Catalogo Capacidades Es

Catlogo de Capacidades Cientfico Tcnicas
NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO
TABLA DE CONTENIDO
SI TRABAJAS CON GENES

ANLISIS DE EXPRESIN GNICA
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Anlisis de la actividad de promotores mediante genes reporteros ................................................. 10 Microarrays ........................................................................................................................................ 10 PCR cuantitativa a tiempo real .......................................................................................................... 11 Ensayos Run-On ................................................................................................................................. 12 Short interfering RNA/Small interfering RNA (siRNA) ....................................................................... 12 Microinyeccin de morfolinos ........................................................................................................... 13 Inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP y ChIP on Chip) ................................................................. 14 Northern-Blot .................................................................................................................................... 14 Southern-Blot .................................................................................................................................... 15 Primer Extension ........................................................................................................................... 15 Libreras de microRNA ................................................................................................................... 16
ANLISIS DE INTERACCIN PROTENA-DNA O PROTENA-RNA
1. Ensayos de cambio de movilidad electrofortica (Electrophoretic Mobility Shift Assay-EMSA/ Band Shift) 17 2. Huella gentica o Footprinting .......................................................................................................... 17
TRANSGNESIS GENMICA COMPARADA ANALISIS DE POLIMORFISMOS Y HAPLOTIPOS HIBRIDACIN IN SITU
SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS

MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS IN VITRO
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Modelo de adhesin leucocitaria en monocapas endoteliales ......................................................... 23 Modelo de migracin o extravasacin leucocitaria a travs de monocapas endoteliales ............... 23 Modelo de permeabilidad del endotelio ........................................................................................... 24 Modelo de formacin de angiotubos en matrigel ............................................................................. 24 Modelo de invasin en colgeno I ..................................................................................................... 25 Modelo de isquemia cerebral murina ............................................................................................... 25 Modelo de migracin celular y cierre de herida (Modelo in vitro de reendotelizacin) ................... 26 Modelo de diferenciacin de clulas dendrticas .............................................................................. 26 Modelo de activacin de linfocitos y estudio de la polarizacin de la respuesta inmune ................ 27
10. Modelo de generacin de sinapsis inmunolgica de presentacin antgeno y superantgeno dependientes .............................................................................................................................................. 27 11. Modelo de silenciamiento de ILK en clulas endoteliales ............................................................. 28
MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS IN VIVO
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.
Modelo de air-pouch de extravasacin o reclutamiento leucocitario ............................................... 29 Modelo de neovascularizacin .......................................................................................................... 29 Modelo de implantacin de matrigel subcutneo............................................................................. 30 Modelo de implantacin tumoral ...................................................................................................... 30 Modelo de retinopata isqumica ...................................................................................................... 31 Modelo de hipertrofia cardiaca en ratas inducida por hipertensin arterial sistmica .................... 31 Modelo de isquemia en extremidad inferior (Limb isquemia o ligacin de arteria femoral) ............ 31 Modelo de infarto de miocardio en ratn ......................................................................................... 32 Modelo de isquemia/reperfusin de miocardio en ratn ................................................................. 32 Modelos de generacin de transgnicos en pez cebra ................................................................. 33 Modelo de isquemia cerebral reversible murina .......................................................................... 33 Procedimiento para la generacin de modelos murinos de aneurismas de aorta abdominal ..... 34
13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.
Modelo murino de denudado de arteria aorta ............................................................................. 34 Modelos de peces cebra con alteraciones en el desarrollo cardiaco ............................................ 34 Modelo de activacin de linfocitos y estudio de la polarizacin de la respuesta inmune ............ 35 Modelos murinos para el estudio del envejecimiento de las clulas madre hematopoyticas.... 35 Modelo de edema en oreja de ratn ............................................................................................ 36 Modelo de induccin de endotoxemia por administracin de LPS o LPS/D-galactosamina ......... 36 Modelo murino de asma alrgico.................................................................................................. 37 Modelo murino de inflamacin aguda .......................................................................................... 37
DETECCIN ANATMICA DE RGANOS AISLAMIENTO DE RGANOS
SI TRABAJAS CON PROTENAS

EXPRESIN DE PROTENAS RECOMBINANTES
1. 2.
Expresin de protenas en bacterias.................................................................................................. 39 Expresin de protenas en eucariotas mediante sistemas virales ..................................................... 40
SEPARACIN DE PROTENAS
1. 2. 3.
Electroforesis bidimensional clsica (2D) .......................................................................................... 41 Electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) ................................................................ 41 Cromatografa de afinidad ................................................................................................................. 42
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE PROTENAS
1. Digestin enzimtica automatizada de protenas en gel para su identificacin por espectrometra de masas ..................................................................................................................................................... 43 2. 3. Determinacin de huella peptdica de masa mediante MALDI-TOF.................................................. 43 Determinacin de huella peptdica de fragmentacin mediante MALDI-TOF/TOF........................... 44
4. Anlisis de mezclas poco complejas de protenas mediante cromatografa lquida acoplada a trampa inica (nLC-MS/MS) ...................................................................................................................... 44 5. Secuenciacin de pptidos en disolucin mediante nanoSpray off-line ........................................... 45
6. Anlisis de mezclas complejas de protenas mediante cromatografa bidimensional acoplada a trampa inica (MudPIT) .............................................................................................................................. 46
DETERMINACIN DE MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES EN PROTENAS
1. Identificacin de modificaciones post-traduccionales mediante cromatografa lquida acoplada a trampa inica nLC-MS/MS ......................................................................................................................... 47 2. Identificacin de modificaciones post-traduccionales mediante cromatografa lquida conectada a trampa inica lineal conectada a un analizador de masas electrosttico de alta resolucin Orbitrap y fragmentacin ETD ..................................................................................................................................... 47 3. Anlisis de espectros de fragmentacin mediante espectrmetro de masas hbrido (triple cuadrupolo-trampa inica lineal) ............................................................................................................... 48
CUANTIFICACIN Y ANLISIS DE LA EXPRESIN DE PROTENAS
1. 2.
Electroforesis bidimensional diferencial en gel (Differential Gel Electrophoresis-2D-DIGE)............. 49 Marcaje isobrico diferencial (iTRAQ) ............................................................................................... 49
ANLISIS DE INTERACCIONES PROTENA-LIGANDO
1.
Co-Inmunoprecipitacin .................................................................................................................... 51
2. 3.
Ensayos Pull-Down............................................................................................................................. 51 Inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP y ChIP on Chip) ................................................................. 52
4. Ensayos de cambio de movilidad electrofortica (Electrophoretic Mobility Shift Assay-EMSA/ Band Shift) 53 5. Huella gentica o Footprinting .......................................................................................................... 53
TCNICAS INMUNOLGICAS
1. 2. 3.
Western-Blot...................................................................................................................................... 55 Western-Blot 2D ................................................................................................................................ 56 ELISA .................................................................................................................................................. 56
SI TRABAJAS CON CLULAS Y TEJIDOS

CULTIVOS CELULARES
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Cultivo celular en condiciones de normoxia (21% o2) e hipoxia (3% o2) .......................................... 58 Cultivo de progenitores linfohematopoyticos murinos y humanos ................................................ 58 Cultivo de larga duracin de mdula sea murina ............................................................................ 59 Cultivo de lneas y Cultivos primarios de clulas gliales murinos ...................................................... 59 Cultivo de endotelio de aorta de ratn ............................................................................................. 59 Cultivos de lneas y cultivos primarios de clulas endoteliales de aorta vaca ................................... 59 Cultivos de lneas y cultivos primarios de clulas endoteliales de cordn umbiilical humano (huvec) 60 Cultivos de lneas y cultivos primarios de hepatocitos de ratn ....................................................... 60
8.
9. Cultvos de lneas y cultivos primarios fibroblastos embrionarios de ratn (MEF: Mouse Embryonic Fibroblasts) ................................................................................................................................................. 60 10. 11. Cultivos primarios de clulas endoteliales de pulmn de ratn ................................................... 61 Cultivos primarios de clulas de msculo liso de ratn ................................................................ 61
12. Cultivos primarios de clulas madre hematopoyticas. subpoblaciones long-term, short-term y progenitoras ............................................................................................................................................... 61 13. 14. 15. 16. 17. Cultivos primarios de macrfagos peritoneales ............................................................................ 61 Cultivos primarios de clulas de mdula sea .............................................................................. 62 Cultivos celulares primarios de endotelio de vasculatura coronaria de ratn .............................. 62 Cultivos celulares inmortalizados de endotelio de pulmn de ratn ............................................ 62 Cultivos celulares inmortalizados de endotelio de vasculatura coronaria de ratn ..................... 62
SEPARACIN DE CLULAS
1.
Separacin de poblaciones celulares mediante citometra de flujo (cell sorting) ............................. 63
2. Aislamiento de clulas mediante catapultado por presin de lser (Laser Pressure Catapulting) en cultivo o de muestras procedentes de muestras de tejido ........................................................................ 64 3. 3. Separacin de clulas mediante mtodos inmunomagnticos ..................................................... 64
ANLISIS DE POBLACIONES CELULARES
1. 2.
Determinacin de parmetros estructurales y funcionales mediante citometra de flujo ............... 65 Inmunofenotipaje celular .................................................................................................................. 66
3. 4. 5. 6. 7.
Anlisis de proliferacin y ciclo celular .............................................................................................. 66 Anlisis de viabilidad celular .............................................................................................................. 67 Anlisis multiplexado ......................................................................................................................... 68 Anlisis de procesos de migracin celular ......................................................................................... 68 Rastreo de alto contenido (HCS) ........................................................................................................ 69
VEHICULIZACIN DE MOLCULAS AL INTERIOR CELULAR
1. 2. 3.
Microinyeccin de sustancias ............................................................................................................ 70 Transfeccin ....................................................................................................................................... 70 Vehiculizacin de frmacos al interior celular a travs de microesferas ........................................... 71
MICOSCOPA CONFOCAL Y MULTIFOTN
1. 2. 3. 4.
Localizacin intracelular de molculas .............................................................................................. 72 Obtencin de imgenes mediante microscopa de fluorescencia tradicional o confocal ................. 72 Anlisis de parmetros morfomtricos y de intensidad de fluorescencia de imgenes celulares .... 73 Adquisicin y Anlisis de imgenes en 3D y 4D ............................................................................. 74
SI TRABAJAS CON EMBRIONES

EMBRIONES DE RATN
1. 2. 3. 4.
Cultivo de embriones de ratn pre-implantacin ............................................................................. 75 Microinyeccin pronuclear de cigotos de ratn con soluciones de ADN .......................................... 75 Microinyeccin subzonal o perivitelina con lentivirus recombinantes ............................................. 76 Produccin de quimeras de ratn por agregacin de embriones con clulas madre embrionarias 77
5. Produccin de quimeras de ratn por microinyeccin de embriones de ocho clulas o blastocistos con clulas madre embrionarias ................................................................................................................ 78 6. 7. 8. 9. 10. Rederivacin de lneas de ratn por transferencia embrionaria ....................................................... 78 Fertilizacin in vitro (FIV) de ovocitos de ratn ................................................................................. 79 Inyeccin Intracitoplsmica de Esperma (ICSI) en ratn ................................................................... 80 Interrupcin de genes en clulas madre embrionarias de ratn ...................................................... 81 Criopreservacin de lneas de ratn ............................................................................................. 81
EMBRIONES DE POLLO
1. 2. 3. 4.
Embriologa experimental en embriones de pollo ............................................................................ 82 Manipulaciones del embrin de pollo ............................................................................................... 82 Aplicacin de molculas en embriones de pollo in ovo ..................................................................... 83 Electroporacin en embrin de pollo ................................................................................................ 83
EMBRIONES DE PEZ ZEBRA
1. 2. 3.
Microinyeccin de molculas en oocitos de pez cebra ..................................................................... 84 Generacin de peces cebra mosaicos ................................................................................................ 84 Hibridacin in situ de ARNm en embriones de pez cebra ................................................................. 84
SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA
SI TRABAJAS CON GENES

