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Macarena Moreno. Laboratorio Microbiologa Profesor: Dra. Marcela Zahr T. Martn Galaz G.

Licenciatura en Ciencias mencin Biologa o Qumica VALPARASO, 27 ENERO DE 2012 AISLAMIENTO, RECUENTO, CARATERIZACION E IDENTIFICACION A PARTIR DE UNA MUESTRA NATURAL. INTRODUCCION: La microbiologa, es una parte de la biologa que se encarga del estudio de los microorganismos (seres vivos pequeos), a partir de ello se han creado diversas tcnicas, para su anlisis y conocimiento, una de estas es el aislamiento, la cual permite la obtencin de microorganismos a partir de muestras complejas, como suelo, agua, alimentos entre otros, en los cuales se encuentra una gran diversidad microbiana. La obtencin de cultivos puros, los cuales estn formados por un solo tipo de microorganismo, permiten conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades de tincin, actividad bioqumica, patogenicidad, sensibilidad a antibiticos e identificacin de las especies microbianas.1 El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por medio de tcnicas de dilucin, en medios slidos por estra ( en este caso, cada clula bacteriana que se separa dar origen a una poblacin, la cual formara una colonia caracterstica, visible) o en medios lquidos. La principal falencia de esta tcnica es que no es prctica para mezclas de microorganismos donde el grupo de inters se encuentre en pequeas cantidades, donde se obtendrn como resultado las bacterias dominantes de la mezcla .Para contrarrestar esta falencia se utilizan medios de cultivos especiales, los cuales estn compuestos de nutrientes especiales, antibiticos, concentracin de sales, temperatura, luz especificas que favorecern el crecimiento del organismo de inters, este paso se denomina mtodo de enriquecimiento. 1 La cuantificacin es una parte muy importante al momento de reconocer una muestra de microorganismo de inters, para ello existen dos mtodos los cuales permiten contar solo microorganismos vivos ( recuento viables) o bien organismos vivos y muertos ( recuentos totales).A su vez podemos separar estos mtodos de recuentos , de la forma con la cual se observan, se llamara Recuento Directo, cuando las clulas bacterianas se cuentan directamente al microscopio, con cmaras de Neubauer o breed. Por otro lado esta el Recuento Indirecto, el cual permite cuantificar el nmero de clulas a travs del crecimiento o alguna propiedad (turbidez, densidad de la muestra). 2 Para conocer la morfologa, permite caracterizar al microorganismo aislado, para ello existen diversos parmetros que permiten clasificar al organismo, una vez cultivado en una placa, una observacin a simple vista, permite ir acotando la gran diversidad de microorganismos existentes en la muestra problema. Estos parmetros se basan en : forma, borde, elevacin, opacidad, cromogenesis, superficie y consistencia. Por ltimo como tcnica de identificacin de microorganismo, existen diversos mtodos como por ejemplo : gentico, molecular, fisiolgico y bioqumico, este trabajo se centra en

