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SECCIN 2.1.

ENFERMEDADES DE PECES

CAPTULO I.1.

INFORMACIN GENERAL

A. BASES GENERALES DE LOS PROGRAMAS DE VIGILANCIA Y CONTROL SANITARIO PARA PECES 1. PATGENOS Y ENFERMEDADES ESTUDIADAS
Los patgenos y las enfermedades de peces se incluyen en el Cdigo Sanitario de Animales Acuticos (el Cdigo Acutico) segn las siguientes consideraciones bsicas: las enfermedades resisten la terapia o responden escasamente a ella, tienen una distribucin geogrfica restringida, son de gran importancia socio-econmica, y ocurren en especies implicadas en el mercado internacional. Para la lista actual de enfermedades de peces de la OIE, consulte la ltima edicin del Cdigo Acutico. Este Manual de animales acuticos contiene captulos sobre enfermedades enumeradas en el Cdigo de animales acuticos y otros captulos sobre enfermedades de importancia comercial.

2. ENFOQUE GENERAL DEL CONTROL SANITARIO ANIMAL EN CULTIVOS DE PECES


Un abordaje completo del control sanitario animal en cultivos de peces requiere: Una evaluacin del estado sanitario de los animales empleando mtodos basados en las disposiciones del captulo 1.1.4. La obligacin de reabastecer las instalaciones de aguas libres o cerradas solamente con animales que tengan un estado sanitario superior o igual al de los animales que ya viven en las reas consideradas. La erradicacin, cuando sea posible, de la enfermedad mediante el sacrificio de las existencias infectadas, la desinfeccin de las instalaciones y la repoblacin con peces libres de enfermedad y de origen aprobado. La notificacin por parte de cada pas miembro de sus necesidades particulares, adems de aquellas consideradas en el Cdigo Acutico, para la importacin de animales acuticos y de productos de animales acuticos.

Si se siguen los procedimientos anteriores, es posible dar una seguridad adecuada del estado sanitario de los productos de acuicultura en cuanto a las enfermedades especificadas y respecto a su pas, zona o lugar de origen. La emisin de un certificado sanitario por el funcionario adecuado, basado en un informe sobre el estado sanitario y en exmenes de los animales acuticos, proporciona la seguridad de que los productos de acuicultura de un envo definido se originan en un pas, zona, granja o sitio de recoleccin que est libre de una o ms de las enfermedades especificadas que se relacionan en el Cdigo Acutico y posiblemente de otras enfermedades (ver modelo de certificado internacional en el Cdigo Acutico).

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Captulo I.1. Enfermedades de peces: Informacin general

La evaluacin del estado sanitario de las existencias de peces se basa en la inspeccin de los sitios de produccin pisccola y en el examen posterior de muestras en el laboratorio, procedentes de ejemplares de peces tomados de las existencias de una poblacin definida de peces. Este objetivo requiere que las muestras se recojan siguiendo tablas de tamao de muestreo definidas y que se procesen con base en mtodos aceptados. Para los patgenos de animales acuticos se aplican varias tcnicas. A efectos de anlisis y diagnstico, el Manual de animales acuticos ha establecido dos tipos de procedimientos de examen que son aceptables para dicho fin: 1) Mtodos de anlisis, y 2) Mtodos de diagnstico. Los mtodos aceptados se indican en cada captulo de la enfermedad.

B. PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO 1. RECOGIDA DE EJEMPLARES DE PECES


1.1. Diagnstico en una situacin de enfermedad Debera recogerse un nmero mnimo de diez peces moribundos o de diez peces que manifiesten signos de la enfermedad en cuestin: los peces deben estar vivos cuando se recogen y deben enviarse vivos o muertos al laboratorio, envasados por separado en contenedores cerrados aspticos y refrigerados, o en hielo. Debe evitarse de forma especial la congelacin de los peces recogidos. No obstante, es preferible y se recomienda la recoleccin de muestras de rganos de los peces inmediatamente despus de haber sido seleccionados en el sitio de produccin, y despus guardar y procesar las muestras como se describe en las secciones 2 y 3. Debera unirse a cada muestra una etiqueta de identificacin que contenga informacin sobre el lugar, tiempo, fecha, especie, nmero de muestras recogidas, estado muerto o moribundo del ejemplar al recogerse, y nombre y datos de contacto del individuo que tom la muestra. 1.2. Peces con apariencia clnica normal La recoleccin de peces debe abarcar un nmero de ejemplares estadsticamente significativo, pero resulta obvio que la falta de deteccin de algunos patgenos en la muestra no garantiza la ausencia de dichos agentes en la muestra examinada o en las existencias pisccolas. Esto es particularmente cierto en el caso de poblaciones libres o domesticadas de las que resulta difcil tomar una muestra representativa y aleatoria. Sin embargo, el riesgo de que un patgeno escape al sistema de vigilancia se reduce en las piscifactoras cuyas existencias se han inspeccionado y comprobado para patgenos durante varios aos (al menos 2), en la medida en que no se hayan expuesto a una posible recontaminacin por peces en vida libre. Cuando un sitio determinado de produccin de peces se dedica a la cra de salmnidos, para los ensayos de Renibacterium salmoninarum y de algunos agentes de enfermedades vricas, es preferible que una de las muestras que se hacen cada ao se dedique al anlisis de los productos sexuales (esperma y fluido ovrico), que liberan los reproductores en el momento del desove (ver ms abajo). Si las poblaciones de peces adultos incluyen peces de diferentes edades, deben seleccionarse para el muestreo los peces de mayor edad. Las muestras deben abarcar todas las especies del lugar que sean susceptibles (ver los captulos pertinentes de este Manual de animales acuticos para la lista de especies susceptibles de cada enfermedad), y en el grupo de muestras debe estar representado cada lote de una especie. Un lote se define como un grupo de la misma especie que comparte un mismo suministro de agua y que se origina de una misma descendencia o poblacin reproductora. El origen geogrfico de las muestras debe definirse con el nombre del sitio de muestreo asociado con sus coordenadas geogrficas o con su localizacin respecto al curso de un ro o de un cuerpo de agua.

