Protocolo de validacin para determinaciones en muestras biolgicas (sangre y orina) de inters en higiene industrial

MTA/PV - III(2)/98
Palabras clave: Agente qumico, xenobitico, metabolitos, sangre, orina, validacin.

ndice
0. INTRODUCCIN 1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN 2. DEFINICIONES 3. MATERIALES 3.1. Reactivos 3.2. Aparatos 4. PRUEBAS INTRALABORATORIO 4.1. Seleccin del mtodo analtico 4.2. Establecimiento de las condiciones que debe reunir la muestra 4.3. Estudio comparativo con materiales de referencia 4.4. Estudio de conservacin de las muestras 5. REQUISITOS INTRALABORATORIO 6. PRUEBAS INTERLABORATORIOS 7. INFORME DEL PROCESO DE VALIDACIN 8. BIBLIOGRAFA

0. INTRODUCCIN
La validacin de un procedimiento de medida establece, mediante estudios sistemticos de laboratorio, que las caractersticas de dicho procedimiento cumplen las especificaciones relativas al uso previsto de los resultados analticos. El proceso de validacin permite el conocimiento de las caractersticas de funcionamiento del mtodo y proporciona un alto grado de confianza en el mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo. A fin de establecer los procedimientos de medida utilizados para la determinacin de la concentracin de analitos en muestras biolgicas (sangre y orina) es necesario prefijar unos criterios de comportamiento que incluyan, entre otros, los valores mximos del sesgo y de la precisin que se deben conseguir bajo condiciones de laboratorio.

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

Este protocolo especifica los requisitos generales de comportamiento que deben cumplir los procedimientos de medida para la determinacin de la concentracin de analitos en muestras biolgicas, incluyendo las condicio-nes para el transporte y almacenamiento de muestras.

2. DEFINICIONES
En este protocolo se utilizan los siguientes trminos segn las definiciones que se dan a continuacin: Agente qumico Es una sustancia susceptible de producir un efecto adverso para la salud. Exposicin (por inhalacin) Situacin en la que el agente qumico est presente en el aire inhalado por una persona. Xenobitico Cualquier sustancia con actividad biolgica, extraa al organismo y presente en el mismo como consecuencia de una exposicin laboral. Valor lmite biolgico (VLB) Es un valor de referencia de la concentracin del xenobitico en un medio biolgico, sus metabolitos o un indicador de efecto, propuesto o adoptado como gua para la evaluacin del riesgo potencial para la salud en la prctica de la Higiene Industrial. Valor verdadero Valor "verdadero" o aceptado es la concentracin del xenobitico, de alguno de sus metabolitos o de algn indicador de efecto, en el material de referencia utilizado para efectuar la validacin del mtodo. Sesgo Es la desviacin o diferencia de los resultados obtenidos aplicando un procedimiento de medida con respecto al valor aceptado como referencia o valor verdadero. El sesgo es una expresin de la inexactitud del mtodo y representa el error sistemtico total. Precisin Es el grado de concordancia entre los resultados obtenidos aplicando el mtodo repetidas veces, bajo condiciones determinadas. La precisin slo depende de la distribucin de errores aleatorios. Intervalo de medida Es el intervalo de concentraciones para las cuales el sesgo y la precisin de un procedimiento de medida estn dentro de los lmites especificados. Procedimiento de medida Procedimiento utilizado para la determinacin del analito en un medio biolgico, incluyendo el almacenamiento y transporte de la muestra. Validacin Es el proceso para evaluar las caractersticas de funcionamiento de un procedimiento de medida y verificar que se cumplen los criterios exigidos a los datos. Repetibilidad (r) a. Cualitativamente Es el grado de concordancia entre resultados sucesivos obtenidos con el mismo mtodo sobre una materia idntica sometida al ensayo, en las mismas condiciones (siempre el mismo operador, igual aparato, igual laboratorio y en pequeos intervalos de tiempo). b. Cuantitativamente

