In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces

Key words: biofilm, dental implant, live/dead staining, surface free energy, surface roughness, Streptococcus sanguinis Abstract Objectives: The aim of the present in vitro and human in vivo study was twofold: first, to evaluate the initial biofilm formation on different titanium implant surfaces by means of two highly sensitive fluorescent techniques and, second, to correlate these findings to different surface properties. Materials and methods: In vivo biofilm formation was induced on purely machined (Pt) and on sand-blasted and acid-etched titanium (Prom) specimens, which were mounted buccally on individual splints and worn by six study participants for 12 h. In vitro bacterial adhesion was also investigated after incubation with Streptococcus sanguinis suspension (371C, 2 h). Adherent bacteria were quantified by the following fluorescence techniques: Resazurin staining in combination with an automated fluorescence reader or live/dead cell labeling and fluorescence microscopy. Surface roughness (Ra) was determined with a perthometer, and surface free energy (SFE) was measured with a goniometer. Results: Prom showed a significantly higher median Ra (0.95 mm) and a significantly lower median SFE (18.3 mJ/m2) than Pt (Ra0.15 mm; SFE39.6 mJ/m2). The in vitro and in vivo tests showed a significantly higher bacterial adhesion to Prom than to Pt, and the initial biofilm formation on Pt corresponded to the circular surface modifications on the machined substratum. Both observations may be attributed to the predominant influence of surface roughness on bacterial adhesion. No significant differences in the percentage of dead cells among all adhering bacteria were found between Prom (23.7%) and Pt (29.1%). Ectopic solitary epithelial cells from the oral mucosa strongly adhering to the substratum were found on each Prom specimen, but not on any of the Pt surfaces. Conclusions: Initial bacterial adhesion to differently textured titanium surfaces is primarily influenced by Ra, whereas the influence of SFE seems to be of only minor importance. Therefore, the micro-structured parts of an implant that are exposed to the oral cavity should be highly polished to prevent plaque accumulation. Both tested fluorometric techniques proved to be highly sensitive and reproducible in the quantification of biofilm formation on titanium implant surfaces.

The success of dental implants depends on the osseointegration between the implant and the surrounding bone as well as on an inflammation-free contact healing with the mucosal connective tissue. While the problems in osseous healing of implants appear to be largely solved, the sealing of the implant surface through soft tissuemay be crucial for long-term therapeutic success (Abrahamsson et al. 1998). Microbial adhesion and the accumulation of pathogenic biofilms are considered to play major roles in the pathogenesis of peri-implantitis and implant loss (Scarano et al. 2004; Elter et al. 2008). Once the clean implant surface is exposed to the oral cavity, it is immediately covered by salivary pellicle and colonized by microorganisms (Elter et al. 2008). Besides sufficient oral hygiene through mechanical and chemical cleaning, it is therefore most important to develop implant surfaces around the transmucosal portion that reduce the number of initially adhering bacteria, which in turn minimizes plaque formation and subsequently the inflammation of soft tissues (Grossner-

Schreiber et al. 2001, 2004). The physico-chemical characteristics of specific material surfaces are known to significantly influence the bacterial adhesion process (Wu-Yuan et al. 1995; An & Friedman 1998; Rasperini et al. 1998; Teughels et al. 2006). Both surface free energy (SFE) and surface roughness are known to play a major role in this process, whereas surface roughness has been suggested to be the predominant of both parameters (Nakazato et al. 1989; Esposito et al. 1998; Quirynen et al. 1999, 2002). The bony and connective tissue interfaces of most dental implant materials are porous or micro-textured to support osseointegration. Therefore, titanium implant surfaces that are too smooth prevent cell attachment. On the other hand, roughly textured implant substrata enhance plaque accumulation, whereas high-polished materials with reduced surface roughness limit initial biofilm formation in vivo (An & Friedman 1998; Quirynen et al. 1999; Teughels et al. 2006). In this context, a value of 0.2 mm has been generally accepted as the average roughness threshold below which the amount of bacterial adhesion cannot be reduced any further (Bollen et al. 1997; Grossner-Schreiber et al. 2001; Elter et al. 2008). Therefore, to aid the clinical treatment of bacteria-induced peri-implant destructions, exposed implant threads with rough micro-structure are burnished and polished (implantoplasty) to prevent excessive plaque accumulation (Lang et al. 2004). The SFE of a solid substratum has been shown to have crucial impact on the initial adhesion of oral microorganisms (Busscher et al. 1984; Weerkamp et al. 1985; Pratt-Terpstra et al. 1988, 1989). In the thermodynamic model of microbial adhesion, bacterial strains with high SFE have a negative interfacial free energy of adhesion (DFadho0) at substratum surfaces with high SFE. Therefore, these strains are expected to preferentially adhere to such substrata (Weerkamp et al. 1985; PrattTerpstra et al. 1988, 1989). Surface roughness and SFE may be easily modified on titanium dental implants by sand-blasting, plasma nitriding, acid etching, titanium vacuum plasma spraying, or by applying various chemical coatings (Browne & Gregson 1994; Del et al. 2005). As a consequence, a more detailed understanding of the role of different implant surface properties in bacterial adhesion and an optimization of these physico-chemical characteristics seems necessary. For this purpose, a large number of experimental systems for studying microbial adhesion in vivo and in vitro are available, most of which are based on direct colony counting (Bollen et al. 1996; Drake et al. 1999; Barbour et al. 2007) and scanning

electron microscopy (SEM) observations (Gatewood et al. 1993; Drake et al. 1999; Rimondini et al. 2002; Kuula et al. 2004; Del et al. 2005; Barbour et al. 2008). In contrast to these traditional microbial quantification methods, systems based on biofluorescence have gained increasing importance, because they have become accepted as simple, precise, reproducible, and highly sensitive tools for the quantification of adhering microorganisms (Grivet et al. 1999; Grossner-Schreiber et al. 2001; Gaines et al. 2003; Pier-Francesco et al. 2006; Muller et al. 2007; Buergers et al. 2008; Hahnel et al. 2008). Newly developed two-color live/dead staining techniques complement the investigative possibilities by providing a visual differentiation between living and dead bacteria (Boulos et al. 1999; Hannig et al. 2007; Al-Ahmad et al. 2008). In this context, SYTO 9 and propidium iodide staining has proven superior in comparison with other assays, because it provides a clear differentiation between dead and active microorganisms without interference of background fluorescence (Decker 2001). In general, fluorescence microscopy approaches offer the opportunity to visualize bacteria directly on the substrata and in the state of adherence (Hannig et al. 2007). The present study was conducted to evaluate the in vitro and in vivo microbial adhesion to sand-blasted and acid-etched Promotes titanium surface in comparison with machined pure titanium by means of two highly sensitive fluorescence techniques (Resazurin and live/dead staining) and to correlate these findings to differences in surface roughness, SFE, and surface morphology.

