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Captulo 2

Tcnicas para el estudio de la patologa

iii) el estudio de la demografa y la epidemiologa de las enfermedades y iv) la educacin de los estudiantes y el personal de patologa. La reduccin de la tasa de autopsia en todo el mundo durante los ltimos aos se debe a las siguientes razones: 1. Diagnsticos ms confiables gracias a los avances en las tcnicas de diagnstico por la imagen, como la tomografa computarizada (TC), la resonancia magntica (RM), la angiografa y otras. 2. Temor del mdico frente a la responsabilidad legal por cometer un error. La estimulacin de la realizacin de autopsias a cargo de mdicos y patlogos en hospitales de tercer nivel es fundamental para mejorar la atencin de los pacientes y para el avance de la ciencia mdica.

CAPTULO 2

Para aprender la patologa contempornea de manera eficiente, resulta fundamental que el estudiante est familiarizado con los diversos mtodos de laboratorio, y con las tcnicas y herramientas empleadas para el estudio de esta materia. Este captulo se dedicar a los aspectos bsicos de los mtodos disponibles en los laboratorios modernos de patologa desde la microscopia bsica, hasta los mtodos ms recientes.

Tcnicas para el estudio de la patologa

LA PATOLOGA EN LA AUTOPSIA
El profesor William Boyd escribi con su estilo inimitable: La patologa se inici en la camilla de autopsias. La importancia de la autopsia para la patologa se destaca en la inscripcin en latn en una sala de autopsias, que significa: ste es el sitio donde la muerte ayuda a la vida. Como se afirm en el captulo anterior, el italiano G. B. Morgagni (1682-1771) y el francs T. H. A. Laennec (1781-1826) comenzaron a coleccionar informes de casos hospitalarios y a relacionar las caractersticas clnicas con las lesiones observadas en las autopsias, de manera que establecieron la correlacin clnico-patolgica. Este mtodo an se mantiene como la forma ms importante de enseanza clnica en las instituciones mdicas de todo el mundo. El minucioso examen posmrtem le india al mdico la patogenia de la enfermedad, le revela los efectos nocivos de la terapia administrada y establece las discrepancias entre los diagnsticos previo y posterior a la muerte; an no se ha hallado un sustituto para este mtodo. Hay dos mtodos tradicionales para realizar una autopsia, que se pueden emplear de forma indistinta: 1. Extraccin en bloque de los rganos abdominales y torcicos. 2. Diseccin in situ de cada rgano por separado. Cuando se cree que varios rganos podran estar comprometidos, se debe realizar una autopsia completa, pero si se sospecha una enfermedad de un rgano especfico, una miniautopsia o una autopsia limitada podran ser suficientes. El estudio realizado durante la autopsia proporciona conocimientos y habilidades tanto al mdico como al patlogo. Los objetivos principales de la autopsia son los siguientes. 1. Evaluacin de la calidad de la atencin del paciente mediante: i) la confirmacin de la causa de la muerte, ii) el establecimiento del diagnstico de certeza y iii) el estudio de la respuesta teraputica. 2. Educacin de todo el equipo comprometido en la atencin del paciente mediante: i) el diagnstico en la autopsia de trastornos que, a menudo, pasan inadvertidos en el examen clnico, como por ejemplo neumona, embolia pulmonar, pancreatitis aguda, carcinoma de prstata; ii) el descubrimiento de nuevas enfermedades en la autopsia, como por ejemplo sndrome de Reye, legionelosis (enfermedad de los legionarios), sndrome de dificultad respiratoria aguda grave;

PATOLOGA QUIRRGICA
PERSPECTIVA HISTRICA El trmino patologa quirrgica se aplica en la actualidad como sinnimo de histopatologa, anatoma patolgica, patologa anatmica y patologa celular. La patologa quirrgica es el mtodo clsico y comprobado para el diagnstico tisular basado en el examen macroscpico y microscpico de los tejidos. Como se coment, la patologa quirrgica inici el estudio patolgico de los tejidos obtenidos en las autopsias. Los primeros cirujanos slo dependan de los hallazgos quirrgicos o macroscpicos y descartaban los tejidos resecados sin aprovechar la oportunidad de realizar un diagnstico microscpico. No obstante, con los avances tecnolgicos realizados en la industria de los colorantes en los primeros aos del siglo XX, se desarroll la especialidad de la patologa quirrgica diagnstica a travs de la creacin de la biopsia. Al comienzo, esta tarea estaba a cargo de un miembro con experiencia del equipo quirrgico en los departamentos de ciruga, que reciba el nombre apropiado de patlogo quirrgico. En la actualidad, el campo de la anatoma patolgica quirrgica se expandi tanto que se desarrollaron varias subespecialidades, como nefropatologa, neuropatologa, hematopatologa, dermatopatologa, citopatologa ginecolgica, patologa peditrica y otras. LA EXTENSIN Y LAS LIMITACIONES DE LA PATOLOGA QUIRRGICA Los servicios de patologa quirrgica de cualquier hospital grande dependen, sobre todo, del material proporcionado por los cirujanos y los mdicos familiarizados con la extensin y las limitaciones de la especialidad. En consecuencia, resulta fundamental que el mdico se pueda comunicar con libertad con el patlogo, tanto de manera formal como informal, a travs de formularios de patologa quirrgica, de forma verbal y en diferentes foros como reuniones y conferencias interdepartamentales.

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LOS PROTOCOLOS DE LA PATOLOGA QUIRRGICA FORMULARIOS. La primera tarea y la ms importante del mdico que solicita un diagnstico tisular consiste en enviar un formulario completo con los datos de identificacin del paciente, que deben coincidir con los del recipiente con la pieza. El formulario debe contener toda la informacin relevante sobre el caso y la enfermedad (anamnesis, hallazgos en el examen fsico y en la ciruga, resultados de otras pruebas bioqumicas, hematolgicas y radiolgicas relevantes y diagnsticos clnicos y diferenciales) y referencias a exmenes citolgicos o biopsias previas en los servicios de patologa. RECEPCIN DEL TEJIDO. El personal del laboratorio que recibe la pieza de la biopsia siempre debe controlar la identificacin del paciente en el formulario y en el recipiente con la muestra. Para el procesamiento habitual de los tejidos con la tcnica de inclusin en parafina, el tejido se debe introducir en una solucin fijadora (con mayor frecuencia solucin fisiolgica y formol al 10% o formalina amortiguada al 10%) o se puede recibir en fresco sin fijar. Para el corte por congelacin, el tejido siempre se transporta en fresco sin fijacin. La fijacin con microondas tambin se puede usar en el laboratorio para la fijacin rpida y el procesamiento de piezas quirrgicas. EXAMEN MACROSCPICO. El examen macroscpico de la pieza recibida en el laboratorio es el paso siguiente ms importante. El corte tisular macroscpico apropiado, la descripcin macroscpica y la seleccin de una muestra representativa de tejido de una pieza ms grande son partes esenciales del examen anatomopatolgico del tejido remitido. Un error en este paso no puede resolverse en un estadio posterior, ya que podra requerir la separacin de fragmentos de tejido en fresco en caso de que la pieza sea bastante grande y de que se pueda retrasar el transporte; o, si la biopsia es pequea y se pierde en el procesamiento, ser necesario realizar otra vez todo el procedimiento quirrgico para obtener la biopsia. Los laboratorios modernos para la evaluacin macroscpica disponen de un sistema de grabacin de la descripcin macroscpica a travs de un dictfono sin la necesidad de un asistente que escriba el informe. Algunos laboratorios tienen un protocolo para la obtencin de fotografas de la pieza macroscpica y radiografas de la muestra antes y despus del corte del tejido para su documentacin. Los tejidos calcificados y el hueso se deben someter a descalcificacin para eliminar los minerales y ablandar el tejido mediante su tratamiento con agentes descalcificantes, como cidos y quelantes (con mayor frecuencia, cido ntrico acuoso). Resulta fundamental que todo el personal de la sala de examen macroscpico mantenga precauciones estrictas para la manipulacin de los tejidos infectados con tuberculosis, hepatitis, HIV y otros virus. EL LABORATORIO DE HISTOPATOLOGA. Los bloques de tejido con su nmero de la sala de macroscopia se someten a los procedimientos del laboratorio. La mayora de los departamentos de histopatologa usa procesadores tisulares automticos (Fig. 2.1) que cuentan con doce espacios separados para completar el ciclo durante la noche en aproximadamente dieciocho horas. Se describen a continuacin: formalina al 10% para su fijacin, grados ascendentes de alcohol (10, 95% hasta 100%) para su deshidratacin durante cinco horas en 6 o 7 recipientes, xileno, tolueno y cloroformo para su limpieza en tres horas en dos recipientes e impregnacin en parafina durante seis horas en dos baos de cera con termostato.