ANLISIS DE EXPRESIN GNICA
1. ANLISIS DE LA ACTIVIDAD DE PROMOTORES MEDIANTE GENES REPORTEROS
La actividad de un promotor puede medirse de diversas formas. En esta tcnica en particular, el promotor a analizar se fusiona a una secuencia que codifica para una protena (gen reportero) cuya actividad pueda ser fcilmente cuantificable. De esta forma, midiendo los niveles de la protena codificada por el gen reportero puede analizarse el nivel de actividad del promotor baja cuyo control se expresa. Dos de los casos ms frecuentes utilizan como gen reportero el gen que codifica para la protena luciferasa o para la protena verde fluorescente, cuyas actividades pueden medirse fcilmente ya que tienen como resultado la produccin de luz blanca o verde fluorescente respectivamente.
APLICACIN: Analizar la actividad de un promotor. DISPONIBLE EN: Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
2. MICROARRAYS
Consiste en inmovilizar molculas de ADN en un soporte fsico de manera que dichas molculas pueden ser identificadas utilizando las tcnicas adecuadas. Segn el tipo de anlisis que se quiera realizar, las molculas de ADN pueden tener distintas procedencias y pueden inmovilizarse de diferentes formas, dando lugar a diversos tipos de microarrays. El CNIC dispone de distintas plataformas tecnolgicas para el anlisis de microarrays de DNA, as como conocimiento para el tratamiento estadstico de los datos procedentes de cada una de ellas:
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- microarrays de Agilent Technologies - microarrays de Affymetrix
APLICACIN: Con esta tcnica puedes detectar si un determinado gen se expresa en una clula en unas condiciones determinadas y obtener informacin sobre l (su posicin en el genoma, su secuencia, su expresin diferencial en distintas situaciones, etc.) DISPONIBLE EN: Unidad de Genmica Responsable: Ana Dopazo Gonzlez
3. PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL
Consiste en realizar la amplificacin de una secuencia de cido nucleico por PCR y monitorizar la produccin de amplificados despus de cada ciclo de amplificacin mediante fluorescencia, gracias a la utilizacin de un fluorforo capaz de unirse al cido nucleico de doble cadena. De esta forma, tras cada ciclo de amplificacin se mide la fluorescencia y, en funcin del nmero de ciclos de amplificacin necesarios para detectar la fluorescencia del producto amplificado, puede determinarse la cantidad de partida del producto.
APLICACIN: Esta tcnica tiene mltiples aplicaciones. Con ella podrs saber la cantidad de cidos nucleicos o de un gen determinado que hay en una muestra. DISPONIBLE EN: Unidad de Genmica Responsable: Ana Dopazo Gonzlez Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez
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Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn
4. ENSAYOS RUN-ON
Esta tcnica permite analizar qu genes estn siendo expresados en una clula en un momento determinado. Se basa en que cuando se extrae el ncleo intacto, la trascripcin del DNA que se est llevando a cabo queda paralizada al eliminarse los ribonucletidos. Dicha transcripcin puede reiniciarse in vitro aadiendo nuevamente ribonucletidos para detectar el mRNA de los genes que estaban siendo transcritos en el momento del lisado.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs averiguar qu genes se estn expresando en la clula en un momento determinado. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez
5. SHORT INTERFERING RNA/SMALL INTERFERING RNA (SIRNA)
La interferencia por RNA es un mecanismo de control de la expresin gnica que permite el bloqueo selectivo de la expresin de genes especficos. Es necesario disponer de fragmentos de RNA de entre 19 y 22 nucletidos y con una secuencia homloga a la del gen cuya expresin se desea silenciar. Estos fragmentos de RNA, denominados RNA interferentes pequeos (siRNA), pueden emparejar por complementariedad con el mRNA del gen que se quiere silenciar y al hacerlo, las molculas de doble
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cadena resultantes entre el mRNA y los fragmentos de siRNA son degradados por nucleasas celulares, de forma que el trascrito del gen es eliminado y su expresin paralizada.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs inhibir la expresin de un gen cuya secuencia conozcas, al menos parcialmente. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Sealizacin Celular Responsable: Kenneth McCreath Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
6. MICROINYECCIN DE MORFOLINOS
Los morfolinos son oligonucletidos antisentido en cuya estructura molecular el anillo de azcar se ha sustituido por un anillo de morfolina, para conferirles ms estabilidad. Su secuencia es complementaria a la de un mRNA al que se puede unir bloqueando su traduccin o splicing. Por lo tanto, el uso de morfolinos permite bloquear la expresin de un gen particular a nivel del bloqueo de la traduccin de su mRNA o a nivel del bloqueo de su splicing correcto.
APLICACIN: Estudiar la expresin de un gen concreto mediante el bloqueo de la sntesis de la protena para la cual codifica a nivel de la traduccin del RNAm. En concreto, se utiliza la microinyeccin de morfolinos en pez cebra para el anlisis y bsqueda de nuevos genes con efectos en angiogsesis. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Desarrollo de la Vasculatura Coronaria en Pez Cebra Responsable: Nadia Mercader
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7. INMUNOPRECIPITACIN DE CROMATINA (CHIP Y CHIP ON CHIP)
La Inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP, Chromatine Inmunoprecipitation) consiste en el aislamiento, mediante anticuerpos especficos contra un factor nuclear, de las secuencias genmicas asociadas al mismo, tras la estabilizacin covalente de los contactos protena-DNA y la fragmentacin de la cromatina. El DNA co-precipitado con el factor nuclear es analizado para identificar la secuencia a la que estaba unido dicho factor. El mtodo de anlisis ms corriente es la amplificacin por PCR con oligonucletidos especficos del DNA inmunoprecipitado. Esta aproximacin requiere un conocimiento previo de la secuencia de DNA de forma que su utilidad es limitada para el estudio de las secuencias desconocidas a las que se une protena determinada. Esta limitacin ha sido resuelta mediante aproximaciones genmicas gracias la hibridacin del DNA precipitado sobre microarrays genmicos. Es lo que se denomina tecnologa ChIP on-Chip.
APLICACIN: La inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP) permite determinar si un factor de transcripcin est unido a su diana en el genoma en una situacin concreta. Adems, utilizando la tcnica de ChIp on Chip se pueden identificar secuencias de unin desconocidas para un factor de transcripcin. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
8. NORTHERN-BLOT
Consiste en separar una muestra de RNA (normalmente RNA mensajero) mediante electroforesis en gel, para posteriormente transferir los fragmentos separados a una membrana de nitrocelulosa donde sern inmovilizados. Esa membrana se pone en contacto con una sonda de DNA o RNA que reconozca una secuencia de inters, de forma que se fijar all donde sta se site.
APLICACIN: Podrs detectar la presencia de un RNA de inters en una muestra siempre que dispongas de una sonda adecuada. La aplicacin ms habitual es averiguar si un gen determinado est siendo expresado en un momento concreto o en un tipo celular particular mediante la deteccin de su RNA mensajero.
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DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
9. SOUTHERN-BLOT
Consiste en separar una muestra de DNA (por ejemplo, procedente de una digestin con una enzima concreta) mediante electroforesis en gel para posteriormente transferir los fragmentos de DNA separados y desnaturalizados (es decir, en forma de una sola cadena y no de doble hlice) a una membrana de nitrocelulosa donde sern inmovilizados. Esa membrana se pone en contacto con una sonda de DNA o RNA que reconozca una secuencia de inters de forma que se fijar all donde sta se site.
APLICACIN: Podrs detectar la presencia de un gen o secuencia de DNA de inters en una muestra siempre que dispongas de una sonda adecuada. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
10. PRIMER EXTENSION
Consiste en generar una molcula de cDNA utilizando como molde una molcula de RNAm mediante una transcriptasa reversa de tal forma que la transcripcin se realice sobre la molcula de RNAm a partir de un pequeo oligonucletido (Primer) complementario. El transcrito generado ser el equivalente al gen original a partir del cual se gener el RNAm y su secuenciacin permitir determinar exactamente cual el inicio de la transcripcin del citado gen. Adems, en funcin de las condiciones en la que se realice la retrotranscripcin, la cantidad de cDNA generada puede relacionarse directamente con los niveles de RNAm originales y por lo tanto indicar los niveles de expresin del gen a partir del cual se gener.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs determinar en qu punto comienza la transcripcin de un gen concreto, lo cual adems te facilitar la identificacin de la zona promotora. Tambin podrs medir la cantidad de un transcrito particular.
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11. LIBRERAS DE MICRORNA
Los microRNAs (miRNA) son molculas de RNA de doble cadena de 22 nucletidos, que regulan la expresin gnica a nivel post-transcripcional. Los microRNAs son transcritos de DNA pero no traducidos a protena, es decir, son molculas de RNA no codificante, que se encuentran en regiones no codificantes del genoma. Estas molculas son parcialmente complementarias a uno o ms mRNAs reprimiendo as su traduccin. Los microRNAs juegan un papel importante en varios procesos biolgicos como apoptosis, proliferacin, diferenciacin o desarrollo celular. La funcin de estos microRNAs puede estudiarse in vitro y, mediante tcnicas de biologa molecular, construirse una librera o coleccin de estas molculas de donde poder aislarlas posteriormente para su uso.
APLICACIN: Estas libreras de miRNA pueden ser utilizadas para estudiar si la expresin de un gen de inters est regulada en la clula a nivel de miRNA. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez
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SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE INTERACC IN PROTE NA -DNA O PROTENA RNA
ANLISIS DE INTERACCIN PROTENA-DNA O PROTENA-RNA
1. ENSAYOS DE CAMBIO DE MOVILIDAD ELECTROFORTICA (ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY-EMSA/ BAND SHIFT)
Es una tcnica que permite analizar las interacciones protena-cido nucleico (DNA o RNA). La tcnica se basa en el hecho de que la capacidad de migracin de una molcula de cido nucleico en un gel de electroforesis se ve modificada cuando esta molcula est unida a una o varias protenas. De esta forma, cuando a un fragmento de ADN se migra en un gel de electroforesis en compaa de una protena que es capaz de unirse a l, lo hace a una velocidad menor a la que lo hara en ausencia de dicha protena.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs determinar si una protena concreta es capaz de unirse por s sola o con otras protenas a una secuencia de DNA o RNA particular. Tambin podrs saber si en una mezcla de protenas hay alguna capaz de unirse a una secuencia de DNA o RNA particular. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
2. HUELLA GENTICA O FOOTPRINTING
Esta tcnica consiste en determinar la secuencia de DNA exacta a la que es capaz de unirse una protena concreta. La determinacin se basa en el hecho de que una protena, cuando est unida a una secuencia del DNA, protege a dicha secuencia de ser cortada por un enzima capaz de cortar molculas de DNA como por ejemplo la DNAsa I. Tras un tratamiento DNAsa I de un DNA al cual se encuentra unido una protena y la separacin por electroforesis en gel de los fragmentos de la digestin, se observar que hay una serie de fragmentos de digestin que no se han producido como resultado de la unin de la protena. Comparando estos fragmentos de digestin con los de la digestin del mismo DNA en ausencia
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SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE INTERACC IN PROTE NA -DNA O PROTENA RNA
de unin a la protena, puede determinarse la secuencia a la que corresponden los fragmentos de digestin ausentes y por lo tanto la secuencia del DNA donde se encontraba unida la protena.
APLICACIN: Con esta tcnica se puede saber a qu secuencia exacta del DNA se une una protena de tu inters. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
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SI TRABAJAS CON GENE S TRA NSGNESIS
TRANSGNESIS
La transgnesis es el conjunto de tcnicas por las que se obtienen organismos genticamente modificados. stos se consiguen introduciendo molculas de ADN exgeno (transgn) en el genoma del organismo multicelular a modificar. As se obtienen bien lneas estables, si el transgn se mantiene estable de forma hereditaria y afecta a todas las clulas del organismo, bien transgnesis transitorias, en los casos en los que el transgn no se integra de forma estable o en la lnea germinal. Existen mltiples herramientas para integrar transgenes en clulas. Para ms informacin puedes visitar la seccin de Si trabajas con embriones de este catlogo. Ah encontraras en detalle diferentes mtodos y aplicaciones de la transgnesis.
APLICACIN: Con esta tcnica pueden integrarse fragmentos de DNA en el genoma de una clula u organismo para generar, por ejemplo, animales transgnicos, que expresen o carezcan de la expresin de un determinado gen. DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Genmica Funcional de la Pluripotencia Embrionaria y del Desarrollo del Corazn Responsable: Miguel Manzanares
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SI TRABAJAS CON GENE S GE NMICA COMPARADA
GENMICA COMPARADA
La genmica comparada es el estudio de las relaciones entre los genomas de diferentes especies, de manera que una vez secuenciados se comparan sus estructuras utilizando como herramienta la bioinformtica. La genmica comparada presupone que los elementos del genoma responsables de similitudes entre diferentes especies se conservarn a lo largo del tiempo, as como los elementos que son importantes para el xito evolutivo de los organismos.
APLICACIN: Utilizando esta tcnica pueden localizarse regiones conservadas del genoma que no codifican para ninguna protena y que, por tanto, deben tener alguna funcin importante, seguramente como reguladores funcionales. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Genmica Funcional de la Pluripotencia Embrionaria y del Desarrollo del Corazn Responsable: Miguel Manzanares
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SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE POLI MORF ISMOS Y HA PLOTIPOS
ANALISIS DE POLIMORFISMOS Y HAPLOTIPOS
El polimorfismo gentico se refiere a la existencia de variaciones en la secuencia de una regin determinada del ADN entre diferentes individuos en una poblacin. Por ejemplo, en el caso de un gen particular, los diferentes alelos del locus que codifica para ese gen constituyen diferentes polimorfismos del mismo. Por su parte, el haplotipo se define como la combinacin particular de alelos presentes en una regin del genoma y que se transmiten juntos.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs identificar diferentes variantes de un gen concreto o relacionar dos muestras por la presencia de haplotipos similares. Otra aplicacin de esta tcnica es la de relacionar determinados polimorfismos o haplotipos con una patologa concreta de forma que stos puedan ser utilizados como marcadores de la presencia de dicha patologa. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
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SI TRABAJAS CON GENE S HI BRIDACIN I N SITU
HIBRIDACIN IN SITU
La tcnica de hibridacin in situ se basa en la capacidad que tienen los fragmentos de cido nucleico de cadena sencilla de unirse a otros fragmentos de cido nucleico de cadena sencilla cuya secuencia sea complementaria. Este proceso de hibridacin puede hacerse de diferentes formas como en cortes de tejidos o en embriones, denominndose en este caso, hibridacin in situ en whole mount. Este proceso consiste en utilizar un fragmento de cido nucleico (sonda de ARN) para identificar la presencia en las clulas o tejidos de la correspondiente secuencia complementaria. En funcin del mtodo de marcaje del fragmento utilizado para la hibridacin, el resultado puede visualizarse por diferentes mtodos, siendo el ms habitual en biologa del desarrollo la obtencin de un precipitado coloreado.
APLICACIN: Con esta tcnica se analizar la expresin de un gen concreto si lo que utilizas es un fragmento de cido nucleico capaz de hibridar con la cadena de RNA mensajero correspondiente. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Papel de Nuevos Genes en el Desarrollo Cardiovascular Responsable: Juan Jos Sanz-Ezquerro
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SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOL GIC OS MODELOS DE PROCESOS BIOL GIC OS IN VIT RO
SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS

MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS IN VITRO
1. MODELO DE ADHESIN LEUCOCITARIA EN MONOCAPAS ENDOTELIALES
Este modelo permite estudiar la adhesin de los leucocitos a la superficie de las clulas endoteliales. Para ello se marcan clulas linfoides con sonda fluorescente y se incuban con una monocapa de clulas endoteliales estimuladas y tratadas segn el diseo del experimento.
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
2. MODELO DE MIGRACIN O EXTRAVASACIN LEUCOCITARIA A TRAVS DE MONOCAPAS ENDOTELIALES
Este modelo consiste en tapizar un transwell con clulas endoteliales de tal forma que stas formen una monocapa que imite la del endotelio. Cuando la monocapa est confluente se aaden leucocitos en el compartimento superior del transwell. Aadiendo los estmulos a estudiar puede analizarse cmo esos leucocitos son capaces de migrar y atravesar la capa de clulas endoteliales, imitando el proceso de migracin que tiene lugar desde el torrente sanguneo a los tejidos afectados durante un proceso inflamatorio. Este modelo puede realizarse utilizando un sistema de flujo laminar conectado al transwell y que imite la presin sangunea habitual para mimetizar an ms las condiciones fisiolgicas. La migracin de los leucocitos puede analizarse por citometra de flujo o incluso pueden adquirirse imgenes o vdeos a tiempo real mediante microscopia de contraste de fase.
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DISPONIBLE EN:
Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
3. MODELO DE PERMEABILIDAD DEL ENDOTELIO
Este modelo consiste en tapizar un transwell con clulas endoteliales de tal forma que stas formen una monocapa que imite la del endotelio. Cuando la monocapa est confluente se aaden en la parte superior del transwell polmeros de dextrano de diferentes pesos moleculares marcados con isotiocionato de fluorescena (FITC). Posteriormente puede analizarse por fluorometra el paso de los dextranos a travs de la capa de clulas endoteliales en respuesta a diferentes estmulos o sustancias, indicando cmo stos afectan a la permeabilidad de dicha capa.
DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
4. MODELO DE FORMACIN DE ANGIOTUBOS EN MATRIGEL
Se utiliza la matriz proangiognica comercial Matrigel de BD Biosciences sobre la que se siembran clulas endoteliales. Estas clulas son capaces de formar estructuras tubulares, fcilmente cuantificables, en respuesta a diversos estmulos. Este modelo permite cuantificar la capacidad de formacin de tubos, es decir, de angiognesis in vitro de las clulas en cuestin.
DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
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Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
5. MODELO DE INVASIN EN COLGENO I
Se emplea una solucin de Colgeno tipo I sobre la que se siembran clulas endoteliales. Al cabo de 24 horas se cuantifica el nmero de clulas que han invadido la matriz de colgeno, que depender del estmulo aadido.
DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
6. MODELO DE ISQUEMIA CEREBRAL MURINA
Modelo creado a partir de cultivos de clulas gliales, que son sometidas a una deplecin de glucosa y condiciones de hipoxia, que mimetizan las condiciones sufridas tras un proceso de isquemia. Este modelo in vitro permite mimetizar de forma controlada y reproducible las condiciones sufridas por las clulas gliales tras un episodio de isquemia y facilita el anlisis a nivel celular y molecular de las consecuencias fisiopatolgicas de dicho episodio.
DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
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7. MODELO DE MIGRACIN CELULAR Y CIERRE DE HERIDA (MODELO IN VITRO DE REENDOTELIZACIN)
Modelo creado mediante el cultivo de clulas endoteliales de ratn, vaca o humanas que permite analizar in vitro el proceso de migracin de clulas endoteliales. Para ello, se parte de una monocapa confluente de clulas endoteliales que se daa mecnicamente con un rascador de tamao conocido creando una zona carente de clulas. Posteriormente, se analiza cmo y en respuesta a qu seales las clulas endoteliales que circundan el rea daada migran para volver a cubrirla, es decir, cmo se produce el proceso de reendotelizacin.
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
8. MODELO DE DIFERENCIACIN DE CLULAS DENDRTICAS
Las clulas dendrticas (DCs) son clulas del sistema inmune que provienen de clulas precursoras circulantes en sangre (precursores hemotopoyticos). Pueden fagocitar virus, bacterias u otros microorganismos y presentrselos, en la superficie de sus membranas unidos al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), a los linfocitos T. El mtodo de diferenciacin de clulas dendrticas consiste en cultivar sus precursores, obtenidos de mdula sea, en medio completo suplementado con las citoquinas implicadas en la diferenciacin de estas clulas. Dependiendo de las citoquinas que se utilizan para la generacin in vitro de DCs, pueden obtenerse las dos subpoblaciones principales de DCs descritas: DCs plasmacitoides o bien DCs convencionales.
APLICACIN: Teniendo en cuenta que la proporcin de DCs en el organismo es muy baja en condiciones fisiolgicas, la ventaja de este mtodo es que permite obtener un nmero elevado de DCs, que sern utilizadas posteriormente en diferentes ensayos como ensayos de induccin de activacin de linfocitos T antgeno-especficos, para analizar el papel de estas clulas presentadoras de antgeno en la regulacin de respuestas inmunes adaptativas.
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DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
9. MODELO DE ACTIVACIN DE LINFOCITOS Y ESTUDIO DE LA POLARIZACIN DE LA RESPUESTA INMUNE
Para estudiar la respuesta inmune frente a un antgeno, se activan linfocitos T CD4+ mediante co-cultivo in vitro con clulas dendrticas (diferenciadas previamente in vitro) presentadoras del antgeno especfico. Los linfocitos T CD4+ proceden de ratones transgnicos en los que todas las clulas T CD4+ expresan un TCR que reconoce especficamente el antgeno de inters. Una vez realizado el co-cultivo in vitro, se analiza la diferenciacin de los linfocitos T a clulas efectoras o reguladoras, mediante el anlisis de diferentes parmetros como la expresin en membrana de molculas implicadas en la activacin de linfocitos T, la expresin de factores de transcripcin implicados en diferenciacin de clulas T reguladoras, o la produccin de citoquinas. Estos anlisis se realizan mediante tcnicas convencionales de biologa molecular como citometra de flujo, o mtodo ELISA.
APLICACIN: Este modelo puede utilizarse para estudiar in vitro el tipo de respuesta inmune que desencadena un antgeno de inters. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
10. MODELO DE GENERACIN DE SINAPSIS INMUNOLGICA DE PRESENTACIN ANTGENO Y SUPERANTGENO DEPENDIENTES
La sinapsis inmunolgica es la estructura molecular que se establece entre las superficies de una clula dendrtica presentadora de antgeno (APC) y un linfocito T, para el reconocimiento de un agente patgeno, desencadenndose una respuesta inmune apropiada. El anlisis de la estructura molecular y de la funcionalidad de la conformacin de la sinapsis inmunolgica puede estudiarse en determinados modelos tanto humanos como murinos, en los que se emplean clulas dendrticas humanas o de ratn preincubadas con un antgeno y linfocitos T CD4+ humanos o de ratn. Las clulas dendrticas y los linfocitos T CD4+ se co-cultivan in vitro, promoviendo
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as la diferenciacin de los linfocitos T vrgenes hacia sus diferentes linajes: Th1, Th2, Treg, Th17 y Tfh. Posteriormente se analizan los diferentes conjugados T-APC formados mediante microscopa confocal para determina las estructuras de estas sinapsis establecidas. El anlisis funcional se estudia mediante tcnicas de citometra, ELISA, etc.
APLICACIN: Generacin de modelos humanos y murinos de presentacin antgeno y superantgeno dependientes para el estudio de la conformacin de la sinapsis inmunolgica. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
11. MODELO DE SILENCIAMIENTO DE ILK EN CLULAS ENDOTELIALES
ILK es una serina-treonina quinasa que regula rutas de sealizacin esenciales en clulas endoteliales para el correcto desarrollo y funcionamiento del sistema vascular. Este modelo in vitro permite silenciar ILK de clulas endoteliales de ratn, bien a travs de infeccin con adenovirus o bien por eliminacin de ILK por siRNA.
APLICACIN: Este modelo permite estudiar in vitro la funcin de ILK en el correcto desarrollo y funcionamiento del sistema vascular tanto en procesos fisiolgicos como en situaciones patolgicas (cicatrizacin de heridas, angiognesis, inflamacin y aterosclerosis). DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
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SI TRABAJAS CON MODELOS DE P ROCESOS BIOL GICOS MODELOS DE PROCESOS BIOL GIC OS IN VIV O
MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS IN VIVO
1. MODELO DE AIR-POUCH DE EXTRAVASACIN O RECLUTAMIENTO LEUCOCITARIO
Este modelo se basa en la creacin de una cmara de aire en un lugar de fcil acceso en el cuerpo de un ratn (por ejemplo en la espalda). Esta cmara proporciona un espacio controlado donde realizar estudios in vivo en el ratn. Por ejemplo, este modelo es til para estudiar el proceso de reclutamiento leucocitario en respuesta a un estmulo o sustancia concreta. Tras la inyeccin en la cmara de aire de la sustancia estimulante se produce la migracin de los leucocitos circulantes a la cmara de aire. Finalmente, esta cmara puede ser lavada con una solucin o bien extrada quirrgicamente para analizar su contenido y aislar los leucocitos presentes en ella.
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Metaloproteinasas de Matriz en Angiognesis e Inflamacin Responsable: Alicia Garca Arroyo
2. MODELO DE NEOVASCULARIZACIN
Se forman precipitados de hidrn-sucralfato de aproximadamente 1l que contengan 50ng/precipitado de bFGF o 100ng/precipitado de VEGF. Los precipitados se introducen en un bolsillo generado mediante ciruga en la crnea de ratones C57/BL6 a una distancia de entre 0,5 y 1mm del limbo esclerocorneal. La neovascularizacin se observa a partir del da 5 tras la operacin. Se considera respuesta positiva un desarrollo evidente de vasos desde el limbo esclerocorneal hacia el implante. La eficacia de los vectores virales para interferir con el proceso de angiognesis en crnea ha sido previamente documentada y permite analizar la implicacin de protenas en el proceso de neovascularizacin.
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3. MODELO DE IMPLANTACIN DE MATRIGEL SUBCUTNEO
Se utiliza la matriz proangiognica comercial Matrigel GFR de BD Biosciences fra complementada con 250 ng/ml VEGF. Se inyectan 400 l de la solucin subcutneamente en la zona media torcica o media abdominal de ratones C57/BL6. Entre el da 8 y 14, los implantes de Matrigel se extraen, y se cuantifica el grado de vascularizacin del implante mediante tincin de los vasos con anti-CD31 o por cuantificacin del contenido de hemoglobina. Este modelo permite realizar ensayos de angiognesis in vivo en ratn.
DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Metaloproteinasas de Matriz en Angiognesis e Inflamacin Responsable: Alicia Garca Arroyo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
4. MODELO DE IMPLANTACIN TUMORAL
En ratones inmunodeprimidos se inyectan intradrmicamente clulas tumorales que, al cabo del tiempo, comienzan a desarrollar una masa tumoral. Estos tumores pueden medirse usando un calibre, de forma que el seguimiento del tamao del tumor en respuesta a un tratamiento determinado permite evaluar la efectividad de dicho tratamiento.
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5. MODELO DE RETINOPATA ISQUMICA
Consiste en introducir ratones C57/BL6 de 7 das de edad en una cmara estanca con una concentracin de oxgeno del 75%. Tras 5 das se sacan de la cmara y se mantienen otros 5 das en una concentracin normal de oxgeno, lo que desencadena el proceso de neovascularizacin en la retina. Posteriormente se sacrifican los ratones y se analizar el grado y patrn de vascularizacin de las retinas.
6. MODELO DE HIPERTROFIA CARDIACA EN RATAS INDUCIDA POR HIPERTENSIN ARTERIAL SISTMICA
Se usa el modelo de rata espontneamente hipertensa (SHR) utilizando las ratas Wystar-Kyoto como control normal. Las SHR desarrollan hipertensin arterial de forma espontnea al llegar a la edad adulta (aproximadamente 6 semanas de vida), mostrando de forma casi invariable hipertrofia ventricular izquierda a las 12 semanas.
DISPONIBLE EN:
Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
7. MODELO DE ISQUEMIA EN EXTREMIDAD INFERIOR (LIMB ISQUEMIA O LIGACIN DE ARTERIA FEMORAL)
Modelo creado mediante ligacin de la arteria femoral. Este modelo se puede utilizar para el estudio de la fisiopatologa isqumica y en concreto, puede utilizarse para el anlisis de nuevas molculas Pro/anti angiognicas mediante electroporacin in vivo o para analizar la supervivencia celular.
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8. MODELO DE INFARTO DE MIOCARDIO EN RATN
Existen actualmente dos modelos de infarto de miocardio con diferentes caractersticas y, por lo tanto, distintas aplicaciones. Por un lado, un modelo en el que el infarto de miocardio es generado mediante ligacin de arteria coronaria izquierda. Este modelo podra considerarse como un modelo de infarto de miocardio clsico en el que ensayar la fisiopatologa asociada comnmente a esta patologa. Por otro laso, un modelo en el que el infarto de miocardio es generado mediante la congelacin de una zona concreta del corazn (el ventrculo izquierdo) por contacto localizado con una sonda a muy baja temperatura. Este modelo, denominado de crioinfarto, tiene como resultado una patologa menos severa que el modelo de infarto clsico y por lo tanto puede ser ms adecuado para estudiar determinados aspectos relacionados con esta patologa como, por ejemplo, los mecanismos moleculares y celulares relacionados con la recuperacin celular tras el episodio de infarto.
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza
9. MODELO DE ISQUEMIA/REPERFUSIN DE MIOCARDIO EN RATN
Modelo creado mediante ligacin temporal de la arteria coronaria izquierda. Este modelo permite crear un episodio de infarto con una duracin determinada mediante la ligacin de la arteria coronaria izquierda. Dicha ligacin puede revertirse tras el periodo deseado y, por lo tanto, regresar a una situacin fisiolgica normal. Este modelo es especialmente til para el estudio de los mecanismos moleculares y celulares implicados en la respuesta de las clulas de tejido infartado y circundantes al episodio de infarto y, en concreto, para determinar cules son aquellos mecanismos implicados en la recuperacin del tejido infartado.
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10. MODELOS DE GENERACIN DE TRANSGNICOS EN PEZ CEBRA
Se dispone de dos modelos diferentes para generar transgnicos en pez cebra que incorporen un gen de inters bajo la expresin de un promotor especfico de un tejido concreto. Por un lado, el modelo que utiliza la nucleasa Sc1, que permite la insercin al azar en el genoma del gen de inters. Por otro lado, el modelo que utiliza el transposn Tol2, que permite que la insercin se realice siempre en los sitios diana para dicho transposn en el genoma del pez cebra.
11. MODELO DE ISQUEMIA CEREBRAL REVERSIBLE MURINA
Modelo creado mediante la oclusin de la arteria cerebral media (MCAO) tanto en rata como en ratn. La oclusin se realiza para generar la isquemia y puede ser revertida para controlar el tiempo de isquemia mimetizando el proceso de isquemia/reperfusin que tiene lugar en los pacientes isqumicos. El modelo es especialmente til para poder estudiar los procesos fisiopatolgicos que tienen lugar en las clulas presentes en la zona de penumbra tras la isquemia y analizar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a dichos procesos.
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12. PROCEDIMIENTO PARA LA GENERACIN DE MODELOS MURINOS DE ANEURISMAS DE AORTA ABDOMINAL
Procedimiento quirrgico para la creacin de modelos in vivo de ratn de aneurismas de aorta abdominal. El aneurisma se genera mediante la inyeccin de elastasa en la aorta abdominal. El modelo permite el estudio a nivel celular y molecular del proceso de aneurisma en la aorta abdominal y es especialmente til para realizar ensayos funcionales in vivo de biologa vascular
DISPONIBLE EN: Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza
13. MODELO MURINO DE DENUDADO DE ARTERIA AORTA
Este modelo se genera quirrgicamente. Para ello, se introduce una cnula por va femoral hasta el corazn del ratn y mediante friccin se elimina todo el recubrimiento interno endotelial de la aorta. El modelo es especialmente til para el anlisis de los mecanismos implicados en la migracin de las clulas progenitoras endoteliales para la generacin de nuevo endotelio en las zonas afectadas.
DISPONIBLE EN: Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza
14. MODELOS DE PECES CEBRA CON ALTERACIONES EN EL DESARROLLO CARDIACO
Varios modelos de pez cebra que contienen diferentes mutaciones que afectan a diferentes receptores implicados en el desarrollo cardiaco, ofrecen la oportunidad de analizar el efecto que sobre las diferentes alteraciones del desarrollo cardiaco tienen otras protenas o sustancias de inters.
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DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Desarrollo de la Vasculatura Coronaria en Pez Cebra Responsable: Nadia Mercader
15. MODELO DE ACTIVACIN DE LINFOCITOS Y ESTUDIO DE LA POLARIZACIN DE LA RESPUESTA INMUNE
Para estudiar la respuesta inmune frente a un antgeno, se realiza una inyeccin subcutnea de clulas dendrticas preincubadas con el antgeno especfico y posteriormente se inyectan por va intravenosa linfocitos T CD4+. Posteriormente se analiza la activacin de estos linfocitos. Los linfocitos T CD4+ proceden de ratones transgnicos en los que todas las clulas T CD4+ expresan un TCR que reconoce especficamente el antgeno de inters.
Una vez realizada la activacin de los linfocitos T CD4+ por las clulas dendrticas presentadoras de antgeno, se analiza su diferenciacin a clulas efectoras o reguladoras mediante el anlisis de diferentes parmetros, como la expresin en membrana de molculas implicadas en la activacin de linfocitos T, la expresin de factores de transcripcin implicados en diferenciacin de clulas T reguladoras, o la produccin de citoquinas. Estos anlisis se realizan mediante tcnicas convencionales de biologa molecular como citometra de flujo, o mtodo ELISA.
APLICACIN: Este modelo puede utilizarse para estudiar el tipo de respuesta inmune que desencadena un antgeno de inters. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
16. MODELOS MURINOS PARA EL ESTUDIO DEL ENVEJECIMIENTO DE LAS CLULAS MADRE HEMATOPOYTICAS
Modelos murinos que presentan diferentes deleciones en el locus INK4-ARF para el estudio del envejecimiento en clulas madre hematopoyticas. Estas deleciones conllevan al silenciamiento del locus INK4-ARF. A travs de un transplante seriado se mide envejecimiento de las clulas hematopoyticas tanto de individuos jvenes como viejos.
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DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez
17. MODELO DE EDEMA EN OREJA DE RATN
La generacin de este modelo consiste en la administracin de la sustancia txica TPA (13 acetato de 12tetradecanoilforbol) en la oreja de los ratones, lo que pone en marcha una respuesta inflamatoria que conlleva al hinchamiento de la oreja (edema). Se determina la inflamacin que se ha producido por diferencia de peso entre las orejas tratadas y no tratadas, y se llevan a cabo cortes de secciones idnticas de oreja, en las que se determina la actividad mieloperoxidasa, que es un ndice del grado de infiltracin de neutrfilos, ya que la mieloperoxidasa es la protena ms abundante en los neutrfilos y la nica peroxidasa que cataliza la conversin del perxido de hidrgeno y cloruro a cido hipocloroso. ste es un potente agente oxidante que contribuye al mecanismo de defensa contra los agentes infecciosos.
APLICACIN: Modelo in vivo de induccin de inflamacin. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
18. MODELO DE INDUCCIN DE ENDOTOXEMIA POR ADMINISTRACIN DE LPS O LPS/D-GALACTOSAMINA
Modelo en el que se administra endotoxinas, normalmente lipopolisacridos (LPS), induciendo una respuesta inflamatoria generalizada que cursa con elevacin de citoquinas proinflamatorias (TNF-alfa, IL-6). La administracin de LPS es capaz de inducir por s solo este efecto, pero en ocasiones se administra conjuntamente con D-galactosamina, porque sta incrementa la potencia del LPS entre 100 y 1000 veces, cursando adems con dao heptico.
Aplicacin: Se trata de un modelo in vivo de induccin de inflamacin, por lo que puede utilizarse para estudiar deficiencias en los procesos inflamatorios o sensibilidad a patgenos. Normalmente se llevan a cabo curvas de supervivencia y se determinan los niveles de citoquinas proinflamatorias en los sueros de los animales. Adems se puede extraer los tejidos para que sean analizados histolgicamente.
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19. MODELO MURINO DE ASMA ALRGICO
Este modelo consiste en la induccin del desarrollo de asma en ratn, generando una reaccin alrgica a la albmina del pollo u Ovoalbmina (OVA). Para desarrollar el modelo, los ratones se inmunizan intraperitonealmente dos semanas consecutivas con OVA emulsionada en adyuvante de Albmina (mezcla de hidrxido de aluminio e hidrxido de magnesio, con un bajo potencial inmunognico) y una semana ms tarde, se les expone al mismo antgeno administrado en forma de aerosol. Esta exposicin se realiza introduciendo el grupo de ratones inmunizados en una cmara de metacrilato hermticamente cerrada en la que se aplican los aerosoles de OVA disuelta en PBS durante 1 hora y en dos sesiones. Tras 48 horas se puede observar cmo los ratones han desarrollado un cuadro de asma alrgico.
APLICACIN: Este modelo es til para estudiar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen al desarrollo del asma as como para el anlisis de posibles tratamientos de esta patologa. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn
20. MODELO MURINO DE INFLAMACIN AGUDA
Se dispone de modelos murinos de inflamacin aguda que afectan al correcto funcionamiento cardiovascular. Mediante estos modelos animales se pueden simular diversas patologas humanas relacionadas con la inflamacin; incluyendo inflamacin vascular inducida por TNF-, dao pulmonar agudo inducido por anticuerpos y sepsis.
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DISPONIBLE EN: Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Imagen de la Inflamacin Cardiovascular y la Respuesta Inmune Responsable: Andrs Hidalgo
DETECCIN ANATMICA DE RGANOS
AISLAMIENTO DE RGANOS
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS EXPRESIN DE PROTEN AS REC OMBI NANTES
SI TRABAJAS CON PROTENAS

