antibiticos y quimioterpicos que actan a travs de distintos mecanismos: antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular, como la penicilina y cefalosporinas antibiticos que actan sobre la membrana celular antibiticos que inhiben la sntesis de protenas, como las tetraciclinas, aminoglucsidos y macrlidos antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos, como las quinolonas 2 INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LOS PROCARIOTAS Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, las clulas procariticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho ms directo e inmediato que las clulas de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de aos, los procariotas han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procariticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida normal, encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo cmodamente a pHs muy cidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproducindose a temperaturas de ms de 100C y a grandes presiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que los humanos consideramos como extremos reciben el calificativo de extremfilos. En este captulo veremos algunas de estas notables adaptaciones. Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que 1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;

2) condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales; 3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de parmetros para: a) la mutagnesis, b) la esterilizacin y desinfeccin, c) la quimioterapia. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciacin (si la hubiera) o de reproduccin. Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera: Agentes fsicos (tema 13) Agentes qumicos (tema 14) Temperatura Desinfectantes y antispticos Desecacin Radiaciones Ondas sonoras Presin hidrosttica Presin osmtica pH 2 EFECTO DE LA TEMPERATURA 2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO La temperatura es uno de los parmetros ambientales ms importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generacin, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva caracterstica de tasa de crecimiento en funcin de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos caractersticos llamadostemperaturas cardinales: Quimioterpicos de sntesis Antibiticos

Temperatura mnima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temperatura mxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento; Temperatura ptima: permite la mxima tasa de crecimiento (o sea, g mnimo). El margen entre la temperatura mnima y la mxima se suele llamar margen de crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados. La temperatura mnima se puede explicar en funcin de un descenso de la fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte de nutrientes yel gradiente de protones. Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura ptima, debido a que las reacciones metablicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su ptimo. En dicha temperatura ptima las enzimas y reacciones se dan a su mxima tasa posible. A partir de la temperatura ptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura mxima. Dicha temperatura refleja desnaturalizacin e inactivacin de protenas enzimticas esenciales, colapsamiento de la membrana citoplsmica y a veces lisis trmica de la bacteria. Obsrvese en el grfico que la temperatura ptima est ms cerca de la mxima que de la mnima. 2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo que una bacteria puede presentar una temperatura ptima superior a la temperatura mxima de otra, o inferior a la temperatura mnima de una tercera. Segn el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos principales:

2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRFILOS Las psicrfilas o crifilas: crecen a partir de entre -5 a 5C. a) Las llamadas psicrfilas obligadas tienen temperatura ptima a 15-18C, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antrtida es lo que pudiramos llamar un psicrfilo extremo: tiene su ptimo de crecimiento en 4C, y es incapaz de crecer a 14C (se muere de calor!). b) Las psicrfilas facultativas o psicrotolerantes (tambin llamadas psicrotrofas) presentan temperatura ptima en torno a los 20-30C y mximas a los 35C. Las bacterias y hongos psicrotrofos son los responsables de que los alimentos guardados en nevera se estropeen al cabo del tiempo. Ejemplos de medios permanentemente fros son la mayor parte de las aguas ocenicas (cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan slo 1-2C por encima de cero) y las reas permanentemente heladas del rtico y de la Antrtida. En los medios helados existen pequeas bolsas o microcavidades de agua lquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no bacteriano muy caracterstico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis), que llega a conferir color rojo a la nieve en algunas zonas de montaa a mitad de la estacin estival. Las principales adaptaciones bioqumicas a medios fros exhibidas por estos microorganismos psicrfilos son: enzimas ms resistentes al fro; sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas; los fosfolpidos de la membrana celular aumentan la proporcin de cidos grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados, con entre 4 y 9 dobles enlaces); ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido, evitndose su congelacin. Los psicrotrofos (psicrfilos facultativos) son ms abundantes, ya que estn adaptados a soportar grandes oscilaciones trmicas, y en verano pueden crecer a unos 30C-40C. Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas y hortalizas) que se guardan en frigorficos, alterando las cualidades organolpticas e incluso, echndolos a perder (una experiencia que casi todos hemos tenido). 2.2.2 MICROORGANISMOS MESFILOS Los mesfilos presentan temperaturas ptimas a los 25-40C y mximas entre 35 y 47C. La mayor parte de las eubacterias (incluyendo las patgenas) pertenecen a esta categora. La mayor parte de los microorganismos que viven en ambientes templados y tropicales, incluyendo los simbiontes y parsitos, pertenecen a esta categora. 2.2.3 MICROORGANISMOS TERMFILOS Las nicas formas de vida capaces de vivir por encima de 65C son todas procariotas. Los termfilos presentan ptimos a 50-75C y mximos entre 80 y 113C. Dentro de esta categora se suele distinguir las termfilas extremas (=hipertermfilas), que pueden llegar a presentar ptimos cercanos a los 100C, y que taxonmicamente pertenecen al dominio de las Archaea. Los hbitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima de 45-50C) estn restringidos a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente relacionadas con fenmenos volcnicos: fuentes termales volcnicas terrestres (en zonas de EE. UU., Japn, Nueva Zelanda e Islandia); fuentes termales submarinas: los llamados humeros (fumarolas hidrotermales) asociados a las grandes dorsales ocenicas); fumarolas Los materiales en fermentacin como acmulos de abono (compost) y ensilados pueden alcanzar 65C.