SECCIN I
Patologa general y tcnicas bsicas

Figura 2.1 Procesador automtico de tejido para el procesamiento mediante la tcnica de inclusin en parafina. (Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt. Ltd., Nueva Delhi.

Para evitar la contaminacin del laboratorio con formalina y alcoholes, tambin se dispone de procesadores tisulares por vaco con sistema cerrado. La fijacin del tejido se realiza en cera derretida, en bloques que se preparan con molde metlicos L (de Leuckhart). En la actualidad, tambin hay moldes plsticos de diferentes colores para constituir bloques con las diversas biopsias. Todo el proceso de fijar los tejidos y formar bloques se puede controlar a travs de la temperatura; adems, hay centros dedicados a la fijacin de los tejidos (Fig. 2.2). Luego, los bloques se cortan despus de su seccin con micrtomo, con mayor frecuencia con un micrtomo rotatorio, que emplea bistur fijo u hojas de bistur desechables (Fig. 2.3). El cristato o el corte por congelacin eliminan todos los pasos de procesamiento tisular y de inclusin en parafina. En cambio, el tejido se congela rpidamente con hielo a alrededor de 25 C que acta como medio de fijacin, y luego se secciona (Fig. 2.4). A continuacin, los cortes quedan listos para su tincin. El corte por congelacin es un procedimiento de diag-

Figura 2.2 Centro de inclusin tisular para la tcnica de parafina (Histocentre). (Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt. Ltd., Nueva Delhi.

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Los cortes incluidos en parafina se tien de forma sistemtica con hematoxilina y eosina (H & E). El material sometido a corte por congelacin se puede teir con H & E rpida o con azul de toluidina de manera habitual. Se pueden emplear tinciones especiales con cualquiera de los dos mtodos de acuerdo con la necesidad. Los cortes se colocan en un portaobjetos y se envan al laboratorio para su estudio microscpico. EL INFORME ANATOMOPATOLGICO. La ltima tarea, y la ms importante del laboratorio de patologa, es la elaboracin de un informe rpido, preciso, breve y con relevancia pronstica. El informe ideal debe contar con cinco elementos: i) Datos del paciente (disponibles para el patlogo, como el nombre del paciente). ii) Descripcin macroscpica precisa. iii) Hallazgos microscpicos. iv) Diagnstico morfolgico, que debe incluir el rgano con fines de clasificacin con los cdigos de SNOMED (Scientific Nomenclature in Medicine, Nomenclatura cientfica en medicina). v) Otros comentarios en algunos casos.
Figura 2.3 Micrtomo rotatorio para la seccin de la pieza con la tcnica de inclusin en parafina. (Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt. Ltd., Nueva Delhi.

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CAPTULO 2
Tcnicas para el estudio de la patologa

nstico intraoperatorio rpido que se puede llevar a cabo en los tejidos antes de avanzar a una ciruga radical mayor. Asimismo, tambin se usa para identificar algunos componentes que, en condiciones normales, se pierden durante el procesamiento en alcohol o xileno, como por ejemplo los lpidos, las enzimas y otros. Este procedimiento se puede realizar en el quirfano cerca de la camilla.

EL CONTROL DE CALIDAD. El control de la calidad de la informacin proporcionada por el laboratorio de histopatologa es importante para detectar los resultados inadecuados, los procedimientos de actualizacin y los avances en los informes definitivos. Es posible implementar un control de calidad interno mediante discusiones mutuas en los casos controvertidos y la autoevaluacin de la calidad de los cortes en el mbito del laboratorio. En la actualidad, tambin se cuenta con programas de control de calidad externo de todo el laboratorio de histopatologa. EL HISTOPATLOGO Y LOS ASPECTOS LEGALES. En este momento, el problema de las demandas por negligencia y mala prctica en histopatologa se equipara con el que acecha a otras disciplinas clnicas. En las biopsias y en los casos controvertidos, se pueden solicitar interconsultas internas y externas. Asimismo, la tarea responsable nunca se debe delegar, salvo que el superior sienta confianza de que su delegado tiene la suficiente experiencia y capacidad.

TINCIONES ESPECIALES (HISTOQUMICA)

Con la tincin de H & E, la hematoxilina tie los ncleos y la eosina se usa como contratincin para el citoplasma y varios materiales extracelulares. La tincin con H & E se emplea de forma habitual para diagnosticar mediante microscopia la gran mayora de las piezas quirrgicas. Sin embargo, en algunas circunstancias especiales, cuando el patlogo desea demostrar sustancias o componentes especficos de las clulas para confirmar constituyentes etiolgicos, histognicos o patognicos, se pueden emplear tinciones especiales tambin denominadas tinciones histoqumicas. La tincin depende de las caractersticas fsicas o qumicas, o de la solubilidad diferencial entre la tincin y los tejidos. Los principios de algunos de los procedimientos de tincin se conocen de forma amplia, pero otros an son desconocidos. Algunas de las sustancias para las cuales hay tinciones especiales que se emplean con frecuencia en el laboratorio de patologa quirrgica son el amiloide, los hidratos de carbono, los lpidos, las protenas, los cidos nucleicos, el tejido conectivo, los microorganismos, los tejidos nerviosos, los pigmentos y los minerales; estas tinciones se enumeran en el Cuadro 2.1.

Figura 2.4 Cristato para la realizacin de cortes mediante la tcnica de congelacin (Cryotones). (Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt. Ltd., Nueva Delhi.

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CUADRO 2.1: Tinciones especiales (histoqumicas) usadas con mayor frecuencia en patologa quirrgica (en orden alfabtico de los componentes)

Tincin A. AMILOIDE 1. Rojo Congo con luz polarizada

Componente/tejido

Colorantes

Interpretacin

SECCIN I
Patologa general y tcnicas bsicas

Amiloide Amiloide

Rojo Congo Azul de toluidina

Birrefringencia verde: amiloide Azul ortocromtico: amiloide

2. Azul de toluidina
B. HIDRATOS DE CARBONO 3. cido peridico de Schiff (PAS)

Hidratos de carbono (en particular, glucgeno), todas las mucinas Mucina cida Mucina cida Mucina neutra

cido peridico, reactivo de Schiff (fucsina bsica) Carmn Azul alcin (a pH 2,5) Azul alcin

Glucgeno y otros hidratos de carbono: magenta Ncleos: azul Mucina: rojo Ncleos: azul Mucina cida: azul Ncleos: rojo Mucina cida: azul Mucina neutra: magenta Ncleos: azul plido