EXPRESIN DE PROTENAS RECOMBINANTES
1. EXPRESIN DE PROTENAS EN BACTERIAS
Consiste en introducir en una bacteria, por diversos mtodos, un fragmento de ADN que codifica para la protena que se quiere expresar. Lo ms habitual es introducir el fragmento de ADN en la bacteria mediante su insercin en un plsmido recombinante, que contenga todos los elementos necesarios para que se produzca la transcripcin y traduccin a protena del fragmento de inters; esta construccin se denomina vector de expresin. Este vector de expresin incluye normalmente un elemento (marcador) que permite seleccionar en cultivo positivamente aquellas bacterias que lo poseen, y por tanto, capaces de producir la protena de inters. De forma adicional, el vector de expresin puede disearse de manera que la protena de inters se sintetice fusionada a otra protena o pptido que facilite el proceso de purificacin de la misma, tales como GST o HA.
APLICACIN: Mediante esta tcnica pueden producirse cantidades significativas (sobreexpresin) de una protena de inters. Si adems sta se produce como protena de fusin a otras protenas o pptidos contra los que haya anticuerpos especficos de inters, no slo podrs producir tu protena sino purificarla con facilidad.
DISPONIBLE EN: Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS EXPRESIN DE PROTEN AS REC OMBI NANTES
2. EXPRESIN DE PROTENAS EN EUCARIOTAS MEDIANTE SISTEMAS VIRALES
Uso de retrovirus, adenovirus y lentivirus como vectores de expresin estable, para la produccin de una protena de inters en un sistema de expresin determinado. Aprovechando la eficiencia natural de los virus de integrar sus genes virales dentro del material gentico de la clula infectada y de utilizar la maquinaria celular para reproducir las partculas virales, se emplean estos virus para transportar genes de inters al interior de clulas donde se producir la protena correspondiente. La ventaja de estos sistemas es que la integracin del gen de inters en el genoma de la clula infectada se realiza en un nico sitio y en mltiples copias.
APLICACIN: Podrs expresar una protena de inters en una clula eucariota partiendo del mRNA correspondiente. Estos sistemas son especialmente interesantes si tu protena dispone de modificaciones postraduccionales que no pueden ocurrir en sistemas procariotas. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS SEPARACIN DE PROTE NAS
SEPARACIN DE PROTENAS
1. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL CLSICA (2D)
La electroforesis bidimensional es una tcnica de alta resolucin para la separacin de mezclas complejas de protenas. Durante la electroforesis bidimensional las protenas son separadas secuencialmente por dos criterios fsicos: en primer lugar en funcin de su punto isoelctrico, y a continuacin, segn su masa molecular. Finalmente las protenas separadas son procesadas para su identificacin por diversos mtodos.
APLICACIN: Con esta tcnica puedes separar las protenas de una muestra de tejido, cultivo, etc., para futuros anlisis (tincin, identificacin, western-blot, etc.)
DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
2. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL DIFERENCIAL EN GEL (2D-DIGE)
La electroforesis bidimensional diferencial en gel (Differential Gel Electrophoresis-2D-DIGE) es una variacin de la electroforesis bidimensional clsica que permite la separacin de hasta tres extractos proteicos distintos en un nico gel. Cada una de las muestras es marcada con un fluorforo distinto; hasta tres fluorforos espectralmente distinguibles son usados. Una vez marcadas, se mezclan hasta tres muestras y se separan en un nico gel mediante electroforesis bidimensional convencional. Posteriormente cada una de las muestras es visualizada de forma independiente seleccionando las
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS SEPARACIN DE PROTE NAS
longitudes de onda de excitacin y emisin adecuadas para cada fluorforo. Finalmente las protenas separadas son procesadas para su identificacin por diversos mtodos. Con un nmero de rplicas biolgicas adecuado, esta tcnica permite la cuantificacin estadstica de pequeas variaciones en los niveles de expresin de una misma protena en estados diferentes.
APLICACIN: Con esta tcnica puedes separar las protenas de muestras diferentes y detectar variaciones en el nivel de expresin de cada una de las protena de las diferentes condiciones. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
3. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas en funcin de la distinta afinidad o capacidad de unin de las protenas a un determinado ligando. Esta tcnica es utilizada frecuentemente para purificar protenas recombinantes que disponen de una fusin a un eptopo contra el que existen columnas de alta afinidad comerciales. Aplicacin: Con esta tcnica podrs purificar protenas recombinantes utilizando diversos eptopos: GST, HA, HIS, etc.
DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS IDENTIFICACIN Y CAR ACTERI ZACIN DE PROTENAS
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE PROTENAS
1. DIGESTIN ENZIMTICA AUTOMATIZADA DE PROTENAS EN GEL PARA SU IDENTIFICACIN POR ESPECTROMETRA DE MASAS
Tras la separacin electrofortica en gel y tincin de las protenas de una muestra, se recortan las manchas de protena y se digieren con tripsina. El digerido as obtenido se mezcla con una sustancia matriz apropiada y se deposita en un portamuestras para su posterior anlisis por espectrometra de masas. El proceso se halla en gran medida automatizado, lo cual permite el procesamiento rpido de un elevado nmero de muestras y reduce notablemente la contaminacin de las mismas con queratinas.
Aplicacin: La automatizacin del recorte de protenas de geles es muy til para los proyectos que implican el recorte sistemtico de todas las protenas de un gel e imprescindible cuando las protenas de inters provienen de geles teidos con agentes fluorescentes. El proceso posibilita la obtencin de forma rpida de los pptidos trpticos de protenas separadas mediante electroforesis en gel, minimizando las contaminaciones derivadas de la manipulacin manual, para ser analizados por espectrometra de masas.
DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
2. DETERMINACIN DE HUELLA PEPTDICA DE MASA MEDIANTE MALDI-TOF
La ionizacin MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, desorcin/ionizacin mediante lser asistida por Matriz), acoplada a un analizador TOF (Time-Of-Flight, tiempo de vuelo), permite determinar con gran exactitud la masa de los pptidos resultantes de la digestin con tripsina de protenas en gel. La medida de la masa de dichos fragmentos proteicos genera un espectro de masas, denominado huella peptdica de masa, que es caracterstico de dicha protena y permite identificarla de forma inequvoca. La identificacin de la protena se lleva a cabo por comparacin de la huella peptdica de masa experimental con las masas predichas por la digestin in silico de todas las secuencias incluidas en las bases de datos de protenas.
Aplicacin: Este abordaje permite identificar de forma inequvoca la protena contenida en un fragmento de un gel de poliacrilamida, siempre y cuando la secuencia de la protena est depositada en
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una base de datos de acceso pblico, y se disponga de cantidades suficientes de la misma (el lmite de deteccin se sita en torno a los 2 ng, lo cual significa que este mtodo es aplicable a las protenas visibles mediante tincin con plata).
3. DETERMINACIN DE HUELLA PEPTDICA DE FRAGMENTACIN MEDIANTE MALDI-TOF/TOF
La ionizacin MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, desorcin/ionizacin mediante lser asistida por Matriz), acoplada a un analizador TOF/TOF, permite determinar las masas de los fragmentos que se derivan de la descomposicin metaestable de pptidos. Dicha descomposicin genera la denominada huella peptdica de fragmentacin del pptido, la cual es caracterstica de la secuencia del mismo y permite su identificacin inequvoca. Este abordaje puede emplearse en combinacin con la huella peptdica de masa para aumentar notablemente la eficacia de la bsqueda en bases de datos, permitiendo incluso la identificacin de protenas de organismos cuyo genoma es an desconocido. En ciertos casos, el estudio detallado del espectro de fragmentacin permite determinar sitios de modificaciones post-traduccionales u obtener secuencias parciales mediante secuenciacin de novo.
APLICACIN: Este abordaje permite identificar de forma inequvoca la protena contenida en un fragmento de un gel de poliacrilamida, en ciertos casos incluso trabajando con organismos de genoma desconocido, as como determinar modificaciones post-traduccionales y obtener informacin de secuencia de pptidos de novo. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
4. ANLISIS DE MEZCLAS POCO COMPLEJAS DE PROTENAS MEDIANTE CROMATOGRAFA LQUIDA ACOPLADA A TRAMPA INICA (NLC-MS/MS)
Consiste en una cromatografa lquida acoplada a un espectrmetro de masas, formado por una fuente de ionizacin de electrospray (ESI) y un analizador de masas de Trampa Inica y/o un analizador Orbitrap. Los pptidos trpticos provenientes de una digestin enzimtica son separados por cromatografa lquida de fase inversa e introducidos secuencialmente on-line de forma automtica en el
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espectrmetro de masas para su anlisis. Esta tcnica se emplea para la identificacin de protenas en mezclas poco complejas mediante el estudio de sus espectros de fragmentacin. El resultado es una lista de masas de pptidos (huella peptdica de masa) y de sus correspondientes fragmentos (huella peptdica de fragmentacin), de modo que la eficacia de su bsqueda en bases de datos es muy elevada. Mediante esta tcnica pueden identificarse unos cientos de protenas de una mezcla, determinar la secuencia peptdica de novo de un pptido y la caracterizacin de posibles sitios de modificacin posttraduccional.
APLICACIN: Mediante esta tcnica podrs obtener informacin sobre la identidad de las protenas de una mezcla (entre 20 y 500 protenas), y sus posibles modificaciones post-traduccionales. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
5. SECUENCIACIN DE PPTIDOS EN DISOLUCIN MEDIANTE NANOSPRAY OFF-LINE
Este abordaje contempla el anlisis directo de una mezcla de pptidos en solucin, en ausencia de contaminantes, para su ionizacin y fragmentacin en un espectrmetro de masas con ionizacin por electrospray (ESI) y analizador de Trampa Inica y/o analizador Orbitrap. Ofrece la ventaja de poder efectuar rondas sucesivas de seleccin y fragmentacin, de modo que mediante la correcta interpretacin de los espectros de fragmentacin se puede llegar a determinar la secuencia peptdica de novo, as como la caracterizacin de posibles sitios de modificacin post-traduccional.
Aplicacin: Con esta tcnica puedes averiguar la secuencia de aminocidos de una mezcla de pptidos poco compleja que tengas en solucin y determinar las modificaciones post-traduccionales de la misma.
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6. ANLISIS DE MEZCLAS COMPLEJAS DE PROTENAS MEDIANTE CROMATOGRAFA BIDIMENSIONAL ACOPLADA A TRAMPA INICA (MUDPIT)
Consiste en realizar la digestin enzimtica de las protenas presentes en una mezcla compleja y posteriormente someter los digeridos a dos tipos de cromatografa diferentes de forma consecutiva (normalmente, intercambio catnico fuerte seguido de cromatografa de fase inversa). Finalmente, los pptidos separados son analizados en tiempo real en un espectrmetro de masas con ionizacin por electrospray (ESI) y un analizador de Trampa Inica y/o analizador Orbitrap. El resultado es una lista de masas de pptidos (huella peptdica de masa) y de sus correspondientes fragmentos (huella peptdica de fragmentacin). Este abordaje, que resulta muy sensible, es apropiado para el anlisis de ciertos subproteomas cuando se pretende soslayar las limitaciones de la electroforesis bidimensional.
APLICACIN: Mediante esta tcnica podrs obtener informacin sobre la identidad de las protenas de una mezcla compleja (apropiado para un subproteoma), y algunas de sus posibles modificaciones posttraduccionales. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS DETERMINACIN DE MOD IFIC ACIONES POSTRADU CCIONALES EN PROTEN AS
DETERMINACIN DE MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES EN PROTENAS
1. IDENTIFICACIN DE MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES MEDIANTE CROMATOGRAFA LQUIDA ACOPLADA A TRAMPA INICA NLC-MS/MS
Consiste en una cromatografa lquida acoplada a un espectrmetro de masas, formado por una fuente de ionizacin de electrospray (ESI) y un analizador de masas de Trampa Inica y/o un analizador Orbitrap. Los pptidos trpticos provenientes de una digestin enzimtica son separados por cromatografa lquida de fase inversa e introducidos secuencialmente on-line de forma automtica en el espectrmetro de masas para su anlisis. Mediante la correcta interpretacin de los espectros de fragmentacin se puede llegar a determinar la secuencia peptdica y la caracterizacin de posibles sitios de modificaciones post-traduccionales.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs detectar cierto tipo de modificaciones en protenas, como acetilaciones, metilaciones, glicosilaciones, fosforilaciones, nitrosilaciones, etc. Es necesario que la proporcin de molculas modificadas sea significativa, y disponer de una cantidad suficiente de protena. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