el ultimo parmetro de identificacin, ya que esta es una de las caractersticas mas puntuales de los microorganismo, ya que permiten demostrar la existencia de ciertas enzimas de vas metablicas caractersticas de cada grupo bacteriano, esto demuestra claramente una expresin de un determinado gen del DNA bacteriano .Considerando la gran variedad y diversidad de vas metablicas y compuestos qumicos orgnicos e inorgnicos utilizados por las bacterias como fuentes de energa, permitiendo as definir un perfil metablico, al recrear las distintas rutas metablicas que posee el microorganismo de inters, ms adelante se detallara los diversos pasos para la identificacin de estos. OBJETIVOS: A partir de una muestra natural, aplicar tcnicas de aislamiento y recuento de microorganismos presentes. Caracterizar, a travs de parmetros fsicos, las colonias formadas por los organismos presentes en la muestra. Identificacin de microorganismo, mediante pruebas Bioqumicas especificas para vas metablicas de las bacterias aisladas. MATERIALES Y METODOS Aislamiento de microrganismos desde una muestra natural. Se utiliz una muestra de origen natural (agua de pozo) para realizar las siembras en placas de medio nutritivo, para ello se realizaron diversos mtodos de siembra el primero fue por agotamiento de estras que consiste en extraer un inculo de la muestra con un asa de loop, previamente esterilizada en el mechero bunsen y se deposit en forma de estra (zig-zag) sobre la superficie del agar, (tal como se muestra en la figura 1a), posteriormente se esterilizo nuevamente el asa en la llama del mechero bunsen y se extendi el inculo depositado en la posicin a realizando estras en posiciones b y c tal como se muestra en la figura 1. Luego se realiz el mtodo de dilucin y estras en un placa, en la cual primero se realizaron diluciones seriadas, tal como se muestra en la figura 2, donde se tenan 4 tubos de ensayo cada uno con 9 ml de solucin salina estril, primero se tomo 1ml de la muestra y se deposit en el tubo 1, para dejarla con una dilucin de 10-1, luego del tubo 1 se tomo 1ml y se deposit en el tubo 2 dejndola con una dilucin de 10-2, despus del tubo dos se tomo un 1ml y se deposit en el tubo 3 (dilucin 10-3) y finalmente del tubo 3 se tomo 1ml y se deposit en el tubo 4 (dilucin 10-4), tras realizado esto, se dividi en cuatro cuadrantes una placa Petri y se sembraron las distintas diluciones por estras desde el borde hasta el centro de la placa en cada cuadrante cada dilucin en un cuadrante respectivo tal como se muestra en la figura 2. Luego se realizo el mtodo de dilucin y plaqueo utilizando las diluciones 10-3 y 10-4 preparadas anteriormente, de las cuales se tomo 0,1 ml de inculo de la dilucin 10-3 utilizando una pipeta Pasteur y se deposita en un placa Petri y se siembra homogneamente con el asa de drigalsky este procedimiento se realizo 2 veces

para cada dilucin 10-3 y 10-4. tal como se muestra en la figura 3. finalmente se incubaron las placas.

Figura 1 aislamiento por agotamiento por estras en una placa de cultivo

Figura 2 aislamiento por dilucin y estra en una placa

Figura 3 mtodo de recuento por dilucin y plaqueo

Recuento y caracterizacin de colonias microbianas Para contar los microrganismo existentes en la muestra realizamos el mtodo de recuento de clulas viables, para lo cual se sembr en superficie de una placa de cultivo por dilucin y paqueo, para ello se tomo 1 ml de agua de poso con una pipeta estril y se diluyo en un tubo con 9 ml de solucin salina estril al 0,8% de NaCl obteniendo 3 diluciones, homogenizando bien la solucin en cada caso. De cada una de las diluciones obtenidas se tomo 0.1 ml de inculo y se sembr en forma homognea en 2 o 3 placas por cada dilucin y se incubaron a temperatura adecuada. Despus de la incubacin se conto el nmero de colonias en cada placa (rplicas) correspondiente a una determinada dilucin y se obtuvo un promedio. Slo se deben tomar en cuenta las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Para obtener el nmero de clulas por ml de muestra se usa la siguiente frmula:

Identificacin de microrganismos utilizando pruebas bioqumicas Se realizaron diversas pruebas bioqumicas como son: prueba de la catalasa, prueba de la oxidasa, prueba de oxido- fermentacin (O/F), prueba con agar Hierro Kligler, pruebas IMVIC ( prueba del indol, prueba del rojo metilo, prueba de Voges Proskauer, prueba del citrato), prueba de degradacin de molculas ( hidrlisis de Almidn e hidrlisis de gelatina).

RESULTADOS: 1. Recuento de microrganismos a partir del mtodo de dilucin y plaqueo.

