Grzegorz Kurzawski, Joanna Matyjasik

Analizy molekularne DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych predyspozycji do nowotworw

W ostatnich latach zidentyfikowano szereg genw, ktrych mutacje odpowiedzialne s za wysok dziedziczn predyspozycj do nowotworw (1). U nosicieli mutacji tych genw ryzyko zachorowania na chorob nowotworow moe wynosi nawet 90%. Wybrane geny zwizane z predyspozycj do nowotworw dziedzicznych i najczciej badane w praktyce lekarskiej zestawiono w tabeli 1.
Tab.1. Geny, ktrych mutacje predysponuj do nowotworw dziedzicznych. Zestawienie obejmuje geny najczciej badane w naszym laboratorium.

Opracowano szereg metod molekularnych, ktre pozwalaj na wykrywanie mutacji. Mona je podzieli na metody: I bezporedniego, II poredniego wykrywania mutacji. Ad. I. Bezporednie wykrywanie mutacji jest najbardziej swoist metod wykrywania zaburze w obrbie genu. Umoliwia rozpoznanie nosicielstwa mutacji niemal ze 100% pewnoci. Ad. II. Porednie wykrywanie mutacji jest metod o nieco mniejszej swoistoci pozwala natomiast na potwierdzenie lub wykluczenie nosicielstwa mutacji w wielu przypadkach, w ktrych nie mona wykry zmian bezporednio w genach. Metody wykrywania mutacji klasyfikowane s rwnie w zalenoci od tego, czy su do diagnozowania mutacji nieznanych czy te znanych i powtarzalnych, ze wzgldu na zasadnicze rnice w czuoci identyfikowania i efektywnoci ekonomicznej.

Wykrywanie nieznanych mutacji

Zastosowanie technik wchodzcych w skad tych metod w odpowiednio dobranych pod wzgldem cech rodowodowo-klinicznych przypadkach jest w praktyce lekarskiej uzasadnione mimo tego, e techniki te jak dotychczas s zoone, pracochonne i kosztowne. I. Techniki bezporedniego wykrywania nosicielstwa mutacji 1. Analizy DNA Zasadnicze rodzaje analiz: 1a / izolacja DNA 1b / amplifikacja fragmentw genw, z reguy sekwencji kodujcych 1c / wstpne wykrywanie zaburze w produktach amplifikacji technikami przesiewowymi 1d / sekwencjonowanie 1e / metoda Southerna 1f / zalena od ligacji multitpleksowa amplifikacja sond Ad. 1a. Materia do izolacji DNA stanowi na og komrki atwo dostpne, takie jak leukocyty z krwi obwodowej lub rzadziej bioptaty innych tkanek. W trakcie analiz wykrywana jest mutacja konstytucyjna, a wic obecna we wszystkich komrkach pacjenta. Materia do badania najlepiej pobra bezporednio przed izolacj, ale dobre wyniki uzyskuje si rwnie po kilkudniowym przechowywaniu krwi w temperaturze pokojowej lub nawet przez kilka lat w temperaturze poniej zera. Jeeli nie dysponujemy tkankami wieymi to izolacj DNA mona wykona z tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w bloczkach parafinowych, chocia uzyskanie jednoznacznych wynikw z takiego materiau jest trudne, niekiedy wrcz niemoliwe. Izolowanie DNA polega na usuniciu biaek z lizatu komrkowego. Zwykle uzyskuje si to poprzez trawienie proteinaz K i ekstrakcji w mieszaninie fenolu i chloroformu. Z odbiaczonych w ten sposb prbek kwasy nukleinowe wytrca si alkoholami: etylowym lub izopropylowym. Ad. 1b. W tej analizie powielane s fragmenty badanego DNA za pomoc reakcji acuchowej polimeryzacji (PCR). W skad mieszaniny reakcyjnej wchodz: matryca DNA (zwykle genomowi DNA), polimeraza DNA, para specyficznych starterw (primers), trjfosforany deoksyrybonukleotydw oraz bufor reakcyjny. Mieszanina ta poddawana jest w specjalnym termostacie cyklicznym zmianom temperatury. Kady cykl skada si z trzech etapw: denaturacji, przyczania starterw i syntezy. Po 22 cyklach, przy 100% wydajnoci, liczba kopii powielanego fragmentu zwiksza si milion razy.

Ad. 1c. Niegdy popularn technik wstpnego wykrywania zaburze w produktach amplifikacji byo badanie zmian konformacji jednoniciowego DNA -SSCP (single stranded conformational polymorphism) (7). Inne techniki tego rodzaju to analiza heterodupleksw HET (heteroduplex analysis) (8), chemiczne rozszczepianie niesparowa heterodupleksw - CMC (chemical mismatch cleavage) (9) DHPLC (Denaturing High-performance Liquid Chromatography ) (10) i elektroforeza na elach z gradientem czynnika denaturujcego -DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) (11). SSCP - badanie zmian konformacji jednoniciowego DNA Technika ta opiera si na tym, e jednoniciowe DNA w roztworze wykazuje okrelon struktur drugorzdow. Struktura

ta zaley od rodzaju i sekwencji zasad tworzcych ni DNA. Mutacje punktowe, delecje i insercje powoduj zmiany struktury drugorzdowej, ktra wpywa na szybko poruszania si nici w trakcie elektroforezy na niedenaturujcych elach poliakrylamidowych. Nici normalne i zmutowane wykazuj odmienn ruchliwo elekroforetyczn (ryc. 1 i 2). W ostatnich latach wprowadzono szereg udoskonale tej techniki, dziki ktrym mona wykona analiz na gotowych elach w kontrolowanej temperaturze, a barwienie eli (srebrzenie) zostao cakowicie zautomatyzowane. Caa procedura trwa niespena dwie godziny. Do zalet tej analizy naley rwnie to, e startery zsyntetyzowane do SSCP mog by rwnoczenie stosowane do

sekwencjonowania, analizy heterodupleksw oraz chemicznego rozszczepiania niesparowa heterodupleksw. Niedogodnoci SSCP to przede wszystkim konieczno analizowania produktw PCR nie duszych ni 200-300 pz (par zasad), bowiem przy wikszej dugoci produktw spada znaczco czuo wykrywania mutacji. Dlatego by oceni sekwencj kodujc duych genw trzeba wykona wiele reakcji PCR. Wielu autorw podkrela, e czuo SSCP w wykrywaniu mutacji nie przekracza 80% (12). HET - analiza heterodupleksw HET podobnie jak SSCP jest technik wzgldnie prost. Jeeli sekwencje niezmienione (typu dzikiego) oraz sekwencje z mutacj s obecne w reakcji PCR (jako matryce) to produktami tej reakcji s cztery rne dwuniciowe fragmenty DNA (ryc.3). Dwa z nich to homodupleksy, czyli struktury dwuniciowe w peni komplementarne. Dwa inne to heterodupleksy zawierajce miejsca niesparowane (mismatch). Heterodupleksy ze zmian co najmniej jednej zasady mog wykazywa inn w porwnaniu do homodupleksw ruchliwo podczas elektroforezy na zwykym poliakrylamidowym elu. Czuo tej analizy w wykrywaniu mutacji nie jest dobrze znana. Szacuje si, e w niektrych ukadach dowiadczalnych moe wynosi nawet 90% (8). Wedug niektrych autorw stosujc HET mona wykrywa niekiedy zaburzenia genw, ktre nie s wykrywane przez SSCP. Poniewa reakcje PCR do HET i SSCP s takie same, a rnica w wykonaniu dowiadcze pomidzy technikami sprowadza si jedynie do rnej obrbki produktw amplifikacji, wielu autorw proponuje stosowanie w kadym przypadku zarwno HET jak i SSCP celem zwikszenia czuoci wykrywania mutacji stosunkowo niewielkim kosztem (13).

CMC - chemiczne rozszczepianie niesparowa heterodupleksw

Zamiana nukleotydw w wyniku mutacji prowadzi do tego, e heterodupleksy powstajce w wyniku reakcji PCR maj miejsca niesparowania, w ktrych zamana jest regua, e w strukturze dwuniciowego DNA naprzeciwko C znajduje si G i tworzy potrjne wizanie wodorowe, a komplementarnie do A znajduje si T tworzc podwjne wizanie wodorowe. Niesparowane w heterodupleksach zasady C i T ulegaj chemicznej modyfikacji, odpowiednio z hydroksyloamin i czterotlenkiem osmu. Miejsca wizania tych substancji s cite z uyciem piperydny. Pocite fragmenty DNA s rozdzielane elektroforetycznie (ryc.4). Zalet metody jest niezwykle wysoka czuo bliska 100%, a take moliwo wykrywania mutacji w odcinkach DNA dugoci 1-2 kpz (tysicy par zasad) (12). Gwn

wad techniki jest toksyczno chemikaliw, jak i wiksza zoono procedury w porwnaniu z SSCP czy HET. DHPLC - wysokosprawna denaturujca chromatografia cieczowa Najlepsz i coraz czciej uywan technik wstpnego wykrywania zmian jest DHPLC (10, 14, 15, 16, 17). Jest to odmiana HET wykorzystujca wysok rozdzielczo nowoczesnych wypenie kolumn chromatograficznych. Rozdzia analizowanych fragmentw DNA przeprowadzany jest w gradiencie czynnika denaturujcego. W warunkach subdenaturacyjnych heterodupleksy wykazuj mniejsze powinowactwo ni homodupleksy do zoa kolumny i atwiej ulegaj wymyciu. Cao rozdziau monitorowana jest przez miernik absorbancji mierzonej przy 260nm. Profil elucji (ryc. 5) jest charakterystyczny i powtarzalny dla danej zmiany i pozwala na odrnienie nowych zmian od wczeniej wykrytych mutacji bd polimorfizmw. Z danych literaturowych (18) i bada wasnych (19) wynika, e DHPLC czy zalety dotychczas stosowanych metod. Czuo metody siga 100% (10, 16, 17) przy stosunkowo niskich kosztach (koszt odczynnikw najwyej 20 zotych na prbk) jest szybka, a przy zastosowaniu autosamplera pozwala wykona analiz 200 prbek na dob.