Es el valor por debajo del cual est situado, con una probabilidad especificada, el valor absoluto de la diferencia entre dos resultados individuales obtenidos en las condiciones anteriormente expuestas. En ausencia de otra indicacin se entender que la probabilidad es del 95%. Reproducibilidad (R) a. Cualitativamente Es el grado de concordancia entre dos resultados individuales obtenidos con el mismo mtodo sobre una materia idntica sometida al ensayo, pero en condiciones diferentes (operadores distintos, aparatos diferentes, distintos laboratorios y/o pocas diferentes). b. Cuantitativamente Es el valor por debajo del cual est situado, con una probabilidad especificada, el valor absoluto de la diferencia entre dos resultados individuales obtenidos en las condiciones anteriormente expuestas. En ausencia de otra indicacin se entender que la probabilidad es del 95%. Lmite de deteccin Es la menor cantidad de analito que puede ser detectada y diferenciada de un blanco, pero no necesariamente cuantificada con un nivel aceptable de exactitud y precisin. Lmite de cuantificacin Es la cantidad o concentracin mnima que puede determinarse con un nivel aceptable de exactitud y precisin. Incertidumbre de la medida Estimacin que caracteriza el intervalo de valores en el que se sita generalmente, con una alta probabilidad, el valor verdadero de la magnitud medida. La incertidumbre de la medida incluye, en general, varios componentes. Algunos pueden estimarse a partir de la distribucin estadstica de los resultados de una series de mediciones y pueden caracterizarse por la desviacin tpica muestral. La estimacin de otros componentes solamente puede basarse en la experiencia o en otros informaciones. Incertidumbre global Es una cantidad utilizada para caracterizar, como un todo, la incertidumbre del resultado dado por un equipo o un procedimiento de medida. Se expresa, en porcentaje, por una combinacin del sesgo y de la precisin, generalmente de acuerdo con la frmula: | - xref | + 2s xref donde: es el valor medio de los resultados de un nmero n de mediciones xref es el valor de referencia aceptado o verdadero s es la desviacin tpica de las n mediciones x 100

Material de referencia (MR) Es un material o sustancia en el cual uno o ms valores de sus propiedades son suficientemente homogneos y estn bien definidos para permitir utilizarlos para la calibracin de un instrumento o la evaluacin de un procedimiento de medida. Material de referencia certificado (MRC) Es un material de referencia acompaado de un certificado, en el cual uno o ms valores de sus propiedades estn certificados por un procedimiento que establece su trazabilidad con una realizacin exacta de la unidad en la que se expresan los valores de la propiedad y para la cual cada valor certificado se acompaa de una incertidumbre con la indicacin de un nivel de confianza.

3. MATERIALES
3.1. Reactivos Todos los reactivos deben ser de calidad analtica.

3.2. Aparatos Los equipos e instrumentos necesarios para efectuar las determinaciones de inters.

4. PRUEBAS INTRALABORATORIO
4.1. Seleccin del mtodo analtico La seleccin del mtodo analtico debe basarse en factores tales como: 4.1.1. Selectividad Capacidad de un mtodo analtico para determinar nicamente los componentes que se pretenden medir. 4.1.2. Sensibilidad Es la pendiente de la recta de calibracin que se obtiene cuando el resultado (o seal) de la medida o una funcin de la misma se representa frente a la cantidad o concentracin del analito. 4.1.3. Correspondencia biunvoca Cada procedimiento de medida debe ser biunvoco, en el intervalo especificado de medida, esto es: que una y slo una concentracin debe corresponder al valor determinado analticamente y viceversa. 4.1.4. Linealidad en el intervalo de aplicacin La pendiente de la recta de calibracin debe ser constante en todo el intervalo de aplicacin del procedimiento de medida. El lmite inferior de dicho intervalo vendr determinado por el valor obtenido para el lmite de cuantificacin del mtodo. El lmite superior del intervalo estar condicionado, en general, por la prdida de linealidad en la curva de calibracin.

4.2. Establecimiento de las condiciones que debe reunir la muestra Las condiciones referentes al tipo de muestra (sangre total, suero, orina, etc.), momento del da para la recogida de la muestra, necesidad o no de aditivos para su adecuada conservacin, condiciones de transporte y tiempo mximo de conservacin vendrn determinadas por el tipo de indicador biolgico escogido, el mtodo de anlisis seleccionado y los resultados obtenidos en las pruebas experimentales para determinar las condiciones de estabilidad y conservacin

4.3. Estudio comparativo con materiales de referencia En los sistemas de adsorcin/desorcin uno de los factores ms importantes a tener en cuenta es el procedimiento de desorcin, que se deber elegir en funcin del procedimiento de medida objeto de la validacin. Dicho procedimiento de desorcin podr ser: Para el clculo del sesgo de un mtodo analtico deben ser utilizados Materiales de Referencia Certificados (MRC). Cuando no se disponga de ellos y se utilicen otros Materiales de Referencia (MR) como los patrones comerciales o muestras procedentes de Controles de Calidad Externos de concentracin garantizada, el valor del sesgo calculado a partir de ellos se considerar nicamente como indicativo. Los ensayos se efectuarn, preferentemente, a tres niveles de concentracin que cubran todo el intervalo de aplicacin del mtodo, analizndose seis muestras por cada concentracin estudiada. Concentracin n muestras

Nivel I Nivel II Nivel III

6 6 6

Para cada uno de los niveles ensayados debern cumplirse los requisitos de sesgo y precisin establecidos en el apartado 5.