4. Mucicarmn/Carmn de Best 5. Azul alcin 6. Azul alcin-PAS combinados

C. TEJIDOS CONECTIVOS 7. de Van Gieson Colgeno extracelular cido pcrico, fucsina cida, celeste azul hemalum Fucsina cida, cido fosfomolibdnico, metil azul, celeste azul hemalum Hematoxilina, cido fosfotngstico, permanganato, cido oxlico Ncleos: azul/negro Colgeno: rojo Otros tejidos: amarillo Ncleos: azul/negro Citoplasma: msculo, clulas rojas: rojo Colgeno: azul Estras musculares, fibras neurogliales, fibrina: azul oscuro Ncleos: azul Citoplasma: rosa plido Fibras elsticas: negro Otros tejidos: contratincin Fibras reticulares: negro Ncleos: negro o contratincin

8. Tricrmico de Masson

Colgeno extracelular

9. cido fosfotngsticohematoxilina (PTAH)

Msculo y filamentos gliales

10. Elstico de Verhoeff 11. de Gordon y de Sweet

D. LPIDOS

Fibras elsticas Fibras reticulares

Hematoxilina, cloruro frrico, yodo, yoduro de potasio Nitrato de plata

12. Aceite rojo O 13. Sudn negro B 14. Tetrxido de osmio

E. MICROORGANISMOS

Lpidos (cristato sin fijar) Lpidos (cristato sin fijar) Lpidos (cristato sin fijar)

Aceite rojo O Sudn negro B Tetrxido de osmio

Aceites minerales: rojo Lpidos no saturados, fosfolpidos: rosa Lpidos no saturados: azul negro Lpidos no saturados: marrn negro Lpidos saturados: no teidos

15. de Gram 16. de Ziehl-Neelsen

Bacterias (cocos, bacilos) Bacilos tuberculosos

Cristal violeta, yodo Lugol, rojo neutro Carbol fucsina, azul de metileno (diferencia en cido-alcohol) Carbol fucsina, azul de metileno (decolorar en cido sulfrico al 10%) Tetraborato de sodio, nitrato de plata, metenamina Polvo de Giemsa Permanganato cido, orcena, tetrazina

Grampositivas: queratina, fibrina: azul Gramnegativas: rojo Bacilos tuberculosos, eje piloso, actinomices: rojo Fondo: azul plido Bacilos de la lepra: rojo Fondo: azul Hongos, Pneumocystis: negro Clulas rojas: amarillo Fondo: verde plido Protozoos: azul oscuro Ncleos: azul HBsAg positivo: marrn a negro Fondo: amarillo

17. Fite-Wade

Bacilos de la lepra

18. Metenamina de plata de Grocott 19. Giemsa 20. Orcena de Shikata

Hongos

Parsitos Antgenos de superficie de la hepatitis B (HBsAg)

Contina

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CUADRO 2.1: (Continuacin ) Tinciones especiales (histoqumicas) usadas con mayor frecuencia en patologa quirrgica (en orden alfabtico de los componentes) Tincin F. TEJIDOS NERVIOSOS 21. Componente/tejido Colorantes Interpretacin

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CAPTULO 2

Azul rpido de Luxol Plata de Bielschowsky

Mielina Axones

Azul rpido de Luxol, violeta de cresilo Nitrato de plata

Mielina: azul/verde Clulas: violeta/rosa Axones y neurofibrillas: negro

22.

G. PIGMENTOS Y MINERALES 23.

Azul de Prusia de Perl Masson-Fontana

Hemosiderina, hierro Melanina, clulas argentafines

Ferrocianuro de potasio Nitrato de plata

Hierro frrico: azul Ncleos: rojo Melanina, argentafn, cromafn, lipofucsina: negro Ncleos: rojo Depsitos de calcio: rojo naranja Hueso mineralizado: negro Osteoide: rojo Cobre: negro verdoso Ncleos: rojo plido Pigmento formalina/pigmento de malaria: eliminados Grnulos argirfilos: marrn-negro

24.

Tcnicas para el estudio de la patologa

25. 26. 27. 28.

Rojo alizarin S von Kossa cido rubenico Extraccin de pigmento

Calcio Hueso mineralizado Cobre Eliminacin del pigmento formalina y del pigmento de la malaria Clulas argirfilas

Rojo alizarin S Nitrato de plata, safranina O cido rubenico cido pcrico alcohlico

29.

de Grimelius

Nitrato de plata

H. PROTENAS Y CIDOS NUCLEICOS 30.

Reaccin de Feulgen Metil verde pironina

DNA DNA, RNA

Metabisulfito de potasio Verde de metilo, pironina Y

31.

DNA: rojo prpura Citoplasma: verde DNA: verde-azul RNA: rojo

HISTOQUMICA PARA LAS ENZIMAS

Las tcnicas histoqumicas para las enzimas requieren tejido no fijado para poder cortarlo con el cristato, y no se pueden aplicar en piezas fijadas en parafina o en formalina dado que las enzimas se daan con rapidez. En la actualidad, la histoqumica para las enzimas tiene una utilidad diagnstica limitada y no es tan popular; en parte, debido al requerimiento de tejidos frescos y a la tcnica compleja y en parte, a causa de la escasez relativa de especificidad de la reaccin en muchos casos. Esto determin que las tcnicas histoqumicas se reemplacen en la mayora de los casos por procedimientos inmunohistoqumicos y tcnicas de patologa molecular. En este momento algunas de las aplicaciones ms frecuentes de la histoqumica para las enzimas en patologa diagnstica son para la identificacin de enzimas relacionadas con el msculo (ATPasas) en las miopatas; acetilcolinesterasa, para el diagnstico de la enfermedad de Hirschsprung; cloroacetato esterasa, para detectar clulas mieloides y mastocitos; reaccin DOPA, para la actividad de la tirosinasa en los melanocitos; deshidrogenasa endgena (que requiere nitroazul de tetrazolio o NBT), para establecer la viabilidad del msculo cardaco, y las fosfatasas cida y alcalina.

MICROSCOPIA PTICA. El tipo de microscopia usado con mayor frecuencia en los laboratorios clnicos se denomina microscopio ptico. En general, hay dos tipos de microscopios pticos: Microscopio simple. Es una lupa que tiene una potencia magnificadora de entre 2 y 200. Microscopio compuesto. Posee una batera de lentes dispuestos en un instrumento complejo. Un tipo de lente permanece cerca del objeto (objetivo) y otro tipo se ubica cerca del ojo del observador (ocular). El ocular y el objetivo tienen distintas magnificaciones. El microscopio compuesto puede ser monocular, con un solo ocular, o binocular, con dos oculares (Fig. 2.5). Los microscopios multicabezales se usan en el mbito de la enseanza y con fines demostrativos. VARIEDADES DE MICROSCOPIOS PTICOS. Adems de los microscopios pticos, a continuacin se describen otras modificaciones especiales para el laboratorio clnico: Iluminacin de campo oscuro. Este mtodo se usa para el examen de microorganismos vivos no teidos, como por ejemplo Treponema pallidum. Los microorganismos se iluminan con un haz de luz oblicuo que no atraviesa el microorganismo. El condensador se oscurece en el centro y la luz pasa a travs de su periferia para iluminar el microorganismo vivo sobre un portaobjetos. Microscopia de luz polarizada. Este mtodo se usa para mostrar birrefringencia, p. ej., del amiloide, cuerpos extraos, pelos, etctera. Se emite una luz polarizada plana. Tras atravesar un disco, los haces de luz vibran en un solo plano en ngulo recto

MICROSCOPIA BSICA
El microscopio es la herramienta bsica para el patlogo, de la misma manera que el estetoscopio lo es para el mdico clnico y el espculo para el gineclogo. Este instrumento permite agrandar las imgenes de objetos diminutos.