Exon 19 MLH1
mAU 8

homodupleksy
Homozygota 3956 A/A Heterozygota 3956 A/G

heterodupleksy

3.6

3.8

4.2

4.4

4.6

4.8

5.2 min

Ryc. 5. Profil elucji DHPLC charakterystyczny (czerwona przerywana linia) dla mutacji A na G w eksonie 19 genu MLH1

DGGE - elektroforeza na elach z gradientem czynnika denaturujcego W trakcie elektroforezy dwuniciowego DNA w elu o wzrastajcym steniu zwizku denaturujcego (formamid, mocznik) niektre fragmenty DNA ulegaj rozdzieleniu na pojedyncze nici (denaturacja) przy niszym, a inne fragmenty przy wyszym steniu formamidu. W momencie rozejcia si na pojedyncze nici ich przemieszczanie w elu zostaje gwatownie przyhamowane. Moment denaturacji DNA zaley od jego budowy (skadu zasad i dugoci). Fragmenty zawierajce mutacje zatrzymuj si w elu na og przy innym steniu czynnika denaturujcego anieli prawidowe. Technik t cechuje bardzo wysoka, ponad 90% czuo wykrywania mutacji (20). Do wad naley potrzeba elekroforezy w specjalnym aparacie oraz konieczno syntetyzowania dodatkowych starterw bogatych w sekwencje GC (GC clamp), co zwiksza znacznie koszty testw.

Ad. 1d. Sewencjonowanie jest najbardziej czu technik wykrywania zmian w materiale genetycznym umoliwiajc jednoczenie ich pen charakterystyk. W ostatnich latach znaczny

postp w technologii sekwencjonowania osignito poprzez wprowadzenie automatycznych aparatw do sekwencjonowania, ktrych funkcjonowanie oparte jest o fluorescencj wzbudzan laserem. Kady z nukleotydw (A, C, G, T) moe by wyznakowany innym fluorochromem (ryc. 6). Najbardziej dogodn technik jest sekwencjonowanie metod cykliczn (21). W trakcie badania oceniane s sekwencje produktw PCR obu nici DNA. Rzeczywista zmiana w odrnieniu od artefaktw wykrywana jest w obu niciach (ryc. 7). Procedura sekwencjonowania skada si z kilku etapw: 1. preparatywnego PCR - polegajcego na namnoeniu wybranego fragmentu genu przy uyciu pary specyficznych starterw; 2. asymetrycznego PCR - dla kadej prbki amplifikacja osobno z kadym ze starterw z zastosowaniem dideoksynukleotydw znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi; 3. elekroforezy na denaturujcym elu poliakrylamidowym z rwnoczesn detekcj i rejestracj przepywajcych produktw; 4. analizy otrzymanych wynikw przy uyciu pakietu programw komputerowych.

Podczas asymetrycznego PCR powstaj wszystkie moliwe, rnice si dugoci oligonukleotydy komplementarne do matrycy i zawierajce na 3-kocu fluorochrom (zaznaczone kolorem). Zostaj one rozdzielone podczas elektroforezy od najkrtszego po najduszy, a kolejno kolorowych nukleotydw odczytana jako sekwencja komplementarna do matrycy. Stwierdzana sekwencja DNA jest pniej porwnywana z sekwencj prawidow z dostpnych baz danych takich jak GenBank i EMBL. Przez porwnanie z sekwencjami prawidowymi okrelany jest dokadnie charakter zmiany (ryc. 7 i 8). Obecnie czoowe firmy oferuj sekwenatory umoliwiajce jednoczesne sekwencjonowanie 96 prbek w oparciu o elektroforez kapilarn produktw otrzymanych metod cykliczn z uyciem dideoksynukleotydw znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi. Postp w tej dziedzinie polega w ostatnich latach , nie tylko na zwikszeniu liczby jednoczenie analizowanych prbek, ale na opracowaniu nowych eli (umoliwiajcych wielokrotny rozdzia na tym samym wypenieniu kapilary) i chemii (mieszaniny zoonej z buforw; substratw, polimerazy i tak zwanych ulepszaczy) umoliwiajcych analiz sekwencji jednego fragmentu dugoci prawie 1000 zasad.

Oferowane s te nowe aparaty GSFLX machine 2007 oparte o rwnoczesne sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym przez syntez rwnoczesn bardzo wielu stosunkowo krtkich fragmentw DNA (okoo 200 zasad), wykorzystuj pirosekwencjonowanie z detekcj luminescencji powstajcej z rozkadu ATP. Aparaty te pozwalaj na analiz 100 mln zasad jednego dnia. Pirosekwencjonowanie (22) jako matryc wykorzystuje jednoniciowy fragment DNA, na ktrych przeprowadzana jest synteza nici komplementarnej poprzez dodawanie kolejno czterech rnych trifosforanw deoksynukleotydw (dNTP). Przyczeniu kadej zasady towarzyszy uwalnianie pirofosforanu, ktry zostaje przeksztacony w ATP przy udziale sulfurylazy i obecnego w mieszaninie adenozyno-5fosfosiarczanu. Powstay ATP wykorzystywany jest przez lucyferaz do przeksztacenia lucyferyny w oksylucyferyn. W reakcji tej powstaje wiato w iloci odpowiadajcej wyprodukowanemu we wczeniejszym etapie pirofosforanowi. wiato to jest rejestrowane przez kamer CCD i przeksztacane do postaci piku na wykresie. Ten sam schemat reakcji przeprowadzany jest rwnie dla kolejno dodawanych rnych dNTPw. Jeeli dodawany nukleotyd nie jest komplementarny do matrycy nie nastpuje wczenie go do nowo syntetyzowanej nici i nie powstaje pirofosforan. Tylko obecno sygnau wietlnego stanowi postaw do zapisu w sekwencji kolejnego dodawanego nukleotydu. Mutacje w DNA obejmujce miejsca przyczania starterw lub inne odcinki poza regionami amplifikowanymi nie s wykrywane za pomoc testw DNA opartych o analizy omwione powyej. Cz takich zmian to due przemieszczenia. Ad. 1e. Jedn z technik, kiedy powszechnie uywan do wykrywanie duych przemieszcze opart o hybrydyzacj jest opisana po raz pierwszy przez E.M. Southerna w 1975 i odtd zwana metod Southerna ( Southern bloting) W tej metodzie genomowe DNA poddaje si trawieniu enzymami restrykcyjnymi by nastpnie powstae fragmenty, rozdzieli przy pomocy elektroforezy na elu agarozowym. W celu uzyskania formy jednoniciowej poddaje si je denaturacji i przenosi na filtr nitrocelulo-

zowy bd nylonowy. Zwizany z filtrem jednoniciowy DNA hybrydyzuje z DNA wyznakowanym i komplementarnym do analizowanego fragmentu (sonda). W wersji z uyciem izotopw obraz prkw wywouje si metod autoradiografii, przykadajc bon fotograficzn do filtra w celu zidentyfikowania pozycji prkw zajtych przez sond (ryc. 9). Due delecje (wypadnicia fragmentu genu), insercje (wstawienia) oraz inwersje (odwrcenia) bd translokacje (przeniesienia) zwykle zmieniaj pozycje i intensywno prkw (bo zmieniaj si odlegoci pomidzy miejscami restrykcyjnymi, a wic i dugoci analizowanych fragmentw). Metoda Southerna jest czaso- i pracochonna oraz wymaga duych iloci dobrej jakoci DNA (dugoczsteczkowego DNA). Doniesienia literaturowe wskazuj ,e Southern moe by zastpiony now technik opart o multipleks PCR z fluorescencyjnymi primerami (23).

Technika ta polega na rwnoczesnej amplifikacji ilociowej wielu fragmentw genu badanego i jednego fragmentu genu odniesienia. Na podstawie zmian stosunkw ilociowych poszczeglnych fragmentw mona wnioskowa o delecjach bd duplikacjach odpowiednich odcinkw genw. Nasze dowiadczenia wskazuj, e ilociowe zmiany czsto maj w tej technice charakter artefaktw, wynikaj np. z rnego stopnia degradacji prbek DNA. Ad. 1f. Zalena od ligacji multitpleksowa amplifikacja sond Metod godn polecenia, ktra niemal cakowicie zastpia metod Southerna. w wykrywania rearanacji w genach odpowiedzialnych za dziedziczne predyspozycje do nowotworw jest zalena od ligacji multitpleksowa amplifikacja sond (MLPA - multiplex ligation-dependent probe amplification) (24). Technika ta w oparciu o reakcj ligacji specyficznych sond i reakcj amplifikacji pozwala na ocen liczby kopii eksonw. Na jej podstawie mona wnioskowa o delecjach bd duplikacjach fragmentw lub caych genw (geny odniesienia jako kontrola). W technice tej stosuje si wiele par sond. Sondy zawieraj oprcz sekwencji docelowych komplementarnych do sekwencji eksonowych (sekwencje ulegajce hybrydyzacji), sekwencje starterowe, a jedna z kadej pary dodatkowo unikatow sekwencj wstawki (Ryc. 10)

Syntetyczny oligonukleotyd 50-60 bp

M13-pochodny oligonukleotyd 60-450 bp

Sekwencja primerowa x

Sekwencja primerowa Y
Wstawka unikatowa (rna w kadej sondzie) Sekwencja ulegajca hybrydyzacji Sekwencja ulegajca hybrydyzacji

Ryc. 10. Budowa sond w MLPA

Sekwencje hybrydyzujce kadej pary sond analizowanego rejonu genu s skierowane komplementarnie do ssiadujcych ze sob fragmentw DNA. analizowanego regionu genu i (wtedy moe zachodzi ligacja przy w peni komplementarnej hybrydyzacji) (Ryc. 11)

X Y 5 3 cel A 5 X 5 3 cel B 5 Y

Ryc. 11. Hybrydyzacja i ligacja sond

Po przyczeniu sond do matrycy nastpuje ich ligacja, a nastpnie denaturacja. Oddysocjowany zligowany fragment DNA (z kadej pary jeden) zawierajcy sekwencj obu starterw zostaje poddany amplifikacji podczas reakcji PCR. Obecno rnej dugoci wstawek pozwala na rozrnienie produktw skierowanych na rne cele, a ilo produktu jest proporcjonalna do iloci sekwencji matrycowej. Kady pik odpowiada produktowi amplifikacji zligowanej specyficznej pary sond (Ryc. 12).