2. IDENTIFICACIN DE MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES MEDIANTE CROMATOGRAFA LQUIDA CONECTADA A TRAMPA INICA LINEAL CONECTADA A UN ANALIZADOR DE MASAS ELECTROSTTICO DE ALTA RESOLUCIN ORBITRAP Y FRAGMENTACIN ETD
Consiste en una cromatografa lquida acoplada a un espectrmetro de masas hbrido formado por dos analizadores, una Trampa Inica lineal modificada con doble detector, acoplada a un analizador de masas electrosttico de alta resolucin, denominado Orbitrap. El sistema de cromatografa permite trabajar a flujos de nanolitros/min en cromatografa multidimensional aconsejable para el anlisis automatizado de proteomas complejos. El analizador Orbitrap ofrece una alta resolucin (del orden de 100.000) y una mayor sensibilidad que los equipos tradicionales. Esto permite la deteccin de protenas que se encuentren en bajas concentraciones as como analizar mezclas de protenas ms complejas y una mayor precisin en la determinacin de la masa de los fragmentos analizados. El fragmentador EDT ofrece un mtodo de fragmentacin de pptidos ms homognea que otros mtodos de fragmentacin
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS DETERMINACIN DE MOD IFIC ACIONES POSTRADU CCIONALES EN PROTEN AS
usados comnmente lo que es especialmente til a la hora de analizar modificaciones postraduccionales por fosforilacin, ya que los enlaces asociados a este tipo de modificaciones son ms sensibles a los mtodos de fragmentacin usados comnmente y en ocasiones pueden romperse durante dicha fragmentacin evitando la deteccin del sitio fosforilado.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs identificar protenas de una mezcla compleja con una gran precisin incluso cuando se encuentran en una baja concentracin. Adems, este equipo es particularmente til para la deteccin de fosforilaciones. En este sentido, la sensibilidad y resolucin del equipo permite hacer anlisis de masas de protenas sin digerir lo que es especialmente til para analizar las posibles modificaciones postraduccionales de una protena por simple comparacin con la masa de la protena entera sin modificar. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
3. ANLISIS DE ESPECTROS DE FRAGMENTACIN MEDIANTE ESPECTRMETRO DE MASAS HBRIDO (TRIPLE CUADRUPOLO-TRAMPA INICA LINEAL)
Consiste en el anlisis de los pptidos trpticos de una mezcla de protenas utilizando un espectrmetro de masas hbrido formado por una fuente de ionizacin por electrospray (ESI) acoplado a un analizador de triple cuadrupolo hbrido (el tercer cuadrupolo es en realidad una trampa inica lineal). Por las caractersticas especiales de escaneo de iones del triple cuadrupolo, este sistema permite la seleccin especfica de cierto tipo de iones, como aquellos que se encuentran modificados, por ejemplo, por fosforilacin. Una vez aislados, el sistema induce la fragmentacin de estos pptidos; la correcta interpretacin de sus espectros permite determinar y localizar el residuo que porta la modificacin. Este sistema ofrece notables ventajas para la determinacin de modificaciones post-traduccionales como, por ejemplo, fosforilacin o glicosilacin.
Aplicacin: Con esta tcnica podrs detectar cierto tipo de modificaciones en protenas, como acetilaciones, metilaciones, glicosilaciones, fosforilaciones, palmitoilaciones, nitrosilaciones, etc. Es necesario que la proporcin de molculas modificadas sea significativa, y disponer de una cantidad suficiente de protena. Es posible la puesta a punto de condiciones especficas para la seleccin de pptidos que porten otras modificaciones no descritas. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS CUANTIFICACIN Y AN LISIS DE LA EXPRESI N DE PROTENAS
CUANTIFICACIN Y ANLISIS DE LA EXPRESIN DE PROTENAS
1. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL DIFERENCIAL EN GEL (DIFFERENTIAL GEL ELECTROPHORESIS-2D-DIGE)
Es una variacin de la electroforesis bidimensional clsica en la que las protenas de hasta tres muestras distintas, antes de ser separadas, son marcadas con fluorforos diferentes, espectralmente distinguibles. Las tres muestras son mezcladas y separadas en un nico gel, reduciendo la variabilidad entre geles y mejorando la reproducibilidad y la capacidad de extraer informacin cuantitativa de los anlisis. As, este sistema permite la cuantificacin estadstica de pequeas variaciones en los niveles de expresin de protenas entre distintas muestras.
APLICACIN: Con esta tcnica puedes separar y comparar la expresin de protenas de varias muestras de tejido, cultivo, etc., para detectar variaciones en el nivel de expresin de cada una de las protenas de las diferentes condiciones. Posteriormente, se identifican las protenas diferencialmente expresadas. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo
2. MARCAJE ISOBRICO DIFERENCIAL (ITRAQ)
Como la tcnica de geles 2D-DIGE, es una tcnica de multiplexado para la comparacin, en un nico paso, de hasta cuatro muestras distintas. El marcaje isobrico diferencial consiste en marcar los pptidos de digestin de una mezcla de protenas con un reactivo qumico. Los pptidos marcados son separados por cromatografa lquida acoplada a ESI y posteriormente analizados por espectrometra de masas. Esta tcnica permite realizar anlisis comparativos entre cuatro estados distintos (ocho en una nueva versin del producto). Para hacer el anlisis comparativo mediante esta tcnica es necesario disponer de un sistema de anlisis capaz de estudiar el rango de bajo peso molecular (114-117 uma), como un espectrmetro de masas hbrido de triple cuadrupolo.
APLICACIN: Con esta tcnica puedes obtener informacin sobre la expresin diferencial de una mezcla poco compleja de protenas entre cuatro (u ocho) muestras distintas.
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS CUANTIFICACIN Y AN LISIS DE LA EXPRESI N DE PROTENAS
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SI TRABAJAS CON PROTEN AS ANLISIS DE INTERACC IONES P ROTENA-LIGANDO
ANLISIS DE INTERACCIONES PROTENA-LIGANDO
1. CO-INMUNOPRECIPITACIN
Tcnica que consiste en recuperar de forma simultnea dos protenas de una solucin mediante el uso de un anticuerpo especfico contra una de las protenas y una matriz capaz de unirse a dicho anticuerpo.
APLICACIN: con esta tcnica podrs recuperar de forma especfica una protena de inters y utilizarla para futuros anlisis, entre los que se encuentra la deteccin de protenas interaccionantes que hayan coinmunoprecipitado con ella. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
2. ENSAYOS PULL-DOWN
Tcnica que permite determinar interacciones fsicas entre dos o ms protenas. Consiste en inmovilizar en una matriz una protena y utilizarla para recuperar de una muestra protenas que se asocien a ella. La protena de inters puede inmovilizarse de varias formas, aunque la ms habitual es gracias a un eptopo contra el que haya anticuerpos de alta afinidad, como HA o la protena GST. As, suelen utilizarse protenas recombinantes que dispongan del eptopo fusionado. La protena recombinante se
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fija a una matriz a travs del anticuerpo contra el eptopo y posteriormente se utiliza como cebo para capturar protenas con las que interaccione. La recuperacin de los complejos proteicos es relativamente fcil aadiendo el propio eptopo que acta como competidor de la protena de fusin que queda liberada al medio.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs identificar protenas que interaccionen con una protena conocida, confirmando una interaccin mostrada por otras tcnicas como la inmunoprecipitacin o identificando nuevas interacciones no descritas previamente. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
3. INMUNOPRECIPITACIN DE CROMATINA (CHIP Y CHIP ON CHIP)
La Inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP, Chromatine Inmunoprecipitation) consiste en el aislamiento, mediante anticuerpos especficos contra un factor nuclear, de las secuencias genmicas asociadas al mismo tras la estabilizacin covalente de los contactos protena-DNA y la fragmentacin de la cromatina. El DNA co-precipitado con el factor nuclear es analizado para identificar la secuencia a la que estaba unido dicho factor. El mtodo de anlisis mas corriente es la amplificacin por PCR con oligonucletidos especficos del DNA inmunoprecipitado. Esta aproximacin requiere un conocimiento previo de la secuencia de DNA de forma que su utilidad es limitada para el estudio de las secuencias desconocidas a las que se une protena determinada. Esta limitacin ha sido resuelta mediante aproximaciones genmicas gracias la hibridacin del DNA precipitado sobre microarrays genmicos. Es lo que se denomina tecnologa ChIP on-Chip.
APLICACIN: La inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP) permite determinar si un factor de transcripcin est unido a su diana en el genoma en una situacin concreta. Adems, utilizando la tcnica de ChIp on Chip se pueden identificar secuencias de unin desconocidas para un factor de transcripcin.
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DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
4. ENSAYOS DE CAMBIO DE MOVILIDAD ELECTROFORTICA (ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY-EMSA/ BAND SHIFT)
Es una tcnica que permite analizar las interacciones protena-cido nucleico (DNA o RNA). La tcnica se basa en el hecho de que la capacidad de migracin de una molcula de cido nucleico en un gel de electroforesis se ve modificada cuando esta molcula est unida a una o varias protenas. De esta forma, cuando a un fragmento de ADN se migra en un gel de electroforesis en compaa de una protena que es capaz de unirse a l, lo hace a una velocidad menor a la que lo hara en ausencia de dicha protena.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs determinar si una protena concreta es capaz de unirse por si sola o con otras protenas a una secuencia de DNA o RNA particular. Tambin podrs saber si en una mezcla de protenas hay alguna capaz de unirse a una secuencia de DNA o RNA particular. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza
5. HUELLA GENTICA O FOOTPRINTING
Esta tcnica consiste en determinar la secuencia de DNA exacta a la que es capaz de unirse una protena concreta. La determinacin se basa en el hecho de que una protena, cuando est unida a una secuencia del DNA, protege a dicha secuencia de ser cortada por un enzima capaz de cortar molculas de DNA como por ejemplo la DNAsa I. Tras un tratamiento DNAsa I de un DNA al cual se encuentra unido una protena y la separacin por electroforesis en gel de los fragmentos de la digestin, se observar que
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hay una serie de fragmentos de digestin que no se han producido como resultado de la unin de la protena. Comparando estos fragmentos de digestin con los de la digestin del mismo DNA en ausencia de unin a la protena, puede determinarse la secuencia a la que corresponden los fragmentos de digestin ausentes y por lo tanto la secuencia del DNA donde se encontraba unida la protena.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs saber a qu secuencia exacta del DNA se une una protena de tu inters. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
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SI TRABAJAS CON GENE S TC NICAS INMUNOLGIC AS
TCNICAS INMUNOLGICAS
1. WESTERN-BLOT
Consiste en separar las protenas de una mezcla compleja mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente transferir las protenas separadas a una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa) donde sern inmovilizadas. Esa membrana se pone en contacto con una anticuerpo que reconozca la protena de inters de forma que se fijar all donde sta se site.
APLICACIN: Podrs detectar la presencia de una protena de inters en una muestra siempre que dispongas de un anticuerpo capaz de reconocerla. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn
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2. WESTERN-BLOT 2D
Consiste en separar las protenas mediante electroforesis bidimensional y posteriormente transferir las protenas separadas a una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa) donde sern inmovilizadas. Esa membrana se incuba con una anticuerpo que reconozca la protena de inters, de forma que se fijar all donde sta se site.
APLICACIN: Podrs detectar la presencia de una protena de inters en una muestra siempre que dispongas de un anticuerpo capaz de reconocerla. El mayor poder resolutivo de la electroforesis 2D permite una separacin mejor de la protena. Sin embargo, recuperar la protena de un gel teido, por ejemplo con plata, por comparacin con una membrana revelada por western-blot puede ser muy complicado. DISPONIBLE EN: Unidad de Protemica Responsable: Juan Antonio Lpez del Olmo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
3. ELISA
La tcnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reaccin cuyo producto puede ser fcilmente detectado (por ejemplo mediante un espectrofotmetro).
APLICACIN: Podras detectar la presencia de una protena en una muestra con un elevado nivel de sensibilidad.
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DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn
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SI TRABAJAS CON CLU LAS Y T EJIDOS CULTIV OS CELULARE S
SI TRABAJAS CON CLULAS Y TEJIDOS