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Filtros. Hay varios filtros que se usan entre la fuente de luz y el objetivo: en primer lugar, el filtro que absorbe el calor; en segundo lugar, el filtro que detiene la luz roja y en tercer lugar, el filtro excitador que slo permite el pasaje de la luz de la longitud de onda deseada. Al atravesar la pieza, se rene tanto la luz excitadora como la que emite fluorescencia. La luz excitadora se elimina debido al pasaje por otro filtro llamado filtro barrera, ubicado entre el objetivo y el observador, que protege el ojo del observador para que slo la luz fluorescente lo alcance. Condensador. El condensador de campo oscuro se usa en el microscopio de fluorescencia para que la luz directa no caiga en el objeto y, en cambio, se cree un fondo de contraste oscuro para la fluorescencia. TCNICAS. Hay dos tipos de tcnicas de fluorescencia, ambas realizadas en cristatos sobre tejido no fijado, que se denominan directa e indirecta. En la tcnica directa presentada por Coons (1941), quien realiz el estudio original sobre inmunofluorescencia, se dirige un anticuerpo conjugado con un fluorocromo contra un antgeno, y luego, el tejido se examina bajo microscopia ptica. En la tcnica indirecta, tambin denominada tcnica sndwich, se genera una interaccin entre un antgeno tisular y un anticuerpo especfico, seguida por el lavado y luego por el agregado de un fluorocromo para completar la reaccin. La tcnica de inmunofluorescencia indirecta se aplica para detectar autoanticuerpos en el suero del paciente. APLICACIONES. Los mtodos de inmunofluorescencia se aplican para realizar las siguientes tareas: 1. para la deteccin de autoanticuerpos en el suero, como los anticuerpos contra el msculo liso (SMA, por su sigla en ingls), anticuerpos antinucleares (ANA, por su sigla en ingls), anticuerpos antimitocondriales (AMA, por su sigla en ingls), anticuerpo microsmico tiroideo, etctera; 2. en las enfermedades renales, para detectar depsitos de inmunoglobulinas, complemento y fibrina en varios tipos de enfermedades glomerulares mediante el corte por congelacin, como se describir en el Captulo 22; 3. en enfermedades de la piel, para detectar depsitos de inmunoglobulina mediante el corte por congelacin; en particular, en la unin dermoepidrmica y en la porcin superior de la dermis, por ejemplo en la dermatosis ampollar (Captulo 26); 4. para el estudio de los marcadores de superficie de la clula mononuclear con anticuerpos monoclonales; 5. y para el diagnstico especfico de enfermedades infecciosas, p. ej., en la hepatitis viral.

SECCIN I
Patologa general y tcnicas bsicas
Figura 2.5 Microscopio ptico binocular (Modelo E 400, Nikon, Japn). Cortesa: Towa Optics (India) Pvt. Ltd., Nueva Delhi.

entre s. Se colocan dos discos o prismas en la trayectoria de la luz: uno debajo del objeto denominado polarizador y otro en el tubo denominado analizador. El disco inferior se rota para que la luz quede polarizada en un plano.

INMUNOFLUORESCENCIA
La tcnica de inmunofluorescencia se emplea para localizar molculas antignicas sobre las clulas en el examen microscpico. Este mtodo se lleva a cabo mediante anticuerpos especficos que actan contra la molcula antignica para formar el complejo antgeno-anticuerpo en el sitio antignico especfico, que se visualiza gracias al empleo de un fluorocromo, el cual tiene la propiedad de absorber la radiacin en forma de luz ultravioleta, de manera que quede dentro del espectro de la luz visible en el examen microscpico. El mtodo de inmunofluorescencia posee los siguientes componentes esenciales: MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. Se basa en el principio de que la radiacin que emite la luz ultravioleta de menor longitud de onda 360 nm o la luz azul longitud de onda 400 nm causa fluorescencia en ciertas sustancias y luego vuelve a emitir la luz con mayor longitud de onda. Algunas sustancias tienen fluorescencia natural, que se denomina fluorescencia primaria o autofluorescencia; aunque se requiere luz ultravioleta para observarlas mejor, como por ejemplo la vitamina A, la porfirina y la clorofila. La fluorescencia secundaria se emplea con mayor frecuencia y es la produccin de fluorescencia a travs del agregado de colorantes o compuestos qumicos denominados fluorocromos. Fuente de luz. El vapor de mercurio y las lmparas de gas xenn se usan como fuente de luz para la microscopia de fluorescencia.

MICROSCOPIA ELECTRNICA
La microscopia electrnica, desarrollada en la dcada de 1930 en Alemania, experiment modificaciones debido al agregado de nuevos conocimientos para la comprensin de la estructura y la funcin de las clulas normales y enfermas en el nivel de los orgnulos celulares. Sin embargo, en etapas ms recientes, la difusin de la inmunohistoqumica diagnstica en la patologa quirrgica limit la aplicacin de la microscopia electrnica a las siguientes reas de la patologa diagnstica: 1. en las enfermedades renales, junto con la microscopia ptica y la inmunofluorescencia (Captulo 22); 2. en la ultraestructura de los tumores de histognesis incierta;

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3. para el estudio subcelular de los macrfagos en enfermedades por depsito de sustancias; 4. y con fines de experimentacin. TIPOS DE MICROSCOPIA ELECTRNICA Hay dos tipos principales de microscopia electrnica: 1. Microscopia electrnica de transmisin. Es la herramienta de eleccin para el estudio de la ultraestructura de la clula y sus orgnulos. Este estudio consiste en el pasaje de un haz de electrones a travs de una seccin ultradelgada de tejido. La magnificacin obtenida oscila entre 2.000 y 10.000 veces. 2. Microscopia electrnica de barrido. Evala la estructura de la superficie celular y produce una imagen tridimensional. Por ejemplo, para observar los podocitos en el glomrulo renal.

emplear de forma habitual bloques de tejido procesados incluidos en parafina para realizar la inmunohistoqumica, lo que influye de forma significativa sobre el desarrollo de la patologa quirrgica diagnstica. En el pasado, la patologa quirrgica diagnstica se sola considerar una ciencia subjetiva con variaciones entre los observadores en particular, en lesiones fronterizas y en lesiones de origen indeterminado pero, el uso de la inmunohistoqumica agreg objetividad, especificidad y reproducibilidad al diagnstico patolgico quirrgico.

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CAPTULO 2

Generalidades de la inmunohistoqumica
La inmunohistoqumica surgi de los mtodos de inmunofluorescencia, en los cuales los anticuerpos marcados con compuestos fluorescentes podan localizar un antgeno especfico en el corte con cristato. La necesidad de microscopia de fluorescencia se evit gracias al desarrollo subsiguiente de la tcnica de marcado enzimtico con peroxidasa de rbano con algn sistema colorignico, en lugar de un fluorocromo; de manera que el corte por congelacin con un anticuerpo marcado se puede observar con microscopia ptica. Los cromgenos empleados con mayor frecuencia en la reaccin inmunohistoqumica son el tetracloruro de diaminobencidina (DAB, por su sigla en ingls) y el aminoetil carbazol (AEC, por su sigla en ingls), ambos para producir un producto final estable de color marrn oscuro. Luego, se desarroll la tcnica de inmunoperoxidasa, que emplea el mtodo del anticuerpo marcado en cortes de parafina fijados con formalina y que, en la actualidad, se emplea con frecuencia. En la actualidad, los dos procedimientos empleados con mayor frecuencia en la inmunohistoqumica son los siguientes. i) Mtodo de peroxidasa-antiperoxidasa (PAP, por su sigla en ingls), que consiste en la generacin del reactivo PAP en inmunocomplejos estables para su reaccin con el anticuerpo primario mediante un anticuerpo intermedio. ii) Tcnica inmunoenzimtica con el conjugado avidina-biotina (ABC, por su sigla en ingls), que consiste en el empleo de un anticuerpo secundario biotinilado para combinar el anticuerpo primario con un complejo grande preformado de avidina, biotina y peroxidasa. La seleccin del anticuerpo o los anticuerpos para la realizacin de tinciones inmunohistoqumicas se realiza tras el diagnstico diferencial en cortes con H & E. En general, se prefiere un panel de anticuerpos sobre una sola prueba para evitar errores. Los anticuerpos utilizados en inmunohistoqumica se producen con tcnicas monoclonales (hibridoma) y policlonales. La primera se emplea, sobre todo, para producir anticuerpos con afinidad elevada por un antgeno. En la actualidad, se dispone de un gran nmero de anticuerpos contra los antgenos celulares para su empleo en la inmunohistoqumica, y el listado tiende a aumentar de forma continua. Las tinciones inmunohistoqumicas siempre se deben asociar con los controles positivos apropiados; es decir, es un tejido que expresa un antgeno especfico y que acta como control, el cual puede ser un control interno o de otro tejido. La tcnica del bloque tisular en salchicha, que se considera muy econmica, combina la tincin de mltiples tejidos en un solo portaobjetos con un nico procedimiento de control. Para la interpretacin de los resultados de las tinciones inmunohistoqumicas, es importante recordar que diferentes antgenos se localizan en distintos sitios de la clula (membrana, citoplasma,