Ryc. 12. Wynik elektroforezy prby kontrolnej

Rnice wzgldne w wysokoci bd powierzchni piku wskazuj na zmiany ilociowe (bd czasami jakociowe) docelowej sekwencji sondy

Ryc. 13. Wynik elektroforezy prby badanej wskazujcy na delecj eksonu 13

Zalet tej techniki jest niewielka ilo DNA wymagana do przeprowadzenia analizy i moliwo zastosowania nawet zdegradowanego materiau genetycznego. Najwaniejszymi zaletami metody s prostota wykonania, niska cena i mae wymagania, co do iloci (20ng genomowego DNA) i jakoci DNA. Oferowane gotowe zestawy sond dotycz najwaniejszych znanych genw silnie predysponujcych do nowotworw takich jak: ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK1, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, APC, FANCA, FANCD2,PTCH, BMPR1A,SMAD4, TP53, CDH1, MEN1, NF1, NF2, STK11, SMARCB1, RB1,CDKN2A-CDKN2B, WT1. 2. Analizy RNA Zalety analiz RNA wynikaj przede wszystkim z moliwoci wykrycia mutacji przy wykonaniu mniejszej liczby reakcji (co wynika z mniejszej dugoci RNA okrelonej liczb zasad w porwnaniu do DNA). Jak dotychczas gwne wady tych technik obejmuj trudnoci w uzyskiwaniu powtarzalnych wynikw, mniejsz stabilno RNA z niektrymi mutacjami oraz kopoty w interpretacji zwizane z wystpowaniem rnych form skadania RNA (altenartive splicing). Etapy badania obejmuj: 2a / izolacj RNA

2b / amplifikacj czci kodujcych genw 2c / wykrywanie zaburze w produktach amplifikacji Ad.2a. Izolacja RNA W wikszoci pracowni RNA izolowane jest z limfocytw krwi obwodowej. Izolacj RNA przeprowadza si w podobny sposb jak izolacj DNA. Ze wzgldu na wszechobecno termostabilnych RNaz w tkankach, izolacja RNA wymaga wikszej starannoci. Powszechnie stosowan metod izolacji jest procedura P. Chomczynskiego (25) polegajca na lizie komrek w roztworze rodanku guanidyny (inhibitor RNaz) i nastpnie ekstrakcji mieszanin fenolu i chloroformu. Lekko kwany odczyn fenolu sprawia, e wytrceniu oprcz biaek ulega rwnie DNA, ktry w tych warunkach jest praktycznie nierozpuszczalny. Ad.2b. RT/PCR - Odwrotna transkrypcja z reakcj PCR (reverse transcription PCR) RNA mona przepisywa na cDNA (komplementarne DNA) za pomoc odwrotnej transkryptazy i namnoy przy pomocy reakcji PCR. RNA nie zawiera intronw wic do powielenia kodujcej czci wybranego genu wystarcza zwykle zaledwie kilka par starterw. Oceniajc tak otrzymane cDNA na zwykych elach agarozowych wykry mona zaburzenia RNA polegajce na delecjach lub insercjach fragmentw o dugoci powyej kilkudziesiciu par zasad. Ad.2c. Produkt reakcji RT/PCR moe by te badany wszystkimi wczeniej omwionymi technikami oraz przy pomocy testu syntezy biaka in vitro - IVTT (In Vitro Transcription Translation Assay) zwanego rwnie PTT (Protein Truncation T est) (26, 27). RT-PCR jest pierwszym etapem w PTT. W PTT jeden starter zawiera nie tylko sekwencje inicjujce przepisywanie na cDNA, ale dodatkowo sekwencje inicjujce translacj tj. syntez in vitro biaka na bazie cDNA. Po rozdziale elektroforetycznym i przeniesieniu na bon nitrocelulozow oceniana jest dugo zsyntetyzowanego biaka, ktra jest zmieniona nie tylko wwczas, gdy w obrbie RNA wystpuj due delecje lub insercje, ale rwnie w przypadkach mutacji nawet pojedynczych nukleotydw prowadzcych do powstania sekwencji typu stop kodon (TGA, TAA lub TAG) lub mutacji splicingowych. Wad PTT jest niemono wykrycia mutacji typu zmiany sensu. Szacuje si, e nawet przy wykorzystywaniu wszystkich znanych testw czuo bezporedniego wykrywania zmian wynosi obecnie okoo 70-80 %, gwnie ze wzgldu na niemono rozpoznania zaburze w nieznanych sekwencjach regulujcych funkcjonowanie genw. W zwizku z tym w badaniach rodzin z dziedzicznymi nowotworami stosowane s rwnie techniki poredniego wykrywania nosicielstwa mutacji. II. Techniki poredniego wykrywania nosicielstwa mutacji Analiza sprze (Linkage analysis) Analiza sprze opiera si na tym, e markery genetyczne znajdujce si na chromosomach blisko siebie dziedzicz si wsplnie w zalenoci od odlegoci pomidzy markerowymi loci - bardzo mae jest prawdopodobiestwo, e dwa loci DNA pooone blisko siebie zostan rozdzielone podczas mejozy w trakcie crossing over, natomiast loci znajdujce si na odlegych kocach chromosomw s w trakcie mejozy rozdzielane znacznie czciej. Jeeli w wielu rodzinach z okrelon chorob genetyczn wystpuje ten sam marker oznacza to, e lokus genu odpowiedzialnego za chorob i marker s sprzone. Prawdopodobiestwo, e oceniany marker zlokalizowany jest blisko genu dla danej choroby okrelane jest za pomoc wartoci zwanej lod score - Z. Z jest log10 prawdopodobiestwa, e marker i choroba s sprzone. Jeeli Z dla sprzenia badanego markera i choroby wynosi 2, oznacza to, e prawdopodobiestwo przypadkowoci sprzenia markera i genu dla choroby wynosi 1:102 , tj. na 1 na 100. Ujemne wartoci Z stwierdzane s wwczas, gdy badany marker i gen dla choroby s oddalone na chromosomach. W opracowaniu Gelehrter i Collons (28) mona znale szczegowy opis matematycznych oblicze Z. Dziki analizie sprze zlokalizowano geny takie jak BRCA1, BRCA2, MSH2,

MLH1 czy APC. Niestety pena analiza sprze moe by wykorzystana jedynie w wyjtkowych sytuacjach, w ktrych dostpne do badania jest DNA, co najmniej od czterech osb dotknitych chorob oraz rwnoczenie od znacznej liczby osb zdrowych z tej samej rodziny. W naszej praktyce w cigu ponad 10 lat funkcjonowania Onkologicznej Poradni Genetycznej tylko wyjtkowo mielimy takie sytuacje. W praktycznym poradnictwie mielimy natomiast niejednokrotnie moliwo wykorzystania niepenej analizy sprze umoliwiajcej wykluczenie nosicielstwa zmutowanego genu (ryc.14). Przykady tego typu bada opisalimy we wczeniejszych publikacjach (29,30). Znaczenie bada utraty heterozygotycznoci w guzie w ocenie nosicielstwa zmutowanych genw W nowotworach dziedzicznych w guzie czsto wystpuje utrata niezmienionego allelu (typu dzikiego) genu odpowiedzialnego za chorob. Tak, wic poprzez badanie LOH (loss of heterozygosity) mona czasami zidentyfikowa wariant markera zwizany z allelem zmutowanym. Umoliwia to wykluczanie nosicielstwa mutacji u krewnych osoby chorej (ryc.15) oraz ustalanie udziau wybranych genw w patogenezie rodzinnych agregacji nowotworw.

Wykrywanie znanych mutacji

Coraz wicej wiadomo o rodzaju i czstoci mutacji predysponujcych do niektrych nowotworw dziedzicznych i charakterystycznych dla rnych populacji, w tym o mutacjach powtarzalnych, czyli wystpujcych w wielu rodzinach danej grupy etnicznej. Testy DNA dotyczce wykrywania znanych mutacji nabieraj coraz wikszego znaczenia ze wzgldu na ich niezwykle wysok efektywno ekonomiczn. Takie geny jak BRCA1, MLH1 i MSH2 czy VHL doczekay si w Polsce opracowa populacyjnych (epidemiologicznych), dziki ktrym wiadomo, jakich mutacji i w ktrych miejscach genw szuka (31, 32, 33). Najczciej stosowane testy DNA wykrywajce znane mutacje wykorzystuj techniki: RFLP/PCR - (restriction fragment-length polymorphism /PCR) - wykrywanie mutacji za pomoc enzymw restrykcyjnych w produktach acuchowej reakcji polimeryzacji. Enzymy restrykcyjne, zwane endonukleazami restrykcyjnymi lub krtko restryktazami rozpoznaj specyficzne sekwencje zasad w dwuniciowym DNA i rozcinaj obie nici dokadnie w okrelonym miejscu. Dlatego s wykorzystywane do wykrywania mutacji punktowych, maych delecji lub insercji, ktre prowadz do utraty lub pojawienia si nowych miejsc restrykcyjnych. Namnoony produkt PCR zawierajcy zmian poddaje si trawieniu odpowiedni restryktaz, a nastpnie rozdziela przy pomocy elekroforezy na elu agarozowym (przykad - ryc.16) lub poliakrylamidowym. ASA - (allele specific amplification) - wykrywanie mutacji przy pomocy specyficznych oligonukleotydw. W popularnie uywanej wersji tej techniki z uyciem elektroforezy agarozowej oprcz starterw flankujcych stosuje si starter w peni komplementarny do allela z mutacj, lub startery z ktrych jeden jest w peni komplementarny do allela z mutacj a drugi do allela niezmienionego. Przy tym startery s tak zlokalizowane, e w wyniku PCR powstaj rne produkty (rnice si dugoci) w zalenoci od genotypu uytej prbki DNA (ryc.17). Nowoczesna wersja tej metody wykorzystujca krtkie sondy fluorescencyjne allelospecyficzne i aparaty real time PCR (34,35) pozwala na bardzo szybkie badanie wielu prbek DNA. Technologi matryc (macierzy) z unieruchomionymi na staej fazie oligonukleotydami mona traktowa jako wspczesn wersj ASA. Niewtpliw zalet tej technologii jest daleko idca automatyzacja i moliwo rwnoczesnego badania nawet kilku tysicy znanych mutacji. Dostp do tej technologii w polskich realiach jest bardzo ograniczony z powodu jej wysokiej ceny.