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Captulo I.1. Enfermedades de peces: Informacin general

Si en la poblacin pisccola que se muestrea estn presentes algunos peces moribundos, stos deben seleccionarse con preferencia para la coleccin de muestras, y el resto de la muestra debe contener peces vivos seleccionados al azar de todas las unidades de cultivo que representen el lote examinado.

En el captulo 1.1.4 de este Manual de animales acuticos se presenta un enfoque general de la inspeccin y el muestreo. El muestreo debe disearse de modo que haga posible la deteccin de los animales infectados, con un nivel de confianza del 95%. La siguiente seccin suministra informacin pertinente sobre el muestreo de peces con aleta. El cuadro 1 puede emplearse para calcular el tamao de la muestra, hasta que se consideren los detalles especficos de cada enfermedad en los captulos dedicados a las enfermedades individuales en este Manual de animales acuticos. Como en el caso de los peces infectados clnicamente, deben tomarse muestras de rganos y fluidos tan pronto como sea posible tras la recogida de las muestras de peces. Debe evitarse la congelacin de las muestras. 1.3. Especificaciones de muestreo segn los objetivos de un programa determinado de vigilancia para peces. En el captulo 1.1.4 de este Manual de animales acuticos se presenta un enfoque general de la vigilancia y muestreo. El muestreo debe disearse de modo que haga posible la deteccin de los animales infectados, con un nivel de confianza del 95%. La siguiente seccin suministra informacin pertinente sobre el muestreo de peces con aletas. Para pruebas diagnsticas en que se ha establecido la sensibilidad y la especificidad, se puede determinar el tamao de la muestra empleando mtodos como el FreeCalc (www.ausvet.com.au) o programas similares, segn se indica en el captulo 1.1.4 bajo el epgrafe Requisitos de vigilancia para el reconocimiento internacional de la ausencia de infeccin. Sin embargo, para aquellas pruebas diagnsticas en las que no se ha establecido la sensibilidad y la especificidad, el tamao de la muestra debe determinarse por defecto a partir del cuadro1 del presente captulo.

Cuadro 1. Tamao de muestra aleatoria en funcin de la supuesta prevalencia del patgeno en el lote, adjudicando a la
tcnica un 100% de sensibilidad y especificidad.
Tamao de la muestra a prevalencia del 2% 50 75 110 130 140 140 145 145 145 150 Tamao de la muestra a prevalencia del 5% 35 45 50 55 55 55 60 60 60 60 Tamao de la muestra a prevalencia del 10% 20 23 25 26 27 27 27 27 27 30

Tamao del lote 50 100 250 500 1000 1500 2000 4000 10.000 100.000 o ms

Segn Ossiander & Wedemeyer, 1973.

a) Determinacin del estado sanitario de una reserva/poblacin de peces en un sitio determinado de inspeccin Cada unidad de cultivo de peces debe inspeccionarse dos veces al ao durante dos aos en la fase apropiada de la vida del pez, y a veces en la fase apropiada del ao, cuando la temperatura y la estacin ofrecen la mayor oportunidad de observar signos clnicos y de aislar los patgenos. En cada ocasin, se deben recoger los peces de las especies susceptibles que aparecen en el Cdigo Acutico para la enfermedad en cuestin, a fin de detectar una prevalencia de infeccin igual o superior al 2% a un nivel de confianza del 95%. Con frecuencia, se toman 150 peces en cada ocasin. Si durante una de las dos

