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CRECIMEITNO DE LEVADURA DE PANIFICACIN (Saccharomyces cerevisiae) PARA LA PRODUCCIN DE INVERTASA Manzano, Andrs; Navas, Daniela. Universidad Tcnica De Ambato.

Facultad de Ciencia e Ingeniera En Alimentos y Bioqumica RESUMEN La cepa de Saccharomyces cerevisiae se cultiv en un proceso de fermentacin por lotes alimentados con el fin de estudiar la produccin de la enzima invertasa bajo condiciones de diferente crecimiento. En el intervalo de pH de 5,4. La productividad especfica de la invertasa aument linealmente con la tasa de crecimiento especfico de microorganismo en un tiempo de 5,25 horas. Para ello se utiliz una levadura activa seca de panificacin LEVAPAN y se obtuvo un cultivo puro del mismo para analizar su curva de crecimiento y su capacidad de produccin de la enzima para la hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa. Adems se realizaron estndares de glucosa para la determinacin del consumo de sustrato realizado por la levadura durante todo el proceso. INTRODUCCIN Las levaduras son hongos que forman sobre los medios de cultivo colonias pastosas, constitudas en su mayor parte por clulas aisladas que suelen ser esfricas, ovoideas, elipsoideas o alargadas. Las dimensiones pueden oscilar de 1 a 9 m de ancho y 2 a ms de 20 m de longitud segn la especie, nutricin, edad y otros factores (Carlile,et al., 2001). La gran mayora de las levaduras son mesfilas, con una temperatura mxima de crecimiento entre 24 y 48C. Solo unas pocas (2%) son psicrfilas con una temperatura mxima de crecimiento por debajo de 24C, pero mayor es el nmero de las levaduras que tienen la temperatura ptima de crecimiento por debajo de 20C. No hay levaduras que puedan crecer a 50C y solamente unas pocas pueden desarrollar cerca de 0C, entre las que se encuentran Yarrowialipolytica, Debaryomyceshansenii y Pichiamembranaefaciens. Las levaduras obtienen sus nutrientes a partir de fructosa, glucosa y otros monosacridos (azcares simples), que son encontrados generalmente en las frutas. Las enzimas de las levaduras rompen qumicamente los azcares en productos que la clula pueda utilizar, mientras que otras pueden crear azcares simples a partir de disacridos (azcares dobles), que son encontrados en ciertos organismos. Estas enzimas incluyen sucrasa (invertasa), zymasa, maltasa (glucasa), lactasa, hexosafosfatasa, reductasa, carboxilasa, melibiasa, y endo-triptasa, as como varias enzimas proteolticas. Tericamente, segn el seguimiento cintico se ha obtenido un max de 0,38 h-1, Ks de 1,35 g/L, un rendimiento (Yx/s) de 1,68 g de levadura/g de azcar consumida y una velocidad especfica de producto (Q) de 0,23 g/g.h. El objetivo de este estudio es obtener un cultivo puro de levaduras Saccharomyces cerevisiae, utilizadas en la industria de la panificacin, y utilizando un medio de cultivo YEPD (yeastextract, peptone, dextrose), obtener una curva de crecimiento microbiano que nos ayude a la determinacin de la velocidad especfica de crecimiento y tiempo de duplicacin de la misma, adems del rendimiento que tienen estos microorganismos para degradar el sustrato y para la obtencin de una enzima comercial como la Invertasa. MATERIALES Y MTODOS Microorganismo En este estudio se utiliz una levadura activa seca de panificacin LEVAPAN que contiene Saccharomyces cerevisiae, ya que esta levadura produce la enzima invertasa que transforma la sacarosa en glucosa y fructosa. Medio (YEPD) El medio qumicamente definido para los cultivos contena lo siguiente: Extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, dextrosa 20 g/l, agar 17.5 g/l. El cual se ajust a un pH de 5.4 y posteriormente se esteriliz por 15 minutos a 121C. Condiciones de Cultivo Se prepar una suspensin de 1g de levadura con 9ml de agua estril, se tom 1ml de esta

