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Imunohistoqumica
Ana Alarco 28 de Maio de 2009
Imunohistoqumica (IHQ)
Cincias: imunologia, histologia e qumica Fundamento: demonstrao de antignios (Ag) nos cortes histolgicos atravs de anticorpos (Ag) especficos. Aps ligao Ag-Ac a sua demonstrao possvel atravs de uma reaco histoqumica com colorao visvel em microscopia ptica Material: tecido parafinado, fresco, suspenses celulares, imprints e cell block Permite: 1 ou mltiplos Ag simultaneamente Analisar a presena de 1 Ag particular em vrios tecidos na mesma lmina (microarray)
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Imunohistoqumica (IHQ)
Aplicao: Diagnstico quando a morfologia e dados clinopatolgicos no o permitem Distino entre tumores histologicamente semelhantes Identificao do sub-tipo histolgico Caracterizao de tumores malignos no diferenciados ou pouco diferenciados para determinar se so primrios ou metastticos Identificao de micrometstases Permite diagnstico, prognstico e orientao teraputica
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Imunoglobulina G (IgG)
Imunoglobulinas (Ig): G, A, M, D , E
Ligao do antignio (Ag): VL e VH Regies hiperactivas (HV): domnios VL e VH Reaco antignio-anticorpo: HV fica em proximidade com o determinante antignico (eptopo) Cada Ag pode conter 1 ou mais eptopos. Cada eptopo pode ser composto por aminocidos (5 ou +) ou unidades de monossacardeos
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Estrutura da IgG: A cadeia pesada (H) e a leve (L) so compostas por domnios varivel (V) e constante (C). As cadeias esto ligadas por pontes dissulfito.
Anticorpos
Tipo de Anticorpos: Monoclonais Produzido atravs de hibridomas Produto de um clone individual clulas do plasma Reagem com um eptopo especfico Animal usado para a sua produo: ratinho
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Anticorpos
Tipo de Anticorpos: Policlonais Produzidos em diferentes clulas Produzidos por animais imunizados Reagem com vrios eptopos Animal usado para a sua produo: coelho, cabra, porco, ovelha, cavalo, porquinho-da-ndia Podem ser obtidos na forma de anti-soro ou fraces de Ig
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Anticorpos
Anticorpos monoclonais versus anticorpos policlonais
Anticorpos Caractersticas Origem Afinidade Sensibilidade Especificidade Contedo Ig irrelevante Efeito da fixao Tolerncia da fixao Homogeneidade Custo
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Monoclonais Maioria ratinho Sem variao Baixo a moderado Alto Nenhum no sobrenadante de clulas, na ascite 0.51.0 mg/ml nico Baixo Sem variao por lote Alto
Policlonais Mltiplas espcies Varivel Alta Baixa a alta Alta (10 mg/ml) Mltipla Alta Variao por lote Moderado
Anticorpos
Algumas dificuldades na utilizao de Ac monoclonais: O eptopo alvo tem de ser preservado pela fixao A reactividade de um eptopo aps uma fixao ptima no assegura necessariamente que seja preservado em condies de fixao sub-ptima O eptopo alvo tem de ser nico para um dado antignio Os Ac monoclonais dependem mais de outros factores, tais como, pH e outros reagentes
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IHQ - Metodologia
Escolha da Metodologia: Tipo de amostra Disponibilidade do Ac primrio Grau de sensibilidade Tempo de processamento necessrio Custo dos reagentes
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IHQ - Metodologia
Mtodo Directo Mtodo Indirecto 2 passos
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IHQ - Metodologia
Mtodo Indirecto 3 passos
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IHQ - Metodologia
Complexo fosfatase alcalina-fofatase anti-alcalina (complexo APAAP)
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IHQ - Metodologia
Complexo peroxidase-anti-peroxidase (complexo PAP)
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IHQ - Metodologia
Labelled streptavidin-biotin (LSAB) method
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IHQ - Metodologia
Mtodo do Polmero: EnVision Systems
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IHQ - Metodologia
Mtodo do Polmero: ImmPRESS polymerized reporter ezyme staining system
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IHQ - Metodologia
Tyramide Signal Enhancing (TSE) ou CSA
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Adio de detergente (ex: Tween 20) Adio ao diluente do Ac primrio de albumina srica bovina a 1% Adio de leite magro em p ou casena Reduo das interaces inicas Diluentes de Ac com fora inica superior
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Bloqueio da fofatase alcalina endgena: Incluir levamisole 5 mM na soluo de substracto Lavagem com cido fraco
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Colorao Imunohistoqumica
PTEN
APC
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VIM
Colorao Imunohistoqumica
EGFR
CK7
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Marcadores Imunohistoqumicos
Anti-queratinas = + Anti-queratinas = + Anti-EMA =+ Anti-EMA =+ Anti-queratinas = Anti-queratinas = =+ Anti-LCA Anti-LCA =+ Anti-queratinas Anti-queratinas Anti-EMA Anti-EMA Anti-LCA Anti-LCA = = = = = =
CARCINOMA CARCINOMA
LINFOMA LINFOMA
CD45 CD45 F1 F1 Anti CD3 Anti CD3 CD20 CD20 CD45 CD45 MAC 387 MAC 387 CD 68 CD 68 CD 163 CD 163 CD15 CD15
CD30 CD30
=+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+
Melanoma
Rabdomiosarcoma Leiomiosarcoma
Protena S100 = + Protena S100 = + HMB 45 =+ HMB 45 =+ Melan-A =+ Melan-A =+ Desmina Desmina =+ =+
Neuroblastoma
Neurofilamentos = + Neurofilamentos = +
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Linfoma de Hodgkins
Leu MI Leu MI
Outros sarcomas
Vimentina Vimentina
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