PRACTICA N O5

ESTERILIZACION

II.INTRODUCCION

Comprende todos los procedimientos fsicos, mecnicos y preferentemente qumicos, que se emplean para destruir grmenes patgenos. III.Objetivo: Capacitar al estudiante para una adecuada utilizacin de los equipos que se tienen en el laboratorio y as tener una adecuada utilizacin.

IV.REVISION DE LITERATURA

Esterilizacin:
Es el proceso de destruccin de todo organismo vivo en cualquier objeto o material por medios fsicos o por procedimientos qumicos. Tambin se define la esterilizacin como la anulacin de la capacidad de reproduccin biolgica de un ser vivo.

Mtodos:
Qumicos: Con oxido de etileno Aldehdos Gas-plasma de Peroxido de Hidrogeno Fsicos: Calor Radiaciones Filtracin Agentes esterilizantes y desinfectantes

a) Mtodos Qumicos Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. Oxido de etileno. Es un agente alquilante etc.Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, destruye todos los microorganismos incluso virus.

Aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas, provocando una modificacin
irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas.

Glutaraldehdo: Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo
fro. Puede esterilizar plstico, goma, vidrio, metal, etc.

Formaldehdo:
Es proceso de esterilizacin a baja temperatura la cual consta en la transmisin de perxido de hidrgeno en fase plasma (estado entre lquido y gas), que ejerce la accin biocida.

Posee como ventajas:

No deja ningn residuo txico. Se convierte en agua y oxgeno al final del proceso. El material no precisa aireacin.

El ciclo de esterilizacin dura entre 54 y 75 minutos.

Desventajas:
No se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodn, lquidos, humedad, madera o instrumental con lmenes largos y estrechos. Es el mtodo de esterilizacin ms caro de entre los descritos. Mtodos fsicos

Calor
La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposicin y la temperatura. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

Calor Hmedo:
El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: *El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua. *El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire.

Autoclave
Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El modelo ms usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120 a una atmsfera de presin (estas condiciones pueden variar)y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

Tyndalizacin
Esterilizacin por accin discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndal. Las bacterias que resisten una sesin de calefaccin, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operacin se repite con intervalos separados y en varias sesiones. Se efecta por medio de la autoclave de Chamberland, dejando abierta la vlvula de escape, o sea funcionando a la presin normal. Puede tambin realizarse a temperaturas ms bajas, 56 u 80 .

Ventajas del calor hmedo:

Rpido calentamiento y penetracin Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo No deja residuos txicos Hay un bajo deterioro del material expuesto Econmico

Desventajas:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos

Calor seco:
El calor seco produce desecacin de la clula, es esto txicos por niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos.

La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja.

Estufas Ventajas del calor seco:

No es corrosivo para metales e instrumentos. Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles.

Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja penetracin del calor.

Radiaciones
Su accin depende de: El tipo de radiacin El tiempo de exposicin La dosis

Filtracin Se usan membranas filtrantes con poros de un tamao determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos ltimos estn en el lmite de separacin segn el dimetro de poro que se utilice. V.MATERIALES Y METODOS MATERIALES Pabilo Papel kraf Gasa Algodn Pipeta de 5 y 2 ml Matrz 500 ml. Tubo de ensayo Probeta Placas petri Esptula Tijeras Escobillones Detergente

EQUIPOS:

Autoclave Horno paster

PREPARACIN DE LOS MATERIALES PARA SU ESTERILIZACIN Elaboracin de tampones de algodn: son utilizados en los tubos y matraces. Con una tira de algodn de (15-20cm de largo, 3cm de ancho y un grosor de 0.5cm) aproximadamente, y con una gasa de 10x10cm, se obtiene un tampn adecuado para un matraz de 500ml. Preparacin de envolturas de pipetas: con un clip se le introduce en la boquilla de succin un filtro de algodn. Luego con papel kraf de 5cm de ancho y 30cm de largo, se pasa a envolver en forma espiralada. Se dobla el extremo inferior aproximadamente 2cm. Verificar que el enrollado no quede flojo. La parte sobrante doblar hacia abajo. Procedimiento para la envoltura de placas petri: es necesario envolver las placas petri antes de esterilizarlas para evitar que al trmino de la esterilizacin estn expuestas al medio ambiente y se contaminen de nuevo. Se corta el papel kraf de tamao adecuado para cubrir las placas petri. En la parte superior se unen los bordes de ambos lados y esta unin se dobla a la mitad. Al papel se presiona a los costados para que pueda ser bien sujetada. Se doblan las puntas del papel hacia atrs, quedando el dobles hacia abajo. Esterilizacin de material plstico no termoresistente (placas petri de piliestireno): se coloca las placas abiertas debajo de una lmpara germicida (luz ultravioleta). Encender la lampara y dejarla actuar durante dos horas. Apagar la lampara y sacarlas antes de sacarlas de la cabina.