4.4. Estudio de conservacin de las muestras Los estudios de estabilidad y conservacin deben realizarse sobre muestras reales. Preferentemente se ensayarn dos niveles de concentracin prximos a los extremos superior e inferior del intervalo de aplicacin del mtodo. Por cada nivel de concentracin la muestra se dividir en 18 alcuotas que se analizarn siguiendo el siguiente esquema: Concentracin Nivel A 6 6 6 Nivel B 6 6 6

Tiempo del Anlisis Inmediato 48 horas (Ta ambiente) 14 das (4 C)

La conservacin de las muestras es un factor crtico en la evaluacin del mtodo. Se considera que no existen problemas si los resultados obtenidos en esta experiencia, en los diferentes tiempos de anlisis ensayados, no difieren de los obtenidos con las muestras analizadas inmediatamente en ms de un 10%. En funcin de los resultados obtenidos se establecern las condiciones de transporte y almacenamiento de las muestras. Dada la naturaleza de las muestras biolgicas, el estudio de conservacin no tiene por qu ajustarse estrictamente al aqu indicado, sino que en cada caso y siempre en funcin de las caractersticas de cada muestra y analito se establecern las condiciones ms idneas para el transporte y la conservacin de las muestras.

5. REQUISITOS INTRALABORATORIO
El mtodo de anlisis deber cumplir los siguientes requisitos en todo su intervalo de aplicacin: El tiempo de almacenamiento admitido ser el tiempo mximo ensayado en el que la diferencia con los resultados de las muestras analizadas de forma inmediata sea < 10%. La desviacin tpica relativa para cada nivel de con-centracin ser < 10%. El sesgo relativo expresado como 100 I verdadero o aceptado y - xref I / xref para cada concentracin y condicin ensayada ser < 10% siendo xref el valor

el valor medio de los resultados obtenidos para cada concentracin en 4.3.

6. PRUEBAS INTERLABORATORIOS
Los mtodos que cumplan los requisitos indicados en el apartado 5, pueden ser sometidos a una prueba interlaboratorios con el fin de determinar su repetibilidad y reproducibilidad. Antes del desarrollo de la prueba, los laboratorios participantes en la misma debern disponer de la descripcin detallada del mtodo de toma de muestra y anlisis y seguir las instrucciones del mismo a la hora de realizar los anlisis. El esquema mnimo a seguir para el desarrollo de una prueba interlaboratorios ser:
q q q

nmero mnimo de laboratorios participantes: 8 nmero mnimo de niveles de concentracin: 2 nmero de muestras por nivel de concentracin: 2< n<6,

El anlisis estadstico de los resultados y el clculo de la repetibilidad y reproducibilidad se realizar de acuerdo con la norma ISO 5725.

7. INFORME DEL PROCESO DE VALIDACIN

El informe deber incluir al menos la siguiente informacin: a. Descripcin completa de la muestra, especificando. r Tiempo y condiciones de muestreo. r Cantidad mnima necesaria. r Instrumental y recipientes adecuados para la toma y conservacin de las muestras. r Aditivos cuando sean necesarios. r Precauciones a tomar una vez recogida la muestra (por ejemplo: tiempo y temperatura de conservacin). b. Descripcin completa del mtodo analtico. c. Concentraciones ensayadas. d. Valores obtenidos en los ensayos realizados. e. Valores calculados para la precisin, sesgo, r y R para cada concentracin. f. Justificacin tcnica de la omisin de algn ensayo.

8. BIBLIOGRAFA
Directiva 98/24/CE del Consejo, de 7-4-1998, relativa a la proteccin de la salud y la seguridad de los trabajadores contra los riesgos relacionados con los agentes qumicos durante el trabajo. ISO 5725 : 1994 (E). Accuraccy (trueness and precisin) of measurement methods and results. Para cualquier observacin o sugerencia en relacin con este Mtodo puede dirigirse al Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo Centro Nacional de Verificacin de Maquinaria Camino de la Dinamita, s/n Monte Basatxu-Cruces - 48903 BARACALDO (VIZCAYA) Tfn. 944 990 211 - 944 990 543 Fax 944 990 678 Correo electrnico.- cnvminsht@mtas.es

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