Como ejemplo clsico, muy conocido por documentales de divulgacin, recordemos que en el famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe la mayor concentracin mundial de fuentes volcnicas, con giseres que emiten a ms de 100oC, siendo esta temperatura bastante constante, con oscilaciones de +/- 1 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullicin. El riachuelo que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera un gradiente de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes comunidades microbianas adaptadas a esas diversas temperaturas. All fue donde T.D. Brock descubri la eubacteria termfila Thermus aquaticus, de la que se extrae la ADN polimerasa termorresistente (Taq) empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) automatizada. Recientemente se est recurriendo a usar la polimerasa de una arquea hipertermfila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy bien a 100C. Los hipertermfilos, con ptimos por encima de los 80C son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su ptimo nada menos que a 105C y puede llegar a aguantar 113C, y parece que detiene su metabolismo (por fro) a la agradable temperatura de 90C (!). Las termfilas facultativas pueden crecer a menos de 37C, como p. ej. la eubacteria Thermus aquaticus. Se han aislado bacterias termfilas en medios artificiales, como calentadores de agua domsticos e industriales. Las principales adaptaciones bioqumicas a altas temperaturas en clulas vegetativas bacterianas son: enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrfobo; ribosomas termorresistentes; membranas ricas en cidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofbicos ms fuertes. En Arqueas hipertermfilas los lpidos son muy especiales: en vez de basarse en steres de cidos grasos con el glicerol, se trata de teres de hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace ter es ms resistente). Algunas, adems, en vez de la tpica bicapa lpdica, exhiben una monocapa bioqumica de C40-bifitanil-tetrateres (resultado de unirse cola con cola dos C20-fitanil-diteres), que condicionan una extrema resistencia a agentes ambientales. (repasar tema 6). 2.3 EFECTO LETAL DEL CALOR Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idneo. La muerte por calor es una funcin exponencial de primer orden: dN/dt = -KTN O sea, y como se puede constatar en el grfico adjunto, la accin del calor supone la muerte de una fraccin constante (KT) de la poblacin sobreviviente en cada momento. La cintica de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la muerte se debe a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la membrana). Cmo podemos caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de una suspensin bacteriana? He aqu algunos parmetros utilizados: tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura; tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D);

punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

Ejemplos punto trmico mortal Especies 55oC Escherichia coli o 60 C Mycobacterium tuberculosis 120oC endosporas de especies muy resistentes de Bacillus. Estos tres parmetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en las de fabricacin de conservas, centrales lecheras, etc. Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento trmico, lograremosinactivacin parcial de la poblacin microbiana (es decir, queda una fraccin de clulas viables) o bien esterilizacin (=inactivacin total). En general, entendemos por esterilizacin todo tratamiento de un material con un agente fsico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o qumico (como veremos en el captulo 14) que acarrea la eliminacin de toda forma de vida en l. Una vez estril, el material sigue estril indefinidamente con tal de que est encerrado en un compartimento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente exterior. Centrndonos de nuevo en el calor, la inactivacin parcial o la esterilizacin se pueden lograr por calor hmedo o por calor seco. La inactivacin (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalizacin de protenas y a la fusin de lpidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces dbiles, sobre todo los puentes de hidrgeno entre grupos -C=O y H2-N-. Estos enlaces se rompen ms fcilmente por calor hmedo (en atmsfera saturada de vapor de agua), debido a que las molculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrgeno.