suspensin y se inocul a un tubo contenido con medio de cultivo lquido, se mezcl completamente y se incub bajo agitacin magntica hasta el da siguiente a temperatura ambiente. Y posteriormente a partir de este cultivo se realizaron diluciones hasta 10-8 en agua destilada estril. Muestreo Para realizar el contaje de levaduras se aadi 1ml de la suspensin de levaduras de las diluciones 10-4, 10-6 y 10-8 a la caja petri vaca y se aadi aproximadamente 15ml de agar estril. Se mezcl la suspensin de levadura con el medio realizando movimientos en sentido vertical, horizontal y con movimientos rotacionales. Para la verificacin de la pureza del cultivo y la determinacin de las caractersticas morfolgicas de las levaduras se realiz un sembrado en estra con la dilucin 10-3 con un mnimo de dos rplicas de la estra. Inoculacin Con un asa estril se tom una porcin de clulas de levadura de los cultivos en estra y se inocul la porcin de 30ml del medio de cultivo estril. Posteriormente, se agit fuertemente con la ayuda de una plancha de agitacin magntica y se incub a temperatura ambiente (aproximadamente 20C) durante toda la noche. Al da siguiente, se tomaron alcuotas aspticamente del cultivo lquido y se realiz una serie de diluciones para obtener un contaje adecuado. Para lo que se tom 1ml de cada dilucin y se deposit en las cajas petri junto con el medio para que se esparza homogneamente en la placa y se incub el cultivo a 25C por 5 das. Curva de crecimiento de cultivo por lote Se virti aspticamente el inoculo en el reactor, que fue un Erlenmeyer que contena aproximadamente 320ml de medio liquido estril y se control el tiempo con agitacin constante. Se extrajeron aspticamente dos alcuotas de 1ml cada una del cultivo, sin dejar de agitar, a 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 20, 24 y 30 horas de incubacin. Se colocaron las alcuotas en tubos de centrifuga previamente tarados, se pes rpidamente el tubo con la muestra y se hirvi por 5 minutos para detener el crecimiento de la levadura. Posteriormente se enfri y centrifug a 4950 rpm por 10 minutos cada alcuota. Se extrajo el sobrenadante, se lavaron las clulas resuspendindolas con 2ml de agua destilada, se volvi a centrifugar a 4950 rpm por 5 minutos y se retir el sobrenadante. Y por ltimo se pesaron los tubos y se secaron a 60C aproximadamente por 60 horas hasta peso constante. Determinacin del consumo de sustrato Se diluyeron los sobrenadantes obtenidos y se determin el contenido de azucares reductores con solucin de DNS. Para la preparacin de la solucin de DNS se disuelve 10 g/l de DNS slido en 400ml de agua destilada con ayuda de un agitador magntico. Se aadi 200 ml/l de solucin de NaOH 1M. a continuacin se agreg lentamente 300 g/l de tartrato de sodio y potasio y se agit hasta que se disuelva. Y finalmente se afor la solucin a 1000 ml. Cuantificacin de azcares reductores Se coloc 0.5ml de los sobrenadantes en tubos de vidrio resistentes al calor, se aadi 0.5ml de la solucin de DNS y se mezcl bien. Se hirvi la mezcla por 5 minutos exactamente en bao mara a ebullicin, y despus se enfri en un bao de agua fra. Se diluy la solucin con 5ml de agua destilada, se agit bien y se ley la absorbancia a 540nm. Curva estndar de glucosa Se calent una solucin de 25ml de glucosa de concentracin 1 mg/ml (solucin madre) por 4 horas a 60C y se enfri en un desecador. A partir de esta solucin se pesaron alcuotas en tubos secos de la solucin madre de glucosa de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5ml; se aadi 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 y 0 ml de agua destilada respectivamente y se determin el peso de la muestra. Adems se prepar un blanco con 0.5ml de agua destilada y a cada tubo se aadi 0.5ml de solucin de DNS. Tampn de extraccin Se prepar 100ml de acetato de sodio 0.1M y 50ml de cido actico 0.1M. Se aadi bajo agitacin a 60ml de la solucin de acetato, el cido actico hasta que el pH del tampn lleg a 5. Posteriormente se midi el volumen del tampn obtenido y se aadi la cantidad necesaria de NaCl hasta que la concentracin del tampn fue de 0.5M. Extracto crudo de invertasa