Todo el material de vidrio se esterilizan en calor seco, siendo el horno pasteur el aparato ms empleado y se somete a temperaturas de 160-180C por 1-2 horas. Los materiales de metal se esterilizan en la llama hasta que se pongan al rojo vivo. PROCEDIMIENTO Hacer un tapn de algodn y poner en la boca de la pipeta, despus hacer tiras delgadas del papel crac para as luego envolver con la parte spera del papel crac a la pipeta comenzando de la boca de la pipeta haca la parte de arriba. Hacer tapones de algodn para los matraces y luego taparles con la gasa para que la pelusa del algodn no se quede en la boca y despus taparle la parte de la boca con

el papel crac y luego con el pabilo se le va que tener que amarrar para que no entre nada. Para los tubos de ensayo se tiene que hacer tapones de algodn pero sin gasa y en bloques de 3 se va a empaquetar con el papel crack en forma de regalo. Para las placas petri ya no vamos hacer tapones porque ya est limpia, si no vamos a empaquetar con el papel crack ya sea de 1 en 1 o de 2 en 2 pero preferentemente que sea de 1 en 1.

OBSERVACIONES La placa petri debe estar bien empaquetada. Para tapar con el papel crac la parte porosa debe esta adentro y la parte lisa asa afuera. Para que empaquetamos con el papel crac? Para que no se contamine con el medio ambiente despus de esterilizar Para llevar al horno pastear debe estar a una temperatura de 160C por 2 horas o 180C 1 hora. Para meter la pipeta en el autoclave debe estar bien forrado o envuelto. Para el caso de los matraces debe estar bien tapado y la pita no tiene que ser ni tan corta ni larga. Pero lo ms recomendable es de 160C/2horas. Despus de esterilizar se debe esperar a que baje su temperatura y luego recin se puede utilizar. Si se lleva a la temperatura de 180C puede ser muy riesgoso.

VI. RESULTADOS: Luego de someter los materiales al horno Pasteur a 180 C. Se obtuvo los materiales libres de cualquier microorganismo, esterilizados y aptos para ser usados en el laboratorio. VII. CONCLUSIONES

La utilizacin de los equipos nos ayudara a la destruccin de microorganismo que en la prctica no deseamos ya que alterara las muestras y nos daran resultados errneos y esto provocara una mala interpretacin y por ende un fracaso en la prctica. La esterilizacin es una practica que se deben realizar al comienzo de cada practica.

CUESTIONARIO 1.- En una esterilizacin mediante calor hmedo Cmo acta el calor respecto a los microorganismos? El calor hmedo acta destruyendo a los microorganismos por coagulacin de sus protenas celulares. Esto se fundamenta cuando el agua comienza a hervir a una presin superior a la normal la cual provoca el aumento de la temperatura y la presin del vapor dentro del recipiente ocasionando que el vapor penetre por osmosis dentro de la clula microbiana

produciendo la coagulacin del citoplasma y destruyendo a los microorganismos tanto en su forma vegetativa. 2.- En un proceso de esterilizacin por calor hmedo (autoclave) que agentes intervienen? Por tanto podemos decir que los agentes que intervienen en el proceso del autoclavado son el vapor, la presin y la temperatura. 3.- El flameado directo para que tipos de materiales se emplea? Se usa para materiales resistentes y que necesiten ser usados varias veces esterilizndose para que no contamine a la muestra, estos materiales son de metal como esptulas, asa de

