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PROCARIOTAS

El DNA dplex se replica por una progresiva separacin de las dos hebras paternas, acompaado de una sntesis de sus hebras complementarias, dando lugar, de forma semiconservadora, a dos hebras hijas de doble hlice . El punto de separacin de las dos hebras donde la sntesis tiene lugaar ha recibido el nombre de ojo de replicacin, y termina en dos puntos extremos que se denominan horquillas de replicacin, Los estudios mediante autorradiografas han demostrado que la replicacin es siempre bidireccional. Adems, dichos experimentos, junto con algunas evidencias genticas, han establecido que el DNA procaritico y el de los bacterifagos slo poseen un nico origen de replicacin (punto donde se inicia la sntesis del DNA).

REPLICACIN EN PROCARIOTES

La replicacin del DNA es un proceso complejo en el que intervienen gran variedad de enzimas y otras protenas:
1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8.

Protenas iniciadoras. Se fijan al punto de origen y separan las dos hebras del DNA para iniciar la replicacin DNA Helicasa. Desenrolla el DNA en las horquillas de replicacin SSP. Protenas que se fijan a la hebra sencilla de DNA e impiden la nueva unin de las hebras antes de su replicacin DNA Girasa. Se desplaza delante de la horquilla de replicacin y acta como topoisomerasa para liberar el estrs giratorio creado sobre la doble hlice de DNA por el avance del desenrollamiento necesario para la replicacin DNA Primasa. Sintetiza una cadena corta de RNA para que actuara como cebador (primer) para iniciar la actividad de la polimerasa DNA Polimerasa III. Sintetiza la nueva cadena de DNA a partir del extremo 3OH provisto por el cebador DNA Polimerasa I. Elimina los cebadores de RNA y los remplaza con DNA DNA Ligasa. Enzima que une covalentemente los fragmentos de Okazaki contiguos sellando los rompimientos dejados en la cadena de nucletidos.

Protenas Requeridas para la Replicacin de DNA en E. coli


Protena DnaA: Factor de iniciacin Protena DnaB: Helicasa 5' 3' (fusin del DNA) Protena DnaC: Chaperona de la DnaB HU: Protena tipo histona (de unin al DNA) PriA: Ensamble del Primosoma, Helicasa 3' 5' PriB: Ensamble del Primosoma PriC: Ensamble del Primosoma DnaT: Asiste durante la liberacin de la DnaC Protena DnaG: Primasa, Sntesis del cebador de RNA SSB: Protenas de unin al DNA de hebra simple DNA girasa (Topoisomerasa II): Desenrollamiento del DNA DNA polimerasa III: Sntesis de DNA. Holoenzima de elongacin DNA polimerasa I: Elimina el cebador de RNA, rellena espacios con DNA DNA ligasa: Une covalentemente los fragmentos de Okazaki Tus: Terminacin

Iniciacin de la Replicacin en Procariotes


La replicacin del DNA es un proceso complejo en el que

intervienen por lo menos nueve diferentes protenas.


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Protena DnaA, reconoce la secuencia de origen, promueve la separacin inicial de la doble hlice Protena DnaB, Helicasa, desenrolla las dos hebras del DNA Protena DnaC, requerida para la unin de DnaB en el origen HU, protena tipo histona que facilita el inicio Primasa (Protena DnaG), sintetiza el cebador de RNA SSB, protenas de unin al DNA que impiden re-apareamiento de las hebras antes de su replicacin, RNA Polimerasa, facilita la actividad de la DnaA DNA girasa, Topoisomerasa II, libera la tensin torsional Dam metilasa, metila C en las secuencias 5-GATC del oriC

Complejo de Pre-replicacin

El Complejo de Pre-replicacin (pre-RC) es un complejo proteico que se estructura en el punto de origen de la replicacin (Ori) durante la fase de inciacin de la replicacin del DNA. Las protenas involucradas en la formacin del pre-RC son indispensables para que el proceso de replicacin se realice adecuadamente. En los procariotes, el pre-RC esta compuesto de los siguientes factores :
Un factor de iniciacin de la replicacin, tal como la protena

llamada dnaA Una Helicasa y sus cofactores, tales como la dnaB y la dnaC Una Primasa, tal como dnaG, la cual genera el cebador de RNA que requiere la Polimerasa para funcionar en la replicacin del DNA. Una holoenzima de la RNA Polimerasa, la cual es en realidad un complejo enzimtico que realiza efectivamente la replicacin.

