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Inmunofluorescencia La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con energa electromagntica de longitud de onda adecuada,

emiten radiacin de longitud de onda caracterstica permitiendo su cuantificacin. Las molculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energa (longitud de onda ms corta) en luz de menor energa (longitud de onda ms larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y excitacin caracterstico; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores). LaInmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la deteccin de autoanticuerpos y anticuerpos contra antgenos de superficie de clulas y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la protena que se desea detectar marcados con molculas fluorescentes (Figura 6). Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta). Citometra de flujo La tcnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de clulas de sangre perifrica. Actualmente ,el anlisis de una suspensin de clulas vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citmetro de flujo. La suspensin celular se hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas pasan por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la dispersin de la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio, en funcin de sus propiedades fisicoqumicas y del marcaje efectuado. Para la separacin celular ,este aparato lleva acoplado un sistema que carga elctricamente las clulas y ,con placas deflectoras, se realiza su separacin (Figura 7). Adems de basarse en la deteccin de la fluorescencia emitida por las clulas marcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las clulas en estudio, como tamao (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura 8).

La seal, producida como consecuencia de la excitacin del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de clulas reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imgenes en dos dimensiones (Dot-Plot), (Figura 9) o en una dimensin (Histograma), (Figura 10) en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.

La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjuga los avances de informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis fenotpico y funcional de las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se disponga de un antisuero que las identifique. Marcadores de linfocitos B Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresin de las molculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresin de molculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en reposo.

Marcadores de linfocitos T En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8 presentes de forma especfica en linfocitos T totales y en las subpoblaciones de clulas T de colaboracin y citotxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activacin celular T se expresan nuevas molculas de superficie, son principalmente receptores para factores de crecimiento y proliferacin celular. Entre estos nuevos antgenos de activacin expresados en la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la molcula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de la insulina y de la transferrina (CD71); c) antgenos del Complejo Mayor deHistocompatibilidad (CMH) clase II, que no estn presentes en linfocitos T en reposo; y d) una gran variedad de molculas de superficie, cuya funcin no es totalmente conocida (por ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69). n(Ac)+c(Ag) + m(Ag*) h(Ag-Ac)+j(Ag*-Ac)+K(Ag*)+I(Ag) En donde: Ac: Anticuerpo; Ag: Antgeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antgeno marcado con un istopo; Ag-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos no marcados y Ag*-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos marcados.