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Captulo I.1. Enfermedades de peces: Informacin general

inspecciones estn presentes los reproductores, se tomarn hasta 150 muestras de fluidos ovricos en dicha unidad de cultivo de peces. Si la vigilancia sanitaria de los peces se realiza en poblaciones de peces libres en un sitio determinado de inspeccin, o en estanques de crianza sin instalaciones de retencin, en las que pueden juntarse diferentes cultivos de peces, se deben recoger 150 ejemplares de peces una vez al ao durante dos aos. En la medida que sea posible, se deben recoger con preferencia los peces de ms edad y/o el fluido ovrico de los salmnidos. Durante este perodo de dos aos, la unidad de produccin pesquera solo puede recibir peces de una unidad cuyo estado sanitario ya haya sido aprobado y sea igual o superior al estado sanitario que se desea para la instalacin que est siendo inspeccionada. b) Mantenimiento del estado sanitario Las inspecciones deben continuar dos veces por ao despus de que una unidad de produccin pesquera, incluyendo unidades de produccin en estanques equipados con instalaciones de retencin, haya sido reconocida como libre de todas o de alguna de las enfermedades listadas en el Cdigo Acutico tras 2 aos de vigilancia, con pruebas de laboratorio y con ausencia de cualquier sntoma clnico sospechoso. Un establecimiento de acuicultura que se haya reconocido como libre de infeccin puede mantener su reconocimiento oficial como libre de infeccin siempre que se mantengan continuamente las condiciones bsicas de bioseguridad. Un establecimiento de acuicultura que se haya reconocido libre de infeccin puede interrumpir la vigilancia dirigida y mantener su reconocimiento oficial como libre de infeccin siempre que se mantengan continuamente las condiciones bsicas de bioseguridad. La unidad de produccin pesquera solo puede recibir peces cuyo estado sanitario sea igual o superior al de los ya presentes. Las especificaciones anteriores de muestreo para la determinacin y mantenimiento del estado sanitario de los peces en sitios concretos de produccin pesquera presuponen que estn en vigor todas las precauciones detalladas en la seccin A.2 (enfoque global para el control sanitario animal en cultivos de peces).

2. MATERIAL DE MUESTRAS USADO EN PRUEBAS VRICAS Y BACTERIOLGICAS


El material de muestra depende del tamao de los animales y del objeto de la prueba, es decir, vara segn se trate del diagnstico de una enfermedad abierta o de la deteccin de peces que son portadores subclnicos del patgeno. 2.1. Especificaciones segn el tamao del pez Alevines y cras con saco vitelino: la muestra es el pez entero pero se elimina el saco vitelino si est presente. Peces de 4 a 6 cm: se toman todas las vsceras incluyendo el rin. Se puede obtener un trozo del encfalo tras cortar la cabeza al nivel del borde posterior del oprculo y apretar lateralmente. Peces de ms de 6 cm: se toma el rin, bazo y corazn o encfalo. Reproductores: se toma el fluido ovrico y/o tejidos. 2.2. Especificaciones segn el estado clnico En el caso de infeccin clnica, adems de alevines enteros o vsceras completas, los rganos para muestreo en pruebas de virus son el rin anterior, el bazo y el corazn o el encfalo; para pruebas bacteriolgicas, el rin o el bazo; y cuando se muestrea para pruebas del sndrome epizotico ulcerativo, la piel o el msculo. Se toman muestras de diez peces muertos y se combinan para formar grupos con un mximo de cinco peces cada uno.

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Captulo I.1. Enfermedades de peces: Informacin general

Para detectar portadores subclnicos, las muestras pueden combinarse en grupos de hasta cinco peces por grupo. Los grupos de fluido ovrico de cinco peces reproductores no deben superar un volumen total de 5 ml, es decir, 1 ml por reproductor. Estas muestras de fluido ovrico se toman individualmente de cada hembra muestreada y no se recogen despus de la puesta de huevos. Una vez que se han extrado los rganos y/o el fluido ovrico de los peces muestreados aspticamente, se dividen en dos partes si se va a realizar un examen bacteriolgico y vrico.