CULTIVOS CELULARES
1. CULTIVO CELULAR EN CONDICIONES DE NORMOXIA (21% O2) E HIPOXIA (3% O2)
2. CULTIVO DE PROGENITORES LINFOHEMATOPOYTICOS MURINOS Y HUMANOS
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Imagen de la Inflamacin Cardiovascular y la Respuesta Inmune Responsable: Andrs Hidalgo
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3. CULTIVO DE LARGA DURACIN DE MDULA SEA MURINA
4. CULTIVO DE LNEAS Y CULTIVOS PRIMARIOS DE CLULAS GLIALES MURINOS
5. CULTIVO DE ENDOTELIO DE AORTA DE RATN
DISPONIBLE EN: Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Remodelacin de la Pared Vascular y Enfermedad Cardiovascular Responsable: Carlos Zaragoza Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve
6. CULTIVOS DE LNEAS Y CULTIVOS PRIMARIOS DE CLULAS ENDOTELIALES DE AORTA VACA
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7. CULTIVOS DE LNEAS Y CULTIVOS PRIMARIOS DE CLULAS ENDOTELIALES DE CORDN UMBIILICAL HUMANO (HUVEC)
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Metaloproteinasas de Matriz en Angiognesis e Inflamacin Responsable: Alicia Garca Arroyo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
8. CULTIVOS DE LNEAS Y CULTIVOS PRIMARIOS DE HEPATOCITOS DE RATN
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
9. CULTVOS DE LNEAS Y CULTIVOS PRIMARIOS FIBROBLASTOS EMBRIONARIOS DE RATN (MEF: MOUSE EMBRYONIC FIBROBLASTS)
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de Transcripcional de los Sistemas de Proteccin Frente al Estrs Oxidativo Responsable: Mara Monsalve Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez
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10. CULTIVOS PRIMARIOS DE CLULAS ENDOTELIALES DE PULMN DE RATN
11. CULTIVOS PRIMARIOS DE CLULAS DE MSCULO LISO DE RATN
12. CULTIVOS PRIMARIOS DE CLULAS MADRE HEMATOPOYTICAS. SUBPOBLACIONES LONG-TERM, SHORT-TERM Y PROGENITORAS
DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez
13. CULTIVOS PRIMARIOS DE MACRFAGOS PERITONEALES
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14. CULTIVOS PRIMARIOS DE CLULAS DE MDULA SEA
15. CULTIVOS CELULARES P RIMARIOS DE ENDOTELIO DE VASCULATURA CORONARIA DE RATN
16. CULTIVOS CELULARES INMORTALIZADOS DE ENDOTELIO DE PULMN DE RATN
17. CULTIVOS CELULARES INMORTALIZADOS DE ENDOTELIO DE VASCULATURA CORONARIA DE RATN
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SI TRABAJAS CON CLU LAS Y T EJIDOS SEPARACIN DE CL ULA S
SEPARACIN DE CLULAS
1. SEPARACIN DE POBLACIONES CELULARES MEDIANTE CITOMETRA DE FLUJO (CELL SORTING)
La separacin celular por citometra de flujo o cell sorting es el proceso de separacin fsica de poblaciones celulares que se diferencian en uno o varios parmetros que son analizables por citometra de flujo. Entre estos parmetros se encuentran el tamao relativo y la granulosidad celulares, antgenos de superficie o marcadores de expresin, contenido de DNA y sensibilidad a colorantes.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs separar y recuperar (enriquecidas o purificadas) las poblaciones celulares de una muestra en funcin de diversos parmetros. Es til para separar subpoblaciones celulares, para obtener poblaciones que expresan una protena de inters o para realizar clonajes celulares, es decir, para seleccionar una nica clula.
DISPONIBLE EN: Unidad de Celmica Responsable: Mara Montoya Snchez Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
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SI TRABAJAS CON CLU LAS Y T EJIDOS SEPARACIN DE CL ULA S
2. AISLAMIENTO DE CLULAS MEDIANTE CATAPULTADO POR PRESIN DE LSER (LASER PRESSUR E CATAPULTING) EN CULTIVO O DE MUESTRAS PROCEDENTES DE MUESTRAS DE TEJIDO
Consiste en utilizar un microdisector lser para separar las clulas de un cultivo o una seccin de una muestra slida. Posteriormente las clulas o secciones separadas son catapultadas por presin usando el mismo lser que las ha separado y depositarlas en un soporte para posteriores anlisis.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs seleccionar y recuperar clulas de un cultivo para su posterior crecimiento de forma aislada. Podrs obtener secciones de una biopsia para su posterior procesamiento. Siempre de forma limpia y sin contaminacin. DISPONIBLE EN: Unidad de Microscopa Responsable: Valeria Caiolfa
3. 3. SEPARACIN DE CLULAS MEDIANTE MTODOS INMUNOMAGNTICOS
Esta tcnica consiste en separar poblaciones celulares en suspensin utilizando anticuerpos magnticos que reconozcan de forma especfica antgenos de superficie presentes en determinados tipos celulares de la poblacin. As, incubando la suspensin de clulas con los anticuerpos marcados magnticamente se generan los complejos antgeno-anticuerpo que posteriormente pueden separarse del resto de la suspensin aplicando un campo magntico adecuado. La separacin de poblaciones celulares por mtodos inmunomagnticos tiene la gran ventaja, frente a otros mtodos de separacin (como por ejemplo, la filtracin por membrana) de ser ms selectiva y especfica y ofrece mejores resultados cuando se trata de suspensiones con un alto grado de materia orgnica en suspensin.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs separar un tipo celular concreto de una poblacin celular siempre y cuando dispongas de anticuerpos marcados magnticamente que reconocen un antgeno de superficie del tipo celular de inters. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
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SI TRABAJAS CON CLU LAS Y T EJIDOS AN LISIS DE POBLAC IO NES CELULARES
ANLISIS DE POBLACIONES CELULARES
1. DETERMINACIN DE PARMETROS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES MEDIANTE CITOMETRA DE FLUJO
Consiste en utilizar un citmetro de flujo para determinar las caractersticas estructurales y funcionales de una poblacin celular en funcin de una serie de parmetros de inters.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs determinar el tamao relativo y la granulosidad de las clulas, contenido de cidos nucleicos, fase del ciclo celular y otros parmetros que te interesen siempre y cuando puedan detectarse con el citmetro de flujo. Otra aplicacin es medir y determinar propiedades de diferentes tipos celulares como por ejemplo la funcin adhesiva en poblaciones leucocitarias. DISPONIBLE EN: Unidad de Celmica Responsable: Mara Montoya Snchez Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad Departamento: Aterotrombosis e Imagen Cardiovascular Laboratorio: Imagen de la Inflamacin Cardiovascular y la Respuesta Inmune Responsable: Andrs Hidalgo
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2.
INMUNOFENOTIPAJE CELULAR
Anlisis de deteccin de antgenos en superficie o citoplsmico-nucleares mediante el uso de anticuerpos conjugados con fluorocromos para determinar el fenotipo celular. Puede emplearse cualquier anticuerpo al que se le hayan conjugado los fluorocromos para su deteccin.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs diferenciar los diferentes fenotipos celulares presentes en una poblacin compleja usando como criterio de diferenciacin la reaccin de cualquier anticuerpo que te interese. DISPONIBLE EN: Unidad de Celmica Responsable: Mara Montoya Snchez Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
3. ANLISIS DE PROLIFERACIN Y CICLO CELULAR
Mediante citometra de flujo pueden determinarse diferentes aspectos relacionados con el ciclo celular. Por una parte, puede detectarse la poblacin que cicla mediante un pulso con BrDU (Bromodesoxiuridina) o tinciones celulares totales. Por otra parte, pueden distinguirse las clulas de una poblacin que estn en cada una de las fases del ciclo celular, teniendo en cuenta diversos parmetros como el contenido de ADN y/o la deteccin de protenas que se expresan en determinadas fases del ciclo utilizando tinciones con anticuerpos especficos conjugados con fluorocromos.
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APLICACIN: Con esta tcnica podrs determinar si una clula o poblacin celular est proliferando e incluso conocer la fase del ciclo celular en la que se encuentran las distintas clulas que forman la poblacin.
DISPONIBLE EN: Unidad de Celmica Responsable: Mara Montoya Snchez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
4. ANLISIS DE VIABILIDAD CELULAR
Anlisis mediante diferentes tcnicas de la viabilidad celular y cuantificacin por contaje absoluto (siempre que se utilicen bolas normalizadas) de clulas vivas y muertas. Utilizando citometra de flujo o tinciones con anticuerpos conjugados con fluorocromos puede analizarse el proceso de muerte celular.
APLICACIN: Podrs saber el nmero de clulas vivas y muertas en una muestra. DISPONIBLE EN: Unidad de Celmica Responsable: Mara Montoya Snchez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
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Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Estudio del Envejecimiento de Clulas Madre Responsable: Susana Gonzlez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
5.
ANLISIS MULTIPLEXADO
Mediante el uso de un citmetro de flujo es posible analizar de forma simultnea hasta 50 molculas distintas en medios de cultivo, muestras biolgicas o lisados celulares.
APLICACIN: Podrs detectar y cuantificar molculas solubles en sobrenadantes celulares o procedentes de sueros o lquidos biolgicos. Asimismo es posible detectar molculas en lisados celulares. DISPONIBLE EN: Unidad de Celmica Responsable: Mara Montoya Snchez Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn
6.
ANLISIS DE PROCESOS DE MIGRACIN CELULAR
Seguimiento del comportamiento molecular mediante tcnicas de videomicroscopa confocal a tiempo retardado. La tcnica puede emplearse para estudiar la expresin y localizacin de molculas en el interior celular, tanto en cultivos celulares como tejidos histolgicos; estudios de colocalizacin de protenas u otro tipo de molculas; transporte intracelular, endocitosis; medidas de concentraciones de iones intracelulares; desarrollo y expresin gnica; hibridacin in situ con sondas fluorescentes; etc.
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APLICACIN: La tcnica se utiliza para estudiar los fenmenos de extravasacin leucocitaria, migracin celular y formacin de la sinapsis inmune, que tienen una cintica en el rango de minutos. En estos casos es mejor acelerar el proceso durante la grabacin, por lo que el tiempo retardado es una ventaja. Para la microscopia a tiempo retardado se utilizan protenas de fusin de los genes de inters (ICAM-1, VCAM-1, tetraspaninas, integrinas, metaloproteinasas, ERMs, quinasas, adems de los empleados en proyectos de presentacin antignica) con protenas fluorescentes (GFP, YFP, CFP, RFP, dsRed). DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid
7. RASTREO DE ALTO CONTENIDO (HCS)
La tecnologa de HCS utiliza sistemas automatizados para el cultivo, transfeccin, procesamiento y tincin de clulas a gran escala. HCS implica asimismo la utilizacin de un lector de imgenes de fluorescencia automatizado basado en microscopa confocal, un programa de anlisis de imgenes, todo ello integrado en una plataforma de gestin de datos. Utilizando esta tecnologa, puede analizarse un determinado parmetro o conjunto de atributos de cada clula individualizada a partir del anlisis cuantitativo de imgenes de fluorescencia. Mediante un complejo anlisis se pueden clasificar fenotipos o bien determinar funcionalidad celular en mltiples muestras dispuestas sobre una matriz o placas multipocillo sobre la que se han dispuesto libreras de siRNAs.
APLICACIN: Estudiar fenotipos de prdida de funcin de genes por iRNA basados en microscopa automatizada de fluorescencia para analizar funciones o fenotipos celulares (viabilidad, proliferacin o migracin celular, o bien expresin, localizacin traslocacin e interacciones entre protenas) de forma simultnea en placas multipocillo o arrays de siRNAs DISPONIBLE EN: Unidad de Celmica Responsable: Mara Montoya Snchez
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SI TRABAJAS CON CLU LAS Y T EJIDOS VEHICULI ZACIN DE MO LCULAS AL I NTERIOR CELU LAR
VEHICULIZACIN DE MOLCULAS AL INTERIOR CELULAR
1. MICROINYECCIN DE SUSTANCIAS
Introduccin de sustancias en el interior celular mediante sistema de microinyeccin y /o catapultado por lser.
APLICACIN: Podrs introducir en una clula una sustancia que te interese. Es una tcnica til para transfectar clulas cuando otros sistemas no lo permiten. En particular con esta tcnica podrs transfectar exclusivamente una clula o conjunto de clulas determinadas de una poblacin celular. DISPONIBLE EN: Unidad de Microscopa Responsable: Valeria Caiolfa
2. TRANSFECCIN
Es una tcnica para introducir material gentico exgeno en una clula eucariota. La transfeccin puede ser permanente o transitoria. Existen diferentes mecanismos para realizar la transfeccin, tales como el mtodo del fosfato clcico, la nucleofeccin, la electroporacin, la microinyeccin (ver apartado anterior) o el uso de liposomas, entre otros.
APLICACIN: Podrs introducir en una clula un fragmento de ADN para expresar en ella un gen cuya expresin deseas analizar o bien para producir una protena de inters. Tambin podrs bloquear la expresin de un gen concreto si lo que introduces es el correspondiente siRNA; en este caso la transfeccin se hace utilizando oligofectamina. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
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SI TRABAJAS CON CLU LAS Y T EJIDOS VEHICULI ZACIN DE MO LCULAS AL I NTERIOR CELU LAR
Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
3. VEHICULIZACIN DE FRMACOS AL INTERIOR CELULAR A TRAVS DE MICROESFERAS
Las microesferas son esferas de tamao microscpico (entre 100-200 micras) con composicin y estructura adecuadas para que se adhieran a ellas factores de crecimiento, frmacos, etc., y poder introducir as estas sustancias al interior celular o bien a nivel de tejido o embrin. La composicin de estas microesferas es diversa pudiendo ser matrices de agarosa, esferas acrlicas recubiertas de heparina con afinidad por factores de crecimiento, microesferas de intercambio inico a las que se pegan las sustancias de inters por su carga elctrica, microesferas hidrofbicas para la adhesin de sustancias sin carga, etc.
APLICACIN: Las ventajas de utilizar microesferas, son su aplicacin localizada y la liberacin de la sustancia de forma gradual. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Papel de Nuevos Genes en el Desarrollo Cardiovascular Responsable: Juan Jos Sanz-Ezquerro
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SI TRABAJAS CON CLU LAS Y T EJIDOS MICROSCOPA CONF OCAL Y MULTIFOTN
MICOSCOPA CONFOCAL Y MULTIFOTN
1. LOCALIZACIN INTRACELULAR DE MOLCULAS
Estudios de colocalizacin celular mediante el uso de protenas fluorescentes y/o anticuerpos directamente conjugados. Se utilizan diversos mtodos de anlisis de la fluorescencia para finalmente determinar la localizacin subcelular de la molcula de inters. Entre los mtodos de anlisis se usan FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) y FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching).
APLICACIN: Podrs detectar la localizacin subcelular de una molcula DISPONIBLE EN: Unidad de Microscopa Responsable: Valeria Caiolfa Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
2. OBTENCIN DE IMGENES MEDIANTE MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA TRADICIONAL O CONFOCAL
Obtencin de imgenes de tejidos o clulas mediante el uso de un microscopio de fluorescencia tradicional (imgenes en dos dimensiones) o confocal (imgenes en tres dimensiones) con posibilidad de analizar hasta 5 fluorescencias. Las imgenes pueden tomarse en tiempos discretos o de forma continuada a lo largo de un periodo de tiempo determinado. Para el anlisis de procesos cuya cintica es lenta (por ejemplo, minutos) las imgenes pueden tomarse a tiempo retardado, de manera que pueda visualizarse el desarrollo de dicho proceso, que de forma fisiolgica se prolonga en el tiempo, en un periodo ms corto. En este ltimo caso, el mismo objeto (por ejemplo una clula) es fotografiada a intervalos de tiempo regular durante varias horas para poder visualizar los cambios sufridos por ese objeto a lo largo del tiempo analizado.
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APLICACIN: Podrs tomar imgenes en dos o tres dimensiones, tanto puntuales o continuas, detectando la fluorescencia de hasta 5 fluorocromos diferentes. DISPONIBLE EN: Unidad de Microscopa Responsable: Valeria Caiolfa Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Molculas Reguladoras de los Procesos Inflamatorios Responsable: Pilar Martn
3. ANLISIS DE PARMETROS MORFOMTRICOS Y DE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE IMGENES CELULARES
Anlisis de imgenes celulares obtenidas por microscopa utilizando diversos programas: laservox y laserpix de Bio-Rad; Metamorph y Metafluor de Universal UImaging, y Axiovision de Zeiss.
APLICACIN: Podrs extraer informacin cuantitativa y cualitativa de las imgenes obtenidas por microscopia confocal o de fluorescencia. DISPONIBLE EN: Unidad de Microscopa Responsable: Valeria Caiolfa Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Regulacin de la Expresin Gnica en el Endotelio Vascular Responsable: Juan Miguel Redondo
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4. ADQUISICIN Y ANLISIS DE IMGENES EN 3D Y 4D
Obtencin de imgenes incluyendo el eje Z, lo que permite adquirir conjuntos de imgenes que con el tratamiento informtico adecuado, producen las reconstrucciones tridimensionales de las muestras analizadas. Si esto lo realizamos durante un tiempo determinado, adquirimos la dimensin temporal (cuarta) que nos permitira observar las variaciones tridimensionales con el tiempo.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs obtener imgenes tridimensionales de una muestra (clulas o tejidos) y secuencias temporales de dichas imgenes. As, podrs visualizar, por ejemplo, cmo tienen lugar procesos como la movilizacin de orgnulos o las interacciones celulares. DISPONIBLE EN: Unidad de Microscopa Responsable: Valeria Caiolfa Departamento: Biologa Vascular e Inflamacin Laboratorio: Comunicacin Intercelular en la Respuesta Inflamatoria Responsable: Francisco Snchez-Madrid Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Regulacin de la Expresin y Estabilidad Gentica en Clulas Madre Adultas Responsable: Antonio Bernad
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SI TRABAJAS CON EMBR IONES EMBRIONES DE RATN
SI TRABAJAS CON EMBRIONES