La necesidad de desenrollar la hebra paterna del DNA en la horquilla de replicacin produce grandes problemas a nivel topolgico. Sin embargo, en organismos procariticos, los superenrollamientos negativos en el DNA , que seran indispensables para evitar el superenrollamiento que sera inhibitorio de la replicacin de la molcula de DNA, se pueden realizar por la accin de una topoisomerasa del Tipo II (DNA girasa) a expensas de la hidrlisis de ATP. Este proceso es esencial en la replicacin del DNA procaritico, como lo demuestra la detencin de la replicacin del DNA en presencia de inhibidores de la DNA girasa.

Uno de los requerimientos casi universales para todas las DNA polimerasas es el extender la hebra de DNA a partir de un extremo 3'-OH libre. Como consecuencia de este hecho, se ha observado que los fragmentos de Okazaki poseen en sus extremos 5' segmentos de RNA de 1 a 60 nucletidos (esta longitud vara segn la especie), que son complementarios a la hebra de DNA molde y que han funcionado como cebadores para el inicio de la actividad de la DNA polimerasa. E. coli posee dos enzimas que catalizan la formacin de estos cebadores de RNA: la RNA polimerasa, la enzima que media la transcripcin, y otra de menor tamao, la primasa (60 kD), que es el producto monomrico del gene denominado dnaG. El DNA ya replicado, maduro, no contiene ningn fragmento de RNA. Los cebadores de RNA se eliminan durante el proceso de la replicacin y los huecos monohebra que dejan son llenados con DNA.

El inicio de la replicacin esta afectado por la metilacin del DNA y por interacciones con la membrana plasmtica bacteriana. El DNA de oriC es metilado por la metilasa Dam, que metila la adenina en el N6 dentro del palndrome 5-GATC. La regin oriC de E. coli est enriquecida en este tipo de secuencias GATC: tiene 11 en sus 245 pares de bases. Inmediatamente despus de la replicacin el DNA es semimetilado: las hebras parentales tienen las secuencias oriC metiladas, mientras que las hebras de nueva sntesis no las tienen. Las secuencias oriC semimetiladas son secuestradas a traves de una interaccin con la membrana plasmtica, que se produce a travs de un mecanismo todava desconocido. Al cabo de un tiempo, oriC es liberado de la membrana plasmtica y debe ser metilado nuevamente de manera completa antes de que pueda unirse otra vez a la protena DnaA

Molde de DNA preexistente Cebador (primer)

Precursores activados Los cuatro Desoxiribonucletidos 5trifosfato DNA-polimerasas

Pequeo fragmento de RNA (>5 nucletidos) con el grupo 3-OH libre, unido al DNA molde (sintetizado por la primasa del primosoma)

Catalizan la formacin de enlaces fosfodister dirigida por un molde de DNA (actividad polimerasa 5 3) y la correccin de errores (exonucleasa 3 5) Requieren Mg2+ y un cebador con su extremo 3-OH libre Tres tipos en E. coli:
DNA polimerasa I (Pol I): Elimina el cebador mediante una actividad exonucleasa 5 - 3 y sintetiza DNA en su lugar DNA polimerasa II (Pol II): Funcin desconocida (quiz similar a la Pol I) DNA polimerasa III (Pol III): Sntesis de la nueva cadena de DNA a partir del cebador

DNA polimerasas en E. coli

Las principales ADN polimerasas en E. coli son las DNA Pol I, DNA Pol II y DNA Pol III, y cada una de ellas est especializada en diversas funciones segn cul sea su papel en la replicacin.

la DNA Pol I, que es poco procesiva (aade entre 20 y 100 nucletidos por acontecimiento de unin), es la encargada de la eliminacin de los cebadores y el "relleno" del espacio que dejan con DNA (actividad exonucleasa 5' 3' y actividad polimerasa 5' 3'). La DNA Pol II est encargada de la reparacin de DNA (actividades polimerasa 5' 3' y exonucleasa 3' 5'), la DNA Pol III que es muy procesiva es la principal encargada de la elongacin del DNA (actividad polimerasa 5' 3') durante la cual tambin puede realizar tareas de correccin (actividad exonucleasa 3' 5').

Las DNA polimerasas pueden aadir hasta 1000 nucletidos por segundo. Esto es debido a su naturaleza procesiva, es decir, el nmero de nucletidos que las polimerasas son capaces de aadir cada vez que se asocian al molde de DNA que van a copiar. Dado que la adicin de los nucletidos es un proceso que dura unos milisegundos, la velocidad de catlisis va a depender del tiempo que la DNA polimerasa permanece unida al ADN, esto es, de su procesividad.