Materials and methods

Characterization of titanium surfaces

Two different types of titanium specimens measuring 9mm in diameter and 2mm in thicknesswere used. The textured Promotes titanium surface (Camlog Biotechnologies AG, Basel, Switzerland) is sand-blasted and acid-etched and is used for the Camlogs dental implant system (Camlog Biotechnologies AG). Promotes (Prom) surfaces were compared with machined pure titanium specimens (Pt; Camlog). The surface roughness (Ra) of five specimens of each of the two materials on three different sites was determined with a stylus instrument (Perthometer S6P; Perthen, Go ttingen, Germany). The total SFE, its dispersion, and polar components were calculated from automated contact angle measurements (OCA 15 plus; Dataphysics Instruments, Filderstadt, Germany) as described before (Hahnel et al. 2008). SEM was conducted for three specimens of the two titanium materials. The specimens were mounted directly on aluminum stubs and imaged with SEM

(magnification _ 600 and _ 8000) (Quanta FEG 400; FEI Company, Eindhoven, the Netherlands).
In vivo biofilm formation

Three healthy women (A, B, and C) and three healthy men (D, E, and F) volunteered to participate in the present study (age 2238 years, mean: 28 years; all nonsmokers). None of the volunteers had used antibacterial mouth rinses or systemic antibiotics for 12 months before the start of the study. Oral examination was carried out by an experienced dentist. All volunteers had physiological salivary flow rates (11.5ml/min) and excellent oral hygiene (plaque index and sulcus bleeding index close to zero). Informed written consent had been given by the subjects and the study had been approved by the Ethics Committee of the University of Regensburg (application 08/131). All specimens

were disinfected by ultrasonication in 3% sodium hypochlorite (Pharmacy, University Hospital Regensburg, Regensburg, Germany) for 20min and then washed in distilled water. Samples were free of microorganisms after this treatment as proven by SEM and live/dead staining. For in vivo biofilm formation, the specimens were fixed to individual removable acrylic upper jaw splints (Fig. 1), with which the titanium specimens were positioned in the buccal region of the premolars and first molars, so that biofilm growth was not disturbed by tongue movements. Each volunteer had two Prom and two Pt specimens inserted. Food or beverage consumption and oral hygiene were forbidden during carriage. The splints were worn for 12 h. Then, the plaque-covered specimens were removed from the splints and immediately processed for fluorescence staining. All specimens were transferred to well plates and washed threefold in phosphatebuffered saline (PBS) to remove non-adhering cells. The Live/Dead BacLight bacterial viability kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) was used to determine the

proportion of live or active cells (fluorescent green) and dead or inactive cells (fluorescent red). The live/dead stain was prepared by diluting 18 ml of staining component A (SYTO 9) and 18 ml of staining component B (propidium iodide) in 15ml of distilled water. Five hundred microliters of the reagent mixture were added to each well, and specimens were incubated at room temperature and in darkness for 15 min. Each specimen was carefully positioned on a glass slide covered with component C (mounting oil) and stored in the dark at 41C until further processing. Fluorescence emission was determined with a fluorescence microscope (BX61; Olympus GmbH, Hamburg, Germany) in combination with the image processing software cell ^ P (Olympus GmbH). In each specimen, the fluorescent microscopic images of five randomly selected sites were captured with a digital camera (U-CMAD3; Olympus GmbH) that was connected to the microscope. Living and dead cells in the same microscopic field were viewed separately with different fluorescence filter sets (FITC/F41-054 and Alexa594/ F41-027; AHF Analysetechnik, Tu bingen, Germany) and digitally combined to one picture. The areas covered by dead cells (fluorescent red), viable cells (fluorescent green), and total cells were calculated as percentage of specific standard microscopic fields (420 _ 320 mm0.13mm2) with the image analysis software Optimas 6.2 (Meyer Instruments, Houston, TX, USA).
In vitro biofilm formation

Streptococcus sanguinis (strain 20068; DSMZ, Braunschweig, Germany) was used in this study for in vitro biofilm formation. After a frozen (_601C) preculture had been established, the bacteria were exposed on an agar plate and incubated at 371C for 48 h. Cultures from a single colony were cultivated in sterile trypticase soy broth (Trytic-Soy Broth; BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) supplemented with yeast extract (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) at 371C for 16 h. The day before the experiment, 1 ml of each bacterial suspension had been inoculated with 250 ml of sterile trypticase soy broth (BD Diagnostics) and incubated at 371C for 12 h. The bacterial suspensions were centrifuged at 896 g at 181C for 5min and washed twice in PBS (Sigma-Aldrich). Optical density of the suspensions was adjusted to 0.3 at 540 nm. As described before, the oxidation reduction fluorescence dye Alamar Blue/ Resazurin (0.75 g/ml aqua dest) (SigmaAldrich) was used to determine the total quantity of adhering bacteria (Buergers et al. 2007). Fluorescence intensities were recorded by an automated multi-detection reader (Fluostar optima; BMG Labtech,

Offenburg, Germany) at wavelengths of 530nm excitation and 590nm emission. Unstimulated human saliva was collected from one healthy donor aged 31 years who did not show any active carious lesions or periodontal diseases. The saliva was sterilized by means of single-use filtration devices with pore sizes 0.45 and 0.2 mm (Vacuflo PV050/2 and PV050/3; Schleicher & Schu ll Microscience GmBH, Dassel, Germany). Incubated at 371C for 120min, the filtered saliva formed a salivary pellicle on all specimens (Hahnel et al. 2008). After removal of saliva, PBS (1ml) was added to each well (15 specimens for each material) and determined the autofluorescence of each specimen. After the removal of the buffer, 1ml of bacterial suspension was added to each well, and the well plates were incubated with Resazurin (15 ml) at 371C for 120min. The mixture of bacterial suspension and Resazurin was extracted by suction, the wells were subsequently washed twice, and 1ml of PBS was added. Fluorescence intensities after bacterial adhesion were determined as described above. The fluorescence values of pure PBS (0control), buffer and Resazurin (dye-control), and pure bacterial solution (bacteria-control) served as control references. High relative fluorescence intensities (RFIs) indicated high streptococcal adhesion. The in vitro pellicle and biofilm formation was repeated with further five specimens of each material, but without the addition of Resazurin. After 120-min incubation on an orbital shaker (semi-static conditions) with S. sanguinis, the proportion of live or active streptococci (fluorescent green) and dead or inactive streptococci (fluorescent red) was determined with the Live/Dead BacLight bacterial viability kit (Molecular Probes) as described above (please see In vivo biofilm formation).
Statistical analysis

Continuous data were summarized by using medians and interquartile ranges (25th75th percentile). Global betweengroup comparisons were conducted by the BrunnerLanger test for the in vivo testing and by the KruskalWallis rank analysis of variance for the in vitro testing. The detection of differences between Ra and SFE, and the amount of adhering bacteria on the tested titanium surfaces (n2) were detected by the pair-wise MannWhitney Utest in combination with the Bonferroni adjustment (two-sided a0.025). Calculations were done with statistical software SPSS 15.0 for Windows (SPSS Corp., Chicago, IL, USA) and SAS (SAS Institute, Cary, NC, USA).

Results
Surface characterization of titanium substrata

The KruskalWallis rank analysis of variance revealed significant differences between Pt and Prom in surface roughness (Ra) and SFE values (Po0.001 for both comparisons). Significantly higher median roughness values were found for Prom (0.95 mm) than for Pt (0.15 mm). The median SFE of Pt was significantly higher (total SFE: 39.6 mJ/m2; dispersion component: 35.9 mJ/m2; polar component: 3.7 mJ/m2) than the median SFE of Prom (total SFE: 18.3 mJ/m2; dispersion component: 18.1 mJ/m2; polar component: 0.2 mJ/m2). SEM images of Prom discs showed a homogenous roughened micro-structure (Fig. 2), whereas at a higher magnification, Pt surfaces showed a circular configuration of alternating plane and flattened and rough surface areas (Fig. 3). The adhesion of microorganisms both in vitro and in vivo corresponded to these circular surface modifications on Pt surfaces, and bacteria were arranged in orbital patterns (Fig. 4). On Promsurfaces,microorganisms in vivo and S. sanguinis in vitro adhesion tests were uniformly distributed in small aggregates and did not follow any pattern (Fig. 5).
In vivo determination of microbial adhesion (live/dead staining)