PCR w czasie rzeczywistym (Real Time PCR) Jedn z najnowszych i coraz czciej stosowanych technik w biologii molekularnej jest Real Time PCR pozwalajcy na monitorowanie iloci produktu reakcji PCR w kadym jej cyklu. Modyfikacja tej techniki polegajca na zastosowaniu fluorescencyjnie znakowanych sond komplementarnych do sekwencji badanego fragmentu DNA znalaza swoje zastosowanie rwnie w identyfikacji znanych zmian genetycznych. Istnieje szereg systemw opartych na tej technice rnicych si typem sondy zastosowanym w celu detekcji badanej zmiany. Wrd nich wyrnia si systemy wykorzystujce sondy typu: HybProbes, TaqMan i TaqMan Minor Groove Binder, Molecular Beacons, Scorpions czy SimpleProbes. Sondy HybProbes System ten zakada jednoczesne uycie dwch znakowanych fluorescencyjnie sond, pomidzy ktrymi dochodzi do przekazania energii. Jedna z nich znakowana jest za pomoc barwnika penicego funkcj donora (3-Fluorescyna) a druga przy uyciu barwnika stanowicego funkcj akceptora (5Red640 lub 5_Red 705). Akceptor jak i donor musz by w bliskiej odlegoci - wane jest, aby sondy zostay zaprojektowane tak, aby hybrydyzoway z amplifikowana sekwencj w odlegoci nie wikszej ni 1 do 5 nukleotydw. Podczas trwania reakcji PCR na etapie przyczania starterw dochodzi rw-

nie do hybrydyzacji sond. Jednoczesne przyczenie obu sond powoduje przeniesienie energii od donora do akceptora, co skutkuje powstaniem sygnau, ktrego poziom jest odczytywany przez fluorymetr. Podczas etapu wyduania sondy s oddysocjowane od matrycy DNA, co powoduje zanik fluorescencji. Natenie sygnau fluorescencyjnego na etapie hybrydyzacji sond jest proporcjonalne do iloci kopii badanej sekwencji DNA na kocu poprzedniego cyklu reakcji PCR. Analiza kolejnych pomiarw pozwala na ledzenie przyrostu amplifikowanego produktu PCR podczas trwania reakcji. Sondy TaqMan Stosowana w tym systemie sonda specyficzna dla amplifikowanego fragmentu znakowana jest na 5 kocu barwnikiem reporterowym: FAM (6-karboksyfluoresceina), HEX (heksachloro-6karboksyfluoresceina), TET (tetrachloro-6-karboksyfluoresceina), lub JOE (2,7-dimetylo-4,5-dichloro6-6-karboksyfluoresceina) a na kocu 3 barwnikiem tumicym: TAMRA (6-karboksytertrametylorodamina) lub DABCYL (kwas 4-(4-dimetyloaminfenylazo)-benzoesowy). Blisko barwnika reporterowego w stosunku do barwnika tumicego w obrbie tej samej sondy powoduje, i fluorescencja jest wygaszana. Podczas reakcji PCR na etapie przyczania starterw wyznakowana sonda wie si specyficznie z matryc pomidzy miejscami hybrydyzacji starterw. Jej 3 koniec jest zablokowany co powoduje i przy nastpnym etapie jakim jest wyduanie starerw nie moe by ona wyduana tak jak startery. Zastosowana w tym systemie polimeraza o aktywnoci 5-3 dobudowujc ni DNA degraduje sond, co skutkuje uwolnieniem barwnika reporterowego od barwnika tumicego i wzrost fluorescencji. Proces ten zachodzi podczas kadego cyklu powodujc narastanie sygnau fluorescencyjnego z poszczeglnych cykli, co umoliwia detekcj sygnau w kadym momencie trwania reakcji. Sondy stosowane w tym systemie maj dugo od 20 do 40 nukleotydw, liczba par G+C w ich sekwencji zawiera si w przedziale od 40-60%. Sondy nie powinny zawiera powtrze pojedynczych nukleotydw szczeglnie guaniny. Sekwencja sondy nie powinna by te komplementarna do sekwencji starterw jak i do sekwencji matrycy w miejscu przyczenia starterw. Wane jest, aby sonda nie posiadaa na 5-kocu zasady G, poniewa jej obecno wygasza fluorescencj barwnika reporterowego nawet po odseparowaniu go od barwnika tumicego. Modyfikacj tego systemu jest zastosowanie sondy TaqMan typu MGB (Minor Groove Binder), w ktrej do koca 3 przyczona jest rwnie grupa MGB. Jej funkcja polega na stabilizacji przyczenia sondy poprzez wpasowanie si do kompleksu powstaego z sondy i matrycowego DNA. Interakcja grupy MGB z kompleksem sonda-matryca podnosi temperatur topnienia sondy o 15-30C, co pozwala na zastosowanie sond o znacznie krtszej sekwencji (od 14 do 18 nukleotydw). Jest to korzystne podczas analizy polimorfizmw pojedynczego nukleotydu, poniewa krtkie sondy atwiej ulegaj destabilizacji pod wpywem zmian nukleotydw wystpujcych w badanej sekwencji.

Ryc.18. Zasada dziaania sondy typu TaqMan (wg Haugland R.P. The handbook of Fluorescent Probes and Research products. Ninth Edition. Molecular Probes. Inc hhttp// www.probes.com )

Sondy Molecular Beacons Wygaszanie fluorescencji moe by spowodowane rwnie ksztatem sondy. Koce pojedynczej sondy typu Molecular Beacons s do siebie komplementarne co sprawia, e w niskich temperaturach hybrydyzuj ze sob nadajc jej charakterystyczny ksztat spinki do wosw. Barwniki zwizane z kocami sondy ( na kocu 5 fluorochrom, na 3 kocu wygaszasz NFQ DABCYL) pozostaj w bliskiej od siebie odlegoci co powoduje wygaszenie sygnau fluorochromu. rodkowa cz sondy tworzca ptl jest komplementarna do badanego fragmentu DNA. W obecnoci sekwencji komplementarnej jak i pod wpywem odpowiedniej temperatury sonda zmienia ksztat i hybrydyzuje do matrycy. Oddzielony od wygaszacza fluorochrom emituje wiato. Na etapie wyduania sonda jest odczana od sekwencji matrycowej i fluorescencja zanika. Natenie emitowanego sygnau na etapie przyczania sondy jest proporcjonalne do iloci kopii badanego fragmentu DNA na kocu poprzedniego cyklu reakcji PCR.

Sondy typu Skorpion Modyfikacj systemu opartego na sondach Molecular Beacons jest zastosowanie sondy w ksztacie spinki do wosw w poczeniu ze starterem. Zamknity ksztat sondy powoduje wygaszanie fluorescencji barwnikw umieszczonych na jej kocach. Po przyczeniu startera sondy do sekwencji matrycowej a nastpnie jego wyduaniu, struktura spinki do wosw ulega otwarciu, uwolniony koniec sondy ulega zagiciu o 180 i komplementarna do badanego fragmentu sekwencja sondy hybrydyzuje do nowo powstajcej nici DNA. Oddalenie od siebie barwnikw powoduje wzrost fluorescencji. Poczenie sondy ze starterem zapobiega niespecyficznemu poczeniu sondy z matrycowym DNA i otwarcia jej struktury przy braku analizowanej sekwencji DNA.

Ryc.19. Zasada dziaania sondy typu Skorpion (wg Haugland R.P. The handbook of Fluorescent Probes and Research products. Ninth Edition. Molecular Probes. Inc hhttp// www.probes.com )

Simple Probes W technice SimpleProbes wykorzystuje si krtki fragment jednoniciowego DNA o dugoci ok. 20-30 nukleotydw (sonda molekularna) o sekwencji komplementarnej do badanego DNA zawierajcego zmian/mutacj, wyznakowany na 5' lub 3' kocu barwnikiem fluorescencyjnym (fluorescein). Technika ta umoliwia zidentyfikowanie heterozygotycznych oraz homozygotycznych wariantw zmiany/mutacji poprzez pomiar wzrostu fluorescencji wykonywany w gradiencie temperatury. Temperatura topnienia (Tm) kompleksu DNA/sonda molekularna jest o kilka do kilkunastu stopni wysza, gdy sekwencja DNA oraz sondy jest zgodna w stosunku do sytuacji, gdy zgodno ta jest niepena (np. spowodowana wystpieniem zmiany/mutacji). Odczyt poziomu fluorescencji podczas podnoszenia temperatury w zakresie 40st-80C pozwala na zidentyfikowanie konkretnego wariantu badanej zmiany w DNA.