Tcnicas para el estudio de la patologa

Aspectos tcnicos
A continuacin se mencionan algunas de las consideraciones tcnicas principales relacionadas con la microscopia electrnica: 1. Fijacin. Siempre que se planee evaluar un tejido con microscopia electrnica, se debe fijar una lmina delgada y pequea de tejido de no ms de 1 mm de espesor en glutaraldehdo amortiguado al 2% o al 4% o en una mezcla de formalina y glutaraldehdo. Despus de la fijacin, el tejido se fija en una solucin amortiguada de tetrxido de osmio para aumentar el contraste. 2. Inclusin. El tejido se incluye en resina, en una grilla. 3. Cortes semidelgados. En primer lugar, se realizan cortes semidelgados de un espesor de 1 m y se tien con azul de metileno o azul de toluidina. A veces, tambin se pueden cortar bloques de parafina para su estudio con microscopia electrnica; pero, en general, no son bastante satisfactorios debido a la existencia de numerosos artefactos. Los cortes semidelgados guan el diagnstico diferencial y la seleccin del rea que se debe analizar en los cortes ultradelgados. 4. Cortes ultradelgados. Para el examen ultraestructural, los cortes ultradelgados se realizan con un bistur de diamante. Con el fin de aumentar la densidad electrnica, los cortes delgados se pueden teir a travs de la inmersin de la grilla en una solucin de citrato de plomo y de acetato de urinilo.

INMUNOHISTOQUMICA
La inmunohistoqumica es la aplicacin de tcnicas inmunolgicas a la patologa celular. La tcnica se emplea para detectar el estado y la localizacin de un antgeno especfico en las clulas (membrana, citoplasma o ncleo) mediante el empleo de anticuerpos especficos, que luego se observan con un cromgeno de color marrn. De esta manera, se contribuye a la determinacin del linaje celular especfico o se puede confirmar una infeccin. La inmunohistoqumica revolucion la patologa diagnstica conocida como la revolucin marrn y, en muchos laboratorios sofisticados, esta tcnica reemplaz a la histoqumica como procedimiento auxiliar. Adems de los principios subyacentes a la inmunohistoqumica y a la histoqumica, estas dos tcnicas se diferencian en el resultado final: la histoqumica produce diversos colores para los distintos componentes teidos de acuerdo con la sustancia teida, mientras que la inmunohistoqumica produce solamente en el sitio apropiado de la clula su caracterstico color marrn como resultado final. En la ltima dcada, se realizaron avances significativos en las tcnicas inmunohistoqumicas. En la actualidad, es posible

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ncleo) y, en consecuencia, la tincin positiva se observa y se interpreta en esos sitios, como por ejemplo, tincin membranosa para el antgeno comn leucocitario, tincin nuclear para los receptores de estrgeno y progesterona (RE-RP), tincin citoplasmtica para la actina del msculo liso, entre otras. Las tinciones inmunohistoqumicas no se pueden aplicar para distinguir las lesiones neoplsicas de las no neoplsicas o los tumores benignos de los malignos. Estas distinciones se deben llevar a cabo mediante mtodos tradicionales de patologa quirrgica.

Aplicaciones principales de la inmunohistoqumica

En la actualidad, las tinciones inmunohistoqumicas se emplean para los siguientes objetivos, que se enumeran en el orden de utilidad diagnstica: 1. Tumores de histognesis incierta. La inmunohistoqumica gener una revolucin en el diagnstico de los tumores de origen incierto, tanto primarios como metastsicos de un tumor primario desconocido. Se elige un conjunto de anticuerpos para resolver estos problemas con el diagnstico; la seleccin de los anticuerpos se basa en la historia clnica, las caractersticas morfolgicas y los resultados de otras investigaciones importantes. Son de gran utilidad los colorantes de inmunohistoqumica para teir los filamentos intermedios expresados por las clulas tumorales (queratina, vimentina, desmina, neurofilamentos y protenas cidas fibrilares gliales), adems de los enumerados en el Cuadro 2.2. 2. Marcadores de pronstico para el cncer. La segunda aplicacin de la inmunohistoqumica en importancia es la prediccin del pronstico de los tumores a travs de la identificacin de las micrometstasis, las metstasis ocultas y con ciertas caractersticas adquiridas, de productos elaborados o genes expresados en exceso por las clulas malignas para establecer el
CUADRO 2.2: Tinciones inmunohistoqumicas usadas con mayor frecuencia para los tumores de origen incierto. Tumor 1. Tumores epiteliales (carcinomas) Inmunotincin i) Panqueratina (fracciones: queratinas de alto y bajo peso molecular, HMW-K, LMW-K) ii) Antgeno de la membrana epitelial (EMA) iii) Antgeno carcinoembrionario (CEA) iv) Enolasa neuronoespecfica (NSE) i) Vimentina (mesnquima en general) ii) Desmina (miognico en generales) iii) Actina muscular especfica (miognico en generales) iv) Mioglobina (miognicos esquelticos) v) 1-anti-quimiotripsina (para el histiocitoma fibroso maligno) vi) Factor VIII (para los tumores vasculares) vii) CD34 (marcador endotelial i) HMB-45 (ms especfico) ii) Vimentina iii) S-100 i) ii) iii) iv) i) ii) iii) iv) Antgeno comn leucocitario (LCA/CD45) Pan-B (inmunoglobulinas, CD20) Pan-T (CD3) CD15, CD30 (marcador de las clulas RS para la enfermedad de Hodgkin)

comportamiento biolgico del tumor. A modo de ejemplo, se pueden mencionar los protooncogenes, como la expresin excesiva de HER-2/neu (carcinoma de mama), genes supresores tumorales o antioncogenes (p. ej., gen Rb, p53), receptores de factores de crecimiento (p. ej., receptor de factor de crecimiento epidrmico o EGFR) y marcadores de la proliferacin de las clulas tumorales (p. ej., ki67, antgeno de proliferacin nuclear celular PCNA). El anlisis de los tumores mediante estos mtodos representa un avance significativo en el manejo con respecto a los mtodos convencionales para definir el pronstico basados en la estadificacin clnica y el grado histolgico. 3. Prediccin de la respuesta al tratamiento. La inmunohistoqumica se emplea de forma amplia para predecir la respuesta teraputica en dos tumores importantes: carcinoma de mama y de prstata. El crecimiento de ambos tumores est regulado por hormonas: estrgenos y andrgenos, respectivamente. Los receptores especficos para estas hormonas que regulan el crecimiento se localizan sobre las clulas tumorales respectivas. Los tumores con alta positividad del receptor responden de manera favorable a la eliminacin de la fuente endgena de estas hormonas ooforectoma en el cncer de mama positivo para estrgeno y orquiectoma en el carcinoma de prstata positivo para los andrgenos. Tambin se administra tratamiento hormonal para reducir sus niveles: estrogenoterapia, para el cncer de prstata, y androgenoterapia, para el cncer de mama. Los resultados de los receptores de estrgenos y de progesterona en el cncer de mama presentan una correlacin pronstica significativa, aunque la utilidad pronstica de los niveles de receptores de andrgenos en el cncer de prstata es limitada. 4. Infecciones. Las tinciones inmunohistoqumicas se aplican en la actualidad para confirmar agentes infecciosos en los tejidos mediante el uso de anticuerpos especficos contra el DNA o el RNA microbiano, como la deteccin de virus HBV, CMV, HPV, herpesvirus, bacterias p. ej., Helicobacter pylori y parsitos Pneumocystis carinii, etctera.