Adems de su actividad polimerasa, la Pol I tiene dos actividades hidrolticas independientes: La reaccin exonucleasa 3' - 5' difiere qumicamente de la reaccin de pirofosforolisis slo en que el aceptar de nucletidos es el H20 en lugar del PPi. Esto es ventajoso, porque la concentracin de pirofosfato intracelular es prcticamente nula. La funcin exonucleasa 3' - 5' es activada por un nucletido terminal en 3', desapareado, con un grupo OH libre. Cuando la Pol I incorpora, por error, un nucletido equivocado (desapareado) en el extremo de la hebra de DNA que est creciendo, la actividad polimerasa se inhibe y la actividad exonucleasa 3' - 5' elimina el nucletido errneo. A continuacin, la actividad polimerasa reanuda la replicacin del DNA. De esta manera la Pol I tiene la capacidad de releer la hebra de DNA que est sintetizando y corregir sus propios errores. La actividad de exonucleasa 5- 3' tambin elimina los cebadores de RNA de los extremos 5' y rellena los huecos resultantes con DNA sintetizado de nuevo. Esta parece ser la actividad real en que participa la Pol I.
1. Puede actuar como exonucleasa 3' - 5'. 2. Puede actuar como exonucleasa 5' - 3'.

En las bacterias existe un solo origen de replicacin, denominado Ori C, y a partir de este nico punto de origen, la replicacin progresa en dos direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u Horquillas de Replicacin. Entre ellas se encuentra la Burbuja de Replicacin en donde queda comprendida toda la maquinaria que realiza la replicacin del DNA en los dos puntos de crecimiento. El cromosoma bacteriano se denomina Replicn, por ser slo una unidad de replicacin. La replicacin en bacterias se ajusta al modelo semiconservador.

Iniciacin en Procariotes
El genoma de E. coli est contenido en una sla molcula circular de DNA formada por 4.6 x 106 pares de nucletidos. La replicacin del DNA se inicia en un solo lugar, el origen de replicacin. En E. coli, este sitio es conocido como oriC. Se conoce como el origen mnimo de replicacin, la secuencia de DNA ms corta que puede cumplir eficientemente esta funcin. Se trata de una secuencia de 245 pb, muy conservada entre las enterobacterias y que contiene 3 regiones caractersticas:

1. Cuatro copias de la secuencia 5' -TTAT(C/A)CA(C/A)C-3, 2 en un

sentido y otras 2 en sentido contrario en posiciones muy conservadas, designadas Rl a R4, que sirven para la unin de la protena DnaA. 2.Tres zonas de 13 nucletidos, cada una rica en pares AT (5 'GATCTNTTNTTTC-3' ), se localizan a la izquierda de las anteriores y favorecen la desnaturalizacin local del ADN. N representa a cualquier nucletido. 3. Once copias de la secuencia 5 -GATC3', que es el sitio de reconocimiento de la metilasa codificada por el gen dam. La Dam metilasa reconoce esta secuencia y metila la citosina. Al parecer el grado de metilacin es importante para la unin del DNA a la membrana de la bacteria.

El origen de replicacin en E. coli tiene 245 pb de longitud, tres secuencias casi idnticas repetidas en tndem y cuatro lugares de unin para la protena Dna A

En las bacterias existe un solo origen de replicacin, denominado Ori C, y a partir de este nico punto de origen, la replicacin progresa en dos direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicacin. El cromosoma bacteriano se denomina replicn, por ser una unidad de replicacin. La replicacin en bacterias se ajusta al modelo semiconservador.

El Ori C, origen de replicacin, en E. coli es una secuencia de 245 pb que contiene una secuencia de 13 pb, GATCTNTTNTTT, repetida tres veces en tndem. Adems, esta regin contiene cuatro zonas de unin (consenso TTATCCACA) para la protena DnaA, que se encarga de separar las hebras del DNA para comenzar la replicacin.