Ryc.20. Zasada dziaania sondy typu Simple Probe (wg Haugland R.P. The handbook of Fluorescent Probes and Research products. Ninth Edition. Molecular Probes. Inc hhttp// www.probes.com )

Systemy oparte za zastosowaniu komplementarnych wyznakowanych fluorescencyjnie sond posiadaj szereg zalet. S nimi: wysoka czuo, krtki czas analizy i pene zautomatyzowanie analizy oraz zniwelowanie ryzyka kontaminacji poprzez przeprowadzenie wszystkich etapw w zamknitych dokach pytki. Wad techniki jest konieczno projektowania sond dla poszczeglnych sekwencji, jak i zbyt maa uniwersalno warunkw dowiadczalnych.

MALDI TOF (Matrix Assisted Laser Desorption /Ionization Time Of Flight) MALDI-TOF jest jedn z technik spektrofotometrii masowej, ktra wykorzystywana jest rwnie w detekcji zmian w obrbie badanego fragmentu DNA. Najczciej stosuje si j do analizy polimorfizmw pojedynczych nukleotydw. Analizowane prby nanoszone s na pytki razem z macierz, a nastpnie poddawane impulsowi laserowemu wzbudzajcemu jony. Caa analiza przeprowadzana jest w warunkach prniowych, przez co ruch jonw nie jest zakcany przez zderzenia z czsteczkami gazw. Zastosowana macierz przejmuje wikszo energii lasera zabezpieczajc w ten sposb materia genetyczny przed uszkodzeniem. Prdko przemieszczania si wzbudzonych jonw pochodzcych od badanych prbek analizowana jest przez detektor czasu przelotu jonw. Jony pochodzce od wikszej masy docieraj do detektora wolniej ni jony pochodzce od mniejszej masy. Rnice nukleotydowe wystpujce w badanych prbkach wpywaj na ich mas, co pozwala na ich rozrnienie. Rozdzia analizowanych czsteczek dokonywany jest na podstawie stosunku masy jonw do ich adunku. Technika ta charakteryzuje si wysok czuoci i powala na szybkie przeprowadzenie analizy, niemniej wci jest rzadko stosowan w laboratoriach ze wzgldu na koszt aparatu, w ktrym wykonywana jest analiza.

Podsumowanie W niniejszym opracowaniu przedstawiono podstawowe testy DNA i RNA stosowane w wykrywaniu mutacji konstytucyjnych u osb z wysok dziedziczn predyspozycj do nowotworw. Od poprzedniego wydania monografii Nowotwory Dziedziczne mino 5 lat. Rozwj i upowszechnianie nowych metod molekularnych przebiega tak szybko, e rozdzia Analizy molekularne DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych predyspozycji do nowotworw wczeniejszego wydania prawie cakowicie straci swoj aktualno. Mao kto dzisiaj uywa w codziennej pracy do izolacji DNA czasochonnej i toksycznej, cho dajcej czyste i nie zdegradowane DNA, metody fenolowo-chloroformowej. Zastpiy j inne mniej pracochonne metody, ktre atwiej poddaj si procesowi automatyzacji, a s oparte na wybirczym wizaniu DNA z nonikiem (zoe chromatograficzne filtr bd kuleczki magnetyczne) nastpnie odmyciu zanieczyszcze i uwolnieniu DNA do roztworu. Pojawienie si w uyciu wielofunkcyjnych robotw laboratoryjnych umoliwio wykorzystanie ich do izolacji DNA i RNA, normalizacji ste (doprowadzenie do danego i jednakowego stenia serii prbek), rozcieczania badanych prbek, przygotowania reakcji PCR itp. Rwnoczesny rozwj oprogramowania i komputeryzacja sprawiy, e dzisiaj istnieje moliwo cakowitej automatyzacji procesu bankowania prbek i ich testowania, cznie z transferem danych i wynikw. W laboratoriach uywamy coraz mniej oddzielnych probwek. Na trwae do uytku weszy pytki o 96 czy nawet 384 dokach, bo wikszo analiz wykonujemy w duych seriach stosujc coraz mniejsze objtoci odczynnikw (miniaturyzacja), uywajc automatycznych dozownikw, co przekada si na coraz mniejsze koszty analizy jednej prbki. Do lamusa historii odeszy jeszcze tak nie dawno bardzo popularne metody wykrywania nieznanych mutacji takie jak SSCP, czy metoda DGGE. Natomiast na dobre zadomowia si w naszych laboratoriach DHPLC stajc si obowizujcym standardem we wstpnym wykrywaniu mutacji. Wypieranie niektrych mniej czuych czy bardziej zoonych albo toksycznych metod jest te spowodowane znacznym postpem i zwikszeniem dostpnoci sekwencjonowania. W przypadku analizy dugich fragmentw (okoo 1000 zasad) bezporednie sekwencjonowanie jest dzi najtasz, najszybsz i najpewniejsz metod wykrywania nieznanych mutacji. Obecnie czoowe firmy oferuj sekwenatory umoliwiajce jednoczesne sekwencjonowanie 96 prbek w oparciu o elektroforez kapilarn produktw otrzymanych metod cykliczn z uyciem dideoksynukleotydw znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi. Postp w tej dziedzinie polega, nie tylko na zwikszeniu liczby jednoczenie analizowa-

nych prbek, ale na opracowaniu nowych eli (umoliwiajcych wielokrotny rozdzia na tym samym wypenieniu kapilary ) i chemii (mieszany zoonej z buforw; substratw, polimerazy i tak zwanych ulepszaczy) umoliwiajcych analiz sekwencji jednego fragmentu dugoci prawie 1000 zasad. Oferowane s te nowe aparaty (GSFLX machine 2007) oparte o rwnoczesne sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym bardzo wielu stosunkowo krtkich fragmentw DNA. Aparaty te pozwalaj na analiz 100 mln zasad jednego dnia i pewnie ju niedugo znajd zastosowanie do szybkiego sekwencjonowaia indywidualnego genomu ludzkiego bd wielu jego rejonw odpowiedzialnych za zwikszone predyspozycje do chorb, w tym rwnie nowotworowych. Prbie czasu nie opara si ASA w wersji z uyciem elektroforezy agarozowej jest coraz rzadziej uywana. Z trudem broni swojej pozycji RFLP/PCR, ze wzgldu na upowszechnienie mniej pracochonnej i taszej metody PCR w czasie rzeczywistym zwaszcza z uyciem sond TaqMana, ktra pozwala na znacznie szybsze analizowanie znanych SNP-w i mutacji w wielu prbkach rwnoczenie (pytki na 384 prbek). Dodatkow zalet tej techniki jest wyeliminowanie moliwoci kontaminacji laboratorium produktami reakcji PCR, co jest niezwykle wane zwaszcza w laboratoriach diagnostycznych. Niemal cakowicie z uycia wysza mudna i pracochonna metoda Southerna. W wykrywania rearanacji w genach odpowiedzialnych za dziedziczne predyspozycje do nowotworw i innych chorb zastpia j MLPA. Technika ta w oparciu o reakcj ligacji specyficznych sond i reakcj amplifikacji pozwala na ocen liczby kopii eksonw. Na jej podstawie mona wnioskowa o delecjach bd duplikacjach fragmentw lub caych genw.
Pimiennictwo 1. Lubinski J, Gorski B, Kurzawski G, Jakubowska A, Cybulski C, Suchy J, Debniak T, Grabowska E: Molecular basis of inherited predispositions for tumors. Acta Biochim Pol 2002, 49, 571-81. 2. Schubert E.L., Hansen M.F., Strong L.C.: The Retinoblastoma Gene and its Significance. Annals of Medicine 1994, 26, 177-184. 3. Gronwald J, Menkiszak J, Toloczko A, Zajaczek S, Kladny J, Kurzawski G, Krzystolik K, Podolski J, Lubinski J. : Hereditary breast cancer. Pol J Pathol. 1998, 49, 59-66. 4. Neuman H.P.H., Zbar B.: Renal cysts, renal cancer and von Hippel-Lindau disease. Kidney International. 1997, 51, 16-26. 5. Lynch H.T., Smyrk T.: Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Cancer 1996, 78, 1149-1167. 6. Dunlop M.G., Farrington S.M., Carothers A.D., A.H.Wyllie, A.H., Sharp L., J.Burn J., Liu B., Kinzler K.W., Vogelstein B. : Cancer risk associated with germline DNA mismatch repair gene mutations. Hum Molec Genet 1997, 6, 105-110. 7. Orita M.,Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T.: Detection of polimorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 1989, 86, 2766-2770. 8. Nagamine C.M., Chan K, Lau Y,F.C.A. : PCR artifact: Generation of heteroduplexes. Am J Hum Genet 1989, 45, 337-339. 9. Cotton R.G.H., Rodrigues N.R., Camphbell R.D.: Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismathes with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations. Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85, 4397-4401. 10. ODonovan M.C., Oefner P.J. : Blind analysis of denaturing high-performance liquid chromatography as a tool for mutation detection. Genomics 1998, 52, 1, 44-49. 11. Myers R.M., Maniatis T., Lerman L.S.: Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electroporesis. Meth. Enzymol. 1987, 155, 501-527. 12. Cotton R.G.H.: Current methods of mutation detection. Mutation Research 1993, 285, 125-144. 13. White M.B., Carvalho M., Derse D., O`Brien S., Dean M. : Detection single base substitutions as heterodupleks Polymorphisms. Genomics 1992, 12, 301-306. 14. Liu W., Smith D. I.: DHPLC used in the detection of germline and somatic mutations. Nucleic Acids Res 1998, 26, 6, 1396-1400. 15. Jones A.C. Austin J.: Optimal temperature selection for mutation detection by denaturing HPLC and comparison to single-straded conformation polymorphism and heteroduplex analysis. Clin Chem 1999, 45, 1133-1140. 16. Arnold N., Gross E.: A highly sensitive, fast , and economical technique for mutation analysis in hereditary breast and ovarian cancers. Hum Mutat 1999, 14 , 4, 333-339. 17. Gross E., Arnold N. : A comparison of BRCA1 mutations analysis by direct sequencing, SSCP and DHPLC. Hum Genet 1999, 105, 72-78. 18. Xiao W, Oefner PJ. Denaturing high-performance liquid chromatography: a review. Hum Mut 2001, 17, 439-74.