The BrunnerLanger statistical test revealed significant differences between the tested materials for total cells (P0.00478), vital cells (P0.00215), and dead cells (P0.03322). Calculations from live and dead stainings are given in Figs 6 and 7 and in Table 1. Examples for the in vivo fluorescent microscopic images are shown in Figs 8, 4, and 5. In general, the six volunteers showed significant differences in microbial adhesion (total bacteria, dead, and vital bacteria). The assessment of the fluorescence micrographs of all volunteers showed that 1.1% (median) of the surface of reference material Pt was covered by microorganisms after 12 h in situ. Significantly larger areas were covered by microorganisms on Prom (8.5%) (P0.00478). Figure 7 and Table 1 show the percentage of dead cells among all adhering cells (living and dead cells). 29.1% of detected microorganisms on Pt and 23.7% of those on Prom were dead (P0.03322). The microorganisms colonized the surface as monolayer or isolated aggregates of cells, or both, which were randomly distributed but well defined (cf. Fig. 4). Ectopic solitary epithelial cells from the oral mucosa strongly adherent to the substratum were found on each Prom specimen, whereas not a single cell was found on Pt surfaces (cf. Fig. 8).
In vitro determination of microbial adhesion (live/dead and Resazurin staining)

Calculations from the in vitro live/dead stainings are given in Table 2. Examples

for the in vitro fluorescent microscopic images are shown in Figs 9 and 10. According to the in vivo results, a significantly higher amount of adhering S. sanguinis was found on Prom than on Pt. 11.2% (median) of the surface of Prom discs was covered by streptococci, out of which 0.5% were dead (fluorescent red) and 10.7% vital (fluorescent green). Significantly smaller

areas were covered by S. sanguinis on Pt (3% in total: 0.4% dead bacteria, 2.7% vital bacteria) (Po0.001). Table 2 shows the results from the in vitro Resazurin quantification method as RFIs on the two test titanium materials. In

general, statistically significant differences were found after the KruskalWallis rank analysis of variance (Po0.001). Higher RFI, representing higher amounts of adhering streptococci, were found for Prom [median fluorescence intensity: 13489 relative fluorescence units (RFU)] and significantly lower RFI, meaning lower amounts of adhering bacteria, for Pt (9945RFU) (Po0.001).

Discussion
The adhesion of oral microorganisms and the subsequent formation of pathogenic biofilms on the surface of dental implants result in infections of the peri-implant tissues and finally in implant failure. Peri-implantitis has been reported in 16% of implant patients after 914 years (RoosJansaker et al. 2006) When peri-implant inflammatory reactions lead to an exposition of micro-structured implant parts to the oral cavity, the typical and instinctive recommendation is to debride these parts and obtain a smoother surface (Del et al. 2005; Barbour et al. 2007). Scientific knowledge on the fundamental processes of bacterial adhesion to implant surfaces is poor and therapy recommendations on peri-implantitis are mainly based on empirical values rather than on well-founded research results. Therefore, themain objective of the present study was to investigate in vitro and in vivo microbial adhesion to two different titanium surfaces by means of two highly sensitive fluorescence techniques (Resazurin and live/dead staining) and to correlate these findings to specific surface characteristics [surface roughness (Ra) and SFE]. S. sanguinis, formerly known as S. sanguis, was used as a test microorganism for the in vitro part of the study because of its common presence in the human oral cavity. Moreover, S. sanguinis is known as a pioneer bacterium in the oral biofilm (Grossner-Schreiber et al. 2001; Rimondini et al. 2002; Mabboux et al. 2004; Del et al. 2005). Additionally, Drake et al. (1999)

showed that hydrophobic titanium surfaces were preferentially colonized by S. sanguinis (rather hydrophobic). The tested titanium is the most frequently used material for the construction of implant systems in modern dentistry. Tailor-made modifications of titanium implant surfaces have been invented to optimize the bone binding potential of dental implants. In general, these surface modifications lead to increased Ra and variable changes in SFE, which in turn changes the adhesion potential of such titanium surfaces (Pier-Francesco et al. 2006). In in vitro testing, a significantly higher microbial quantity of adhering S. sanguinis was found on Prom than on Pt (Resazurin technique: 1.4-fold; live/dead staining: 3.7fold). This phenomenon was even more pronounced in in vivo testing (7.7-fold higher plaque accumulation on Prom than on Pt), probably because of the sheltering effect of rough surfaces against removal forces, which do not occur under semistatic in vitro conditions (Rimondini et al. 2002). In general, the higher number of adhering microorganisms on Prom can be explained by different surface characteristics such as Ra and SFE. Many studies have been conducted on the influence of surface characteristics on restorative and prosthetic materials. In contrast, little information is available on fundamental interactions between microorganisms and implant surfaces. Additionally, detailed observations of the corresponding implant substrata and

their specific surface properties have often been disregarded. One reported risk for peri-implantmicrobial adhesion and resulting peri-implantitis is high surface roughness of the transmucosal component of an implant (Quirynen et al. 2002). Current opinion indicates that low SFE materials with reduced Ra limits initial microbial adhesion (An & Friedman 1998; Quirynen et al. 1999). Our median SFE values of the two tested titanium materials are consistent with SFE values found by Grossner-Schreiber et al. (2001) (who reported SFE values of different titanium surfaces between 34.3 and 38.71mJ/m2 including low polar components) and Mabboux et al. (2004) (SFE values of 43.8 and 44.6 mJ/m2 also with low polar components). In the present study, Prom showed significantly higher Ra values, lower SFE values, and a higher in vitro and in vivo microbial adhesion than Pt. Therefore, the influence of Ra on plaque accumulation appears to be more important than the influence of SFE. Many studies postulated a predominant influence of Ra in contrast to SFE, which could be affirmed by our investigation (Bollen et al. 1996, 1997; Quirynen et al. 1999; PierFrancesco et al. 2006; Teughels et al. 2006). Some in vivo studies indicated a threshold

Ra of 0.2 mm, below which no further reduction of bacterial accumulation could be expected (Bollen et al. 1996, 1997). The enhanced bacterial adhesion on Prom supported this thesis. According to Verran & Boyd (2001), Prom (median Ra0.95 mm) can be described as micro-rough and Pt (median Ra0.15 mm) as nano-rough. Microorganisms on rough surfaces are assumed to be more protected against shear forces,

and initial colonization has been shown to start from surface irregularities (Nyvad & Fejerskov 1987; Bollen et al. 1997; Hannig 1999; Quirynen et al. 1999). Surprisingly, a higher retention of S. sanguinis on rough surface areas was also shown in the semistatic in vitro part of our study, in which no significant shear forces can be expected. Additionally, rough andmicro-textured surfaces not only seem to accumulate more plaque, but this plaque also contains more pathogenic flora (Bollen et al. 1996). In summary, it was clearly shown that rough surfaces enhance bacterial adhesion both in vivo and in vitro and that the influence of Ra outweighs the influence of SFE. As a consequence, all micro-structured parts that are exposed to the oral cavity and its microorganisms should be highly polished to generate an anti-adherent or plaque-reducing effect. The relevance of this procedure was affirmed by the in vitro and in vivo results of this study. The amount of adhering bacteria in vivo showed high intra-individual and interindividual variability, which was also shown by Hannig et al. (2007) even after shorter incubation times. However, all six volunteers showed the same differences in microbial load on the two tested titanium surfaces (Prom vs. Pt) (Prom4Pt). Additionally, these differences correlated well to the in vitro results,which in turnproved the significance of our in vitro adhesion model. For the first time, in vivo and in vitro bacterial adhesion on dental implants was investigated by means of live/dead staining to study the influence of different surface textures on the viability of adhering bacteria. Fluorometric techniques in adhesion studies offer the opportunity to quantitatively investigate a high number of specimens in a short period of time and, at the same time, to study detailed morphological aspects by microscopic techniques. No statistical differences were found between Prom and Pt with regard to the percentage of dead and vital bacteria. Therefore, differences in surface characteristics such as Ra or SFE which differed significantly between Prom and Pt may not influence the viability of oral biofilms. Interestingly, a high percentage of dead bacteria among the adhering cells (Pt: 29.1% and Prom: 23.7%) could be already found after 12 h of in vivo incubation. Our findings correspond to the results of Hannig et al. (2007), who found about 40% of dead bacteria after different intra-oral incubation times. In conclusion, the role of dead biological material in the formation process of (oral) biofilms may have been underestimated in the past and should be further investigated. In general, the information obtained from fluorescence techniques is mainly quantitative in nature. Therefore,