EMBRIONES DE RATN
1. CULTIVO DE EMBRIONES DE RATN PRE-IMPLANTACIN
Se analizan clulas de embrin de ratn que se encuentran en los primeros cuatro das de desarrollo, es decir, en estadio de blastocisto previa transferencia al tero de la hembra de ratn, para estudiar las regiones reguladoras de determinados genes implicados en el desarrollo embrionario, como aqullos relacionados con las primeras decisiones de linaje que ocurren en el embrin, los genes relacionados con el mantenimiento de la pluripotencia embrionaria, o los implicados en hematopoyesis temprana.
APLICACIN: Anlisis de la regulacin transcripcional de los genes que controlan el desarrollo embrionario en ratones. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Genmica Funcional de la Pluripotencia Embrionaria y del Desarrollo del Corazn Responsable: Miguel Manzanares
2. MICROINYECCIN PRONUCLEAR DE CIGOTOS DE RATN CON SOLUCIONES DE ADN
Esta es la tcnica ms ampliamente difundida y utilizada en la transferencia gnica en ratn para la produccin de ratones transgnicos. Consiste en la introduccin de un fragmento de ADN forneo (transgn), mediante microinyeccin, en cualquiera de los dos proncleos del cigoto unicelular del ratn. El objetivo de la tcnica es que el ADN introducido se integre en el genoma de dicho cigoto que es posteriormente implantado en una hembra receptora de ratn en estado de pseudogestacin para la obtencin del ratn transgnico. Con esta tcnica, el ADN introducido se integra de forma aleatoria y en porcentaje variable en el genoma del cigoto, y no es posible predecir el lugar donde se ha producido su integracin, ni el nmero de copias en las que lo ha hecho ni el nmero de ratones transgnicos
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resultantes. No obstante, la mayora de los genes clonados que han sido introducidos en la lnea germinal del ratn mediante esta tcnica han mostrado patrones de expresin adecuados tanto especficos de tejido como especficos del estado de desarrollo, independientemente de su integracin en sitios ectpicos del genoma husped.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs obtener ratones transgnicos, si bien no podrs dirigir la integracin del transgn a un sitio concreto del genoma ni asegurar que la integracin se producir en una sola copia. Esta tcnica es til para analizar el efecto de la expresin de un transgn sin importar su localizacin o nmero de copias en el genoma, ya que con frecuencia el resultado es la integracin de mltiples copias del transgn en un mismo sitio del genoma. DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
3. MICROINYECCIN SUBZONAL O PERIVITELINA CON LENTIVIRUS RECOMBINANTES
Es una tcnica para generar animales transgnicos en la que el fragmento de ADN (transgn) de inters es introducido en el genoma del ratn por infeccin viral de embriones en estadios de preimplantacin, normalmente en estadio unicelular (cigoto). Esta tcnica se basa en la utilizacin de lentivirus (retrovirus) modificados genticamente y portadores del transgn que son capaces de infectar clulas tanto en divisin como en reposo e integrar su material gentico en el genoma de la clula infectada. Por motivos de seguridad, tales lentivirus son defectivos en replicacin, es decir, que aunque infecten una clula son incapaces de replicarse e infectar ms clulas. Se utiliza una suspensin de partculas lentivirales que son introducidas mediante microinyeccin, en el espacio denominado subzonal o perivitelino (espacio comprendido entre la Zona Pellucida y la membrana plasmtica) de un cigoto unicelular de ratn. La partcula viral puede infectar el cigoto y as integrar su material gentico portador del transgn deseado en el genoma del cigoto. Posteriormente, el cigoto ha de implantarse en una hembra receptora de ratn en estado de pseudogestacin para la obtencin del ratn transgnico.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs obtener ratones transgnicos si bien no podrs dirigir la integracin del transgn a un sitio concreto del genoma. De hecho, utilizando esta tcnica puede ocurrir que el cigoto sea infectado por varias partculas virales y los transgenes que portan se integren en mltiples sitios del genoma y que en cada lugar se integre una sola copia del transgn. La ventaja que tiene esta tcnica frente a la microinyeccin directa de fragmentos de DNA es que la eficiencia de integracin del transgn es mayor y por lo tanto la posibilidad de obtener animales transgnicos es ms alta. Adems, puesto que el transgn puede integrarse en diferentes sitios del genoma, es posible segregar las copias integradas tras procesos de cruzamiento tradicional de forma que finalmente pueden obtenerse diferentes animales transgnicos donde en cada uno de ellos el transgn est integrado en una nica copia en un nico sitio.
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DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
4. PRODUCCIN DE QUIMERAS DE RATN POR AGREGACIN DE EMBRIONES CON CLULAS MADRE EMBRIONARIAS
La finalidad de esta tcnica es la produccin de ratones denominados quimera a partir de los cuales pueden obtenerse los ratones transgnicos denominados Knock-Out y Knock-In. La tcnica consiste en poner en contacto fsico un embrin de ocho clulas de ratn, desprovisto de su zona pelcida, con un acmulo de clulas madre embrionarias que han sido previamente modificadas genticamente. El contacto se hace en un pequeo pocillo recubierto de medio de cultivo donde puedan proliferar tanto el embrin como las clulas madre embrionarias. Debido a su contacto fsico, las clulas madre se agregan (aglutinan) con las clulas (blastmeros) del embrin y, despus de cultivo durante toda la noche en las condiciones adecuadas, al da siguiente se obtiene un embrin en estado de blastocisto. El objetivo es que parte de las clulas madre utilizadas, cuanto ms mejor, formen parte de la denominada Masa Celular Interna (Inner Cell Mass, ICM) del blastocisto a partir de la cual se originar un ratn vivo. Los blastocistos as obtenidos se transfieren al tracto reproductor de una hembra de ratn receptora y en estado de pseudogestacin para la obtencin final del animal quimera (portador de clulas procedentes del embrin y de clulas procedentes de las clulas madre embrionarias utilizadas). En esta tcnica, normalmente se utilizan embriones y clulas madre que proceden de cepas de ratn con diferentes colores de pelaje de manera que si la tcnica ha tenido xito se obtendrn ratones con un pelaje de color no uniforme. Si la lnea germinal del ratn quimera obtenido ha sido colonizada por clulas procedentes de las clulas madre, mediante cruces con ratones normales de sexo opuesto puede transmitirse la modificacin gentica deseada. Dicha modificacin gentica introducida en las clulas madre no es aleatoria sino que el lugar de integracin del ADN utilizado para la modificacin es conocido ya que la integracin se produce por recombinacin homloga por lo que el resultado final del proceso es la generacin de un animal transgnico donde el transgn est integrado en lugar conocido del genoma.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs obtener ratones modificados genticamente (ratones Knock-Out prdida de funcin- o Knock-In ganancia de funcin-) en los que conocers exactamente el lugar del genoma que se encuentra modificado. DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
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5. PRODUCCIN DE QUIMERAS DE RATN POR MICROINYECCIN DE EMBRIONES DE OCHO CLULAS O BLASTOCISTOS CON CLULAS MADRE EMBRIONARIAS
La finalidad de esta tcnica es la produccin de ratones denominados quimera a partir de los cuales pueden obtenerse los ratones transgnicos denominados Knock-Out y Knock-In. La tcnica consiste en microinyectar clulas madre embrionarias de ratn, y que han sido previamente modificadas genticamente, en embriones de ratn de ocho clulas o en blastocistos. Para hacerlo, los embriones o los blastocistos de ratn son depositados y visualizados en un microscopio ptico invertido, y son sujetados mediante una microaguja de vidrio especial. Por otro lado, con otra microaguja de vidrio diferente a la anterior se recogen las clulas madre y se introducen (microinyectan) en el espacio entre las clulas (blastmeros) del embrin o bien en el espacio denominado blastocele si se utiliza un blastocisto. Las clulas madre introducidas en el embrin pueden pasar a formar parte de la Masa Celular Interna (Inner Cell Mass, ICM) del blastocisto resultante y formar parte de tejidos y rganos del animal.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs obtener ratones modificados genticamente (ratones Knock-Out o Knock-In) en los que conocers exactamente el lugar del genoma que se encuentra modificado. La inyeccin de las clulas madre directamente en el embrin aumenta sus posibilidades de que stas pasen a formar parte de Masa Celular Interna y por lo tanto de obtener un embrin quimera. As, esta tcnica es ms eficiente en la obtencin de animales transgnicos que la simple agregacin de clulas madre al embrin. DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
6. REDERIVACIN DE LNEAS DE RATN POR TRANSFERENCIA EMBRIONARIA
La rederivacin consiste en la limpieza de las lneas de ratn contaminadas con agentes patgenos. Las infecciones virales, bacterianas o con parsitos pueden interferir con los resultados de las investigaciones en los modelos animales y enmascarar o complicar la interpretacin de los resultados. Por ello, es muy importante que estos estudios sean realizados en modelos de ratn libres de patgenos especficos (SPF, Specific Pathogen Free). La rederivacin por transferencia embrionaria es la tcnica descrita ms fiable y eficaz para la erradicacin de agentes patgenos en ratn. Consiste en transferir embriones de ratn en estados de preimplantacin en hembras de ratn receptoras pseudogestantes que estn limpias de agentes patgenos. El proceso de rederivacin por transferencia embrionaria incluye los siguientes pasos:
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a.
b. c. d. e.
Recogida de los embriones en estado de preimplantacin y con su estructura denominada Zona Pellucida intacta (acta de barrera fsica contra los agentes patgenos) a partir de hembras donadoras contaminadas. Realizacin de numerosos y exhaustivos lavados de los embriones en diferentes gotas de medio de cultivo estril utilizando en cada paso pipetas estriles. Transferencia de los embriones as tratados a hembras receptoras libres de patgenos. Cuarentena de las hembras receptoras. Anlisis del estatus sanitario de los ratones finalmente obtenidos.
Ha sido descrito un gran nmero de tipos de patgenos de ratn que pueden ser eliminados por transferencia embrionaria, entre ellos: M. Pulmonis, Rotavirus murino, Parvovirus murino, adenovirus murino, virus de la hepatitis murina, virus de la encefalomielitis murina, especies de Helicobacter, as como endoparsitos y ectoparsitos.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs obtener lneas de ratn libres de patgenos especficos y por lo tanto, adecuados para su importacin a instalaciones de barrera limpia o para reemplazar poblaciones ya establecidas que hayan sufrido una infeccin espontnea o de etiologa desconocida. Adems, podrs eliminar patgenos que puedan interferir con el desarrollo de una investigacin. DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
7. FERTILIZACIN IN VITRO (FIV) DE OVOCITOS DE RATN
Se trata de una tcnica de reproduccin asistida que al igual que en otras especies de mamferos, incluida la humana, tambin es aplicable en ratn. La Fertilizacin in vitro (FIV) incluye la fertilizacin de ovocitos maduros (en metafase-II meitica) con esperma capacitado en una placa de cultivo de tejidos. Los embriones resultantes son transferidos quirrgicamente al tracto reproductor de una hembra receptora pseudogestante para obtener una camada de ratones. Esta tcnica es especialmente til en la produccin de ratones modificados genticamente ya que, a veces, la expresin de transgenes o la introduccin de mutaciones en el genoma pueden comprometer la viabilidad de los animales o afectar a su fertilidad haciendo a menudo muy difcil el mantenimiento de las lneas de animales por las tcnicas estndares de cra mediante cruces. As, la FIV puede ser utilizada cuando el macho o la hembra de ratn son incapaces de reproducirse o cruzarse de forma natural, o bien lo hacen con una baja tasa de xito.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs producir un elevado nmero de embriones preimplantacionales en estados de divisin o expandir de forma rpida el nmero de individuos de una cepa de ratn en particular. Esta tcnica tambin es til para generar descendencia a partir de esperma y/u ovocitos criopreservados para recuperacin de cepas almacenadas o para generar descendencia a partir de ratones que, por cualquier razn, no se cruzan bien o no llevan la gestacin a trmino
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DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
8. INYECCIN INTRACITOPLSMICA DE ESPERMA (ICSI) EN RATN
La ICSI es una tcnica de reproduccin asistida que, adems de ser utilizada desde el punto de vista reproductivo, tambin ha sido descrita para la obtencin de ratones transgnicos. Se trata de la introduccin artificial, por microinyeccin, de la cabeza de un espermatozoide de ratn en un ovocito de ratn para provocar la fertilizacin de este ltimo. La ICSI requiere solamente un espermatozoide por ovocito para la fertilizacin. Adems, tiene la ventaja frente a otras tcnicas de reproduccin asistida de que los espermatozoides que son utilizados para la ICSI no necesitan ser mviles o estar vivos. Para el xito de la tcnica lo nico esencial es que la cabeza o ncleo del espermatozoide est intacto en trminos de integridad gentica. Adems, para la ICSI en ratn basta con introducir la cabeza del espermatozoide, por lo que es usual separar la cabeza de la cola antes de la inyeccin de la cabeza del espermatozoide dentro del ovocito, resultando esencialmente en una transferencia nuclear. En la produccin de ratones transgnicos mediante la ICSI, el esperma es incubado en presencia del fragmento de ADN (transgn) que se pretende incorporar en el genoma del ratn. Se ha descrito la produccin de ratones transgnicos, mediante ICSI utilizando fragmentos discretos de ADN (5-14 Kb) pero tambin es posible utilizar eficientemente transgenes de mayor tamao (45-250 Kb) como son los Cromosomas Artificiales Bacterianos (Bacterial Artificial Chromosomes, BACs), los Cromosomas Artificiales de Mamferos (Mammalian Artificial Chromosomes, MACs) y los Cromosomas Artificiales de Levadura (Yeast Artificial Chromosomes, YACs).
APLICACIN: Con esta tcnica podrs producir embriones preimplantacionales en estados de divisin o expandir de forma rpida el nmero de individuos de una cepa de ratn en particular. Esta tcnica tambin es til para generar descendencia a partir de esperma y/u ovocitos criopreservados para recuperacin de cepas almacenadas o para generar descendencia a partir de ratones que, por cualquier razn, no se cruzan bien o no llevan la gestacin a trmino. La ventaja de esta tcnica frente a la Fecundacin In Vitro es que no se necesita disponer de un gran nmero de espermatozoides (basta con un solo espermatozoide) y que adems stos no han de estar vivos o disponer de motilidad (basta con que tengan intacto el ncleo). As, podrs utilizar esperma congelado o liofilizado. DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
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9. INTERRUPCIN DE GENES EN CLULAS MADRE EMBRIONARIAS DE RATN
Consiste en la interrupcin de un gen mediante recombinacin homloga. La interrupcin se realiza en clulas madre embrionarias de ratn, con lo cual las clulas modificadas pueden dar lugar a un embrin modificado que de prosperar generar un animal con el gen interrumpido.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs estudiar el efecto que tiene en el desarrollo embrionario la supresin o modificacin de la expresin de un gen particular. Tambin podrs generar ratones Knockout para un gen concreto. DISPONIBLE EN: Departamento: Cardiologa Regenerativa Laboratorio: Sealizacin Celular Responsable: Kenneth McCreath
10. CRIOPRESERVACIN DE LNEAS DE RATN
Se trata del mantenimiento, mediante congelacin de embriones o esperma de ratn, de aquellas cepas de ratn que no son utilizadas en un determinado periodo de tiempo y su posible recuperacin si fuese necesario. Esta tcnica es especialmente til para preservar cepas de ratones modificados genticamente sin necesidad de estabular individuos adultos, reduciendo los costes de mantenimiento y evitando el proceso de deriva gentica. La criopreservacin de los embriones de ratn puede realizarse en todos los estadios de preimplantacin de los mismos y bsicamente consiste en exponer los embriones a un agente crioprotector y almacenarlos en nitrgeno lquido a -196C. Este proceso puede realizarse de diferentes formas. Por un lado, con equilibrado previo, en el que el enfriamiento se hace de forma progresiva y lenta hasta alcanzar la temperatura final de almacenamiento. Por otro lado, el enfriamiento puede hacerse de forma rpida, es decir, sin equilibrado previo, de forma que los embriones son transferidos directamente a la temperatura final de almacenamiento.
APLICACIN: Con esta tcnica podrs almacenar de forma indefinida y en un espacio limitado cepas de ratn para su posterior recuperacin. DISPONIBLE EN: Unidad de Transgnesis Responsable: Luis Miguel Criado Rodrguez
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SI TRABAJAS CON EMBR IONES EMBRIONES DE POL LO
EMBRIONES DE POLLO
1. EMBRIOLOGA EXPERIMENTAL EN EMBRIONES DE POLLO
Se analizan clulas de embrin de pollo, para estudiar las regiones reguladoras de determinados genes implicados en el desarrollo embrionario, como aqullos relacionados con las primeras decisiones de linaje que ocurren en el embrin, los genes relacionados con el mantenimiento de la pluripotencia embrionaria, o los implicados en hematopoyesis temprana.
APLICACIN: Anlisis de la regulacin transcripcional de los genes que controlan el desarrollo embrionario en aves. Una de las ventajas de estudiar desarrollo embrionario en pollos es que sus embriones son fcilmente accesibles y pueden manipularse in ovo; adems permiten realizar experimentos de ablacin o sustitucin en zonas especficas. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Genmica Funcional de la Pluripotencia Embrionaria y del Desarrollo del Corazn Responsable: Miguel Manzanares
2. MANIPULACIONES DEL EMBRIN DE POLLO
La tcnica consiste en transplantar tejidos o grupos de clulas en distintas regiones de un embrin receptor. Esto permite realizar experimentos de trazado de linaje, anlisis funcionales de regiones embrionarias o aplicacin de molculas secretadas. En estos experimentos pueden utilizarse embriones de pollo en estadios de organognesis.
APLICACIN: Los embriones de pollo son utilizados como modelo para desarrollar sobre l tcnicas estndar en biologa del desarrollo y para estudiar la morfognesis de los rganos, analizando el comportamiento celular y las interacciones entre distintos tejidos. La principal ventaja de utilizar embriones de pollo como modelo de investigacin es su fcil accesibilidad y la sencillez y bajo coste de su mantenimiento DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Papel de Nuevos Genes en el Desarrollo Cardiovascular Responsable: Juan Jos Sanz-Ezquerro
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SI TRABAJAS CON EMBR IONES EMBRIONES DE POL LO
3. APLICACIN DE MOLCULAS EN EMBRIONES DE POLLO IN OVO
Utilizando tcnicas de vehiculizacin, en concreto a travs de microesferas, se introducen dentro del huevo de un embrin de pollo molculas de inters. Pueden aplicarse, por ejemplo, factores de crecimiento o moduladores de las rutas de sealizacin. Las sustancias que se aplican no entran necesariamente en las clulas del embrin, sino que pueden introducirse a nivel de tejido o embrin e iniciar igualmente una cascada de sealizacin. APLICACIN: Mediante esta tcnica pueden activarse o bloquearse determinadas rutas de sealizacin celular y caracterizar as el papel de esas vas en el desarrollo de distintos rganos durante el desarrollo embrionario. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Papel de Nuevos Genes en el Desarrollo Cardiovascular Responsable: Juan Jos Sanz-Ezquerro
4. ELECTROPORACIN EN EMBRIN DE POLLO
Consiste en introducir plsmidos de expresin en el embrin de pollo mediante la tcnica de electroporacin (aplicando una descarga elctrica). APLICACIN: la tcnica de electroporacin en embrin de pollo es til para expresar genes de inters de manera ectpica. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Papel de Nuevos Genes en el Desarrollo Cardiovascular Responsable: Juan Jos Sanz-Ezquerro
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SI TRABAJAS CON EMBR IONES EMBRIONES DE PEZ CEB RA
EMBRIONES DE PEZ CEBRA
1. MICROINYECCIN DE MOLCULAS EN OOCITOS DE PEZ CEBRA
Inyectando morfolinos o RNA mensajero en los ovocitos del pez cebra pueden realizarse estudios de ganancia o prdida de funcin gnica.
APLICACIN: Podrs determinar el efecto de la expresin de un gen concreto en el desarrollo de vertebrados y estudiar la ganancia o perdida de funcin de un gen de inters. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Desarrollo de la Vasculatura Coronaria en Pez Cebra Responsable: Nadia Mercader
2.
GENERACIN DE PECES CEBRA MOSAICOS
Consiste en transplantar clulas manipuladas genticamente en un embrin de pez cebra durante el proceso de gastrulacin con el objetivo de generar un embrin mosaico, es decir, que contenga poblaciones celulares con distinta dotacin gentica. APLICACIN: Podrs analizar el efecto celular de una modificacin gentica concreta. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Desarrollo de la Vasculatura Coronaria en Pez Cebra Responsable: Nadia Mercader
3. HIBRIDACIN IN SITU DE ARNM EN EMBRIONES DE PEZ CEBRA
Esta tcnica permite detectar la expresin de un ARNm de inters dentro de un tejido o embrin. En la hibridacin in situ se hibrida un embrin previamente fijado, o una seccin de embrin con una cadena de ARN complementaria al ARNm que se desee detectar. El ARN antisense, que se ha generado in vitro contiene nucletidos modificados. Despus de la hibridacin, se incuba el embrin o la seccin con un anticuerpo acoplada a la fosfatasa alcalina contra el nucletido modificado. Mediante una reaccin enzimtica se consigue un precipitado de color en aquellas regiones del embrin donde se encuentra el ARNm en cuestin.
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SI TRABAJAS CON EMBR IONES EMBRIONES DE PEZ CEB RA
APLICACIN: Con esta tcnica podrs localizar la expresin de un determinado gen en el embrin. Esta tcnica se puede emplear para la deteccin de la expresin gnica en el embrin entero (in toto) o en secciones de parafina. DISPONIBLE EN: Departamento: Biologa del Desarrollo Cardiovascular Laboratorio: Desarrollo de la Vasculatura Coronaria en Pez Cebra Responsable: Nadia Mercader
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Catlogo de Capacidades Cientfico Tcnicas