19. Kurzawski G, Safranow K, Suchy J, Chlubek D, Scott RJ, Lubinski J. Mutation analysis of MLH1 and MSH2 genes performed by denaturing high-performance liquid chromatography. J Biochem Biophys Methods. 2002, 51, 89-100. 20. Grompe M.: The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids. Nature Genetics 1993, 5, 111-117. 21. Rosenthal A., Charnock J.D.S.: New protocols for sequencing with dye terminators. DNA Seq. 1992, 3, 61-64. 22. Ronaghi M., Karamohamed S., Pettersson B., Uhln M., Nyrn P.: Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal Biochem. 1996, 242, 84-90. 23. Charbonnier F, Olschwang S, Wang Q, Boisson C, Martin C, Buisine MP, Puisieux A, Frebourg T. MSH2 in contrast to MLH1 and MSH6 is frequently inactivated by exonic and promoter rearrangements in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cancer Res. 2002 Feb 1; 62, 3: 848-53. 24. Schouten J.P., McElgunn C.J., Waaijer R., Zwijnenburg D., Diepvens F., Pals G.: Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002, 30, e57. 25. Chomczynski P., Sacchi N.: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal. Biochem. 1987, 162, 156-159. 26. Luce M.C., Marra G., Chauhan D.P., Laghi L., Carethers J.M., Cherian S.P., Hawn M, Binnie C.G., Kam-Morgan L.N.W., Cayouette M.C., Koi M., Boland C.R. : In Vitro Transcription/Translation Assay for the Screening of hMLH1 and hMSH2 Mutations in Familial Colon Cancer. Gastroenterology 1995, 109, 1368-1374. 27. Plumer S.J., G.Casey G.: Are we closer to genetic testing for common malignances. Nature Medicine 1996, 2, 156158. 28. Gelehrer T.D., Collons F.C.: Principles of medical genetics. Williams and Wilkins, Baltimore, 1990. 29. Zajczek St., Podolski J., Lubiski J., Rosawska A., Krzystolik Z. Sagan Z.: Technika RFLP-PCR w wykluczeniu nosicielstwa zmutowanego genu Rb. Klinika Oczna 1993, 95, 216-218. 30. Zajczek St., Grski B., Dbniak T., Podolski J., Lubiski J.. Krzystolik Z., Iwanicka T., Sagan Z.: VNTR-PCR w diagnostyce nosicielstwa genu Rb. Klinika Oczna 1994, 96, 290-292. 31. Kurzawski G, Suchy J, Kladny J, Safranow K, Jakubowska A, Elsakov P, Kucinskas V, Gardovski J, Irmejs A, Sibul H, Huzarski T, Byrski T, Debniak T, Cybulski C, Gronwald J, Oszurek O, Clark J, Gozdz S, Niepsuj S, Slomski R, Plawski A, Lacka-Wojciechowska A, Rozmiarek A, Fiszer-Maliszewska L, Bebenek M, Sorokin D, Stawicka M, Godlewski D, Richter P, Brozek I, Wysocka B, Jawien A, Banaszkiewicz Z, Kowalczyk J, Czudowska D, Goretzki PE, Moeslein G, Lubinski J.: Germline MSH2 and MLH1 mutational spectrum in HNPCC families from Poland and the Baltic States. J Med Genet. 2002, 39, E65. 32. Cybulski C, Krzystolik K, Murgia A, Gorski B, Debniak T, Jakubowska A, Martella M, Kurzawski G, Prost M, Kojder I, Limon J, Nowacki P, Sagan L, Bialas B, Kaluza J, Zdunek M, Omulecka A, Jaskolski D, Kostyk E, Koraszewska-Matuszewska B, Haus O, Janiszewska H, Pecold K, Starzycka M, Slomski R, Cwirko M, Sikorski A, Gliniewicz B, Cyrylowski L, Fiszer-Maliszewska L, Gronwald J, Toloczko-Grabarek A, Zajaczek S, Lubinski J.:Germline mutations in the von Hippel-Lindau (VHL) gene in patients from Poland: disease presentation in patients with deletions of the entire VHL gene. J Med Genet. 2002, 39, E38. 33. Gorski B, Byrski T, Huzarski T, Jakubowska A, Menkiszak J, Gronwald J, Pluzanska A, Bebenek M, FischerMaliszewska L, Grzybowska E, Narod SA, Lubinski J.: Founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breast-ovarian cancer. Am J Hum Genet 2000, 66, 1963-8. 34. Heied CA, Stevens J, LivakKJ, Williams PM.: Real time PCR. Genome Res. 1996, 6, 986-94. 35. Matsubara Y, Fujii K, Rinaldo P, Narisawa K.: A fluorogenic allele-specific amplification method for DNA-based screening for inherited metabolic disorders. Acta Paediatr Suppl. 1999, 88, 65-8.

Grzegorz Kurzawski, Janina Suchy, Jan Lubiski

Test MSH2 i MLH1

Wykonanie testw DNA jest wskazane w rodzinach speniajcych, co najmniej kryteria podejrzenia o HNPCC. Po wykluczeniu FAP (wystpowanie cech charakterystycznych dla FAP to: polipowato jelit, przerost nabonka barwnikowego siatkwki oka, wystpowanie zmian torbielowatokostniakowych koci twarzoczaszki i desmoidw), jeeli dysponujemy tkank z guza, naley wykona immunohistochemiczn ocen ekspresji biaek MLH1, MSH2, MSH6 w tkance nowotworowej, poniewa badanie to moe zawzi dalsze postpowanie do poszukiwania mutacji w obrbie jednego genu (brak ekspresji - moe wskazywa na zmutowany gen!). Wieloletnie wieloorodkowe badania doprowadziy do scharakteryzowania czstoci i rodzajw wystpujcych w Polsce mutacji genw MSH2 i MLH1 (1). Najwaniejsze ustalenia przydatne w opracowaniu testu to: najczstsz przyczyn zespou Lyncha w Polsce s mutacje w obrbie MSH2 i MLH1, ktre stanowi 90% wszystkich mutacji zwizanych z tym zespoem mutacje wykrywane testem MLPA stanowi okoo 10% wszystkich mutacji mutacje powtarzalne wystpuj u ponad 60% wszystkich rodzin z mutacjami. Biorc pod uwag te wytyczne oraz koszty analiz, w nastpnej kolejnoci naley wykona badanie MLPA dla MSH2, MLH1. W przypadku wyniku negatywnego nastpnym krokiem powinno by wykonanie badania najczstszych charakterystycznych dla populacji polskiej mutacji w MSH2 i MLH1 w DNA z krwi obwodowej pacjenta. Ostatnim etapem wykrywania mutacji jest analiza wszystkich fragmentw kodujcych genw za pomoc DHPLC (2) i sekwencjonowanie fragmentw, ktrych chromatogramy wskazuj na obecno heterodupleksw.
Pimiennictwo: 1. Kurzawski G, Suchy J, Lener M, Kujszo-Grabowska E, Kadny J, Safranow K, Jakubowska K, Jakubowska A, Huzarski T, Byrski T, Dbniak T, Cybulski C, Gronwald J, Oszurek O, Oszutowska D, Kowalska E, Gd S, Niepsuj S, Somski R, Pawski A, cka-Wojciechowska A, Rozmiarek A, Fiszer-Maliszewska , Bbenek M, Sorokin D, Ssiadek MM, Stembalska A, Grzebieniak Z, Kilar E, Stawicka M, Godlewski D, Richter P, Broek I, Wysocka B, Limon J, Jawie A, Banaszkiewicz Z, Janiszewska H, Kowalczyk J, Czudowska D, Scott RJ, Lubiski J. Germline MSH2 and MLH1 mutational spectrum including large rearrangements in HNPCC families from Poland (update study). Clin Genet 2006; 69: 40-47. 2. Kurzawski G, Safranow K, Suchy J, Chlubek D, Scott RJ, Lubinski J. Mutation analysis of MLH1 and MSH2 genes performed by denaturing high-performance liquid chromatography. J Biochem Biophys Methods. 2002, 51, 89-100.