the species composition of the microbial communities on the tested specimens was not determined. In contrast to previously conducted molecular methods, no conclusions on biofilm composition could be drawn (Amann et al. 1995). In vitro models are frequently used in studies on microbial adhesion on specific substrata, because they are reproducible and cost-effective. Additionally, the interpretation of results is simplified by the userdefined inclusion and exclusion of specific influencing factors. In comparison, in vivo models offer the opportunity to evaluate materials in realistic clinical conditions, presenting composite plaque, co-adhering microorganisms, salivary pellicle, and removal forces by salivary flow and chewing activities (Rimondini et al. 2002). With the benefit of hindsight, our in vitro results are in strong accordance with our in vivo results. Therefore, our semi-static in vitro model in combination with the Resazurin and the live/dead techniques represent realistic and reproducible models for testing the bacterial adhesion on dental implants. Adherent solitary epithelial cells from the oral mucosa were found on each Prom specimen, whereas not a single cell was found on Pt surfaces. This secondary finding showed that material surface characteristics, which have a pivotal influence on plaque accumulation, also influence the formation of epithelial attachment. The effect of Ra and SFE on attachment, orientation, and proliferation of human gingival fibroblasts has been demonstrated in various other studies (Kononen et al. 1992; Mustafa et al. 1998; Lauer et al. 2001; Rimondini et al. 2002). Although this hypothesis was not tested in our study, the high number of ectopic epithelial cells on Prom strongly adherent to the surface seems to suggest that Prom may be a promising material capable of enhancing cell attachment formation and osseointegration. Biological contamination is difficult to remove from structured implant surfaces, e.g. by the use of plastic curettes or sonic/ ultrasonic scalers (Schwarz et al. 2009). Thus, in addition to making dental implants with high bone binding potentials, it is important to develop implant surfaces that reduce the number of initially adhering bacteria. At this point in time, these two requests for the construction of implant materials unfortunately contradict each other. In general, manufacturers modifications of implant surfaces and the treatment recommendations on exposed implant structures should be based on research results. Therefore, further investigations are needed into the essential proceedings of bacterial adhesion on implant surfaces. As titanium itself does not show any antibacterial activity, anti-adhesive coatings or alloys to provide

bactericidal surfaces may be an alternative to conventional invasive periimplantitis therapies.

Conclusions
Within the limitations of the present study, our findings indicate that in vitro and in vivo adhesion of bacteria to differently textured titanium surfaces is primarily influenced by surface roughness. In contrast, the influence of SFE is of lesser importance. Therefore, any micro-structured part that is exposed to the oral cavity should be highly polished to generate an anti-adherent and plaque-reducing effect. A high percentage of dead cells among the adhering bacteria could be observed on all titanium specimens. This observation affirms the pivotal role of dead biological material in the formation process of (oral) biofilms. At last, the two fluorometric techniques (Resazurin and live/dead staining) used in the present study proved to be reproducible, sensitive, and precise tools to study in vivo and in vitro initial biofilm formation on titanium implant surfaces. Acknowledgements: We are grateful to the Camlog Biotechnologies AG (Basel, Switzerland) for the supply of titanium specimens. The authors declare that they have no conflict of interest.

En vivo e in vitro la formacin de biopelculas en dos implantes de titanio diferente superficies Palabras clave: biofilm, implantes dentales, vivo / muerto de tincin, la energa libre superficial, rugosidad de la superficie, Streptococcus sanguinis Resumen Objetivos: El objetivo de la presente in vitro y humanos en el estudio in vivo fue doble: en primer lugar, evaluar la formacin de biopelculas inicial sobre diferentes superficies de titanio del implante por medio de dos tcnicas fluorescentes de alta sensibilidad y, en segundo lugar, para correlacionar estos hallazgos con diferentes propiedades superficiales. Materiales y mtodos: En la formacin de biopelculas in vivo se indujo en puramente mecanizada (Pt) y el chorro de arena y al cido de titanio (Prom) ejemplares, los cuales fueron montados bucal de frulas individuales y usado por los seis participantes en el estudio de las 12 h. En adhesin bacteriana in vitro Tambin se investig despus de la incubacin con Streptococcus suspensin sanguinis (371C, 2 h). Bacterias adheridas se cuantificaron las siguientes tcnicas de fluorescencia: resazurina tincin en combinacin con un lector automtico de fluorescencia o en vivo / muerto marcacin celular y microscopa de fluorescencia. La rugosidad superficial (Ra) se determin con un Perthometer, y la superficie libre de la energa (SFE) se midi con un gonimetro. Resultados: Prom mostraron una significativamente mayor mediana Ra (0,95 mm) y una significativamente menor mediana de SFE (18,3 MJ/m2) que Pt (Ra 0,15 mm; SFE 39,6 MJ/m2). El in vitro e in vivo las pruebas mostraron una adherencia significativamente mayor que las bacterias a prom a Pt, y la inicial la formacin de biopelculas sobre Pt correspondan a las modificaciones de la superficie circulares en el mecanizado sustrato. Ambas observaciones se puede atribuir a la influencia predominante de superficie rugosidad en la adhesin bacteriana. No se observaron diferencias significativas en el porcentaje de clulas muertas entre todas las bacterias adheridas se encuentran entre los de baile (23,7%) y Pt (29,1%). Ectpico solitarios clulas epiteliales de la mucosa oral, fuertemente adheridos al sustrato-fueron encontrado en cada muestra de baile, pero no en cualquiera de las superficies de Pt. Conclusiones: adhesin inicial bacteriana a las superficies de titanio diferente textura es principalmente

influenciado por Ra, mientras que la influencia de SFE parece ser de importancia slo menor. Por lo tanto, las partes micro-estructurados de un implante que estn expuestos a la cavidad oral debe ser altamente pulido para evitar la acumulacin de placa. Tanto probado fluoromtrico tcnicas demostr ser altamente sensible y reproducible en la cuantificacin de biofilm formacin sobre superficies de los implantes de titanio. El xito de los implantes dentales depende la oseointegracin entre el implante y el hueso circundante, as como en una la inflamacin sin contacto con la curacin el tejido conectivo mucosa. Mientras que el problemas en la cicatrizacin sea de los implantes parecen ser solucionado en gran parte, el sellado de la superficie del implante a travs tissuemay suave ser crucial para el xito a largo plazo teraputica (Abrahamsson et al., 1998). Adherencia microbiana y la acumulacin de patgenos biopelculas se considera que desempean un papel importante en la patognesis de la periimplantitis y la prdida de los implantes (Scarano et al 2004;. Elter et al. 2008). Una vez que la superficie del implante limpio es expuesto a la cavidad oral, es inmediatamente cubierto por pelcula salival y colonizados por microorganismos (Elter et al. 2008). Adems de higiene suficiente oral a travs de mecnica y limpieza qumica, es por lo tanto, lo ms importante para el desarrollo de implantes superficies alrededor de la porcin transmucosa que reducir el nmero de inicialmente bacterias adheridas, que a su vez minimiza formacin de placas y, posteriormente, la inflamacin de los tejidos blandos (GrossnerSchreiber y col. 2001, 2004). Las caractersticas fsico-qumicas del superficies especficas materiales son conocidos por influyen significativamente en la adhesin bacteriana proceso (Wu-Yuan et al 1995;. Una y Friedman, 1998; Rasperini et al. 1998; Teughels et al. 2006). Tanto la superficie libre energa (SFE) y rugosidad de la superficie son sabe que juega un papel importante en este proceso, mientras que la rugosidad superficial ha sugerido