3. TRATAMIENTO GENERAL DE MUESTRAS DE RGANOS O FLUDOS PARA EXAMEN VRICO


3.1. Transporte y tratamiento de las muestras con antibiticos Los grupos de rganos o de fluidos ovricos se colocan en viales estriles y se guardan a 4C hasta que se realiza la extraccin del virus en el laboratorio. La extraccin de virus debe llevarse a cabo preferentemente dentro de las 24 horas siguientes al muestreo de los peces, pero es aceptable hasta las 48 horas. Las muestras de rganos tambin pueden transportarse al laboratorio colocndolas en viales que contengan un medio de cultivo para clulas o solucin salina equilibrada de Hanks (HBSS), con antibiticos que se aaden para evitar el crecimiento de contaminantes bacterianos (un volumen de rgano en al menos cinco volmenes de lquido de transporte). Las concentraciones adecuadas de antibiticos son: gentamicina (100 g/ml) o penicilina (800 Unidades Internacionales [UI]/ml) y estreptomicina (800 g/ml). Tambin pueden incorporarse al medio de transporte los compuestos antifngicos Mycostatin o Fungizona a una concentracin final de 400 UI/ml. Para estabilizar los virus, si el tiempo de transporte supera las 12 horas, se puede aadir suero o albmina (5-10%). 3.2. Extraccin de virus Este procedimiento se realiza por debajo de 15C, y preferiblemente entre 0 y 5C. Se decanta el medio suplementado con antibiticos del rgano de la muestra. Se homogeneiza los grupos de rganos en medio de transporte a una dilucin final de 1/10 utilizando un mortero con mano o un homogeneizador elctrico hasta obtener una pasta. Se centrifuga el homogeneizado en una centrfuga refrigerada a 2-5C y 2.000-4.000 g durante 15 minutos, recoger el sobrenadante y tratarlo cuatro horas a 15C, o durante toda la noche a 4C, con antibiticos, por ejemplo, con gentamicina 1mg/ml. Si el envo de la muestra se ha realizado en un medio de transporte (es decir, con exposicin a antibiticos), puede omitirse el tratamiento del sobrenadante con antibiticos. El tratamiento con antibitico hace innecesario el filtrar a travs de filtros de membrana. De modo anlogo, las muestras de fluido ovrico pueden tratarse con antibiticos para controlar la contaminacin microbiana. En ningn caso las muestras de homogeneizados o de fluidos ovricos pueden diluirse ms de dos veces. Las muestras de fluido ovrico deben centrifugarse del mismo modo que los homogeneizados de rganos, y los sobrenadantes se emplean directamente para los pasos siguientes. 3.3. Tratamiento para neutralizar virus enzoticos En algunos pases, con frecuencia los peces son portadores subclnicos de virus enzoticos, como el virus de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV), que puede inducir en cultivos celulares susceptibles un efecto citoptico (CPE) y, por tanto, complicar el aislamiento y la identificacin de patgenos concretos. En tales situaciones, la capacidad infecciosa de los virus enzoticos debera neutralizarse antes de realizar ensayos para los virus listados en el Cdigo Acutico. Sin embargo, cuando es importante determinar si est presente uno de los virus enzoticos, las muestras deben ensayarse con y sin la presencia de anticuerpos neutralizantes (NAbs).

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Captulo I.1. Enfermedades de peces: Informacin general

Para neutralizar los birnavirus acuticos, se mezclan volmenes iguales (200 l) de una solucin de NAbs contra los serotipos del birnavirus endgeno y del sobrenadante de prueba. Se deja reaccionar la mezcla durante 1 hora a 15C, o durante toda la noche a 4C, antes de la inoculacin a monocapas de clulas susceptibles. El ttulo de la solucin de NAb empleada (puede ser un suero multivalente) debera ser de al menos 2000 en un ensayo de reduccin de placas al 50% contra los serotipos vricos presentes en el rea geogrfica dada. Cuando se considera que las muestras de un pas, de una regin, de una poblacin de peces o de una unidad de produccin estn libres de infecciones vricas enzoticas, puede omitirse este tratamiento del homogeneizado de los rganos. Este esquema tambin puede utilizarse para neutralizar otros virus enzoticos del rea que se est analizando.

4. PROCESAMIENTO GENERAL DE MUESTRAS PARA EXAMEN BACTERIOLGICO


Como en el caso de las infecciones vricas, se pueden usar los rganos internos como fuente para el aislamiento cuando se sospeche cualquier infeccin sistmica. Sin embargo, la proliferacin activa de microorganismos saprofitos supone una desventaja tan importante que para los exmenes bacteriolgicos se emplean tejidos frescos recin tomados. El hecho de que no se puedan aadir sustancias antibiticas al medio de transporte en el que se recogen las muestras refuerza esta preferencia.

C. MATERIALES Y PRODUCTOS BIOLGICOS NECESARIOS PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE PATGENOS DE PECES 1. VIRUS DE PECES
1.1. Lneas celulares de peces Las siguientes lneas celulares de peces son necesarias para ensayos de los patgenos de peces mencionados en el Cdigo Acutico: Mojarra oreja azul (BF-2) Salmn real (CHSE-214) Epithelioma papulosum cyprini (EPC) Trucha arco iris (RTG-2) Carpita cabezona (FHM) Ronco catire (GF) Rin ceflico de salmn (SHK1) Rin de salmn atlntico (ASK) 1.2. Medios de cultivo El medio usado ms ampliamente para el cultivo de clulas de peces es el tradicional medio mnimo esencial de Eagle (MEM) con sales de Earle y suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, antibiticos y 2mM de L-glutamina. No obstante, el medio de Stocker, que es una forma modificada del medio anterior con doble concentracin de algunos aminocidos y vitaminas, se recomienda particularmente para aumentar el crecimiento celular, empleando los mismos suplementos que los arriba indicados ms un 10% de triptosa fosfato. Estos medios se tamponan con bicarbonato sdico, con 0,16 M de tris-hidroximetil aminometano (Tris) HCl o los cortes preferiblemente los cortes con 0,02 M de cido N-2-hidroxietil-piperazinaN-2-etanosulfnico (HEPES). El uso de bicarbonato sdico se restringe solo a cultivos celulares mantenidos en recipientes de cultivo celular muy bien cerrados.