Bohdan Grski, Jan Lubiski

Test BRCA1
Sklonowany w roku 1994 gen BRCA1 zlokalizowany na chromosomie 17q21 jest genem bardzo rozlegym - rozciga si na prawie 100 kpz genomowego DNA, jego mRNA posiada 7,8 kpz dugoci, 24 eksony, a jego biako skada si z 1836 aminokwasw (1, 2). Spektrum mutacji BRCA1 jest bardzo due i mog one wystpowa wzdu caego genu. Gen BRCA1 bardzo rzadko podlega mutacjom de novo i to jest najprawdopodobniej jedn z gwnych przyczyn efektu zaoyciela powodujcego, e w populacjach o duym poziomie homogennoci etnicznej zaledwie kilka mutacji stanowi wikszo obserwowanych uszkodze genu BRCA1. W Polsce zjawisko to po raz pierwszy zaobserwowano w naszym Orodku (3), a niezalenie, jednak nieco pniej i na mniejszym materiale, w Gliwicach (4). Mutacje genu BRCA1 w polskich rodzinach opisano rwnie w innych pracach, jednak z doniesie tych nie wynikao, e zaledwie kilka zmian stanowi zdecydowan wikszo zaburze konstytucyjnych wystpujcych w Polsce (5, 6). W przeprowadzonych w Szczecinie w latach 1996-1999 badaniach 66 rodzin z siln agregacj rakw piersi/jajnika wykryto 35 mutacji konstytucyjnych BRCA1, z ktrych 5382insC, C61G i 4153delA stwierdzono odpowiednio w 18, 7 i 4 przypadkach (3). Dalsze badania przeprowadzone na reprezentatywnej dla wszystkich regionw w Polsce serii 200 rodzin z co najmniej 3 rakami piersi/jajnika wykazay, e mutacje konstytucyjne genu BRCA1 (badane sekwencjonowaniem oraz technikami Long PCR i Southern-RFLP) s przyczyn 64% (128/200) tych agregacji, a okoo 90% z nich stanowi jedna z trzech mutacji 5382insC, C61G i 4153delA wystpujce w stosunku okoo 6:2:1 (7) (tabela 1, 2). Istniejca sytuacja powoduje, e u pacjentw polskiego pochodzenia testowanie w celu wykrycia nosicieli mutacji BRCA1 jest niezwykle efektywne. Opracowany w naszym Orodku test DNA izolowanego z krwi obwodowej oparty o multiplex PCR wykrywa w prosty, szybki i tani sposb (400 z wynosi w Polsce cena testu DNA cznie z porad specjalisty genetyka-onkologa) 90% polskich rodzin z mutacjami BRCA1 zwizanych z wysokim ryzykiem raka piersi/jajnika (opracowanie patentowe nr P-335917). Specyficzno testu jest praktycznie 100% (brak wynikw faszywie dodatnich i faszywie ujemnych) zwaszcza jeeli wynik testu oparty jest o analiz z dwch niezalenych pobra krwi. W rodzinach z co najmniej jedn osob z wykryt mutacj BRCA1 wykluczenie/potwierdzenie nosicielstwa mutacji mona oceni praktycznie biorc ze 100% pewnoci. W przeprowadzonych w naszym Orodku testach u okoo 500 kolejnych pacjentek z rodzin z rakiem piersi zdiagnozowanym przed 50 rokiem ycia mutacje BRCA1 wykryto w 9% przypadkw. W podobnych badaniach u okoo 500 kolejnych pacjentek z rakiem jajnika niezalenie od wieku zdiagnozowania tego nowotworu, mutacj BRCA1 stwierdzono w 14% przypadkw. W koordynowanej przez nasz Orodek akcji Stowarzyszenia Rowa Wstka promowanej przez czasopismo dla kobiet Twj Styl testy BRCA1 wykonano u 5000 kobiet wykrywajc mutacje u 4% pacjentek zdrowych, u ktrych wrd krewnych Io lub IIo stwierdzono raka piersi rozpoznanego przed 50 r.. lub raka jajnika niezalenie od wieku zdiagnozowania. Akcj przeprowadzono na terenie caego kraju, tak wic mona przyj, e mimo istniejcych prawdopodobnie regionalnych rnic, dla wszystkich Polek wskazaniem do testu BRCA1 powinno by stwierdzenie wrd krewnych Io lub IIo zarwno: a. cech rodowodowo-klinicznych dziedzicznego raka piersi/jajnika (wg kryteriw podanych w rozdziale o tych zespoach), jak i: b. stwierdzenie zachorowania na raka piersi przed 50 r.. lub raka jajnika w dowolnym wieku. Inne zasady, ktre koniecznie naley przestrzega przy wykonywaniu testw BRCA1: a. penoletnio osoby testowanej b. wykonywanie analiz DNA z dwch niezalenych pobra krwi przez akredytowan pracowni

c. przeprowadzenie specjalistycznej konsultacji przez genetyka-onkologa zarwno przed jak i po analizie DNA. Dziki niezwykej efektywnoci zarwno medycznej jak i ekonomicznej DNA w naszym Orodku do koca wrzenia 2007 roku wykrylimy 3930 nosicielek mutacji BRCA1 i jest to wedug naszych danych, wrd pracowni diagnozujcych zaburzenia tego genu, liczba najwiksza na wiecie. Mona przyj szacunkowo, e w Polsce yje okoo 100.000 nosicielek i tyle samo nosicieli mutacji genu BRCA1.
Pimiennictwo 1. Chamberlain JS, Boehnke M, Frank TS, et al.: BRCA1 maps proximal to D178579 on chromosome 17q21 by genetic analysis. Am J Hum Genet 1993, 52, 792-798. 2. Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, Futreal PA, et al.: A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science 1994, 266, 66-71. 3. Grski B, Byrski T, Huzarski T , et al.: Founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breastovarian cancer. Am J Hum Genet 2000, 66, 1963-1968. 4. Grzybowska E, Zientek H, Jasiska A, et al.: High frequency of recurrent mutations in BRCA1 and BRCA2 genes in polish families with breast and ovarian cancer. Hum Mut 2000, 16, 482-490. 5. Sobczak K., Kozowski P., Napieraa M, i wsp.: Novel NRCA1 mutations and more frequent intron-20 alteration found among 236 women from Western Poland. Oncogene 1997 Oct 9, 15, 1773-1779. 6. Van der Looij M., Wysocka B., Broek I. i wsp.: Founder BRCA1 mutation and two novel germline BRCA2 mutations in breast and/or ovarian cancer families from North-Eastern Poland. Hum Mut 2000, Mutation in Brief#320. 7. Grski B., Jakubowska A., Mdrek K. i wsp.: BRCA1/BRCA2 mutation spectrum in Polish families with strong aggregation of breast/ovarian cancers. Konferencja Nowotwory dziedziczne profilaktyka, diagnostyka, leczenie Midzyzdroje 23-24 maja 2002, streszczenie s. 36.

Cezary Cybulski

Testy DNA redniego i niskiego ryzyka zachorowania na nowotwory zoliwe

Jak dotd nie ustalono efektywnoci medycznej i ekonomicznej dla testw wykrywajcych zmiany DNA nieznacznie podwyszajce ryzyko zachorowania na nowotwory zoliwe. Niemniej jednak wykonywanie tych testw jako opcji postpowania diagnostycznego naley rozway u wszystkich dorosych niezalenie od nowotworowego wywiadu rodzinnego. 1. Test oparty o wykrywanie mutacji 3020insC genu NOD2 Zmiana 3020insC w obrbie genu NOD2 zwiksza ryzyko zachorowania na: raka piersi (DCIS w wieku poniej 50 r..) ok. 5-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 8% wszystkich rakw piersi raka jelita grubego ponad 2-krotnie w wieku powyej 60 r.. - mutacja ta wystpuje ok. 15% wszystkich rakw jelita grubego raka puc ok. 2-krotnie - mutacje ta wystpuje ok. 12% wszystkich rakw puc raka jajnika ok. 1,5-krotnie - mutacja ta wystpuje ok. 11% wszystkich rakw jajnika (1). Zalecenia dla nosicieli zmiany 3020insC w obrbie genu NOD2 proponowane jako opcja postpowania medycznego: Zalecenia dla kobiet: systematyczna samokontrola piersi badania lekarskie piersi od 20 r. 1 x 6 miesicy USG piersi od 20 r. 1 x rok mammografia od 35 r. 1 x rok naprzemiennie z USG piersi USG dopochwowe narzdu rodnego od 45 r. 1 x rok kolonoskopia lub ewentualny wlew kontrastowy jelita grubego od 60 r. co 5 lat lub czciej w przypadku wystpowania jakichkolwiek zaburze jelitowych bezwzgldny zakaz palenia papierosw, dieta bogata w warzywa i owoce Zalecenia dla mczyzn: kolonoskopia lub ewentualny wlew kontrastowy jelita grubego od 60 r. co 5 lat lub czciej w przypadku wystpowania jakichkolwiek zaburze jelitowych bezwzgldny zakaz palenia papierosw, dieta bogata w warzywa i owoce 2. Test oparty o wykrywanie mutacji 1100delC, IVS2+1G>A, del5395, I157T genu CHEK2 Zmiany skracajce biako CHEK2 (1100delC i IVS2+1G>A, del5395) zwikszaj ryzyko zachorowania na: raka piersi (czciej rak zrazikowy) ok. 2,4-krotnie mutacje te wystpuj w ok. 2,5% wszystkich rakw piersi raka prostaty ok. 2,3-krotnie - mutacje te wystpuj w ok. 2,5% wszystkich rakw prostaty oraz ok. 5% rodzinnych rakw prostaty; ryzyko raka prostaty jest zwikszone okoo 5-krotnie jeli w rodowodzie wystpi rak prostaty wrd krewnych I stopnia