SECCIN I
Patologa general y tcnicas bsicas

CITOGENTICA
En el Captulo 10 se describirn los aspectos aplicados de la citogentica. En este captulo el comentario se centrar en breves consideraciones tcnicas. Las clulas somticas humanas son diploides y contienen 46 cromosomas: 22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales (XX en las mujeres y XY en los varones). Los gametos (espermatozoides y vulos) contienen 23 cromosomas y se denominan clulas haploides. Todos los vulos contienen 23 cromosomas (el sexual es X), mientras que los espermatozoides contienen 23 cromosomas (el sexual puede ser X o Y). En consecuencia, el sexo de la descendencia depende de la contribucin cromosmica paterna, lo que implica que el vulo fertilizado por un espermatozoide con un cromosoma X da como resultado un cigoto femenino, mientras que el vulo fertilizado por un espermatozoide con un cromosoma Y produce un cigoto masculino.

2. Tumores mesenquimticos (sarcomas)

3. Grupos especiales a) Melanoma

b) Linfoma

Cariotipo
El cariotipo se define como la secuencia de cromosomas alineados de acuerdo con su tamao, la localizacin del centrmero y el patrn de bandas. En el Captulo 3, se describir la estructura de los cromosomas. La determinacin del cariotipo de un individuo es una herramienta importante para el anlisis citogentico. A continuacin, se mencionan las caractersticas principales del cariotipo:

c) Tumores neurales y neuroendocrinos

Neurofilamentos (NF) NSE GFAP (para los tumores gliales) Cromogranina (para los neuroendocrinos) v) Sinaptofisina

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1. Seleccin de la clula. Las clulas capaces de crecer y dividirse son las seleccionadas para el anlisis citogentico, como las clulas del lquido amnitico, las de una biopsia de vellosidades corinicas, los linfocitos de la sangre perifrica, las clulas de la mdula sea, de ganglios linfticos, tumores slidos, etctera. 2. Cultivo celular. La muestra obtenida de esta manera se cultiva en un medio mitgeno. Un mitgeno es una sustancia que induce la mitosis en las clulas, como PPD, fitohemaglutinina (PHA, por su sigla en ingls), el mitgeno de la hierba carmn (PWM), ster forbol, etc. Luego, las clulas que se dividen, se detienen en metafase por el agregado de colchicina o colcemida: ambos son inhibidores de la formacin de los microtbulos. A continuacin, las clulas se destruyen por el agregado de una solucin hipotnica. Luego, las clulas en metafase se fijan en una mezcla de metanol y cido actico glacial. 3. Tincin/bandeo. Cuando se tien, los cromosomas forman bandas oscuras y claras alternadas. Para lograr este efecto, el preparado fijado en metafase se tie con una de las siguientes tcnicas de bandeo: a) Bandeo con Giemsa o bandeo G, es empleado con mayor frecuencia. b) Bandeo con quinacrina o bandeo Q, empleado para mostrar las bandas a lo largo de los cromosomas. c) Bandeo constitutivo o bandeo C, se usa para mostrar la heterocromatina constitutiva. d) Bandeo por tincin de Giemsa inversa (o bandeo R), produce un patrn opuesto al obtenido con el bandeo G. 4. Anlisis microscpico. Luego, los cromosomas se fotografan a travs del examen microscpico del preparado. En la fotografa, los cromosomas se cortan y se organizan de acuerdo con su tamao, su localizacin centromrica y sus patrones de bandeo. Los pares de cromosomas se identifican de acuerdo con la longitud del brazo de los cromosomas. El centrmero divide los cromosomas en un brazo superior corto denominado brazo p (la p, por petit, pequeo) y un brazo inferior largo denominado brazo q (la letra q es la que sigue a la p). En la actualidad, se puede llevar a cabo el anlisis citogentico molecular y la caracterizacin de los cromosomas a travs de la tcnica revolucionaria de hibridacin in situ con fluorescencia multicolor (FISH, por su sigla en ingls) (vase ms adelante en la seccin de Patologa molecular).

PATOLOGA DIAGNSTICA MOLECULAR

Durante el ltimo cuarto del siglo XX, se realizaron grandes avances en el campo de la biologa molecular. Como consecuencia, las tcnicas moleculares, que en el pasado slo se empleaban con fines experimentales, ahora estn disponibles para el diagnstico. Estas tcnicas sirven para detectar anomalas en el DNA o el RNA celular. Por lo general, todas las tcnicas moleculares basadas en el DNA o el RNA emplean la hibridacin basada en la tecnologa recombinante. Una regin especfica de DNA o RNA se detecta mediante su marcado con una sonda (la sonda es una cadena de nucletidos formada por un nmero conocido de pares de bases). Las sondas poseen distintos tamaos y orgenes, y son las siguientes. 1. Las sondas genmicas provienen de una regin del DNA de las clulas. 2. La sonda de cDNA se forma a partir de RNA mediante transcripcin inversa. 3. La sonda de oligonucletidos es una sonda sinttica contraria al DNA genmico y a la sonda de cDNA, ambas derivadas de material celular. 4. Las ribosondas se preparan mediante un sistema de transcripcin in vitro. MTODOS MOLECULARES A continuacin, se presenta una descripcin breve de las tcnicas moleculares disponibles como herramienta de diagnstico en la patologa quirrgica: 1. HIBRIDACIN IN SITU. La hibridacin in situ es una tcnica de hibridacin molecular que permite la localizacin de una secuencia de cido nucleico en forma directa en la clula intacta (o sea, in situ) sin la extraccin del DNA, a diferencia de otras tcnicas basadas en hibridacin, que se describirn ms adelante. Esta tcnica consiste en la hibridacin especfica de una sola cadena de una sonda marcada de cido nucleico con una sola cadena de un DNA o un RNA complementario de un tejido que se desea detectar. El producto final de la hibridacin se identifica con una sonda radiactiva (32P, 125I) o no radiactiva (biotina, digoxigenina). Aplicaciones. La hibridacin in situ se usa en las siguientes aplicaciones: i) en infecciones virales (p. ej., HPV, EBV, HIV, CMV. HCV, etc.), ii) en tumores humanos para la deteccin de la expresin de genes y oncogenes. iii) en trastornos cromosmicos, en particular, mediante el uso de hibridacin in situ por fluorescencia (FISH). 2. HIBRIDACIN CON FILTRO. Este mtodo consiste en la extraccin del DNA o del RNA evaluado del tejido, que puede ser fresco, congelado no fijado, o fijado en formalina e incluido en parafina. El DNA o el RNA extrado se inmoviliza en un filtro de nitrocelulosa o nailon. A continuacin, se hibrida el DNA buscado con la sonda marcada. El anlisis del DNA con hibridacin por filtro se realiza a travs de los siguientes mtodos: i) Ensayos de transferencia por manchas (dot) y por ranuras (slot), en los cuales la muestra de DNA se une de forma directa con el filtro sin reduccin del tamao del cido nucleico. ii) Southern blot (electroinmunotransferencia o inmunotransferencia); es similar a la anterior, pero difiere en el fraccionamiento previo del DNA mediante electroforesis en gel (se denomina Southern blot, debido al cientfico E. M. Southern, que describi esta tcnica por primera vez).