siendo el predominante de ambos parmetros . (Nakazato et al 1989; Esposito et al. 1998; Quirynen et al. 1999, 2002). La seas y conectivo interfaces de tejido de materiales para implantes dentales son ms porosos o micro-textura para apoyar la osteointegracin. Por lo tanto, las superficies de los implantes de titanio que son demasiado suaves impedir la adhesin celular. Por otro lado, aproximadamente textura substratos de implantes mejorar la acumulacin de placa, mientras que los materiales de alto pulido con superficie reducida lmite rugosidad inicial la formacin de biopelculas en vivo (An & Friedman 1998; Quirynen et al. 1999; Teughels et al. 2006). En este contexto, un valor de 0,2 mm ha sido generalmente aceptada como la media umbral por debajo del cual la rugosidad cantidad de adhesin bacteriana no puede ser reducir ms (Bollen et al 1997.; Grossner-Schreiber et al. 2001; Elter et al. 2008). Por lo tanto, para ayudar al tratamiento clnico de bacterias inducidas periimplantarios destrucciones, expuestos roscas del implante con aproximada de micro-estructura se bruido y pulido (implantoplasty) para evitar excesiva la acumulacin de placa (Lang et al. 2004). El SFE de un sustrato slido tiene Se ha demostrado que tienen un impacto crucial en el adhesin inicial de los microorganismos orales (Busscher et al 1984;. Weerkamp et al. 1985; Pratt-Terpstra et al. 1988, 1989). En el modelo termodinmico de origen microbiano adhesin, las cepas bacterianas con alta SFE tener un efecto negativo de la energa libre interfacial adhesin (DFadho0) en las superficies del sustrato con un alto SFE. Por lo tanto, estas cepas son espera que se adhieran preferentemente a tales substratos (Weerkamp et al, 1985;. PrattTerpstra et al. 1988, 1989). Rugosidad de la superficie y SFE puede ser fcilmente modificada el Los implantes dentales de titanio por chorro de arena, la nitruracin por plasma, grabado cido, titanio

vaco pulverizacin de plasma, o aplicando diversos revestimientos qumicos (Browne y Gregson 1994; Del et al. 2005). Como consecuencia, una comprensin ms detallada de el papel de diferentes propiedades superficiales de implantes en la adhesin bacteriana y la optimizacin de una de estas propiedades fsico-qumicas caractersticas parece necesario. Para este propsito, un gran nmero de experimental Los sistemas para el estudio microbiana adherencia in vivo e in vitro estn disponibles, mayora de los cuales se basan en directo de las colonias contar (Bollen et al 1996;. Drake et al. 1999; Barbour et al. 2007) y la exploracin microscopa electrnica de barrido (SEM) las observaciones (Gatewood et al 1993;. Drake et al 1999.; Rimondini et al. 2002; Kuula et al. 2004; Del et al. 2005; Barbour et al. 2008). En contraste con estos microbiana tradicional mtodos de cuantificacin, los sistemas basados en biofluorescence han adquirido una importancia cada vez mayor, debido a que han sido aceptados tan simple, precisa y reproducible, herramientas y altamente sensibles para la cuantificacin de microorganismos que se adhieren (Grivet et al. 1999; Grossner-Schreiber et al. 2001; Gaines et al. 2003, Pier-Francesco et al. 2006, Muller et al. 2007; Buerger et al. 2008; Hahnel et al. 2008). El recin desarrollado de dos colores en vivo / muerto tcnicas de tincin complementar la investigacin posibilidades de proporcionar una diferenciacin visual entre las bacterias vivas y muertas (Boulos et al 1999;.. Hannig et al 2007; Al-Ahmad et al. 2008). En este contexto, SYTO 9 y la tincin con yoduro de propidio ha demostrado ser superior en comparacin con otros ensayos, ya que proporciona una clara diferenciacin entre muertos y activa microorganismos sin la interferencia de fluorescencia de fondo (Decker, 2001). En los enfoques generales, microscopa de fluorescencia

ofrecen la oportunidad de visualizar bacterias directamente sobre el sustrato y en el situacin de las adhesiones (Hanning y cols. de 2007). El presente estudio se llev a cabo para evaluar in vitro e in vivo en microbiana la adhesin a chorro de arena y grabado al cidoPromueve superficie de titanio en comparacin con titanio mecanizado puro por medio de dos tcnicas de fluorescencia de alta sensibilidad (Resazurina y manchas en vivo / muerto) y correlacionar estos resultados a las diferencias en la rugosidad superficial, SFE, y la superficie morfologa. Materiales y mtodos Caracterizacin de superficies de titanio Dos diferentes tipos de muestras de titanio la medicin de 9 mm de dimetro y 2 mm de thicknesswere utilizado. La textura Promueve de titanio de superficie (Biotecnologas CAMLOG AG, Basilea, Suiza) es con chorro de arena y al cido y se utiliza para los Camlogs sistema de implantes dentales (Biotecnologas CAMLOG AG). Promueve (de baile) fueron las superficies en comparacin con el titanio puro mecanizada especmenes (PT; Camlog). La rugosidad de la superficie (Ra) de cinco muestras de cada uno de los dos materiales en tres sitios diferentes fue determin con un instrumento ptico (Perthometer S6P; Perthen, Go Gttingen, Alemania). El total de la SFE, su dispersin, y polares componentes se calcularon a partir automatizado pngase en contacto con las mediciones angulares (OCA 15 ms; Instrumentos Dataphysics, Filderstadt, Alemania) como se ha descrito antes (Hahnel et al. 2008). SEM se llev a cabo por tres muestras de los dos materiales de titanio. Las muestras se monta directamente sobre talones de aluminio y con imgenes de SEM (Ampliacin _ 600 _ y 8000) (Quanta FEG 400, FEI Company, Eindhoven, los Pases Bajos). En la formacin de biopelculas in vivo

Tres mujeres sanas (A, B y C) y tres hombres sanos (D, E y F) se ofrecieron voluntariamente a participar en el presente estudio (Edad 22-38 aos, media: 28 aos, todos los no fumadores). Ninguno de los voluntarios haba utilizado enjuagues bucales antibacterianos sistmicos o antibiticos durante 12 meses antes del inicio del estudio. El examen oral se llev a a cabo por un dentista experimentado. Todos los voluntarios tena fisiolgicas tasas de flujo salival (1-1.5ml/min) y una excelente higiene bucal (ndice de placa y el ndice de sangrado del surco cerca de cero). El consentimiento informado por escrito haba sido dada por los sujetos y los estudio haba sido aprobado por la tica Comit de la Universidad de Ratisbona (Solicitud 08/131). Todas las muestras se desinfectaron por ultrasonidos en 3% de hipoclorito de sodio (Farmacia de la Universidad Hospital de Regensburg, Ratisbona, Alemania) durante 20 minutos y luego se lav en agua destilada. Las muestras estaban libres de microorganismos despus de este tratamiento como lo demuestra SEM y vivo / muerto tincin. Por in vivo la formacin de biopelculas, las muestras fueron fijo a acrlico removible individuo superior frulas mandbula (Fig. 1), con el que el titanio las muestras se coloca en el regin bucal de los premolares y el primer molares, de manera que el crecimiento de biopelculas fue no perturbado por movimientos de la lengua. Cada voluntario tena dos de baile y dos muestras de Pt insertada. Los alimentos o bebidas de consumo y la higiene oral se les prohibi durante el carro. Las tablillas fueron usados durante 12 horas. A continuacin, las muestras fueron cubiertas de placa retirado de las frulas e inmediatamente procesado para la tincin de fluorescencia. Todas las muestras se transfirieron a bien platos y lavar tres veces en phosphatebuffered salino (PBS) para eliminar no adherente