2.3.1

CALOR HMEDO Por lo tanto, la inactivacin por calor hmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones de inactivacin total por calor hmedo: Microorganismo condiciones La mayora de clulas vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos 80oC , 5-10 min Bacilo tuberculoso 58oC , 30 min Bacilo tuberculoso 59oC , 20 min Bacilo tuberculoso 65oC , 2 min Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC , 60 min La mayora de esporas de bacterias patgenas 100oC , pocos min esporas del patgeno Clostridium botulinum 100oC , 5,5 horas esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC , muchas horas esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 120oC , 15 minutos Veamos los mtodos principales de lograr esterilizacin de materiales por calor hmedo: Autoclave (introducido por Chamberland en 1884): Es un aparato que permite calentar muestras por calor hmedo a temperaturas superiores a las de ebullicin del agua (sin que sta hierva), debido a que el tratamiento se efecta en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosfrica. (El funcionamiento del autoclave ser oportunamente explicado en clases prcticas). Los parmetros de esterilizacin suelen ser: temperatura 121C y 10-15 min. Como se puede deducir, estos parmetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de especies saprofitas (ver ltima lnea de la tabla anterior), que son las formas de vida que ms aguantan el calor sin perder viabilidad. (Hay que tener en cuenta que, en la prctica, a veces hay que emplear condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volmenes de lquido, habr que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min, ya que el centro del recipiente donde va el lquido tarda ms en alcanzar la temperatura de esterilizacin. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a 115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en estas ocasiones, el tiempo tambin es mayor: 30 min). La accin rpida del calor hmedo depende en buena parte del alto valor de calor latente del agua (540 calg-1); ello hace que los objetos ms fros (como las muestras a esterilizar) se calienten rpidamente por condensacin de agua en su superficie. Tindalizacin (nombre en honor de John Tyndall): Es un mtodo de esterilizacin fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a ms de 100C. Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 4) de dos fases sucesivas cada uno: a) en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100C, durante 1 2 horas; b) en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37C durante 24 horas. Durante las fases de tipo a) mueren todas las clulas vegetativas de la muestra, pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las fases de tipo b) se produce la germinacin de las esporas activadas en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirn las clulas vegetativas procedentes de la germinacin en la fase anterior; y as sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningun microrganismo en la muestra. Como se puede ver, este mtodo es bastante engorroso y consumidor de tiempo, por lo que en los ltimos aos ha sido reemplazado por otro mtodo de esterilizacin, aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilizacin por filtracin. Consiste de hacer pasar una

solucin a travs de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamao inferior al de cualquier clula bacteriana (dimetro de poro =0,22 mm). Aplicaciones principales del calor hmedo: 1. En la prctica cotidiana del laboratorio de microbiologa, en la esterilizacin de medios de cultivo y soluciones. 2. En la esterilizacin de material quirrgico. 3. En la esterilizacin o inactivacin parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados). a) En la industria lctea se emplean como mtodos de esterilizacin la llamada uperizacin. La uperizacin o tratamiento UHT consiste en un tratamiento de calor hmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. ej.: 135-150C durante 1-2 seg). b) Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar eliminar los posibles microorganismos patgenos que pueden contaminarla, y que son ms sensibles al calor que los saprfitos inofensivos. Con esta inactivacin parcial de la poblacin microbiana de la leche logramos que sta se conserve durante unos das, sin alterar apenas sus cualidades organolpticas y nutricionales. He aqu los procedimientos ms habituales para conseguir esto: i. La pasteurizacin (en honor a Pasteur, que la introdujo en los aos 1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfra y envasa rpidamente. ii. La pasteurizacin instantnea (tambin conocida por sus siglas en ingls HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72C durante slo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfra rpidamente. Esta tcnica es la ms usada actualmente, ya que: mata ms rpidamente; mata mejor organismos ms resistentes; altera menos el sabor; acta en flujos continuos (y permite procesar grandes volmenes de leche). Tras la pasteurizacin, el nmero de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales patgenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso,Streptococcus, etc) son eliminados fcilmente. La pasteurizacin tambin se emplea para la preparacin de vacunas a base de microorganismos inactivados por el calor. 2.3.2 CALOR SECO Como ya dijimos, la esterilizacin por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que la efectuada por el calor hmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrgeno y la desnaturalizacin de protenas, as como la fusin de membranas, se efectan a mayores energas. Otros efectos del calor seco son los daos por oxidacin y el provocar un aumento de la concentracin de electrolitos. Aplicaciones del calor seco: 1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170C durante 2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metlico, aceites y jaleas, etc. 2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metlicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias. 3. Incineracin de materiales de desecho. 2.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mnima) no son tiles para la esterilizacin, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelacin (p. ej., especies patgenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas es, sobre todo, bacteriosttico, sin contar aquellos organismos psicrfilos o psicrotrofos.