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CAPTULO 2
Tcnicas para el estudio de la patologa

Aplicaciones
El campo de la citogentica posee amplias aplicaciones en patologa diagnstica (Captulo 10). En resumen, el cariotipo se emplea para los siguientes fines: i) Anomalas cromosmicas numricas, p. ej., sndrome de Down (trisoma del autosoma 21), sndrome de Klinefelter (trisoma 46), sndrome de Turner (monosoma 45, XO), abortos espontneos. ii) Anomalas cromosmicas estructurales, como traslocaciones (p. ej., cromosoma Philadelphia t(9;22), sndrome de cri-duchat, 5p, abortos espontneos recurrentes), deleciones, inserciones, isocromosoma y formacin de cromosoma anular. iii) El cncer se caracteriza por mltiples anomalas cromosmicas complejas, como deleciones, amplificaciones, inversiones, traslocaciones, en especial en leucemias y linfomas, tumores de clulas germinales y algunos sarcomas.

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iii) Northern blot; es similar a la anterior, pero con fraccionamiento del RNA. (En este caso se la ha llamado Northern como opuesta a la anterior, no corresponde a un apellido) iv) Western blot (electroinmunotransferencia de protenas); es anloga a los dos mtodos anteriores, pero para el fraccionamiento de protenas; en este mtodo, se usan anticuerpos como sondas. Aplicaciones. Debido al nivel elevado de especificidad y sensibilidad de las tcnicas de hibridacin molecular, estos mtodos se aplican de forma amplia en la patologa diagnstica. i) En las neoplasias, tanto en las hematolgicas como en las no hematolgicas. ii) En las enfermedades infecciosas, para el diagnstico del agente causal, en estudios epidemiolgicos y para la identificacin de nuevos agentes infecciosos. iii) En las enfermedades genticas hereditarias, para detectar a portadores de mutaciones, para el diagnstico prenatal y para el diagnstico directo de las enfermedades genticas. iii) En la determinacin de la identidad, para el trasplante de tejidos, en patologa forense y para la evaluacin del parentesco. 3. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla en ingls) es una tcnica revolucionaria para la evaluacin gentica molecular con aplicaciones amplias en el diagnstico y la investigacin. La tcnica se fundamenta en el principio de que una cadena de DNA posee una capacidad ilimitada para duplicarse a s misma y as formar millones de copias. En la PCR, una sola cadena de DNA genera otra por la accin de la DNA polimerasa con un fragmento corto de DNA complementario y con el uso de un cebador, que acta como molde para iniciar la reaccin. Un ciclo de la PCR consta de tres pasos: i) Desnaturalizacin del DNA con calor (a 94 C durante 60 a 90 segundos). ii) Hibridacin de los cebadores con sus secuencias complementarias (a 55 C durante entre 30 y 120 segundos). iii) Extensin de los cebadores hibridados con DNA polimerasa (a 72 C durante entre 60 y 180 segundos). Los ciclos se pueden realizar en un ciclador trmico automtico, el cual produce una gran acumulacin de la secuencia evaluada, dado que cada nuevo producto generado acta como molde para el siguiente ciclo. Aplicaciones. El anlisis por PCR posee las mismas aplicaciones que las tcnicas de hibridacin con filtro, pero con muchos beneficios sobre ellas porque es ms rpido, se pueden automatizar con cicladores trmicos y requiere mucho menos DNA inicial. Sin embargo, la PCR se puede contaminar; en consecuencia, se requiere precaucin extrema durante la implementacin de esta tcnica.

corriente, filtros monocromticos, lentes, espejos y un ordenador para el anlisis de los datos. El citmetro de flujo acta como clasificador de clulas, ya que distribuye en forma fsica las clulas presentes en la suspensin lquida, que fluyen en una sola hilera. La citometra de flujo requiere suspensiones unicelulares; y sus aplicaciones se limitan a la evaluacin de lquidos, como por ejemplo leucocitos, eritrocitos y sus precursores, lquidos corporales y, en ocasiones, tejidos slidos homogeneizados para crear suspensiones celulares. Aplicaciones. El anlisis por citometra de flujo se emplea en la prctica clnica para los siguientes casos. 1. Inmunofenotipo, a travs del anlisis antignico detallado de varias neoplasias hematopoyticas, como por ejemplo leucemias agudas y crnicas, linfomas (Hodgkin y no Hodgkin) y neoplasias de clulas plasmticas. 2. Medicin de los antgenos asociados con la proliferacin, como por ejemplo Ki67, PCNA. 3. Medicin del contenido de cido nucleico, por ejemplo a travs de la medicin del contenido de RNA en los reticulocitos, la cuantificacin del contenido de DNA y el recuento de la ploida del DNA en varios tipos de cnceres. 4. Diagnstico y pronstico de la inmunodeficiencia, como por ejemplo en el sndrome de inmunodeficiencia humana o sida, a travs del recuento de CD4 y de los linfocitos T. Los pacientes con recuentos de CD4 y linfocitos T menores de 500/mL requieren tratamiento antiviral. 5. Para diagnosticar la causa del rechazo del aloinjerto en un trasplante renal, en caso de nefropata terminal a travs del recuento de CD3 y linfocitos T. Los pacientes con recuentos de CD3 y linfocitos T menores de 100 a 200/mL tienen menor riesgo de experimentar un rechazo del injerto. 6. Diagnstico de autoanticuerpos en la prpura trombocitopnica idioptica y en la neutropenia autoinmunitaria. MTODOS PARA EL ANLISIS DE LA PROLIFERACIN CELULAR Adems de la citometra de flujo, el grado de proliferacin de las clulas en los tumores se puede determinar a travs de varios otros mtodos, que se mencionan a continuacin: 1. Recuento mittico. Es el mtodo ms antiguo, pero an se utiliza para el diagnstico anatomopatolgico sistemtico. Se cuenta el nmero de clulas en mitosis por campo de gran aumento, como por ejemplo para clasificar varios tipos de tumores del msculo liso. 2. Autorradiografa. Este mtodo consiste en el marcado in vitro con timidina de las clulas en vas de proliferacin para despus procesarlas para su inclusin en parafina. Las clulas marcadas con timidina (que corresponden a la fase S) se cuentan cada 2.000 ncleos de clulas tumorales y se expresan mediante el ndice de marcacin con timidina. El mtodo se emplea como marcador pronstico en el carcinoma de mama. 3. Anlisis microespectrofotomtrico. El fragmento se tie con la reaccin de Feulgen para revelar el contenido de DNA en la clula y medir este contenido con un microespectrofotmetro. El mtodo es tedioso y su aplicacin es limitada. 4. Inmunohistoqumica. El antgeno nuclear especfico para el crecimiento y la divisin celular se tie con inmunohistoqumica y luego se cuentan las clulas positivas con el microscopio o con un analizador de imgenes. Los marcadores de la proliferacin, evaluados con este mtodo, son Ki-67, PCNA y ciclinas.

