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Estudio de los biotensoactivos producidos por Pseudomonas aeruginosa usando cidos orgnicos

Jimnez Islas Donaji (1), Medina Moreno S. Alejandro (1) y Gracida Rodrguez Jorge (1). (1) Universidad Politcnica de Pachuca. Ex-Hacienda de Santa Brbara, Mpio. de Zempoala, Hgo., Carretera Pachuca Cd. Sahagn Km. 20. C.P. 43830. Mxico Tel: 01 771 547 75 10 Ext. 2370. Fax. (2200). E-mail: gracidaj@mail.netscape.net Resumen. Los tensoactivos son molculas anfiflicas, que reducen la tensin superficial e interfacial de lquidos, slidos y gases. Debido a sus caractersticas tienen aplicaciones en diversas reas, principalmente a nivel industrial y ambiental. Los tensoactivos son sintetizados por vas qumicas y biolgicas; los de sntesis biolgica presentan ventajas como compatibilidad con el medio ambiente, baja toxicidad, biodegradable y la desventaja de los costos elevados asociados a su produccin. En este trabajo se presentan los resultados ms importantes de la biosntesis de tensoactivos a partir de cidos orgnicos puros usando diferentes relaciones C/N y C/P, encontrndose que la sntesis s de estas molculas se vio favorecida cunado se empleo cido oleico. Se utiliz adems la tcnica E24 para verificar la estabilidad de la emulsin generada por el tensoactivo presente en la fase acuosa y un sistema inmiscible. Introduccin. Los tensoactivos son obtenidos a partir de sntesis qumica o biolgica, estos ltimos presentan ventajas como baja toxicidad, biodegradables y compatibles con el medio ambiente. Es por eso que los biotensoactivos son un grupo de productos naturales de inters en biotecnologa (bioremediacin) y aplicaciones industriales (emulsificadores y desemulsificadores) (Bodour y col, 2004). Un gran nmero de microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, producen una serie de tensoactivos (Ortiz y col, 2006; Correa y col, 1999). Dentro de las bacterias productoras de biotensoactivos, destacan las especies de Pseudomonas, las cuales producen glicolpidos del tipo ramnolpido, el cual esta compuesto de de una o dos molculas de ramnosa, que esta ligada a una molcula de cido -hidroxidecanoico. Robert y col, (1989) utilizaron como fuentes de carbono glicerol, manitol, glucosa, aceite de oliva, fructosa, succinato y piruvato en la produccin de ramnolpido por Pseudomonas aeruginosa 44T1. Otras fuentes de carbono utilizadas para la produccin de biotensoactivos por Pseudomonas aeruginosa son: aceite de soya, n-hexadecano, aceite de maz, efluentes de aceite de girasol y etanol. De las fuentes de desecho que se han utilizado para la produccin de biotensoactivos, destaca el suero de la industria del