Se centrifug el caldo de cultivo obtenido durante el crecimiento de la levadura en tubos de centrifuga previamente tarados para separar las clulas de levadura del sobrenadante. Y se utiliz uno de los tubos para determinar el peso seco de la levadura. Posteriormente, se removi la levadura sedimentada y se coloc sobre un mortero, donde se mezcl con arena lavada y seca en proporcin 1:1 y se homogeneiz. Despus de este proceso, se suspendi la mezcla en el tampn de extraccin utilizando 7.5ml por cada gramo de levadura utilizado en la molienda. Se agit adems la mezcla durante 15 minutos con un agitador magntico, luego se centrifug y se tom el sobrenadante como extracto enzimtico. Actividad de la invertasa del extracto crudo Se etiquetaron seis tubos de ensayo como b0, 1, 2, 3, 4 y 5, en los que se coloc 0.25ml de solucin de sacarosa 0.2M y se incub los tubos a 55C durante 15 minutos. Se aadi adems 0.25ml del extracto de levadura que contena la actividad enzimtica para que el extracto hidrolizara la sacarosa y se incub cada tubo por tiempos variables; y para posteriormente detener la reaccin se aadi 0.5ml de solucin de DNS. Y para completar el proceso se hirvi los tubos por exactamente 5 minutos y se los enfri inmediatamente en un bao de agua fra. Y se aadi 5ml de agua destilada y se determin la absorbancia a 540nm as se determin la actividad de la enzima. Curva de calibracin con glucosa Se secaron unos 100mg de glucosa a 60C por 4 horas en una caja petri, se colocaron las tapas en las cajas petri y se enfri el producto en un desecador. Con la glucosa seca, se prepar una solucin de 1mg/ml de glucosa y se marcaron cinco tubos de ensayo como bl, Std 1, Std 2, Std 3, Std 4 y Std 5. En cada tubo marcado, se pes la cantidad de estndar de glucosa y agua segn la siguiente tabla. Adems se registr el peso de las alcuotas de Glc y el peso total de Glc+agua y as poder determinar la concentracin exacta de cada estndar. Y finalmente se mezcl el contenido de los tubos y se realiz el mismo procedimiento que se realiz para determinar la actividad de la invertasa del extracto crudo. Tabla #1. Concentraciones de soluciones estndar de glucosa. Tubo V Glc (~1mg/ml) Vol agua Bl 0.0 0.5 Std 1 0.1 0.4 Std 2 0.2 0.3 Std 3 0.3 0.2 Std 4 0.4 0.1 Std 5 0.5 0.0 Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. RESULTADOS El cultivo en fermentacin por lote de levaduras de panificacin result satisfactorio, ya que con las muestras obtenidas en los diferentes tiempos se pudo realizar una curva de crecimiento microbiano que nos ayuda a conocer la velocidad de crecimiento mxima, y el rendimiento que sta posee. La velocidad mxima se obtiene al calcular la pendiente de la fase logartmica graficada con la siguiente frmula: donde X representa la concentracin de clulas en un tiempo dado. Los rendimientos respectivos se calculas con las frmulas: Tabla #2. Concentracin de clulas de levaduras obtenidas en intervalos de tiempo en el proceso de Fermentacin por lotes.

Tubo # Tiempo (h) Tubo v. (g) Tubo+m (g) muestra (5ml) (g) Tubo+res. (g) residuo (g) X (g/l) X medio Desv. Std. Desv. Std. Relativa % ln (X med) 1 0.25 6.992 12.141 5.149 6.996 0.004 0.777 0.894 16.6 -0.112 2 " 6.975 11.921 4.946 6.980 0.005 1.011 0.1655 3 1.25 6.961 12.245 5.284 6.967 0.006 1.136 1.1 6.9 0.083 4 " 6.961 12.741 5.780 6.967 0.006 1.038 0.0689 5 2.25 6.955 12.147 5.192

6.966 0.011 2.119 2.1 8.4 0.722 6 " 6.957 11.957 5.000 6.967 0.010 2.000 0.0839 7 3.5 6.993 12.139 5.146 7.008 0.015 2.915 2.9 4.2 1.059 8 " 7.002 11.905 4.903 7.016 0.014 2.855 0.0421 9 4.25 6.962 12.143 5.181 6.979 0.017 3.281 3.3 3.1 1.181 10 " 6.988 11.931 4.943 7.004 0.016 3.237 0.0313 11

5.25 6.984 11.922 4.938 7.004 0.020 4.050 3.9 15.2 1.371 12 " 7.007 11.961 4.954 7.026 0.019 3.835 0.1520 13 6.25 6.994 11.978 4.984 7.011 0.017 3.411 3.6 20.6 1.268 14 " 6.975 11.837 4.862 6.993 0.018 3.702 0.2060 16 7.25 6.966 11.950 4.984 6.981 0.015 3.010 2.9 11.6 1.074 17 " 6.969 11.889 4.920 6.983

0.014 2.846 0.1160 18 8.25 6.977 12.060 5.083 6.989 0.012 2.361 2.4 2.1 0.865 19 " 6.979 12.000 5.021 6.991 0.012 2.390 0.0205 20 9.25 7.009 11.948 4.939 7.019 0.010 2.025 2.0 2.2 0.697 21 " 6.988 12.005 5.017 6.998 0.010 1.993 0.0224 15 21.25 7.006 12.052 5.046 7.023 0.017 3.369 3.3 13.7 1.185 23 "