SECCIN I
Patologa general y tcnicas bsicas

OTRAS HERRAMIENTAS MODERNAS PARA LA PATOLOGA DIAGNSTICA

LA CITOMETRA DE FLUJO La citometra de flujo es una herramienta moderna que se usa para el estudio de las propiedades de las clulas suspendidas en una corriente en movimiento. Por ende, la citometra de flujo supera el problema de la subjetividad asociada con el examen microscpico de las clulas y tejidos en la histopatologa y en la citopatologa. El citmetro de flujo posee una fuente con luz lser para emitir fluorescencia, un sistema de transporte celular en una sola

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5. Regin organizadora del nucleolo (NOR, por su sigla en ingls). El nucleolo contiene componentes ribosmicos que se forman en regiones de los cromosomas con DNA denominadas NOR. Estas reas revelan afinidad por el metal plata. Esta propiedad se usa para la tincin del fragmento con plata (tcnica AgNOR). Las NOR se presentan como manchas intranucleares de color negro, mientras que el fondo se tie de amarillo-amarronado. ORDENADORES EN EL LABORATORIO DE PATOLOGA Un laboratorio de patologa debe comunicar gran cantidad de informacin a los mdicos. El patlogo tambin debe poder acceder a los datos del paciente antes de informar los resultados de las muestras recibidas. En consecuencia, resulta fundamental que el laboratorio de patologa moderno posea un sistema informtico que est conectado con el sistema informtico hospitalario. Asimismo, el personal del laboratorio y los mdicos deben conocer los sistemas utilizados. El empleo de ordenadores en el laboratorio posee dos objetivos principales: para registrar los resultados de los pacientes y para informar los resultados de las pruebas en formato numrico, narrativo y grfico. Aplicaciones. La aplicacin de ordenadores en el laboratorio de patologa posee varias ventajas que se describen a continuacin. 1. El personal del laboratorio y del hospital tienen acceso a la informacin del paciente, lo que ayuda a mejorar su atencin. 2. El tiempo entre la obtencin de la muestra y el informe de los resultados se abrevia. 3. Mejora la productividad del personal del laboratorio en todos los niveles, y este personal se puede utilizar en otras tareas. 4. Codificacin y clasificacin de los resultados y los datos de las distintas pruebas. 5. Con fines de experimentacin y de acreditacin, para obtener becas para la investigacin, se requieren datos computarizados de los resultados. 6. Almacenamiento y recuperacin de los datos del laboratorio para ahorrar el tiempo y el espacio ocupado por los archivos. SISTEMA DE RECONOCIMIENTO DE VOZ. En la actualidad, hay sistemas computarizados que pueden reconocer la voz y transformar en texto las descripciones macroscpicas y microscpicas verbales de los informes a travs de un dictfono, sin que intervenga un secretario. ANALIZADOR DE LA IMAGEN Y DE LA MORFOMETRA La patologa es una disciplina muy visual; por lo tanto, el anlisis de las imgenes microscpicas representa el elemento principal para su estudio. Existe la necesidad y el deseo de impartir mayor objetividad a los informes de histopatologa, ya que stos solan ser bastante subjetivos. En la actualidad, mediante los avances en las tcnicas de computacin, se lograron mediciones objetivas de las caractersticas microscpicas cuantitativas para permitir la reproducibilidad de las observaciones histopatolgicas. El analizador de imgenes es un sistema que se utiliza para definir las caractersticas estructurales, celulares y nucleares de las clulas. En forma sucinta, el analizador de imgenes consiste en las siguientes partes: 1. microscopio ptico convencional con una cmara de vdeo montada sobre l.

2. un sistema computarizado (CPU, monitor, teclado, mouse, etc.) conectado con el microscopio. 3. un equipo de captura de imgenes que convierte las imgenes de vdeo del monitor en imgenes digitales y las almacena en la CPU. 4. soporte informtico para el anlisis de las imgenes instalado en el ordenador de acuerdo con las necesidades del usuario para realizar las mediciones y los clculos. APLICACIONES. El analizador de imgenes se puede usar con diversos objetivos, que se mencionan a continuacin. 1. Estudio morfomtrico de las clulas tumorales a travs de la medicin de las caractersticas estructurales, celulares y nucleares. 2. Medicin cuantitativa de la ploida del DNA nuclear. 3. Valuacin cuantitativa de la tincin inmunohistoqumica. LAS MICROMATRICES DEL DNA La micromatriz del DNA es la aplicacin ms nueva de la tecnologa con chips de siliconas para el anlisis simultneo de grandes volmenes de datos de genes humanos, como por ejemplo para la deteccin y la cuantificacin de mutaciones puntuales y pleomorfismos de un nucletido nico. El mtodo elimina el uso de sondas de DNA. En su lugar, se usa el marcado fluorescente de un fragmento de DNA (cDNA o complementario), para la hibridacin de la muestra en estudio. Se utilizan escneres lser de alta resolucin para la deteccin de las seales fluorescentes emitidas, mientras que el nivel de expresin de genes y el genotipo de las muestras biolgicas se determinan a travs de la aplicacin de la bioinformtica. APLICACIONES. Las micromatrices de DNA se usan para obtener perfiles moleculares de los tumores que ayudan a arribar a diagnsticos histogenticos especficos y a establecer el pronstico. MICRODISECCIN CON LSER La microdiseccin con lser es otra tcnica nueva en la patologa quirrgica diagnstica que permite definir el perfil molecular del material tisular. Consiste en la diseccin de una sola clula o parte de una clula p. ej., cromosomas a travs de tecnologa lser y soporte informtico apropiado para el procedimiento. Luego, el material aislado se puede usar para realizar las pruebas moleculares disponibles. LA TELEPATOLOGA Y LA MICROSCOPIA VIRTUAL La telepatologa se define como la prctica de la patologa diagnstica a cargo de un patlogo presente en otro sitio a travs de imgenes de las muestras tisulares transmitidas mediante una red de telecomunicaciones. Los componentes principales de un sistema de telepatologa son los siguientes: microscopia ptica convencional; mtodo para la captura de la imagen; en general, una cmara montada sobre el microscopio ptico; conexin de telecomunicaciones entre el lado emisor y el receptor; y una base operativa en el extremo receptor con un monitor de alta calidad. De acuerdo con la necesidad y el presupuesto, el sistema de telepatologa puede ser de dos tipos: Esttico (almacenamiento y transmisin, telepatologa pasiva): consiste en la captura de imgenes especficas, su almacena-

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CAPTULO 2
Tcnicas para el estudio de la patologa

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miento y su transmisin a travs de un correo electrnico, un protocolo de transferencia de archivos, un sitio web o CDROM. El mtodo es bastante econmico y se usa con mayor frecuencia, pero tiene la desventaja de que el emisor es el que selecciona las imgenes transmitidas. Dinmico (telepatologa interactiva con robot): consiste en imgenes transmitidas en tiempo real desde un microscopio distante. El movimiento robtico del microscopio se controla a distancia, se adjuntan las imgenes y los campos elegidos procedentes de un servidor a distancia o local. En consecuencia, este mtodo casi duplica la perfeccin del examen de los portaobjetos bajo el microscopio; se denomina microscopia virtual. Sin

embargo, la calidad de la imagen y la velocidad de Internet pueden ser obstculos importantes. La era de la patologa digital en el siglo XXI alcanz su cenit con la disponibilidad de la tecnologa para preparar piezas de patologa virtuales con equipos de alta velocidad y con el almacenamiento de datos en ordenadores con gran capacidad de memoria. Estas piezas almacenadas en la memoria del ordenador se pueden examinar e informar sin la necesidad de usar un microscopio. No obstante, la pregunta principal es si los patlogos actuales, acostumbrados a la microscopia convencional, lograrn la misma percepcin en el monitor. En la actualidad, esta tecnologa es til para la enseanza, las reuniones clnicas y el control de calidad.

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