queso, que se emplea para el crecimiento y produccin de Pseudomonas aeruginosa, que produce tensoactivos cristalinos (Dubey y Juwarkar, 2001). Los biotensoactivos son producidos a partir de diferentes sustratos como fuente de carbono, como lo son aceites de origen vegetal. Las bacterias como Pseudomonas aeruginosa, producen biotensoactivos a partir de este tipo de aceites, pero no se sabe a ciencia cierta si existe preferencia por algn sustrato de la mezcla de cidos grasos presentes en los aceites. El objetivo de este trabajo es evaluar de manera individual los cidos grasos presentes en mayor cantidad en los aceites de origen vegetal, como es cido oleico, cido linoleico y cido esterico que son utilizados como nica fuente de carbono por Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, adems de su relacin con la fuente de nitrgeno y fsforo, que promueva la produccin de biotensoactivos y capacidad de emulsificacin de los mismos. Materiales y Mtodos Microorganismo El microorganismo utilizado en este estudio fue Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, el cual fue mantenido en un matraz erlenmeyer de 125 mL, el cual contena 50 mL de medio nutritivo, compuesto por 3 g/L de extracto de levadura, 3 g/L de extracto de malta, 5 g/l de polipeptona y 10 g/L de glucosa. El matraz fue colocado en un incubador shaker, a 30 C y 150 rpm. Despus de 72 h de incubacin, 1 mL del medio fue transferido a un matraz erlenmeyer de 125 mL el cual contena 50 mL de caldo nutritivo, el matraz fue colocado en el incubador shaker, a 150 rpm y 30C, despus de 24 h de incubacin, el medio fue considerado como el pre inoculo, para las fermentaciones posteriores. Fermentaciones Se realizaron las fermentaciones en matraces bafleados de 125 mL, conteniendo 48 mL de medio mineral complementado con la fuente de carbono, nitrgeno y fsforo. El medio mineral utilizado, es el diseado por Guerra-Santos y col, 1984. La temperatura de operacin para todas las fermentaciones fue de 30 C, la agitacin de 150 r.p.m. y el pH fue ajustado a 7, con Hidrxido de sodio 1N. El medio mineral se inocul con 300 l de preinoculo que contiene Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, junto con las fuentes de carbono, nitrgeno y fsforo, a diferentes relaciones que van desde 7 hasta 19 para C:N y de 12 a 19 para C:P, se realizaron pruebas de tensin superficial por el mtodo del anillo (tensometro Cole-Parmer tensiomat 21), para posteriormente determinar la capacidad de emulsificacin del tensoactivo producido, mediante la prueba E24, con sistemas de baja solubilidad como gasolina y diesel. Resultados y discusin. Despus de 9 das de fermentacin, con relacin C:N =7 y C:P=12, se determin la tensin superficial, con reduccin en el medio de 72 din/cm a 35.2, 39.8 y 43 din/cm, para cido oleico, cido linoleico y cido esterico respectivamente, para

relaciones C:N=8 y C:P=12, no se presentaron cambios significativos en la reduccin de tensin superficial, con respecto a los de C:N=7 y C:P=12. Debido a que la tensin superficial en los 8 y 9 no cambiaban, se decidi detener el experimento despus de 8 das, con las relaciones de C:N=10 y C:N= 16, la tensin superficial al octavo da fue de 33, 38.1 y 42.1 din/cm, para cido oleico, cido esterico y cido linoleico, respectivamente (Figura 1). A relacin C:N=13 y C:P=16, la reduccin de tensin superficial con respecto a C:N=10 y C:N= 16 fue muy similar, despus de 8 das de fermentacin. Para relaciones C:N=16 y C:P=16, la tensin superficial despus de 7 das fue de 31.7, 39 y 42.1 din/cm, para cido oleico, cido esterico y cido linoleico, respectivamente. Para relacin C:N=19 y C:P=16, la mxima reduccin de tensin superficial fue encontrada despus de 7 das, con valor de 31 din/cm, para cido oleico como fuente de carbono, siendo esta la mejor bajo las condiciones avaluadas. La capacidad de emulsificacin fue determinada por medio de la prueba E24 (figura 2); con relaciones C:N= 16 y C:P=16, se obtuvieron porcentajes de capacidad de emulsificacin en gasolina de 25.64, 1.33, 2.67% para cido oleico, cido esterico y cido linoleico respectivamente, y la capacidad de emulsificacin con diesel a las mismas relaciones C:N y C:P, son de 15.38, 1.33 y 2.67% con cido oleico, cido esterico y cido linoleico respectivamente. Con cido oleico a relacin C:N=19 y C:P=16, se obtuvo la mayor capacidad de emulsificacin con 27.78 %. En la produccin de biotensoactivos con Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, se mostr que el consumo de cido oleico es consumido con mayor facilidad, con respecto a cido linoleico y cido esterico. Se pudo concluir que se obtuvieron mayores reducciones de tensin superficial con cido oleico (ver figura 1) en todas sus relaciones, adems de tener mayor capacidad de emulsificacin en sustratos de baja solubilidad, lo que indicara una buena calidad del biotensoactivo producido. A mayor relacin C:N se incrementa la reduccin de tensin superficial, esto es debido a las limitaciones de Nitrgeno, que confirma lo mostrado por Guerra Santos y col (1984); Rashedi y col (2006). La produccin de biotensoactivos a partir de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 y como fuente de carbono el cido oleico y bajo las condiciones evaluadas es resultado del buen acoplamiento entre el microorganismo y el sustrato, que sin duda promueve una mayor produccin de biotensoactivos, quedando abierta la posibilidad de una mayor exploracin de concentraciones, condiciones y microorganismos; que permitan tener procesos de produccin mas rentables desde el punto de vista econmico y ambiental.