UFC/ml = promedio colonias x dilucin x inoculo


Nmero de Colonias (promedio) Dilucin Inoculo Numero de microorganismos/ml 440 1/10-3 10 440.000 ( 4,4 x105)

2. Caracterizacin de colonias (parmetros fsicos).


COLONIA A FORMA BORDE ELEVACION OPASIDAD Irregular Ondulado Plana Traslucida y brillante Circular Liso Elevada Opaca Blanco Suave Granular COLONIA B

CROMOGENESIS Amarillo SUPERFICIE CONSISTENCIA Rugosa Mucosa

4- Identificacin por pruebas Bioqumicas


PRUEBA CEPA A CEPA B

CATALASA OXIDASA O/F

Positiva (liberacin de burbujas O2) Negativa ( sin cambio de color, amarillo) Va fermentativa ( el tubo con parafina y el si parafina mostraron una coloracin amarilla) Negativo ( color del medio Fucsia) Negativo (anillo incoloro) Negativo (color amarillo) Negativo( coloracin amarillo) Negativo (medio con coloracin verde) Negativo (sin formacin de

Positiva ( liberacin de burbujas) Positivo ( cambio de color azul) Va fermentativa ( el tubo con parafina y el si parafina mostraron una coloracin amarilla) Negativo( color medio fucsia) Negativo (anillo incoloro) Negativo ( coloracin amarilla) Negativo ( coloracin amarilla) Positivo ( medio con coloracin azul) Positivo (halo incoloro)

KLIGLER INDOL RM VP CITRATO AMILASA

halo) GELATINASA Positivo ( halo incoloro) Positiva ( halo incoloro)

5.- tincin GRAM


CEPA A B BACTERIAS Cocos -Bacilos largos (gram + y gram -) - Cocos

6. Prueba de resistencia a antibiticos


CEPA A ANTIBIOTICO AMOXICILINA PENICILINA GRAM Positiva y negativa Positiva y negativa SENSIBILIDAD RESISTENTE RESISTENTE

CEPA B ANTIBIOTICO AMOXICILINA PENICILINA GRAM Positiva y negativa Positiva y negativa SENSIBILIDAD RESISTENTE RESISTENTE

6. Tablas de identificacin para enterobacterias, segn resultado de pruebas Bioqumicas. a. Pruebas de IMVIC

CEPA A BACTERIA Pseudomona INDOL Negativo RM Negativo VP Negativo CITRATO Negativo

CEPA B BACTERIA Pseudomona INDOL Negativo RM Negativo VP Negativo CITRATO Negativo

b. Pruebas Bioqumicas clsicas.


CEPA A BACTERIA CATALASA O/F E.coli Positivo F KLIGLER Negativo AMILASA Negativo GELATINASA H2S Positivo Negativo

CEPA B BACTERIA CATALASA O/F Pseudomona Positivo F KLIGLER Negativo AMILASA Positivo GELATINASA H2S Positivo Negativo

DISCUSION Cuando se observa al microscopio cualquier muestra natural, se logra observar una gran cantidad de microrganismos, de la cual algunos de ellos podran ser tiles para el hombre, mientras que otros podran ser patgenos, la separacin de cada una de estas variedades es lo que se conoce como aislamiento de microrganismo. Para poder obtener un aislamiento exitoso y la obtencin del cultivo puro de un microrganismo en particular se utilizan los mtodos de enriquecimiento, los que estn diseados para incrementar el nmero relativo de un microrganismo, favoreciendo su desarrollo, supervivencia o su separacin espacial de otros miembros de la poblacin. Los mtodos de enriquecimiento pueden ser tanto fsicos como qumicos, entre los fsicos podemos encontrar incubacin a bajas temperaturas, luz visible. Y entre los mtodo qumicos esta el enriquecimiento cido, NaCl, sales biliares cada uno de los cuales suele utilizarse para un tipo de bacteria determinado.