clulas. El BacLight bacteriana Live / Dead la viabilidad de kit (Molecular Probes, Eugene, O, EE.UU.) se utiliza para determinar el proporcin de clulas vivas o activa (fluorescente verde) y las clulas muertas o inactivas (fluorescente rojo). La mancha en vivo / muerto era preparado por dilucin de 18 ml de componente tincin Un (SYTO 9) y 18 ml de tincin componente B (yoduro de propidio) en 15ml de agua destilada. Quinientos microlitros de la mezcla de reactivos se aadieron a cada as, y las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 15 min. Cada muestra se coloc con cuidado sobre un portaobjetos de vidrio cubierto con componente C (aceite de montaje) y se almacena en el oscuridad a 41 C hasta su posterior procesamiento. Fluorescencia emisin se determin con un microscopio de fluorescencia (BX61, Olympus GmbH, Hamburgo, Alemania), en combinacin con el software de procesamiento de imagen cell ^ P (Olympus GmbH). En cada muestra, las imgenes microscpicas fluorescentes de los cinco sitios seleccionados al azar fueron capturados con una cmara digital (U-CMAD3; Olympus GmbH) que se conecta a el microscopio. Las clulas vivas y muertas en el campo microscpico mismo se han visitado por separado con el filtro de fluorescencia diferentes conjuntos (FITC/F41-054 y / Alexa594 F41-027, ICA Analysetechnik, Tu Bingen, Alemania) y digitalmente combinado para un imagen. Las reas cubiertas por las clulas muertas (Fluorescente de color rojo), las clulas viables (fluorescente verde), y las clulas totales se calcularon como porcentaje de la norma especfica del microscopio campos (420 _ 320 mm 0.13mm2) con el software de anlisis de imgenes Optimas 6.2 (Meyer Instruments, Houston, TX, EE.UU.). En la formacin de biopelculas in vitro Streptococcus sanguinis (cepa 20068; DSMZ, Braunschweig, Alemania) fue

utilizado en este estudio in vitro de biopelculas formacin. Despus de un congelado (_601C) precultivo se haban establecido, las bacterias fueron expuestos en una placa de agar y se incubaron a 371C durante 48 h. Los cultivos de una sola colonia se cultiva en estriles caldo de soja tripticasa (Trytic-Caldo de soja; BD Diagnstico, Sparks, MD, EE.UU.) suplementado con extracto de levadura (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) a 371C durante 16 h. La das antes del experimento, 1 ml de cada suspensin bacteriana se haban inoculado con 250 ml de caldo estril de soja tripticasa (BD Diagnostics) y se incub a 371C para 12 h. Las suspensiones bacterianas se centrifugaron a 896 g en 181 quater durante 5 minutos y lav dos veces en PBS (Sigma-Aldrich). ptico densidad de las suspensiones se ajust a 0,3 a 540 nm. Como se ha descrito antes, la oxidacinreduccin de la fluorescencia del colorante Alamar Blue / Resazurina (0,75 g / ml de agua destilada) (SigmaAldrich) se utiliza para determinar el total cantidad de bacterias que se adhieren (Buerger et al. 2007). Intensidad de fluorescencia se registrados por un sistema automatizado de deteccin de multilector (Fluostar ptimos; BMG Labtech, Offenburg, Alemania) a longitudes de onda de Excitacin de 530 nm y 590 nm de emisin. La saliva humana no estimulada se recogi de un donante sano de 31 aos que no mostr lesiones cariosas activas o las enfermedades periodontales. La saliva fue esterilizado por medio de un solo uso filtracin dispositivos con tamaos de poro de 0,45 y 0,2 mm (Vacuflo PV050 / 2 y PV050 / 3; Schleicher Y Schu ll Microscience GmBH, Dassel, Alemania). Incubaron a 371C durante 120 minutos, la saliva filtr form una pelcula salival en todas las muestras (Hahnel et al. 2008). Despus de eliminacin de la saliva, PBS (1 ml) se aadi a cada pocillo (15 muestras para cada material)

y se determin la autofluorescencia de cada muestra. Despus de la eliminacin del tampn, 1 ml de suspensin bacteriana era aadi a cada pocillo, y las placas Se incubaron con resazurina (15 ml) a 371C de 120 minutos. La mezcla de bacterias suspensin y resazurina se extrajo por succin, los pocillos fueron posteriormente se lava dos veces, y 1 ml de PBS se aadi. Intensidades de fluorescencia despus de la adhesin bacteriana Se determinaron como se ha descrito anteriormente. Los valores de fluorescencia de pura PBS (0 de control), tampn y resazurina (colorante de control), y solucin pura bacteriana (bacterias de control) sirvi como referencias de control. Relativa alta la intensidad de fluorescencia (IFR) indic adhesin de estreptococos alta. La pelcula in vitro y la formacin de biopelculas Se repiti con otros cinco especmenes de cada material, pero sin el Adems de resazurina. Despus de la incubacin 120-min en un agitador orbital (semi-esttica condiciones) con S. sanguinis, la proporcin de vida activa o estreptococos (fluorescentes verde) y de los muertos o inactivos estreptococos (fluorescente de color rojo) se determin con la BacLight bacteriana Live / Dead kit de viabilidad (Molecular Probes) como se ha descrito anteriormente (por favor vea 'En vivo biofilm formacin "). El anlisis estadstico Los datos continuos fueron resumidos por con mediana y rango intercuartlico (25a-75o percentil). Global betweengroup comparaciones se realizaron por el Brunner-Langer prueba para el ensayo in vivo y por el anlisis rango de Kruskal-Wallis de varianza para el ensayo in vitro. La deteccin de las diferencias entre Ra y SFE, y la cantidad de bacterias adheridas en el probadas las superficies de titanio (n = 2) se detectaron por el par de sabios Utest de Mann-Whitney

en combinacin con el de Bonferroni de ajuste (a doble cara de un 0,025). Los clculos se realizaron con el software estadstico SPSS 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) y SAS (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.). Resultados Caracterizacin superficial de titanio sustratos El rango de Kruskal-Wallis de anlisis de varianza revel diferencias significativas entre Pt y de baile en la rugosidad de la superficie (Ra) y los valores de SFE (Po0.001 tanto para las comparaciones). Significativamente ms alto promedio valores de rugosidad se encontraron resultados para baile (0,95 mm) que para Pt (0,15 mm). La mediana de la SFE de Pt fue significativamente mayor (total SFE: 39,6 MJ/m2; componente de dispersin: 35,9 MJ/m2; componente polar: 3,7 MJ/m2) que la mediana de la SFE de baile (en total SFE: 18,3 MJ/m2; componente de dispersin: 18,1 MJ/m2; componente polar: 0,2 MJ/m2). Imgenes SEM de discos Prom mostr una homognea rugosa micro-estructura (Fig. 2), mientras que a un aumento mayor, Superficies Pt mostr una configuracin circular alterna de avin y aplanada y spero reas de superficie (Fig. 3). La adhesin de microorganismos, tanto in vitro como in in vivo - correspondi a estos superficie circular modificaciones en las superficies de Pt, y las bacterias se organizan en patrones orbitales (Fig. 4). En Promsurfaces, los microorganismos in vivo y S. sanguinis en la adhesin in vitro pruebas se distribuye uniformemente en pequea agregados y no siguen ningn patrn (Fig. 5). En la determinacin in vivo de adherencia microbiana (Vivo / muerto tincin) La prueba de Brunner-Langer estadstico revel diferencias significativas entre la probada materiales para las clulas totales (P = 0,00478), los