Iniciacin en Procariotes

Los eventos que ocurren en oriC tienen el orden siguiente: la protena DnaA se une secuencialmente a las secuencias de 9 nucletidos R1-R4, de manera que al oriC pueden quedar unidas de 10 a 20 molculas de DnaA. Este proceso requiere la hidrlisis del ATP y provoca dobleces de hasta 90 en el ADN. De esta forma, el ADN se enrolla alrededor del multmero de DnaA provocando la separacin de las 2 cadenas en la zona de 13 nucletidos ricos en AT que se abren de manera secuencial, primero, la ms cercana a R1 y despus las otras. En esas condiciones DnaA gua la translocacin, hacia la zona abierta, de un complejo formado por DnaB y DnaC, formando el llamado complejo de preiniciacin. En presencia de la ADN girasa (topoisomerasa II) y de SSB, la DnaB que posee actividad de helicasa 5' 3' procede a alargar la abertura del ADN, para lo cual requiere la hidrlisis del ATP. De esta manera queda formada una estructura en forma de burbuja u ojal, donde las hebras sencillas de DNA molde estn recubiertas por SSB. Los extremos del ojal forman las horquillas de replicacin; en cada una de las horquillas se inicia la replicacin de las dos hebras del DNA, y, como en la medida que avanza el proceso las horquillas se van separando, la replicacin toma carcter bidireccional

Replisoma
Una vez iniciada la replicacin bidireccional en el origen, los dos replisomas se mantienen unidos y anclados en un punto de la membrana interna de la bacteria, y el DNA sustrato es alimentado a travs de esta factora replicativa, cuyo conjunto ha sido muy adecuadamente llamado Replisoma. El punto de anclaje se encuentra en el centro de la alargada clula bacteriana.

mers son las frecuencias repetidas de 13 pb (repetidas 3 veces) y de 9 pb (repetidas 4 veces) que forman el sitio de iniciacin (OriC) para la replicacin de DNA

Copias mltiples (20-40) de la protena DnaA se fijan en los mers-9 del sitio de origen e inician la fusin (separacin de las cadenas del DNA) en los segmentos 13-mers. La protena DnaC acarrea a la protena DnaB (protena hexamrica con actividad de helicasa) para que se fije en cada una de las cadenas separadas del DNA en el oriC, formando el complejo de pre-iniciacin. La actividad de Helicasa de las molculas de la DnaB desenrollan el DNA en direcciones opuestas, formando las dos horquillas de replicacin.

Modelo del inicio de la replicacin en el origen, oriC, de E. coli.


(1) Alrededor de 20 molculas de la protena DnaA, cada una de ellas con un ATP ligado, se unen secuencialmente a las cuatro repeticiones de 9 pares de bases. El DNA se enrolla alrededor de este complejo. (2) Las tres repeticiones de 13 pares de bases ricas en A-T se desnaturalizan poco a poco de forma secuencial e inician la fusin del DNA. En ello participa la protena, tipo histona, HU (3) Hexmeros de protena DnaB (Helicasa) se unen a cada hebra con ayuda de la protena DnaC y de la hidrlisis de ATP. La actividad de Helicasa de la DnaB desenrolla an ms el DNA y forma las horquillas de replicacin como preparacin para el cebado y la sntesis de DNA.

Modelo de Replicacin en E. coli

DNA Pol III


A diferencia de lo que ocurre con la DNA Pol I, que slo debe aadir unos 5-10 nucletidos de los lugares en que se ha eliminado el cebador, es importante que la DNA Pol III s sea muy procesiva, y por esa razn suele formar parte de un complejo denominado holoenzima DNA Pol III que le da una mayor procesividad. Este complejo consta de diversas subunidades polipeptdicas encargadas cada una de una funcin, y que constituyen en su conjunto un dmero asimtrico: una mitad se encarga de la sntesis de la hebra adelantada y la otra mitad de la hebra rezagada.

HOLOENZIMA DNA POL III


El centro cataltico lo componen las subunidades que corresponden a dos copias de la DNA Pol III, la subunidad con actividad correctora exonucleasa 3' 5' y la subunidad cuya funcin podra ser la de ensamblar las otras dos; las subunidades mantienen la estructura dimrica; el complejo lo conforman las subunidades y cuya funcin es la de aumentar la procesividad de la DNA Pol III; la subunidad (abrazadera) sujeta la DNA Pol III al DNA y aumenta notablemente su procesividad.

El DNA molde y el DNA sintetizado en la cadena retrasada deben sufrir un plegamiento, de tal forma que la DNA polimerasa de las cadenas conductora y retrasada, en los procariotes, puedan funcionar como un complejo dimrico. De este modo las protenas de replicacin pueden utilizarse de manera armnica en la replicacin de ambas cadenas. Las topoisomerasas mantienen esta estructura y evitan que el DNA se superenrolle por delante de la horquilla de replicacin. Adems, existen unas protenas llamadas protenas de unin al DNA de hebra sencilla (SSB), que se fijan a la hebra de DNA; de esta manera protegen y estabilizan la forma monocatenaria de la hebra en replicacin, para que no se acople por complementariedad de bases con ella misma.