Tras el aislamiento de microrganismos de una muestra de agua de pozo, nosotros obtuvimos 4 tipos de colonias de las que analizamos 2 a las que denominamos colonia A y colonia B y se lograron caracterizar utilizando 7 criterios (forma, borde, elevacin, opacidad, cromognesis, superficie y consistencia) Tras realizar la tincin de Gram se observaron varios tipos de bacterias entre los cuales estaban los cocos, bacilos pequeos y grandes (Gram positivos y Gram negativos), al encontrar esta variedad, puede deberse a que haba contaminacin, provocada por la mala manipulacin, al no elegir una colonia bien aislada, puesto que algunas placas posean hongos provocando que al pasarlo a llevar con el asa de Loop provocara dicha contaminacin, y tambin se pudo haber contaminado porque no se trabajo aspticamente. Para las pruebas bioqumicas se obtuvo que las bacterias si presentan la enzima catalasa, enzima esencial para la respiracin celular, puesto que descompone el perxido de hidrogeno generado en la cadena transportadora de electrones, por otro lado se observo que en una cepa solo hay presencia de la enzima oxidasa encargada de oxidar el citocromo c, este citocromo que es parte de la cadena trasportadora de electrones en presencia de oxigeno molecular reduce una serie de sustratos inorgnicos produciendo el Indofenol. Para la prueba de oxido fermentacin obtuvimos que tanto la cepa A como la B presentan la va fermentativa para su metabolismo, es decir utiliza carbono orgnico en vez de oxgeno como receptor terminal de electrones. Esto significa que estos organismos no utilizan una cadena de transporte de electrones para oxidar NADH a NAD+ y por lo tanto deben tener un mtodo alternativo para usar esta energa reductora y mantener una fuente de NAD+ para el funcionamiento apropiado de las rutas metablicas normales (por ejemplo, la glicolisis). Puesto que no requieren oxgeno, puesto que los organismos fermentantes son anaerobios. Tras realizar la prueba de hierro Klingler se pudo comprobar que los organismos presentes en las dos cepas no utilizan ni glucosa ni lactosa en su metabolismo. En la prueba de Indol se puede concluir que los organismos presentes no tienen la capacidad de producir Indol a partir de una molcula de triptfano en el medio puesto q el resultado fue negativo para ambas cepas. Por otro lado los microrganismo no tiene la capacidad de producir y mantener estables los productos cidos de fermentacin tras los resultados obtenidos de la prueba de rojo metilo. Para la prueba de citrato se obtuvo que solo una cepa con microrganismos capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono. Para las pruebas de degradacin de molculas se obtuvo que una cepa es capaz de hidrolizar el almidn de la placa de cultivo, por lo tanto haba presencia de la enzima amilasa encargada de hidrolizar el almidn en glucosa y restos de maltosa.