colle etc. Que se usan varias veces para la siembra de microorganismos, y preparar medios
de cultivo. Los instrumentos tales como las asas y alambres de siembra y varillas secas se esterilizan calentndolas en la llama de un mechero bunsen hasta que se ponen al rojo. 4.- Cul es el fundamento de la esterilizacin por calor seco? El calor seco produce desecacin de la clula, esto es txico por niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lipidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja. 5.- Describa el procedimiento para el adecuado uso de la autoclave. Primero se debe tener un amplio conocimiento de las partes y componentes que contiene el autoclave, de la misma manera se debe la relacin entre la temperatura, la presin y el tiempo de exposicin, ya que stos son factores crticos en el proceso. Slo cuando el vapor se coloca bajo presin, es cuando su temperatura aumenta por encima de los 100C y esto permite alcanzar las temperaturas de esterilizacin (121C). BIBLIOGRAFIA Macedo Aguirre, S. 1999. Gua 'de Practicas de Microbiologa General. Facultad de Medicina. Bibliografa especializada

PRACTICA N O6

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO (MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES) II.INTRODUCCIN

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Se basa en la hiptesis de que las clulas microbianas que confieren una muestra mezclada con un medio de agar forman, cada una, colonias visibles y separadas. III.OBJETIVOS Determinar y reconocer la presencia de microorganismo presentes en los alimentos y luego as llegar si un alimento est realmente contaminado o no. Familiarizar al estudiante con los clculos para la preparacin de los medios de cultivo (medios selectivos y diferenciales), Conocer el uso adecuado de los medios de cultivo. IV. REVISION BIBLIOGRFICA La presencia de un microorganismo en los alimentos no significa necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos, sin embargo la mayor parte de los alimentos de los alimentos se convierte en un potencialmente peligroso para el consumidor solo despus de que han sido violodados los principios de higiene y desinfeccin. MEDIO DE CULTIVO Es un sustrato ptimo para el mantenimiento y crecimiento de microorganismos en el laboratorio. El medio variara dependiendo del tipo de microorganismo. Un cultivo que contiene una clase de microorganismo se conoce como cultivo puro o axenico. Aquel que contiene ms de un tipo de microorganismo se conoce como cultivo mixto CONDICIONES GENERALES DE UN MEDIO DE CULTIVO Presentar todos los elementos necesarios y en sus proporciones/cantidades necesarias, pH adecuado, condiciones osmticas adecuadas, debe de ser estril y preservado de cualquier contaminacin y medio fresco (ya que se desecan y pierden humedad, concentrndose el resto de componentes). MEDIOS SELECTIVOS: Son aquellos que contienen entre otros componentes una variedad de inhibidores en una concentracin adecuada que impide o retarda el crecimiento de bacterias.

Se emplea de preferencia para el aislamiento de Enterobacterias de importancia clnica y alimentaria (Salmonella, shigella, E. coli) Agar Mac Conkey Agar SS.

MEDIOS DIFERENCIALES: los cuales poseen dentro de sus ingredientes, carbohidratos, aminocidos y otros sustratos que van a ser utilizado por el microorganismo, siendo interpretados e identificados posteriormente. Agar Hierro tres azucares ( TSI) Agar Lisina hierro (LIA) Sim medio fluido (Sulfuro-indol-movilidad) Agar citrato de Simmons Caldo Urea Recuento en placa de bacterias. Los recuentos de bacterias viables se basan comnmente en el numero de colonias que desarrollan en placas con agar nutritivo que han sido precisamente inoculados en cantidades conocidas del alimento diluido e incubadas en condiciones ambientales predetermidas. Su incubacin se dan de 0 y 7oC favorecen el crecimiento de las bacterias psicrotroficas. CLASES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. 1. POR SU ORIGEN a. b. c. Naturales Ejemplo: Leche, pan. Artificiales o sintticos Ejemplo: Agar nutritivo, Agar Mc Conkey Mixtos Agar chocolate, Agar Sangre

2. PORSU CONSISTENCIA: a. Lquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers. Ejemplo: Caldo nutritivo, Caldo BHI, Caldo selenita, Caldo lauril sulfato. b. Semi-slidos Ejemplo: Agar SIM, Indol, Ornitina, Movilidad. c. Slidos Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos con la superficie del medio inclinada. Ejemplo: Agar Saboround, Agar TSI, Agar SS.