Selectividad de estructura. La fijacin de un desoxinucletido trifosfato (dNTP) a la polimerasa induce un cambio en la conformacin de la enzima que genera una estrecha bolsa donde cabr estrechamente el nuevo par de bases constituido por la nueva base y su base correspondiente en el molde de DNA. Tal modificacin conformacional slo es posible cuando el dNTP entrante puede formar un par de bases tipo Watson-Crick con su correspondiente base en el molde de DNA. Este mecanismo asegura la exactitud de la replicacin. Lectura de pruebas. La cadena creciente de polinucletidos abandona ocasionalmente el sitio activo de Polimerasa y migra al sitio con actividad de Exonucleasa. En dicho sitio, el ltimo nucletido agregado es suprimido por hidrlisis. Debido a que las bases mal apareadas inducen este traslado del sitio de polimerasa al sitio de exonucleasa, este proceso funciona como una manera, muy adecuada, de proveer una prueba de la exactitud de la secuencia de bases del DNA que esta siendo sintetizado.

(a) El replisoma del DNA de E. coli, contiene dos holoenzimas de la Pol III, y sintetiza tanto la hebra conductora como la hebra retrasada. El molde de la hebra retrasada debe formar un lazo para permitir que la holoenzima extienda la hebra retrasada, iniciada por el primosoma.

(b) La holoenzima Pol III libera el molde de la hebra retrasada cuando se encuentra con el fragmento de Okazaki previamente sintetizado. Ello probablemente sirve de seal para que el primosoma inicie la sntesis de un nuevo RNA cebador para la hebra retrasada.

(c) La holoenzima Pol III se une de nuevo al molde de la hebra retrasada y extiende el RNA cebador, formando un nuevo fragmento de Okazaki. Obsrvese que, en este modelo, la sntesis de la hebra conductora est siempre ms avanzada que la de la hebra retrasada

La Helicasa rompe los puentes de hidrgeno de la doble hlice permitiendo el avance de la horquilla de replicacin. La DNA Girasa (Topoisomerasa) impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido por la separacin de la doble hlice. Las protenas SSB se unen la hebra discontnua de ADN, impidiendo que sta se una consigo misma. La DNA Polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de forma discontnua en la hebra rezagada. La Primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la sntesis de la cadena complementaria a la cadena rezagada, junto con la Helicasa forma el Primosoma. La DNA Ligasa une los fragmentos de Okazaki.

En procariotes, la sntesis de las dos cadenas, conductora y retrasada, se encuentra coordinada, existiendo un replisoma que contiene un dmero activo formado por dos molculas de DNA pol III

DNA Replicacin. Alargamiento


El DNA de doble cadena en la horquilla de replicacin es desenrollado por la actividad de la Helicasa (generalmente la protena DnaB) La Topoisomerasa, DNA girasa, utiliza la hidrlisis del ATP para producir un desenrollamiento negativo del DNA justamente adelante de la horquilla, lo cual alivia el torque creado por la replicacin. Puesto que la cadena retrasada forma un asa antes de entrar al sitio activo de la Polimerasa III, tanto la cadena retrasada, como la conductora se mueven en la misma direccin. Segn la Helicasa progresa, se debe sintetizar un nuevo cebador en la cadena retrasada. Cuando se termina la sntesis de un fragmento de Okazaki, la Polimerasa libera la cadena. En ese momento el Primosoma sintetiza otro cebador y se inicia la sintesis de un nuevo fragmento de Okazaki. La Pol III se asocia nuevamente a la cadena retrasada justamente despus del nuevo cebador e inicia la sntesis de un nuevo fragmento de Okazaki. La Pol I y la DNA Ligasa, suprimen el cebador y cierran los huecos entre los segmentos de Okazaki.

Replicacin. Finalizacin.
La replicacin termina cuando la horquilla de replicacin

encuentra el extremo de la otra horquilla de replicacin que ha progresado en el cromosoma circular. Esto sucede en una regin llamada ter (t) de terminacin. La Regin ter est compuesta de dos secuencias de 20 pares de bases, invertida una con respecto a la otra y separadas entre s por un segmento de unas 20 pares de bases. Cada una de las secuencias ter impide la progresin de la horquilla de replicacin que progresa en sentido contrario cuando una protena de 36 kD, llamada de unin a ter (Tus), est ya fijada en esta regin del cromosoma. Este mecanismo asegura que el cromosoma sea replicado en su totalidad sin sobrereplicacin. La manera como se separan las dos hlices de DNA hijas no ha podido ser determinada, aunque se supone que est involucrada en el proceso la actividad de una Topoisomerasa IV