raka brodawkowego tarczycy - ok. 5-krotnie mutacje te wystpuj w ok. 4% wszystkich rakw brodawkowatych tarczycy (2,3,4). Zmiana typu "missense" I157T w obrbie genu CHEK2 zwiksza ryzyko zachorowania na: raka piersi ok. 1,5-krotnie mutacja ta wystpuje w ok. 7% rakw piersi raka prostaty ok. 1.6-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 8% wszystkich rakw prostaty oraz ok. 12% rodzinnych rakw prostaty; ryzyko raka prostaty jest zwikszone okoo 3-krotnie gdy w rodowodzie wystpi rak prostaty wrd krewnych I stopnia raka brodawkowatego tarczycy ok. 2-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 9% rakw tarczycy raka nerki ok. 2-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 10% rakw nerki raka jelita grubego ok. 2-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 10% rakw jelita grubego (2,3,4). Zalecenia dla nosicieli zmian skracajcych biako CHEK2 (1100delC i IVS2+1G>A, del5395) proponowane jako opcja postpowania medycznego: Zalecenia dla kobiet: systematyczna samokontrola piersi badania lekarskie piersi od 25 r. 1 x 6 miesicy USG piersi od 25 r. 1 x rok mammografia od 35 r. 1 x rok naprzemiennie z USG piersi USG tarczycy od 20 r. 1 x rok Zalecenia dla mczyzn: badanie palpacyjne prostaty, PSA od 50 r. 1 x rok do rozwaenia biopsja saturacyjna po 60 r. - tylko jeli w rodowodzie jest rak prostaty wrd krewnych I stopnia !!!! Zalecenia dla nosicieli zmiany I157T w obrbie genu CHEK2 proponowane jako opcja postpowania medycznego: Zalecenia dla kobiet: systematyczna samokontrola piersi badania lekarskie piersi od 40 r. 1 x 6 miesicy USG piersi od 40 r. 1 x rok rezonans magnetyczny piersi ewentualnie mammografia od 40 r. 1 x rok naprzemiennie z USG piersi USG dopochwowe narzdu rodnego od 25 r. 1 x rok USG jamy brzusznej od 40 r. 1 x rok ze szczeglnym zwrceniem uwagi na nerki kolonoskopia lub ewentualny wlew kontrastowy jelita grubego od 60 r. co 5 lat lub czciej w przypadku wystpowania jakichkolwiek zaburze jelitowych USG tarczycy od 20 r. 1 x rok Zalecenia dla mczyzn : USG jamy brzusznej od 40 r. 1 x rok ze szczeglnym zwrceniem uwagi na nerki kolonoskopia lub ewentualny wlew kontrastowy jelita grubego od 60 r. co 5 lat lub czciej w przypadku wystpowania jakichkolwiek zaburze jelitowych badanie palpacyjne prostaty, PSA od 50 r. 1 x rok

do rozwaenia biopsja saturacyjna prostaty po 60 r. - tylko jeli w rodowodzie jest rak prostaty wrd krewnych I stopnia !!!!

3. Test oparty o wykrywanie mutacji 657del5 genu NBS1 Zmiana 657del5 w obrbie genu NBS1 zwiksza ryzyko zachorowania na: raka piersi ok. 2-krotnie; mutacja ta wystpuje w ok. 1% wszystkich rakw piersi raka prostaty ok. 4-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 3% wszystkich rakw prostaty i ok. 9% rodzinnych rakw prostaty; ryzyko raka prostaty jest zwikszone okoo 15-krotnie jeli w rodowodzie wystpi rak prostaty wrd krewnych I stopnia (5) Zalecenia dla nosicieli zmiany 657del5 w obrbie genu NBS1 proponowane jako opcja postpowania medycznego: Zalecenia dla kobiet: systematyczna samokontrola piersi badania lekarskie piersi od 30 r. 1 x 6 miesicy USG piersi od 30 r. 1 x rok mammografia od 35 r. 1 x rok naprzemiennie z USG piersi Zalecenia dla mczyzn: badanie palpacyjne prostaty, PSA od 50 r. 1 x rok do rozwaenia biopsja saturacyjna po 60 r. - tylko jeli w rodowodzie jest rak prostaty wrd krewnych I stopnia !!!! 4. Test oparty o wykrywanie zmiany A148T genu CDKN2A (p16) Zmiana A148T w obrbie genu CDKN2A (p16) zwiksza ryzyko zachorowania na: czerniaka zoliwego ok. 2-krotnie - mutacja wystpuje w okoo 7% wszystkich czerniakw zoliwych raka piersi (czciej DCIS) poniej 50. roku ycia ok. 1,5-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 5% rakw piersi poniej 50. roku ycia raka puc ok. 2-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 7% wszystkich rakw puc raka jelita grubego ok. 1,5-krotnie - mutacja ta wystpuje w ok. 5% wszystkich rakw jelita grubego (6, 7, 8) Zalecenia dla nosicieli zmiany A148T w obrbie genu CDKN2A proponowane jako opcja postpowania medycznego: Zalecenia dla kobiet: systematyczna samokontrola piersi badania lekarskie piersi od 20 r. 1 x 6 miesicy USG piersi od 20 r. 1 x rok mammografia od 35 r. 1 x rok naprzemiennie z USG piersi kolonoskopia lub ewentualny wlew kontrastowy jelita grubego od 60 r. co 5 lat lub czciej w przypadku wystpowania jakichkolwiek zaburze jelitowych bezwzgldny zakaz palenia papierosw, dieta bogata w warzywa i owoce unikanie nadmiernej ekspozycji na soce/inne rda promieniowania UV; stosowanie filtrw przeciwsonecznych o wysokim (30 i wicej) wspczynniku fotoprotekcji

w przypadku stwierdzenia znamion wykazujcych nastpujce zaburzenia: powikszanie si, zmiana zabarwienia, wid, obwdka zapalna, sczenie, krwawienie- natychmiastowa konsultacja u dermatologa

Zalecenia dla mczyzn: kolonoskopia lub ewentualny wlew kontrastowy jelita grubego od 60 r. co 5 lat lub czciej w przypadku wystpowania jakichkolwiek zaburze jelitowych bezwzgldny zakaz palenia papierosw, dieta bogata w warzywa i owoce unikanie nadmiernej ekspozycji na soce/inne rda promieniowania UV; stosowanie filtrw przeciwsonecznych o wysokim (30 i wicej) wspczynniku fotoprotekcji w przypadku stwierdzenia znamion wykazujcych nastpujce zaburzenia: powikszanie si, zmiana zabarwienia, wid, obwdka zapalna, sczenie, krwawienie- natychmiastowa konsultacja u dermatologa 5. Test oparty o wykrywanie zmian C142G, G355T, G4326C genu CYP1B1 Homozygotyczne nosicielstwo zmian C142G, G355T, G4326C (homozygoty GTC) w obrbie genu CYP1B1 zwiksza ryzyko zachorowania na raka piersi ok. 2-krotnie i wystpuje w ok. 12% wszystkich rakw (9). Zalecenia dla nosicielek homozygotycznego genotypu GTC w obrbie genu CYP1B1 proponowane jako opcja postpowania medycznego: systematyczna samokontrola piersi badanie lekarskie piersi od 25 r. 1 x 6 miesicy USG piersi od 25 r. 1 x rok rezonans magnetyczny piersi ewentualnie mammografia od 25 - 30 r. 1 x rok naprzemiennie z USG piersi 6. Test oparty o wykrywanie zmiany C5972T genu BRCA2 Zmiana C5972T zwiksza ryzyko zachorowania na raka piersi (DCIS poniej 50. roku ycia) ok. 3krotnie; homozygotyczne nosicielstwo tej zmiany (homozygoty TT) zwiksza ryzyko raka piersi poniej 50. roku ycia ok. 5-krotnie; zmiana ta wystpuje w ok. 6% rakw piersi poniej 50. roku ycia (10). Zalecenia dla nosicielek zmiany C5972T genu BRCA2 proponowane jako opcja postpowania medycznego: systematyczna samokontrola piersi badania lekarskie piersi od 25 r. 1 x 6 miesicy USG piersi od 25 r. 1 x rok mammografia od 35 r. 1 x rok naprzemiennie z USG piersi 7. Test oparty o badanie nosicielstwa mutacji C61G oraz 4153delA genu BRCA1 u mczyzn Zmiany C61G oraz 4153delA genu BRCA1 u mczyzn zwikszaj ryzyko zachorowania na raka prostaty ok. 3,6-krotnie - mutacje te wystpuj w ok. 0,4% wszystkich rakw prostaty; ryzyko raka prostaty u nosicieli tych zmian jest zwikszone okoo 12-krotnie gdy w rodowodzie wystpi rak prostaty wrd krewnych I stopnia (11).

Zalecenia dla nosicieli mutacji C61G oraz 4153delA genu BRCA1 proponowane jako opcja postpowania medycznego: badanie urologiczne, PSA od 50 r. 1 x 1 rok do rozwaenia biopsja saturacyjna prostaty po 60 r. - tylko jeli w rodowodzie jest rak prostaty wrd krewnych I stopnia !!!!
Pimiennictwo 1. G. Kurzawski i wsp.: The NOD2 3020insC mutation and the risk of colorectal cancer. Cancer Res 2004, 64: 1604-6; J. Lubiski i wsp.: The 3020insC Allele of NOD2 Predisposes to Cancers of Multiple Organs, Hereditary Cancer in Clinical Practice 2005; 3; 59-63. 2. Cybulski C i wsp. CHEK2 is a multiorgan cancer susceptibility gene. Am J Hum Genet. 2004; 75: 1131-5, C. Cybulski i wsp.: A novel founder CHEK2 mutation is associated with increased prostate cancer risk. Cancer Res 2004, 64: 2677-9. 3. Cybulski C i wsp. A large germline deletion in the CHEK2 gene is associated with an increased risk of prostate cancer. J Med Genet. 2006, 43: 863-6. 4. Cybulski C i wsp. A deletion in CHEK2 of 5,395 bp predisposes to breast cancer in Poland. Breast Cancer Res Treat. 2007; 102: 119-22. 5. Cybulski T i wsp.: NBS1 is a prostate cancer susceptibility gene. Cancer Res. 2004, 64: 1215-9. 6. Dbniak T i wsp: CDKN2A common variants and their association with melanoma risk: a population-based study. Cancer Res. 2005, 65: 835-9. 7. Dbniak T i wsp.: A Common Variant of CDKN2A (p16) Predisposes to Breast Cancer. J Med Genet. 2005; 42: 763-5. 8. Dbniak T i wsp.: CDKN2A common variant and multi-organ cancer risk-a population-based study. Int J Cancer 2006, 15; 118 (12): 3180-2. 9. Matyjasik J i wsp.: CYP1B1 and predisposition to breast cancer in Poland. Breast Cancer Res Treat 2007, Apr 26; Epub. 10. Grski B i wsp. A common missense variant in BRCA2 predisposes to early onset breast cancer. Breast Cancer Res. 2005; 7 (6): 1023-7. 11. Cybulski C i wsp. BRCA1 mutations and prostate cancer in Poland. Eur J Cancer Prev 2007, w druku.