Los efectos de someter una suspensin bacteriana a temperaturas menores de 0C dependen de: el medio donde estn suspendidas las bacterias; el modo en que se realice la congelacin y una ulterior descongelacin. Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelacin del medio, el citoplasma queda en sobrefusin (sin congelar) entre -1 y -10C. Pero como la tensin de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser: por prdida de agua de la clula (cuando la congelacin se efecta lentamente), o bien por cristalizacin de agua en el interior (cuando la congelacin se realiza rpidamente). En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo que supone que la solucin del citoplasma puede llegar a saturarse, con precipitacin de sales. Ello conlleva varias consecuencias: los cristales de sales y la alta concentracin de electrolitos provocan la desnaturalizacin de protenas y daos a la membrana; otro efecto de menor importancia es el dao mecnico a la pared celular y a la membrana provocado por los cristales de hielo. En general, el enfriamiento rpido es ms lesivo que el lento, existiendo una velocidad ptima. Cuando una bacteria se enfra rpidamente a -35C se producen cristales de hielo que provocan daos cuando la muestra se descongela. Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la descongelacin, y el nmero de ciclos de congelacin-descongelacin. La descongelacin lenta es ms letal que la rpida, ya que aumenta el volumen de cristales de hielo. Aplicaciones de la congelacin: La congelacin se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cmo se efecta tanto la congelacin como la descongelacin. Una vez congeladas, las bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutctico: en nieve carbnica (CO2 slido), a -78C; en nitrgeno lquido, a -180C. Por ello, este mtodo es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbnica o nitrgeno lquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos enseguida, hay mtodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras microbianas durante largos periodos de tiempo. Para preservar an mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a aadir a la suspensin ciertas sustancias, como por ejemplo: Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificacin amorfa y vtrea, en lugar de la cristalizacin, evitando as la formacin de zonas intracelulares con alta concentracin de sales: glicerina, sacarosa, lactosa, dimetilsulfxido (DMSO). Materiales ricos en protena: leche, suero, extracto de carne. Protenas purificadas (p. ej., la albmina). Determinadas macromolculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos. La suspensin bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas sustancia entre -25 a -30C, en congelador. Si se hace con nitrgeno lquido, la conservacin puede ser de varios aos. 3 LIOFILIZACION La liofilizacin es la desecacin al vaco de una muestra previamente congelada. Aplicada a bacterias, es uno de los mtodos que mantiene por ms tiempo la viabilidad bacteriana (varios aos). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero (vase epgrafe anterior),

se congela sobre nieve carbnica (-78C), y se conecta a una bomba de vaco, que provoca la desecacin. La eliminacin de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la viabilidad de sta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente, hasta su uso, que como vemos, puede ser incluso muchos aos despus. 4 EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS La desecacin al aire (sin vaco) mata a las clulas vegetativas bacterianas, pero no a las endosporas. La sensibilidad a la desecacin vara de una especie a otra. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia de luz), de ah que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos. En cambio, el vibrin colrico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de slo dos horas. Las causas de la muerte son, principalmente: el aumento de concentracin intracelular de sales, lo que conlleva efectos txicos y desnaturalizantes de protenas; daos por oxidacin. La mayor eficacia de la desecacin al aire se logra con 50% de humedad relativa. 5 EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS 5.1 CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLCULAS Se puede definir la radiacin como la propagacin de energa por el espacio. Los principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son: radiacin electromagntica l (longitudes de onda, en nm) radiacin infrarroja (IR) 800-106 radiacin visible 380-800 ultravioleta (UV) 13,6-380 rayos X 0.14-13.6 rayos g 0.001-0.14 rayos csmicos < 0.001 Los efectos derivados de la absorcin de radiacin dependen de: la energa de la radiacin absorbida; la naturaleza del material. 1) Si la energa es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los rayos g (estos ltimos se emiten como resultado de la desintegracin de radioistopos). Un fotn de gran energa incide sobre un tomo, provocando la expulsin de un electrn de gran energa (fotoelectrn), y quedando el tomo en forma ionizada (cargado positivamente). El electrn expulsado suele tener energa suficiente para originar una nueva ionizacin, de la cual surge otro electrn de alta energa, etc... producindose unacadena de ionizaciones, con transferencia linear de energa, hasta que sta se disipa en el material: el ltimo electrn de la cadena es captado por otro tomo o molcula, que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman pares de iones (uno positivo y otro negativo). A su vez, esos iones originados tienden a experimentar reorganizaciones electrnicas ulteriores, que dan pie a cambios qumicos en el sistema que se haba sometido a la irradiacin. 2) Si la energa es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del tomo o molcula pasan transitoriamente (de 10-8 a 10-10 segundos) a un nivel energtico superior (entonces se habla de que el tomo o molcula estn excitados), pero enseguida dicho electrn vuelve al estado energtico inicial. En su regreso a su nivel energtico previo, el electrn puede dar origen a una variedad de fenmenos: fluorescencia: emisin de energa a una longitud de onda mayor que la del fotn incidente;