Para la prueba de la gelatina se obtuvo que ambas cepas posean microrganismos capaces de producir una enzima de tipo proteoltico capaz de licuar la gelatina de la placa de cultivo. Tras realizar el antibiograma se obtuvo que tanto la cepa A como la B fueran resistentes a los 2 antibiticos (amoxicilina y penicilina), esta resistencia puede deberse a que los microrganismos hayan tenido a lo largo de su vida una mutacin que les permita sobrevivir y poder reproducirse de esta manera pasaran este rasgo a su descendencia, que ser una generacin totalmente resistente. La sensibilidad de los microrganismos a los antibiticos vara segn el tipo. Las bacterias Gram positivas son generalmente ms sensibles que las Gram negativas. Cuando un antibitico acta eficazmente sobre ambas se dice que es de amplio espectro, si acta slo sobre determinadas bacterias se dice que es de corto espectro. Este ltimo puede ser muy til para el control de microrganismos que no responden a otros antibiticos. Los antibiticos, segn su estructura qumica y su modo de accin, actan en diversos puntos de la bacteria. Las dianas ms importantes son la pared celular, la membrana citoplasmtica y los procesos biosintticos de las sntesis de protenas. Algunos agentes quimioteraputicos, como las sulfas, son anlogos de factores de crecimiento, funcionan porque mimetizan importantes factores de crecimiento que son necesarios para el metabolismo de la clula Estas cepas fueron resistentes, esta resistencia puede tener varios orgenes: 1- puede generar sustancias que se llaman beta-lactamasas que eliminan el antibitico, es decir, anulan su funcin. por lo que no mata a la bacteria. 2- puede adquirir resistencia al antibitico por medio de plsmidos R (son genomas pequeos e individuales, es decir, que no forman parte del cromosoma bacteriano y que pueden poseer genes de resistencia) estos genes de resistencia son transmitidos por medio de la conjugacin que es un intercambio de informacin gnica entre dos bacterias. Transfiriendo la ventaja de resistir a antibiticos. Analizado los resultados obtenidos en la prueba especfica para enterobacterias se puede decir que la cepa A y B, estamos en presencia de Pseudomonas se caracterizan por ser bacilos rectos o ligeramente curvados, son bacterias Gram negativas, oxidasa positivos, aerbicos estrictos aunque en algunos casos pueden utilizar el nitrato como aceptor de electrones. Es comn la presencia de plsmidos y no forman esporas, la presencia de plsmido puede indicar la capacidad de resistencia a antibiticos, ya que estas cualidades son otorgadas por los plsmidos. Ahora bien al tomando encuentra los resultados obtenidos por las pruebas bioqumicas clsicas, estos concuerdan con clasificar a la cepa A con la presencia de E.Coli y en B Pseudomona, los resultados de la Cepa B nos corroboran la presencia de una Pseudomona, en cambio la Cepa A, arroja la presencia de E.coli bacteria, Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, es anaerbico facultativo, adems no forma esporas.

Hay que tener en cuenta para la obtencin de resultados certeros en la buena manipulacin de instrumentos y realizacin de tcnicas ya que pequeos errores pueden provocar la contaminacin de muestra, mala aislacin, y cambios en las respuesta a pruebas bioqumicas y por ende en vez de aislar una cepa determinada, se pueden tener dos o mas en un mismo cultivo. CONCLUSION Estos anlisis nos permiten aislar, conocer, bacterias presenten en muestras naturales, sobre todo este mtodo puede ser aplicado para verificar la presencia de patgenos en agua, en alimentos, o en zonas que estn en contacto directo con el hombre, adems de conocer la microbiota de un lugar o sitio especifico. El reconocimiento de bacterias a travs de mtodos bioqumicos, permiten identificar de forma ms precisa a una bacteria ya que cada una posee vas metablicas especficas. La presencia de estas Bacterias tanto Pseudomona como E.Coli es normal encontrarlas en muestras de agua de origen natural, como en este caso agua de pozo. Estudios previos indican que la presencia de Pseudomonas es normal en aguas subterrneas o pozos, pero su presencia hace no potable a esta agua.3 Tambin la presencia de E.Coli en muestras aisladas indican presencia de contaminacin de origen fecal, pero esta prueba no permite verificar si su procedencia es de humanos o animales, ya que la contaminacin que se desea manejar o controlar es la humana. BIBLIOGRAFIA: 1- http://www.uamenlinea.uam Manual de prcticas de Microbiologa. 20-01-2012 20:51 2- Gua N5 Recuento y caracterizacin de colonias microbianas. 3- BACTERIAS INDICADORAS DE RIESGO SANITARIO APORTADAS POR EL
RIEGO FRENTE A LA SUPRESIVIDAD EDFICA. Laura C De Luca, Angela S. Zamora y Alicia M. Folabella. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UNMDP. Departamento de Biologa. Laboratorio de Microbiologa. 4- Gua N4 y 6 prctico microbiologa. Temas Aislamiento e Identificacin de Muestras.

ANEXOS
Caldo nutritivo, solucin salina esteril , perxido de hidrogeno, Bactident Oxidase (MERCK), medio cultivo hugo Leifson, cultivo peptonado, reactivo de Kovacs, tampn fosfato, citrato de Simmon, Lugol, reactivo Frazier.4