clulas vitales (P = 0.00215) y las clulas muertas (P = 0,03322). Clculos de vivo y coloraciones muertas se dan en las figuras 6 y 7 y en la Tabla 1. Ejemplos para la in vivo fluorescente imgenes microscpicas se muestran en la Las figuras 8, 4, y 5. En general, los seis voluntarios mostraron diferencias significativas en microbiana adhesin (bacterias totales, muertos, y bacterias vitales). La evaluacin de la fluorescencia micrografas de todos los voluntarios mostr que 1,1% (medio) de la superficie de material de referencia Pt estaba cubierta por microorganismos despus de 12 horas in situ. Es significativo que reas ms grandes estaban cubiertos por microorganismos en el baile (8,5%) (p = 0,00478). Figura 7 y la Tabla 1 muestran el porcentaje de las clulas muertas de entre todas las clulas adheridas (que viven y las clulas muertas). 29,1% de los microorganismos detectados sobre Pt y el 23,7% de los que Baile estaban muertos (p = 0,03322). Los microorganismos colonizado la superficie como monocapa o agregados aislados de las clulas, o ambos, que fueron distribuidos al azar pero bien definidos (ver fig. 4). Ectpico solitarios clulas epiteliales de la va oral mucosa - fuertemente adherente al sustrato - Se encontraron en cada muestra de baile, mientras que no una sola clula se encuentra en Pt superficies (vase la Fig. 8). En la determinacin in vitro de la adherencia microbiana (Tincin en vivo / muerto y resazurina) Los clculos de la in vitro en vivo / muerto coloraciones se dan en la Tabla 2. Ejemplos para la in vitro microscpico fluorescente imgenes se muestran en las figuras 9 y 10. Conforme a los resultados in vivo, una significativa mayor cantidad de adherirse S. sanguinis Se encontr que el baile sobre Pt. 11,2% (Mediana) de la superficie de los discos de baile era cubierto por estreptococos, de los cuales 0,5% estaban muertos (fluorescente de color rojo) y vital del 10,7% (Verde fluorescente). Significativamente menor

reas fueron cubiertas por S. sanguinis sobre Pt (3% en total: 0,4% bacterias muertas, 2,7% bacterias vitales) (Po0.001). La Tabla 2 muestra los resultados de la en resazurina in vitro como mtodo de cuantificacin IFR sobre los dos materiales de titanio de ensayo. En diferencias estadsticamente significativas en general, fueron encontrados despus de la fila de Kruskal-Wallis El anlisis de la varianza (Po0.001). Mayor RFI, lo que representa una mayor cantidad de adhesin estreptococos, se encontraron de fiesta [Intensidad media de fluorescencia: 13489 relativa unidades de fluorescencia (RFU)] y de manera significativa bajar RFI, es decir, cantidades ms bajas de bacterias adheridas, para Pt (9945RFU) (Po0.001). Discusin La adhesin de los microorganismos orales y la subsiguiente formacin de microorganismos patgenos biopelculas en la superficie de los implantes dentales resultado de las infecciones de la peri-implante tejidos y, finalmente, en el fracaso del implante. La periimplantitis ha sido reportado en 16% de pacientes con implantes despus de 9-14 aos (RoosJansaker et al. 2006) Cuando peri-implante reacciones inflamatorias conducir a una exposicin de las partes de un implante de micro-estructuradas para la cavidad oral, el tpico e instintivo recomendacin es para desbridar estas partes y obtener una superficie lisa (Del et al. 2005; Barbour et al. 2007). Cientfico conocimientos sobre los procesos fundamentales de adhesin bacteriana a la superficie del implante es recomendaciones pobres y terapia sobre periimplantitis se basan principalmente en emprica Los valores ms que en bien fundada resultados de la investigacin. Por lo tanto, themain objetivo

del presente estudio fue investigar in vitro e in vivo para la adherencia microbiana dos superficies de titanio por medio de diferentes dos tcnicas de fluorescencia de alta sensibilidad (Resazurina y manchas en vivo / muerto) y correlacionar estos hallazgos a la superficie especfica caractersticas [rugosidad superficial (Ra) y SFE]. S. sanguinis, antes conocida como S. sanguis, se utiliz como un microorganismo de ensayo para la parte en el estudio in vitro de debido a su presencia comn en la cavidad oral humana. Adems, S. sanguinis se conoce como un pionero de bacteria en el biofilm oral, (Grossner-Schreiber et al 2001;. Rimondini et al. 2002; Mabboux et al. 2004; Del et al. 2005). Adems, Drake et al. (1999)

mostr que las superficies hidrofbicas de titanio fueron preferentemente colonizado por S. sanguinis (En lugar hidrfobo). El titanio probado es el material ms utilizado para la construccin de sistemas de implantes en la odontologa moderna. A medida de las modificaciones de superficies de titanio del implante tiene han inventado para optimizar la unin del hueso potencial de los implantes dentales. En general, estas modificaciones de la superficie conducir a un aumento Ra y cambios variables en SFE, que en convertir los cambios del potencial de adhesin de tales de titanio superficies (Pier-Francesco et al. 2006). En los ensayos in vitro, un significativamente mayor cantidad microbiana de adherirse S. sanguinis Se encontr que el baile sobre Pt (resazurina tcnica: de 1,4 veces, en vivo / muerto tincin: 3.7 veces). Este fenmeno fue an ms pronunciado en el ensayo in vivo (7,7 veces mayor acumulacin de placa en la que el baile sobre Pt), probablemente debido a la refugio

efecto de superficies rugosas contra remocin fuerzas, que no se producen bajo semiesttico en condiciones in vitro (Rimondini et al. 2002). En general, el mayor nmero de adherirse los microorganismos en prom puede ser explicarse por las caractersticas superficiales diferentes tales como Ra y SFE. Muchos estudios han han realizado sobre la influencia de la superficie caractersticas de restauracin y prtesis materiales. En contraste, poca informacin est disponible en las interacciones fundamentales entre los microorganismos y las superficies de los implantes. Adicionalmente, observaciones detalladas de los sustratos de implantes correspondientes y sus propiedades superficiales especficos tienen a menudo sido tenida en cuenta. Uno de ellos mencion el riesgo de peri-implantmicrobial la adhesin y la que resulta la periimplantitis es rugosidad de la superficie elevada de la transmucosa componente de un implante (Quirynen et al. 2002). La opinin actual indica que materiales de bajo SFE con la reduccin de los lmites de Ra adherencia microbiana inicial (An & Friedman 1998; Quirynen et al. 1999). Nuestro medio SFE valores del titanio dos comprobada materiales son consistentes con los valores SFE encontrado por Grossner-Schreiber et al. (2001) (Que reportaron los valores de los diferentes SFE las superficies de titanio entre 34,3 y 38.71mJ/m2 incluyendo componentes de bajo polares) y Mabboux et al. (2004) (SFE valores de 43,8 y 44,6 MJ/m2 tambin con componentes de bajo polares). En el presente estudio, Prom mostr significativamente mayor Ra valores, los valores ms bajos SFE, y un mayor in vitro e in vivo en la adhesin microbiana que pinta. Por lo tanto, la influencia de Ra sobre la acumulacin de placa que parece ser ms importante que la influencia de SFE. Muchos Los estudios postulan una influencia predominante de Ra en contraste con SFE, que podra ser afirmada por nuestra investigacin (Bollen et al.