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Alternativamente, para algunas lneas celulares como la SHK1, se puede usar el medio de Leibovitz (L15) suplementado con FBS (al 5 o 10%), L-glutamina (4 mM) y gentamicina (50 g/ml). Para el crecimiento celular, el contenido normal de FBS en el medio es del 10%, mientras que para el aislamiento de virus o para la produccin de virus el FBS puede reducirse hasta el 2%. De modo similar, el pH del medio de cultivo para el crecimiento de las clulas es de 7,3-7,4 y se ajusta a 7,6 para la produccin de virus o para el ensayo de virus. La composicin de la mezcla de antibiticos utilizada con ms frecuencia es penicilina (100 IU/ml) y dihidroestreptomicina (100 g/ml). Si se espera una contaminacin por hongos puede usarse Mycostatin (50 IU/ml). Se pueden emplear otros antibiticos y otras concentraciones de antibiticos segn la conveniencia del operador dependiendo de la sensibilidad antibitica de las cepas bacterianas encontradas. 1.3. Controles positivos para virus y preparacin de antgeno a) Nomenclatura de los virus Virus de la necrosis hematopoytica epizotica (EHNV) Virus de la necrosis hematopoytica infecciosa (IHNV) Virus de la viremia primaveral de la carpa (SVCV) Virus de la septicemia hemorrgica vrica (sinnimo, virus Egtved) Virus de la anemia infecciosa del salmn (ISAV) Iridovirus de la dorada japonesa del Mar Rojo (RSIV) Virus de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV)

b) Poduccin de virus Para la produccin de la mayora de estos virus deben inocularse los cultivos celulares susceptibles (ver las secciones correspondientes en este Manual de animales acuticos) con multiplicidades de infeccin (m.o.i.) ms bien bajas, es decir, de 10-2 a 10-3 unidades formadoras de placas (PFU) por clula. Para la propagacin de los virus, las temperaturas ptimas son: 15C para IHNV, VHSV, ISAV y IPNV 20C para SVCV 22C para EHNV 25C para RSIV

c) Conservacin y depsito de los virus Centrifugar los cultivos celulares infectados a 2-5C y 2.000-4.000 g durante 15 minutos, despus diluir los sobrenadantes que contienen los virus hasta obtener ttulos vricos de alrededor de 1-2 106 PFU/ml. Distribuir las suspensiones vricas resultantes en viales estriles conteniendo 0,3-0,5 ml cada uno. Congelar y almacenar cada serie de stock de virus estndar a 80C o en nitrgeno lquido, y comprobar su ttulo vrico a intervalos regulares si no se han empleado durante mucho tiempo. Liofilizacin: el almacenamiento de las muestras de siembra de las cepas de virus estndar a largo plazo (dcadas) se realiza por liofilizacin. Con este fin, antes del proceso, las suspensiones vricas en el medio de cultivo celular suplementado con FCS al 10% se mezclan (v/v) con un volumen igual de medio de crioconservacin (como, por ejemplo, hidrolizado de lactoalbmina al 20% en agua destilada). Los lifilos se sellan o se taponan al vaco y se guardan a 4C en la oscuridad.