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

SI TRABAJAS CON GENES

ANLISIS DE INTERACCIN PROTENA-DNA O PROTENA-RNA

TRANSGNESIS GENMICA COMPARADA ANALISIS DE POLIMORFISMOS Y HAPLOTIPOS HIBRIDACIN IN SITU

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS

MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS IN VIVO

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

DETECCIN ANATMICA DE RGANOS AISLAMIENTO DE RGANOS

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

SI TRABAJAS CON PROTENAS

IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE PROTENAS

ANLISIS DE INTERACCIONES PROTENA-LIGANDO

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

Ensayos Pull-Down............................................................................................................................. 51 Inmunoprecipitacin de cromatina (ChIP y ChIP on Chip) ................................................................. 52

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

SI TRABAJAS CON CLULAS Y TEJIDOS

Separacin de poblaciones celulares mediante citometra de flujo (cell sorting) ............................. 63

ANLISIS DE POBLACIONES CELULARES

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

VEHICULIZACIN DE MOLCULAS AL INTERIOR CELULAR

MICOSCOPA CONFOCAL Y MULTIFOTN

NDICE DE CONTENI DOS DE L C ATLOGO

SI TRABAJAS CON EMBRIONES

EMBRIONES DE PEZ ZEBRA

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA

SI TRABAJAS CON GENES

1. ANLISIS DE LA ACTIVIDAD DE PROMOTORES MEDIANTE GENES REPORTEROS

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA

- microarrays de Agilent Technologies - microarrays de Affymetrix

3. PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA

5. SHORT INTERFERING RNA/SMALL INTERFERING RNA (SIRNA)

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA

7. INMUNOPRECIPITACIN DE CROMATINA (CHIP Y CHIP ON CHIP)

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA

10. PRIMER EXTENSION

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE EXPRESI N GNICA

11. LIBRERAS DE MICRORNA

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE INTERACC IN PROTE NA -DNA O PROTENA RNA

ANLISIS DE INTERACCIN PROTENA-DNA O PROTENA-RNA

2. HUELLA GENTICA O FOOTPRINTING

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE INTERACC IN PROTE NA -DNA O PROTENA RNA

SI TRABAJAS CON GENE S TRA NSGNESIS

SI TRABAJAS CON GENE S GE NMICA COMPARADA

SI TRABAJAS CON GENE S AN LISIS DE POLI MORF ISMOS Y HA PLOTIPOS

ANALISIS DE POLIMORFISMOS Y HAPLOTIPOS

SI TRABAJAS CON GENE S HI BRIDACIN I N SITU

SI TRABAJAS CON MODELOS DE PROCESOS BIOLGICOS

1. MODELO DE ADHESIN LEUCOCITARIA EN MONOCAPAS ENDOTELIALES

2. MODELO DE MIGRACIN O EXTRAVASACIN LEUCOCITARIA A TRAVS DE MONOCAPAS ENDOTELIALES

3. MODELO DE PERMEABILIDAD DEL ENDOTELIO

4. MODELO DE FORMACIN DE ANGIOTUBOS EN MATRIGEL

5. MODELO DE INVASIN EN COLGENO I

6. MODELO DE ISQUEMIA CEREBRAL MURINA

7. MODELO DE MIGRACIN CELULAR Y CIERRE DE HERIDA (MODELO IN VITRO DE REENDOTELIZACIN)

8. MODELO DE DIFERENCIACIN DE CLULAS DENDRTICAS

9. MODELO DE ACTIVACIN DE LINFOCITOS Y ESTUDIO DE LA POLARIZACIN DE LA RESPUESTA INMUNE

10. MODELO DE GENERACIN DE SINAPSIS INMUNOLGICA DE PRESENTACIN ANTGENO Y SUPERANTGENO DEPENDIENTES

11. MODELO DE SILENCIAMIENTO DE ILK EN CLULAS ENDOTELIALES