6.975 12.013 5.038 6.991 0.016 3.176 0.1365 Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Grfico #1. Curva de crecimiento microbiano. Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Para el clculo de la velocidad de crecimiento mxima se toma la parte de crecimiento con tendencia lineal, en nuestro caso hasta el tiempo 5,25 h., y se aplica la ecuacin. Para calcular el tiempo de duplicacin de Saccharomyces cerevisiae se requiere conocer el nmero de divisiones de la misma: Con el dato del nmero de generaciones en el tiempo establecido, se calcula el tiempo de generacin: Se procede a cuantificar la glucosa realizando una curva estndar con los datos de la siguiente tabla: Tabla #3. Concentraciones de glucosa y absorbancia. Glc Absorb. 0.0000 0.000 0.2025 0.048 0.3848 0.1060 0.5844 0.1640 0.7876 0.222 0.9772 0.3360 Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Grfico #2. Grfica Abs. vsGlc. Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Se despeja la concentracin de glucosa de la ecuacin obtenida y se obtiene: Se calcula la concentracin de glucosa con la ecuacin de la recta obtenida en la curva estndar, y se obtiene la siguiente tabla Tabla #4.Cuantificacin de glucosa en los sobrenadantes. Tubo # Tiempo h Dilucin Peso medio Peso tot. Absorb. Glucosa (mg/ml) Glc total (mg/ml) Glcdesv (mg/ml) s/n medio 29,6 0,2731 8,0907 0,402 1,246

36,91 38,01 " 29,6 0,2731 8,0907 0,427 1,320 39,10 1,55 1-2 0,25 28,9 0,2773 8,0013 0,365 1,137 32,80 32,50 " 28,9 0,2773 8,0013 0,358 1,116 32,20 0,42 3-4 1,25 28,8 0,2775 7,9783 0,332 1,039 29,87 30,34 " 28,8 0,2775 7,9783 0,343 1,072 30,81 0,66 5-6 2,25 14,7 0,2742 4,0255 0,467 1,438 21,11 21,00 " 14,7 0,2742

4,0255 0,462 1,423 20,89 0,15 7-8 3,5 14,8 0,2717 4,0094 0,277 0,877 12,93 12,96 " 14,8 0,2717 4,0094 0,278 0,879 12,98 0,03 9-10 4,25 4,3 0,4665 2,0216 0,277 0,877 3,80 3,86 " 4,3 0,4665 2,0216 0,287 0,906 3,93 0,09 13 5,25 16,2 0,2690 4,3609 0,02 0,117 1,90 1,90 14 15,1 0,2668 4,0293 0,023 0,126 1,90 0,00

22 6,25 4,5 0,4632 2,098 0,116 0,401 1,82 1,79 22 4,5 0,4632 2,098 0,112 0,389 1,76 0,04 16 7,25 15,9 0,2695 4,2786 0,191 0,622 9,88 9,98 17 15,1 0,2669 4,0343 0,206 0,667 10,08 0,14 18 8,25 14,9 0,2724 4,0489 0,367 1,143 16,98 17,32 19 14,7 0,2753 4,0469 0,387 1,202 17,66 0,48 20 9,25 15,7 0,2710 4,2434

0,45 1,388 21,73 21,89 21 14,7 0,2694 3,9531 0,489 1,503 22,06 0,23 15 21,25 15,3 0,2629 4,025 0,015 0,102 1,57 1,52 23 15,3 0,2624 4,0127 0,013 0,096 1,47 0,07 Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Se realiza un grfico de consumo de sustrato por parte del microorganismo cultivado. Grfico #4. Curva de consumo de sustrato Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Se procede al clculo de la actividad de la enzima invertasa con los estndares de glucosa realizados de acuerdo a los siguientes datos: Tabla #5.Abosrvancias y concentracin de glucosa para calcular la actividad de la invertasa Tubo Absorbancia error Absorbancia corregida [Glc] Tiempo de reaccin(min) Blanco 0,029 0 0 0 1 0,124 0,095 0,3387 1 2 0,222 0,193