fotosensibilizacin: la energa se transfiere a otra molcula; reacciones fotoqumicas: se origina un cambio qumico; emisin de calor: la energa simplemente se disipa en colisiones entre molculas. La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoqumicas, aparte de calor. Pero la radiacin infrarroja slo conduce a disipacin de calor, si bien ciertas bacterias fotosintticas anoxignicas pueden aprovechar el infrarrojo para la fotosntesis. 5.2 EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES Aunque la unidad de radiacin emitida es el roentgen (R), a efectos biolgicos se usan parmetros que miden la energa absorbida por el sistema: las unidades son el rad (100 erg/g) y el gigaray (1Gy = 100 rads). En general, los microorganismos son ms resistentes a las radiaciones ionizantes que los seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reduccin decimal (D10) para las endosporas de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las clulas vegetativas de la bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre especfico) es de 2.200 Gy. Otras especies ms normales poseen una dosis de reduccin decimal en torno a 200-600 Gy. Compara estos datos con el valor de slo 10 Gy como dosis letal para humanos. Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos X, los rayos g y los radioistopos, como el Co60 o el Cs137. Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, as como mutagnicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiacin, mientras que los letales indirectos y mutagnicos se consiguen a menores dosis. 1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiacin ionizante sobre alguna molcula esencial para la vida, que es el ADN (ya que obviamente es absolutamente esencial y suministra una sola copia de la mayora de los genes bacterianos). Los daos al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse. 2. Efecto mutagnico: deriva de la produccin de daos menores al ADN que pueden repararse por mecanismos propensos a error. 3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el ms importante, y deriva de la radiolisis del agua, que genera hidrgeno naciente (H) y radical hidroxilo (OH). El radical hidroxilo reacciona fcilmente con macromolculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo cual se traduce en efectos de letalidad. Si, adems, la bacteria est expuesta al oxgeno mientras se la est irradiando, el efecto es an ms intenso, debido a que el O2 reacciona con los radicales libres, originando cadenas de reacciones de autooxidacin, muy destructivas, y promoviendo la formacin de perxidos y epxidos, asimismo letales. H + O2 HO2 2 HO2 H2O2 + O2 Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilizacin de: material farmacutico (antibiticos, hormonas, etc); material mdico-quirrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas, bistures, catteres, prtesis, etc); alimentos envasados (aunque en algunos pases an sigue abierta la polmica por parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento). 5.3 EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA La radiacin UV tiene un efecto letal y mutagnico, que depende de su longitud de onda. Ello se debe a la absorcin selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas molculas biolgicas: Las protenas tienen dos picos (es decir, mximos) de absorcin: uno a 280 nm, debido a los aminocidos aromticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los enlaces peptdicos.

El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las bases pricas y pirimidnicas. Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios qumicos en las molculas absorbentes, de modo que aparecen molculas alteradas denominadas genricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivacin de macromolculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas. Las consecuencias de inactivar protenas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad, ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromolculas, y se pueden volver a sintetizar. En cambio, la inactivacin del nico cromosoma de la bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagnicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de accin biolgica de la luz UV equivale al de absorcin del UV por el ADN (260 nm). 5.3.1 FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de alteraciones en las bases pirimidnicas (citosina, timina): a) dmeros de pirimidina (anillo ciclobutano) b) fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina) c) hidratos de pirimidina Los dmeros de pirimidina son los fotoproductos ms importantes en las clulas vegetativas bacterianas. El principal es el dmero de timina (T-T), aunque tambin se producen T-C y C-C. Como se puede observar, se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creacin de un anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsin local de la configuracin de la doble hlice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicacin y transcripcin, y secundariamente en el crecimiento y la respiracin. A dosis muy altas de rayos UV se forman tambin dmeros entre pirimidinas de las dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que igualmente afectan a la replicacin y a la transcripcin, aunque este tipo de daos reviste menos significacin biolgica. El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el captulo 9, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratacin, pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes. Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas dosis de luz UV. Tienen efecto mutagnico (no letal), favoreciendo la aparicin de transiciones T=A a CG. 5.3.2 MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS Debido al carcter esencial del ADN como molcula central informativa de los seres vivos, la evolucin ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para enfrentarse con los posibles daos ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar as: 1) Mecanismos prerreplicativos: a) reparacin fotoenzimtica o fotorreactivacin, que permite la reparacin directa del dao en s b) reparacin por escisin y resntesis 2) Mecanismos posreplicativos: a) reparacin por recombinacin b) reparacin inducible de emergencia (SOS) A) Reparacin fotoenzimtica

Se debe a la actuacin de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas reparandirectamente los dmeros de pirimidina, en una reaccin que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos prostticos coloreados (cromforos): flavina reducida (FADH2) una pterina. Mecanismo 1) La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el dmero de pirimidina, y se une a l, formando un complejo enzima-sustrato [E-S]. 2) La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz (l=300-500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dmero de pirimidina, rompindolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar. Aunque se sabe que el segundo cromforo (la pterina) favorece la reparacin, no est claro cul es su papel exacto. No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la fotorreparacin est muy extendida entre eucariotas. B) Reparacin por escisin-resntesis La distorsin en la doble hlice provocada por el dmero es reconocida por un complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido comocorrendonucleasa o escinucleasa. El dao se repara indirectamente (es decir, no se acta sobre el propio fotoproducto), sino que las bases daadas se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucletido, y el hueco resultante se rellena por resntesis reparadora de ADN. Mecanismo: 1) Un complejo formado por dos subunidades de la protena UvrA y una de la UvrB (Uvr[A2B]) se une cerca del dmero de pirimidina, usando la energa de la hidrlisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hlice. 2) Se une la protena UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr[A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena daada del ADN, cerca del dmero. 3) La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dmero: corta el 8 enlace fosfodister a la izquierda del dmero (o sea, hacia el lado 5') respecto de la localizacin del dmero y corta el 4 o 5 enlace fosfodister a la derecha (en direccin 3' del dmero). Por lo tanto, se produce y libera un fragmento de unos 12 nucletidos de longitud, que incluye al dmero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipptidos constituyentes. 4) Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la sntesis de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5' 3'), tomando como molde la cadena intacta, y usando como cebador (primer) el extremo 3'-OH que se haba generado en la fase anterior. 5) Finalmente, la actuacin de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneracin del enlace fosfodister del lado 5'). C) Reparacin por recombinacin Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que est usando como molde, con un dmero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y salta unos 1000 nucletidos ms adelante para seguir la replicacin. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos 1000 nucletidos. Esta discontinuidad (llamada mella post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparacin

por recombinacin general, recurriendo a la protena RecA, que verifica una recombinacin con la hebra parental homloga intacta. Mecanismo: 1) Numerosas unidades de protena RecA recubren la zona de cadena sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales. 2) La protena RecA promueve emparejamiento homlogo de la cadena sencilla a la que recubre con la doble cadena hermana intacta. 3) Se produce un intercambio recproco de cadenas. 4) El extremo 3'-OH libre de la cadena daada (que merced al intercambio recproco est ahora emparejada con la cadena complementaria procedente de la doble hlice hermana) sirve de cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena complementaria intacta del dplex. 5) Ligacin e isomerizacin espontneas, que produce la llamada estructura de Holliday, una figura en X donde hay dos sobrecruzamientos (crossing-over) que mantienen unidos entre s a los dos duplex. 6) Resolucin de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y religaciones, lo cual genera dos dobles hlices ininterrumpidas. Como se ve en la figura, uno de estos dplex lleva el dmero de pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contien ADN de nueva sntesis. Como se puede ver, el mecanismo de reparacin por recombinacin no repara por s mismo la lesin en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa, evitando que se detenga la replicacin del cromosoma. Al final del proceso el dmero como tal sigue sin reparar, pero ahora tendr una oportunidad de ser reparado por algn otro mecanismo, como el de escisin-resntesis. D) Reparacin de emergencia (SOS) propensa a error Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados agentes qumicos que daan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con la replicacin, puede ocurrir que los sistemas de reparacin que hemos visto hasta ahora no sean suficientes para reparar todos los daos; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que calificamos como de emergencia, ya que tiende a salvaguardar la viabilidad de la clula, a costa de acumular mutaciones con frecuencia elevada (y por eso lo llamamos tambin propenso a error). Descripcin del sistema en una clula normal (no sometida a daos al ADN): El gen lexA posee un nivel basal de expresin, de modo que codifica la protena LexA, que acta como represor sobre su propio gen (represin autgena), as como sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represin no es total, sino que se da un nivel basal de produccin de los polipptidos correspondientes a estos genes. As, por ejemplo, el nivel de protena RecA es suficiente para efectuar los procesos normales de recombinacin, y los niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeos daos en el ADN. Descripcin del sistema en una clula severamente daada: Una clula seriamente afectada por un agente que daa el ADN o interfiere con su replicacin poseer zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una seal de situacin de emergencia para la protena RecA: dicha protena se une a esas regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy especfica (para distinguir esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La protena RecA* (activada como proteasa) induce la proteolisis del represor LexA (rompindolo entre dos aminocidos concretos hacia la mitad de la molcula). Por lo tanto, ya no hay suficiente protena LexA intacta como para seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos

genes (llamados genricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos niveles, de modo que: Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la reparacin por recombinacin; Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A2BC]), lo que supone mejorar la reparacin por escisin-resntesis; Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagnesis. Pero por qu aumenta la mutagnesis? El mecanismo exacto no est claro. Se sabe que en esta situacin de emergencia algunos dmeros de pirimidina son procesados con la intervencin de los productos de recA y de umuD y umuC, de modo que hay unasntesis de emergencia de ADN que acarrea la frecuente introduccin de bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparacin propenso a error). De esta manera, la clula salvara su integridad en esta situacin lmite, pero a costa de adquirir frecuentes mutaciones. (Es mejor sobrevivir aunque sea con unas cuantas mutaciones a morirse!). 5.3.3 APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV La luz UV se puede producir artificialmente en lmparas de vapor de mercurio de baja presin, que emiten el 90% de su radiacin a 254 nm. La unidad de energa de radiacin se mide en watts/(segcm2). Por ejemplo, una lmpara de 15 watios emite una energa de 38mwattscm-2seg-1, a una muestra situada a 1 metro de la lmpara. La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La dosis letal para clulas vegetativas suele estar entre 1800 y 6500 mwattcm-2, pero las endosporas requieren 10 veces ms dosis. El uso prctico de la luz UV como agente esterilizante est limitado, ya que tiene poco poder penetrante: no entra en objetos slidos, y adems se ve apantallada por el cristal y penetra poco en los lquidos. Su aplicacin concreta ms frecuente es en el control de infecciones por va area: lmparas de desinfeccin en salas de hospitales y de laboratorios de investigacin. En Microbiologa se emplea la luz UV como agente mutagnico en bacterias (en muchos estudios que requieran obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes bases genticas). 5.4 EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energa, y adems, sus cuantos no tienen efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sera de esperar, en principio, que este tipo de radiacin tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenmeno de sensibilizacin fotodinmica. La luz visible de fuerte intensidad (p. ej., exposicin a pleno sol) es capaz de matar las bacterias, debido a que ciertas molculas de stas (riboflavinas, porfirinas, citocromos) absorben la energa de los cuantos y se excitan durante 10-6-10-8 seg, tras lo cual reemiten la energa a otras molculas, originando fotooxidaciones en residuos His y Trp de las protenas y en las bases de los cidos nucleicos. Tambin se puede generar oxgeno singlete (1O2), que es un radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la clula con rapidez. As pues, la moraleja prctica es: no dejarse los cultivos bacterianos expuestos a la luz solar, sino que habrn de cultivarse en oscuridad (salvo el cultivo de las bacterias fototrofas). Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintticas, y las que se propagan va area) poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energa del oxgeno singlete y la reenvan al estado basal, no excitado). 6 EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS

Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuencias entre los 9 kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitan las ondas supersnicas (hasta los 200 Kc/seg) y las ultrasnicas (desde 200 hasta 2000 Kc/seg). Estos tipos de ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo las ultrasnicas) tienen el efecto de desintegrar las clulas. El fundamento de esta accin es el siguiente: el paso del sonido a travs de un lquido produce cambios de presin alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), que a grandes frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 mm de dimetro (fenmeno de cavitacin). Dichas cavidades van aumentando de tamao y terminan colapsando violentamente, dando lugar a enormes presiones locales (de hasta 1000 atmsferas o 10 Tm/cm2). Las consecuencias del colapso son: la clula se desintegra; si existe oxgeno en el lquido de suspensin, se forman perxidos (como el H2O2); despolimerizacin de macromolculas; cortes en ambas hebras del ADN. Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibraciones sonoras. En general, son ms sensibles las Gram-negativas y ms resistentes las Gram-positivas. Sin embargo, ante un tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad de que sobrevivan algunos individuos, por lo que este mtodo no tiene utilidad para la esterilizacin. El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la llamada sonicacin o disrupcin ultrasnica de clulas para obtener extractos celulares, en investigaciones bioqumicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generador de ultrasonidos o sonicador, que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100 Kc/seg. 7 EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA La mayor parte de las especies bacterianas de hbitats continentales no pueden crecer (e incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm2). Ello se debe a los siguientes efectos adversos: aumento de la viscosidad del citoplasma; disminucin de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos; interferencia en la divisin celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin produccin de tabique transversal (crecimiento sin divisin celular). Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altas presiones (barotolerantes y barfilas, respectivamente): Bacterias barotolerantes: Crecen a la presin atmosfrica, pero aguantan hasta unas 500 atmsferas. Su hbitat son las aguas ocenicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad. Bacterias barfilas: Crecen ptimamente a ms de 400 atmsferas. Podemos distinguir entre barfilas moderadas (facultativas) y barfilas extremas (obligadas): Las barfilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presin atmosfrica, aunque su ptimo est a unas 400 atmsferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000 metros. Las barfilas extremas presentan ptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de 600-700 atmsferas), y son incapaces de crecer a presin atmosfrica. Se han llegado a aislar a ms de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la temperatura del agua es de slo 2-3oC, suelen ser simultneamente crifilas. Este tipo de bacterias est empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas en cmaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones que requieren.

Aplicacin prctica de las altas presiones a bacterias barosensibles: La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamente como prensa francesa) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandes presiones y brusca descompresiones, lo que logra la rotura mecnica de las bacterias, con objeto (al igual que la sonicacin) de obtener extractos libres de clulas. 8 EFECTOS DE LA PRESIN OSMTICA (Repasa en el captulo 11 el concepto de potencial de agua o actividad de agua, aw) Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias pueden vivir en medios tanto hipotnicos como hipertnicos, debido a la proteccin de una pared celular rgida y a la membrana citoplsmica semipermeable. Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente superior a la del entorno, lo que garantiza el paso de agua al interior. La presin de turgor es relativamente constante porque la membrana citoplsmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta presin de turgor permite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentracin de solutos en su entorno (dentro de ciertos lmites). Pero esto plantea una pregunta (que intentaremos responder a continuacin): cmo logra la bacteria ajustar su osmolaridad interna a esos cambios exteriores? A) En medios hipotnicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplsmica tienda a sufrir una presin de turgor excesiva. B) En medios hipertnicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentracin de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado genricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos: bombeando iones al interior; sintetizando una molcula orgnica osmticamente activa; bombeando sustancias osmoprotectoras. 1) En el caso de los iones, el in bombeado suele ser el potasio (K+), por un sistema de antiporte K+/H+. 2) Como ejemplos de sntesis de solutos orgnicos compatibles y osmticamente activos tenemos el glutamato, la glutamina y la trehalosa. En levaduras es frecuente que el soluto compatible sea un poliol (sorbitol, manitol, etc.). Ahora bien, si el medio es muy hipertnico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retraccin de la membrana citoplsmica. La prdida de agua puede suponer la deshidratacin del citoplasma, lo que conlleva la detencin del crecimiento. En Gram-positivas se produce una plasmolisis autntica (retraccin de la membrana citoplsmica respecto de la pared rgida suprayacente) En Gram-negativas no existe autntica plasmolisis, ya que la pared celular y la membrana citoplsmica se retraen al mismo tiempo. Las bacteria entricas crecen lentamente por encima de 0.65M de NaCl. 3) Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la mxima terica, si en el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores. La bacteria bombea esos compuestos a su interior, usndolos como solutos compatibles. Ejemplos de osmoprotectores exgenos que pueden ser bombeados al interior celular: Prolina (p. ej., en Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus) Betana (glicnbetana), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y en algunas