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2. BACTERIAS DE PECES
2.1. Medios de cultivo Pocas especies de bacterias patgenas de peces requieren medios especiales de cultivo, y la mayora de las peptonas que se utilizan normalmente para aislamiento (tripsina-soja, cerebrocorazn, etc.) pueden emplearse adecuadamente. Sin embargo, las bajas temperaturas ptimas de algunas especies causan un crecimiento lento, y durante el aislamiento se obtienen con frecuencia colonias pequeas. En estos casos, para mejorar el cultivo se suelen aadir factores de enriquecimiento, como suero o sangre al 5-10%. Contrariamente, Renibacterium salmoninarum es un organismo muy difcil de crecer y requiere medios especiales enriquecidos con cistena (No. A11B). En el caso de los peces, la bacteriologa se lleva a cabo a temperaturas entre 20 y 26C. Resulta a veces til o necesario tener acceso a diversas estufas. Renibacterium salmoninarum, Flavobacterium psychrophilus y otras bacterias necesitan 15C para un crecimiento ptimo, y muchas de las bacterias aisladas de peces de agua caliente pueden incubarse a 30C para acelerar las etapas del diagnstico. 2.2. Almacenamiento de los cultivos Las cepas bacterianas se pueden guardar a corto plazo en medios ordinarios, manteniendo los tubos con agar inclinado o los cultivos lquidos a 4C. Para muchas cepas, el uso de medios comerciales o de cultivo en agar inclinado, recubiertos con una capa de aceite mineral, extiende la viabilidad a 1-2 aos manteniendo las mismas condiciones sin especiales requisitos adicionales. La congelacin es probablemente el mejor modo de conservar las suspensiones bacterianas de ttulos elevados. Sin embargo, no siempre evita que cambien algunas caractersticas fenotpicas. Cuando es importante la estabilidad de alguna caracterstica, como la virulencia, puede ser mejor emplear la liofilizacin, aunque el nmero de bacterias viables puede descender notablemente. Se han propuesto diversas clases de aditivos para mejorar la eficacia de la congelacin y de la liofilizacin, en el primer caso principalmente glicerol (5-15%), y en el segundo leche desnatada, lactosa o dextrano (5-10%). No hay una regla general, y las condiciones ms convenientes tienen que determinarse para todas las especies en ensayos previos. La adicin a cultivos frescos de un volumen de aditivo que contenga Bactopeptona al 11% + Dextrano al 4% ha proporcionado excelentes resultados en la liofilizacin de algunas bacterias de peces, pero en muchos casos merecen ensayarse otras frmulas.

3. SEROLOGA
3.1. Produccin de antisueros de conejo y de anticuerpos policlonales contra virus de peces Hay varios modos de obtener anticuerpos de conejo contra virus de peces. No obstante, el ttulo y la especificidad estn influenciados por el programa de inoculacin utilizado. Los siguientes protocolos de inmunizacin se pueden emplear para producir antisueros para uso en el aislamiento de virus y/o en procedimientos de identificacin que se describen ms tarde. a) Antisueros contra el virus de la necrosis pancretica infecciosa Inyeccin intravenosa el da 0 con 50-100 g de virus purificado, seguida de una inoculacin idntica de recuerdo el da 21, y sangra 5-7 das ms tarde. Los conejos pueden reutilizarse si la sangra no es completa. b) Antisueros contra otros virus Los protocolos de inmunizacin alternan una inyeccin intramuscular o intradrmica con posteriores dosis intravenosas de recuerdo:

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Da 0: inyeccin primaria, se mezcla (v/v) 500-1.000 g de virus purificado con adyuvante (adyuvante incompleto de Freund u otros1) hasta un volumen total de 1,2 ml. Este antgeno se inocula en el conejo mediante inyecciones intradrmicas multipuntuales (20 puntos en cada lado) despus de que el animal haya sido afeitado. Da 21: se recogen aproximadamente 20 ml de sangre y se prueba su reactividad (neutralizacin, fluorescencia); se reinocula intravenosamente con la misma cantidad de virus purificado que en la inyeccin primaria, pero sin adyuvante. Antes de la inyeccin intravenosa de recuerdo, se debe tratar el conejo con promotazina (12 mg, intramuscularmente) para evitar una posible respuesta anafilctica. Da 28: se toma una muestra de sangre, se comprueba la reactividad del suero y se sangra o se vuelve a inocular segn los resultados. Este procedimiento de inmunizacin es muy adecuado, en el caso de los rabdovirus, para producir antisueros que se utilicen en pruebas de inmunofluorescencia y en enzimoinmunoensayos (ELISA). Sin embargo, un mtodo ms eficaz para la produccin de antisueros neutralizantes es la inyeccin regular intravenosa sin adyuvante (0,2 ml) cada 3 4 das (dos veces a la semana). Pueden ser necesarias hasta 15 inyecciones; 1 semana despus de la ltima inyeccin, se debe recoger una muestra de suero y probarla. 3.2. Antisueros contra bacterias de peces Todava resulta difcil obtener de fuentes comerciales sueros antimicrobianos en grandes cantidades, y a menudo ser necesario preparar dichos antisueros. Los mtodos generales son los mismos que para los virus. Con frecuencia los antgenos bacterianos se usan como preparaciones crudas de bacterias muertas por calor o por formalina (0,35% de formalina). La inoculacin al conejo en dosis crecientes puede ser intramuscular, cada semana, con adyuvante la primera vez, o intravenosa en intervalos de 34 das y sin adyuvante. A menudo se requiere una inyeccin de recuerdo despus de 15 das. Para produccin de sueros anti-Renibacterium resulta muy eficaz un programa especial de inoculaciones intradrmicas multipuntuales, y es tambin til para otras bacterias de baja antigenicidad en conejos. El antgeno son bacterias muertas por calor (60C, 45 minutos) y se ajusta a 2 mg/ml. Los costados de los animales se afeitan cuidadosamente, y se realizan inyecciones intradrmicas multipuntuales utilizando cantidades totales de 1mg de bacteria por animal, de acuerdo con el siguiente programa: Da 1: Da 21: Da 42: Da 63: Da 68: 1 mg + adyuvante completo de Freund (CFA) (v/v) 1 mg + adyuvante incompleto de Freund (IFA) (v/v) 1 mg + IFA 1 mg de antgeno Recoleccin de muestras de sangre (unos 30 ml)

Las inyecciones de recuerdo y las sangras para recoger suero pueden repetirse a intervalos de 1 mes.