0,6283 2 3 0,303 0,274 0,8677 3 4 0,408 0,379 1,1779 4 5 0,484 0,455 1,4025 5 Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Se realiza la curva de Glucosa vs Tiempo de reaccin y de la cual la pendiente es la actividad de la invertasa en el sustrato. Grfico #5. Curva de actividad de invertasa Fuente: Laboratorio de Ingeniera de las Fermentaciones de la FCIAL. Elaborador por: Manzano; Navas. Cantidad total de Actividad (UE)= Se calcula los rendimientos en funcin al sustrato consumido, el producto obtenido y el crecimiento de levadura: La velocidad especfica de formacin de producto se obtiene con los datos ya analizados anteriormente DISCUSIN Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son muy utilizadas en las industrias de panificacin debido al sencillo manejo que stas tienen y a la gran capacidad de produccin de metabolitos. En nuestro caso el metabolito de inters es la Invertasa, utilizada para romper a la sacarosa en glucosa y fructosa, la cual se determin mediante el mtodo de espectrofotometra, ya que las muestras tomadas desarrollan un color luego de colocarlas al calor, y se obtuvo una actividad enzimtica de , con una velocidad especfica de formacin de producto igual a . Se debe tener en cuenta que estos valores se ven relativamente bajos, pero ya que fue realizado a nivel de laboratorio las condiciones no se pueden controlar a la perfeccin, y que al momento de realizar este proceso a escala industrial estos valores se pueden transformar en rendimientos realmente buenos, ya que se obtendr el producto en menor tiempo y con menor gasto econmico. De acuerdo con los datos bibliogrficos se tiene que la velocidad mxima de crecimiento microbiano para Saccharomyces cerevisiae es 0,38 h-1, mientras que el valor obtenido en la prctica fue de 0.31 h-1, lo que nos indica que nuestro proceso de fermentacin se realiz de una manera correcta a pesar de las condiciones adversas que se pudieran presentar, como cambios de temperatura, pH, etc. A pesar de esta aproximacin los valores de rendimiento y de velocidad especfica de producto no se asemejan en nada a los valores tericos para esta especie de microorganismo, por lo que queda una duda sobre el proceso realizado para esta determinacin, pudiendo encontrarse fallas al momento de realizar la reaccin de calor para la determinacin de invertasa, ya que los valores de tiempo pueden haber variado por errores propios, o pudo haber una mala lectura de los pesos de las muestras obtenidas despus del tiempo de fermentacin. COCLUSIONES Se obtuvo un cultivo puro a partir de levadura activa seca de panificacin de Saccharomyces cerevisiae, utilizando cajas petri con un cultivo de YEPD que favoreci el crecimiento de estas levaduras realizando estras compuestas y vertido en placa para realizar el conteo de las colonias dando un resultado de 78 colonias en la dilucin 1/108, ya que en las dems diluciones vertidas las colonias eran incontables.

Se realiz adems la determinacin del peso seco para generar una curva de crecimiento para S. cerevisiae en el mismo medio complejo YEPD para garantizar que las levaduras tengan todos los nutrientes necesarios para su desarrollo. En lo que se obtuvo un resultado favorable como se puede observar en la tabla # 2. Se determin as mismo la velocidad especfica de crecimiento con un valor de 0.31 h-1 y el tiempo de duplicacin de la S. cerevisiae de 2.19 h utilizando frmulas especficas deducidas anteriormente, contando con los resultados obtenidos en las curvas de crecimiento. Entre los clculos realizados para la determinacin de la actividad de la enzima se determin el coeficiente de rendimiento celular YX/S que dio como resultado , considerando como sustrato limitante la glucosa del medio de cultivo. Para determinar el rendimiento de invertasa, se utiliz el extracto de levadura libre de clulas que contena la enzima; realizando una curva de consumo de sustrato y una curva de biomasa formada o de crecimiento microbiano. Y posteriormente con todos los datos obtenidos gracias a los experimentos realizados se determin la velocidad especifica de formacin de producto mxima que dio un valor de . REFERENCIAS Carrillo, L. 2003. Los Hongos de los Alimentos y Forrajes. Doyle MP et al., eds. ASM Press, Washington Carlile,MJ et al. 2001. The Fungi.2 ed. Academic Press, San Diego, p 70. Charles Simmonds. s/f. "Alcohol, Its Production, Properties, Chemistry, And Industrial Applications". Disponible en: http://chestofbooks.com/food/beverages/Alcohol-Properties/Enzymes-OfYeast.html#ixzz2BVGSwBqA Snchez, Anabel. 2011. Fermentacin De Malta Empleando Un Sistema Semicontinuo En El Proceso De Elaboracin De Cerveza. Universidad Tecnolgica De La Mixteca. Tesis de graduacin. Huajuapan De Len, Oaxaca.