Gram-positivas). Colina (en Escherichia coli). Ectona en enterobacterias. Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, pero mejora si al medio se aade 1mM de prolina. Un mtodo normal de aislar S.aureus es comprobar el crecimiento en medio con 7.5% de ClNa en presencia de prolina. Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertnicos, y en general se llaman osmfilos. Entre los osmfilos podemos distinguir los sacarfilos y los halfilos. Uno de los mejores ejemplos de microorganismos sacarfilos no es una bacteria, sino las levaduras, que viven en jugos vegetales, nctares, zumos, etc. Utilizan como solutos compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc. Entre los organismos halfilos, podemos distinguir los halfilos moderados y los halfilos extremos o hiperhalfilos. Halfilos moderados: suelen ser bacterias marinas (ej.: Vibrio fischeri) que viven en 3.5% de NaCl, y que ven inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halfilos moderados tienen requerimientos concretos de una aw equivalente a la de agua de mar, as como concentraciones determinadas de iones Na+. El papel jugado por este Na+ es: mantenimiento de los sistemas de membrana citoplsmica y transporte; estabilizacin de la pared celular; requerimiento por parte de muchas enzimas. Halfilos extremos (hiperhalfilos), representados paradigmticamente por las arqueas del gnero Halobacterium, que viven en (y de hecho requieren) concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto compatible el K+, concentrndolo a partir del medio donde viven, hasta que el citoplasma queda prcticamente saturado con l (4 a 7 M). Esta gran concentracin de potasio es esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus ribosomas, enzimas y sistemas de transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas requieren altas concentraciones de cloruro sdico. Dejando aparte las bacterias halfilas, hay algunas bacterias halotolerantes (como por ejemplo, Staphylococcus aureus), pero la inmensa mayora de los procariotas viven a valores de actividad de agua de 0.98. Por ello, un mtodo que ya se conoca empricamente en la antigedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o salarlos, o aadirles grandes cantidades de azcar (como en las mermeladas). 9 EFECTO DEL pH La mayora de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio, manteniendo al mismo tiempo su pH interno ptimo prcticamente constante. Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor. Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, stas se pueden clasificar en: Neutrfilas, si crecen de modo ptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8). Acidfilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5. Alcalfilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5. La mayor parte de las bacterias son neutrfilas. Muchas bacterias neutrfilas modifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente cidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan cidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminacin de aminocidos. Por otro lado, la mayor parte de los hongos y levaduras requieren pHs ligeramente cidos (en torno a 4-5). Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen ms o menos amplio de pH (alrededor de un ptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte

de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplsmico cae rpidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir. Uno de los mecanismos que, al menos en neutrfilos parece controlar el pH interior es un sistema de antiporte H+/K+: a pH cidos, el interior celular puede quedar en principio ms alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana para establecer una fuerza protn motriz que les suministre energa. Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una respuesta de tolerancia a cidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones (expulsan protones al exterior) y chaperonas (protenas celadoras) para corregir las protenas desnaturalizadas. Existen algunos notables procariotas cuyo pH ptimo es muy bajo (acidfilos extremos u obligados): Algunas eubacterias del gnero Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las arqueas de los gneros Sulfolobus, Thermoplasma y Ferroplasma tienen su ptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta cido sulfrico. (Sulfolobus es un Secciones un termoacidfilo). De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran. Una arquea sorprendentemente acidfila es Picrophilus oshimae, cuyo pH ptimo es nada menos que 0.7 (aparte de que es una termfila que necesita temperaturas de ms de 60C). Las especies alcalfilas obligadas tienen ptimos de pH en torno a 10-11. Por ejemplo, Bacillus alcalophilus , cuyo pH interno es de 9. Sus hbitats tpicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son tambin halfilos, como Natronobacterim gregoryi). Estos organsimos tienen gran inters industrial, porque de ellos se obtienen enzimas hidrolticas como proteasas y lipasas que se usan como aditivos en detergentes.