El uso de adyuvante completo de Freund puede estar restringido en base a consideraciones de proteccin animal. Los adyuvantes alternativos sintticos son trehalosa dimicolato y monofosfato del lpido A.

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3.3. Procesamiento y depsito de sueros inmunes Despus de la coagulacin de la sangre, se recoge y centrifuga el suero a 20C y se calienta durante 30 minutos a 56C. El suero resultante tratado por calor se filtra a travs de un filtro de membrana (tamao de poro 450 nm) y se guarda temporalmente a 4C durante el tiempo necesario para el anlisis de su reactividad y especificidad, y para probar que estas propiedades no se afectan por las condiciones de conservacin (por ejemplo, congelacin o liofilizacin). Los sueros estriles de conejo se pueden mantener al menos 2 meses a 4C sin ningn cambio en sus propiedades. Se distribuye (normalmente en pequeos volmenes) y se congela a 20C o se liofiliza. Las inmunoglobulinas (Ig) se pueden extraer de los antisueros por mtodos convencionales apropiados para la purificacin de Ig. La unin selectiva a la protena A constituye un mtodo fiable y eficaz. La concentracin de las soluciones de Ig se ajusta a los valores requeridos para la posterior preparacin de conjugados o para el almacenamiento. Conservacin de Ig: Mezclar una solucin de Ig de una concentracin de 2 mg/litro con glicerol puro estril (v/v) y mantener a 20C. Tambin se pueden preparar soluciones de Ig en glicerol con una concentracin ms elevada. 3.4. Anticuerpos monoclonales de ratn contra virus y bacterias de peces En los ltimos aos se han obtenido anticuerpos monoclonales (MAbs) contra la mayora de los virus de peces. Algunos de ellos, como MAbs solos o asociados en dos o tres, han originado reactivos biolgicos adecuados para la identificacin de grupos vricos (IPN, VHS, IHN). Otros MAbs, tomados individualmente o como componentes de combinaciones de Ab, permiten la tipificacin exacta de VHSV e IHNV. Estos MAbs se pueden obtener de los laboratorios de referencia citados al final de este Manual de animales acuticos. Tambin se ha descrito la produccin de MAbs contra bacterias. Ello ha permitido el desarrollo de kits comerciales de diagnstico para Renibacterium salmoninarum, pero en la mayora de los casos la produccin permanece limitada a laboratorios especializados. Tericamente, las IgGs monoclonales de ratn se pueden procesar y guardar como las IgGs policlonales. Sin embargo, la reactividad de algunos MAbs puede alterarse por procesos enzimticos, de radiomarcaje o de liofilizacin. Por tanto, es necesario probar los distintos MAbs en las condiciones en que van a ser empleados. 3.5. Uso de tcnicas moleculares para pruebas y diagnsticos confirmativos Se han desarrollado tcnicas moleculares que incluyen sondas de cido nucleico y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la identificacin de muchos patgenos de animales acuticos. Sin embargo, como en el caso de otras tcnicas de diagnstico, las ventajas de sensibilidad se contrarrestan frecuentemente por problemas tcnicos de interpretacin o susceptibilidad. Mientras que los mtodos basados en el cultivo directo o en la serologa son relativamente fiables, la PCR puede ser muy dependiente de las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo y muy susceptible a contaminaciones en el laboratorio por productos de PCR previas, originando falsos resultados positivos. Por tanto, aunque en esta versin de este Manual de animales acuticos se incluyen como mtodos de diagnstico y confirmativos varios protocolos con sondas de cido nucleico y PCR, siempre que sea posible se especifican, como mtodos estndar de anlisis, tcnicas bien establecidas (por ejemplo, el aislamiento del virus). Cuando se empleen estas nuevas tcnicas moleculares, deben realizarse con cuidado y con especial atencin a la inclusin de controles positivos y negativos adecuados. 3.5.1. Preparacin de muestras En estas tcnicas, las muestras deben prepararse para conservar el ADN del patgeno. De modo similar, las muestras preparadas para pruebas basadas en mtodos con anticuerpos deben conservarse para que retengan los sitios antignicos reactivos frente a los anticuerpos usados.