1996, 1997; Quirynen et al. 1999, PierFrancesco et al. 2006; Teughels et al. 2006). Algunos estudios in vivo indican un umbral

Ra de 0,2 mm, por debajo del cual no ms reduccin de la acumulacin bacteriana podra Se espera (Bollen et al. 1996, 1997). La mayor adherencia bacteriana en apoyo de baile esta tesis. De acuerdo con Verran y Boyd (2001), Baile (mediana Ra 0,95 mm) puede ser descrito como micro-rugosa y Pt (Mediana de R 0,15 mm) como nano-spero. Microorganismos en superficies rugosas se supone a ser ms protegido contra las fuerzas de cizallamiento, y la colonizacin inicial se ha demostrado que partir de irregularidades de la superficie (y Nyvad Fejerskov 1987; Bollen et al. 1997; Hannig 1999; Quirynen et al. 1999). Sorprendentemente, un una mayor retencin de S. sanguinis en bruto reas de superficie se muestra tambin en la semiesttico en la parte de nuestro estudio in vitro, en los que no importantes fuerzas de cizallamiento se puede esperar. Adicionalmente, en bruto andmicro superficies de textura no slo parece acumular ms la placa, pero esta placa tambin contiene ms flora patgena (Bollen et al, 1996). En resumen, se ha demostrado claramente que superficies rugosas mejorar la adhesin bacteriana tanto in vivo como in vitro y que el influencia de Ra supera la influencia del SFE. Como consecuencia, todos los micro-estructurada partes que estn expuestas a la va oral cavidad y sus microorganismos deben ser altamente pulido para generar un anticuerpo anti-adherente o placa efecto de reduccin. La relevancia de este procedimiento fue confirmada por la in vitro e in vivo los resultados de este estudio. La cantidad de bacterias que se adhieren en vivo mostr alta intra-individual e interindividual variabilidad, que tambin fue

mostrado por Hannig et al. (2007), incluso despus de cortos tiempos de incubacin. Sin embargo, los seis voluntarios mostraron las mismas diferencias en carga microbiana en el titanio dos comprobada superficies (Prom vs PT) (Prom4Pt). Adems, estas diferencias se correlacionan bien con los resultados in vitro, que en la turnproved importancia de nuestro modelo en la adhesin in vitro. Por primera vez, in vivo e in vitro la adhesin bacteriana sobre los implantes dentales fue investigado por medio de Live / Dead tincin para estudiar la influencia de la superficie diferente texturas sobre la viabilidad de las bacterias adheridas. Tcnicas fluoromtricos en la adhesin Los estudios ofrecen la oportunidad de cuantivamente investigar un gran nmero de especmenes en un corto perodo de tiempo y, en el mismo tiempo, para estudiar detallada morfolgica aspectos de las tcnicas microscpicas. No se encontraron diferencias estadsticas entre los Prom y Pt con respecto al porcentaje de bacterias muertas y vital. Por lo tanto, las diferencias en las caractersticas superficiales tales como Ra o SFE - que difieren significativamente entre Baile y Pt - no puede influir en la viabilidad de las biopelculas orales. Curiosamente, un alto porcentaje de bacterias muertas entre las clulas adheridas (Pt: 29,1% y el baile: 23,7%) ya pudo haber sido encontrado despus de 12 horas de en incubacin in vivo. Nuestros hallazgos se corresponden a los resultados de Hanning y col. (2007), que se encuentra alrededor del 40% de los muertos las bacterias despus de diferentes intra-oral de incubacin veces. En conclusin, el papel de los muertos material biolgico en el proceso de formacin de (oral) biofilms puede haber sido subestimado en el pasado y debe ser an ms investigado. En general, la informacin obtenido a partir de tcnicas de fluorescencia es sobre todo de naturaleza cuantitativa. Por lo tanto, la composicin de especies de la microbiana comunidades en las muestras analizadas fue

no determinado. En contraste con anterioridad llevadas a cabo mtodos moleculares, no hay conclusiones en la composicin de la biopelcula puede ser elaborado (Amann et al., 1995). En modelos in vitro se utilizan frecuentemente en estudios sobre la adherencia microbiana especfica sobre substratos, porque son reproducibles y rentable. Adems, la interpretacin de los resultados se simplifica por el UserDefined inclusin y exclusin de determinada los factores que influyen. En comparacin, en vivo modelos ofrecen la oportunidad de evaluar materiales en condiciones clnicas realistas, presentando placa compuesta, co-adherentes microorganismos, pelcula salival, y la eliminacin las fuerzas de flujo salival y las actividades de mascar (Rimondini et al., 2002). Con el beneficio de la retrospectiva, los resultados obtenidos in vitro son de acuerdo con nuestra fuerte resultados in vivo. Por lo tanto, nuestro modelo semi-esttico in vitro en combinacin con la resazurina y el tcnicas en vivo / muerto representan realista y modelos reproducibles para probar la bacteriana adherencia en implantes dentales. Adheridas las clulas epiteliales de solitarios la mucosa oral se encuentra en cada La muestra de baile, mientras que no es una sola clula Se encontr en las superficies de Pt. Esta secundaria mostr que la bsqueda de caractersticas de la superficie de materiales, que tienen una influencia fundamental en la acumulacin de placa, tambin influyen en la formacin de la insercin epitelial. La efecto de Ra y SFE en el apego, la orientacin, y la proliferacin de gingival humano fibroblastos se ha demostrado en varios otros estudios (Kononen et al 1992; Mustafa. et al. 1998; Lauer et al. 2001; Rimondini et col. 2002). Aunque esta hiptesis no fue probados en nuestro estudio, el elevado nmero de ectpicos en las clulas epiteliales de baile, fuertemente adherente a la superficie - parece sugerir Prom que puede ser un material prometedor

capaz de mejorar la formacin de la unin celular y la osteointegracin. La contaminacin biolgica es difcil de eliminar de la superficie del implante estructuradas, por ejemplo por el uso de curetas de plstico o snica / raspadores ultrasnicos (Schwarz et al. 2009). As, adems de hacer implantes dentales con los potenciales de unin del hueso de alta, es importante el desarrollo de superficies de los implantes que reducir el nmero de adherir inicialmente bacterias. En este punto en el tiempo, estos dos solicitudes para la construccin de implante materiales por desgracia se contradicen otro. En general, los fabricantes modificaciones de las superficies de los implantes y el tratamiento recomendaciones sobre las estructuras de implantes expuestos debe basarse en resultados de la investigacin. Por lo tanto, las investigaciones se necesitan ms en los procedimientos esenciales de bacterias la adherencia en la superficie del implante. Como titanio por s mismo no muestran ninguna actividad antibacteriana, antiadhesivos revestimientos o aleaciones para proporcionar superficies bactericidas puede ser un alternativa a la periimplantitis invasiva convencional terapias. Conclusiones Dentro de las limitaciones del presente estudio, nuestros hallazgos indican que in vitro e en la adhesin in vivo de las bacterias a diferente superficies texturadas de titanio est influenciado principalmente por la rugosidad superficial. En contraste, la influencia de SFE es de menor importancia. Por lo tanto, cualquier micro-estructurada parte que est expuesta a la cavidad oral debe ser altamente pulido para generar un efecto anti-adherente y la placa reductoras. Un alto porcentaje de clulas muertas entre el bacterias adheridas se pudo observar en todo especmenes de titanio. Esta observacin confirma el papel fundamental de los muertos biolgica material en el proceso de formacin de (oral) biopelculas. Por ltimo, los dos fluoromtrico

tcnicas (resazurina y en vivo / muerto tincin) utilizados en el presente estudio demostr ser reproducibles, sensibles, y las herramientas precisas para estudio in vivo e in vitro en biopelcula inicial formacin sobre superficies de los implantes de titanio. Agradecimientos: Agradecemos a la Camlog Biotecnologas AG (Basilea, Suiza) para el suministro de especmenes de titanio. Los autores declaran que no tienen ningn conflicto de inters