R ed ucci n d e t ensi n sup erf icial

a
75 70 65 60 55 50 45 40 35 30

R ed ucci n d e t ensi n sup er f i ci al

75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 1 2

cido oleico C:N=10, C:P=16 cido esterico C:N=10,C:P=16 cido linoleico C:N=10, C:P=16

cido oleico C:N=10, C:P=16 cido esterico C:N=10,C:P=16 cido linoleico C:N=10, C:P=16

4 d a s

4 d a s

Figura 1. Reduccin de la tensin superficial en funcin de la fuente de carbono. a) con diferentes fuentes de carbono, con la misma elacin C/N y C/P usando Pseudomonas aeruginosa, b) Reduccin de la tensin superficial con diferentes fuentes de carbono, usando Pseudomonas aeruginosa.

Porcentaje (%)

Oleico C:N=16, gasolina Oleico C:N=16, diesel Linoleico C:N=16, gasolina Linoleico C:N=16, diesel Esterico C:N=16, gasolina Esterico C:N=16, diesel Oleico C:N=19, gasolina Oleico C:N=19, diesel

78 7. 2

24

28

25
16 20

.6 4 15 .3 8

33 1.

67 2.

Sustratos 1

Figura 2. Evaluacin del ndice de emulsificacin mediante la prueba E24, usando gasolina y diesel como componentes inmiscibles.

Conclusiones: Es el cido oleico el cido graso de origen vegetal el que ms propicia la reduccin en la tensin superficial para la biosntesis de tensoactivos. A medida que se aument la relacin C/N la reduccin fue mayor, siendo el valor de esta relacin de 16 y obtenindose una reduccin de la tensin superficial de 72 din/cm a 31 din/cm.

2. 67

Indice de Emulsificacin

4. 17

33 1.

12

Bibliografa
Bodour, A., Guerrero-Barajas, C., Jiorle, B. V., Malcomson, M. E., Paull, A. K., Somogyi, A., Trinh, L. N., Bates, R. B. y Maier, R. M. (2004). Structure and caracterization of flavolipids, a novel class of biosurfactants produced by Flavobacterium sp. strain MTN11. Applied and Environmental Microbiology. Vol.70, No.1, p114-120. Correa, B. F., Colombo, F. L. y Ayub, M. A. Z. (1999). Production of biosurfactants by hydrocarbon degrading Rhodococcus rubber and Rhodococcus erytropolis. Revista de Microbiologa, Vol.30, p231-236. Dubey, K. y Juwarkar, A. (2001). Destillery and crude whey waste as viable alternative source for biosurfactant production. Word J. Microbiol. Biotecnol. Vol.17, p61-69. Guerra-Santos, L., Kappeli, O. y fiechter A. (1984). Pseudomonas aeruginosa biosurfactants production in continuous culture with glucose as carbon source. Applied and Environmental Microbiology Vol.48, No.2, p301-305. Ortiz, A., Manresa, ., Teruel, J. A., Espuny, M. J. y Aranda, F. J. (2006) Thermodynamics of the interaction of a dirhamnolipid biosurfactant secreted by Pseudomonas aeruginosa with phospholipid membranes. Langmuir American Chemical Society. Vol.23, No.5, p2700-2705. Rashedi, H., Mazaheri, A. M. M., Bonakdarpour, B. y Jamshidi, E. (2006). Biosurfactant production with glucose as a carbon source. Chem.Biochem. Eng. Q. Vol.20, No.1,p 99-106. Robert, M., Mercade, M. E., Bosch, M. P., Parra, J. L., Espuny, M. J., Manresa, M. A. y Guinea, J. (1989). Effect of the carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44T. Biotechnol. Lett. Vol.11, p871-874.

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