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Captulo I.1. Enfermedades de peces: Informacin general

Las muestras seleccionadas para pruebas de diagnstico basadas en ADN o en anticuerpos deben manejarse y envasarse con el mximo cuidado para minimizar la potencial contaminacin cruzada entre las muestras o la degradacin de las mismas antes de poder realizar el ensayo. Para evitar la contaminacin, deberan usarse recipientes nuevos (bolsas de muestra o botellas de plstico). En cada envase o contenedor debe colocarse una etiqueta resistente al agua rellenada con los datos apropiados para cada serie de muestras. Algunos mtodos adecuados para la conservacin y el transporte de muestras tomadas para pruebas moleculares, o basadas en anticuerpos, son los siguientes: Ejemplares vivos helados o refrigerados: en el caso de ejemplares que pueden ser transportados rpidamente al laboratorio para ensayos a realizar en 24 horas, las muestras se envasan en bolsas que se rodean de una adecuada cantidad de hielo hmedo en una caja aislada y se envan al laboratorio. Ejemplares completos congelados: se seleccionan ejemplares vivos segn el propsito del muestreo, se congelan rpidamente en el campo usando hielo seco machacado, o se congelan en el laboratorio de campo mediante un congelador mecnico a 20C o a temperatura ms baja. Se prepara e inserta la etiqueta en el contenedor con las muestras, se empaquetan stas con una cantidad adecuada de hielo seco en una caja aislada y se envan al laboratorio. Muestras conservadas en alcohol: en regiones donde es problemtico el almacenamiento y envo de muestras congeladas, se puede usar etanol de 90-95% para conservar, guardar y transportar algunos tipos de muestras. Se envasan para el transporte de acuerdo con los mtodos que se describen arriba. Tejidos fijados para la hibridacin in-situ e inmuno-histoqumica: para esta finalidad son adecuados los mtodos clsicos de conservacin de tejidos. Una buena eleccin para el posterior uso de sondas moleculares es la solucin de Davidson. Especficamente para ADN, se debe evitar una sobre-fijacin (ms de 24-48 horas). 3.5.2. Conservacin de ARN y ADN en tejidos usando RNAlater El tejido se corta hasta que sea menor de 0,5 cm en una dimensin y se sumerge en 10 volmenes de solucin RNAlater (por ejemplo, una muestra de 0.5 gramos requiere unos 5 ml de RNAlater). Los rganos pequeos, como el rin, el hgado y el bazo se pueden mantener enteros en RNAlater. Estas muestras se pueden guardar a 4C durante un mes, a 25C durante una semana o a 20C indefinidamente. Los tejidos tratados con RNAlater se mantienen a 20C. 3.5.3. Extraccin de ADN Para extraer el ADN, se homogeneizan a polvo los tejidos conservados. Se aaden alrededor de 10 volmenes de tampn de extraccin (NaCl [100 mM], cido etilendiaminotetractico [EDTA, 25 mM], pH 8, dodecil sulfato sdico [SDS, 0,5%]) junto con proteinasa K (100 g/ml). Despus de incubar durante toda la noche a 50C, se extrae el ADN con fenol/cloroformo usando un protocolo estndar, y se precipita con etanol. Teniendo en cuenta las limitaciones de tiempo y los riesgos para el personal de laboratorio, los kits comerciales disponibles constituyen una alternativa tcnica satisfactoria. El uso de kits comerciales debera validarse mediante comparacin con un protocolo estndar a base de fenol/cloroformo antes de emplearlos de mtodo rutinario en los laboratorios de diagnstico.

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3.5.4. Extraccin de ARN Para aislar ARN de tejidos conservados en RNAlater, se extrae simplemente el tejido de la solucin de RNAlater y se trata como si fuera un tejido fresco. La mayora de los tejidos puede homogeneizarse directamente en tampn de lisis o de extraccin. 3.5.5. Preparacin de cortes finos para hibridacin in-situ Para hibridacin in-situ (ISH), los tejidos se fijan en solucin fijadora de Davidson durante aproximadamente 24 horas y despus se incluyen en parafina segn mtodos estndar en histologa. Se realizan cortes de 5 m de grosor y se colocan en portas tratados con aminoalquilsilano, que se incuban despus durante toda la noche en una estufa a 40C. Se elimina la parafina de los cortes mediante inmersin en xileno durante 10 minutos. Este paso se repite otra vez y luego se elimina el solvente por inmersin sucesiva en dos baos de alcohol absoluto, durante 10 minutos cada vez. Despus, los cortes se rehidratan por inmersin en una serie de etanol. El protocolo puede exigir un paso de permeabilizacin de membrana para facilitar el acceso al ADN diana. Con este fin, los cortes se tratan a 37C durante 30 minutos con proteinasa K (100 g/ml) en tampn TE (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]). En pruebas de ISH resulta esencial teir tanto un corte conocido positivo como un corte conocido negativo para eliminar resultados positivos falsos debidos a una tincin inespecfica, y resultados negativos falsos por errores en el protocolo de tincin.

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