3. POR SU COMPOSICIN
a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto; con la adicin de

componentes, como sangre, suero. Para proporcionar sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento dlos hetertrofos exigentes. c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems, d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone ciertos reactivos o sustancia qumicas que dan lugar a determinado tipo de crecimiento bacteriano o cambios para diferenciar las bacterias V. MATERIALES Y METODOS Placas Petri estriles Frascos tapa rosca 100 ml - Probeta 250 mi Tubos de ensayo - Vasos de precipitacin 250 ml - Gradillas - Esptula Insumos Peptona, cloruro de sodio y agua destilada. PROCEDIMIENTO Preparacin de medios de cultivos (spp) Dilucin de las muestras: Peptona 1.0 g Nacl 8.5 g Agua destilada 100 ml - Autoclave - Balanza analtica - Bao Maria - Plancha de calentamiento - Mechero Bunsen

Preparacin de la soluciones Peptona: 1g ---------------------------1000ml X 100ml X= 0.1 g ---------------------------Nacl: 8.5g---------------------------1000ml Y ---------------------------- 100ml Y= 0.85 g

Pesar la peptona y NaCL y luego disolver en 100ml de agua destilada. Luego de disolver los dos medios de cultivos la peptona y el NaCL se mide para cada tubo bacteriolgico 9ml y enumerar de 10-1 hasta 10-5. PREPARACION DEL AGAR ROJO BILIS VIOLETA

Medir 200 ml de agua para autoclavar para preparar el agar rojo bilis violeta ya que el agar no debe ser autoclavado. Colocar en el autoclave los tubos bacteriolgicos y agua de 200ml colocada en el matraz. Durante 10 a 15 minutos para eliminar todas las vidas vegetativas y esporas.

Una vez esterilizada la solucin salina peptonada (ssp) medir 1ml de la muestra del alimento(refresco). Para preparar disoluciones de 10 -1. Luego pipetear 1ml del tubo 10-1 a la 10-2, previamente esterilizada para cada una de las muestras, seguidamente pipetear de la muestra 10 -2 a la 10-3 y asi sucesivamente hasta llegar a 10-5. 38.53g ---------------------------1000ml X ---------------------------- 200ml X= 7.70 g

Pesar 7.70g de (ABV) frente a un mechero para eviratar que se hudesca, luego incorporar al agua destilada ya antes esterilizada en el autoclave para disolver bien se pone en la llama de mechero y luego se lo balancea dando vueltas circulares.

Colocar a bao maria que va a mantener 44-44.5oC de 10 a 15m para que se mantenga en forma liquida y no se gelidifique, luego verter a las placas previamente enumeradas.

En las placas previamente esterilizadas inocular 1ml de la solucin (ssp), luego incorporar aproximadamente 15ml de agar rojo bilis violeta. Mezclar bien mediante movimiento rotatorios (5 a la derecha y 5 a la izquierda). Dejar glorificar y adicionar 5ml aproximadamente de agar rojo bilis violeta para cubrir completamente la superficie del medio, para evitar la formacin de colonias en la superficie.

Dejar en forma invertida las placas durante 24 horas a 37 oC para la incubacin.

IV. RESULTADOS: Dil -1 -2 N 1 Infinito Infinito N 2 Infinito Infinito

-3 -4 -5

46x4=184 28 1

56x4=224 23 2

Calcular el nmero de colonias por gramo de muestra. Dil N 1 N 2 Nmero de unidades formadoras de colonia por gramo de muestra -1 -2 -3 -4 -5 Infinito Infinito 184 28 1 Infinito Infinito 224 23 2 Infinito UFC/ml Infinito UFC/ml (184 + 224)/2 = 204X 103 = 2.04X 104 = 20400UFC/ml (28 + 23)/2 = 25.5 X 104 = 2.55 X 105 = 255000 UFC /ml (1 + 2)/2 = 1.5 X 105= 1.5 X 106 = 1500000 UFC /ml

Las muestras se toman por duplicado. como todas las muestras se encuentran fuera del lmite establecido se considera entonces el promedio como el total de ufc/ml Tubo de ensayo , 1ml de muestra y 9ml de ssp,

DISCUSION: la practica de cultivos es de vital importancia para alumnos que estudian los alimentosya que estos son de vital importancia para el organismo y para llegar e ello deben de cumplir con el requisito libre de microorganismos patgenos los cuales nos evitan de enfermedades transmitidas por alimentos.

CONCLUSION: Se deben de hacer un riguroso anlisis a los productos alimenticios para evitar ETAS.

Las pruebas microbiolgicas ms usadas son aquellas que se realizan por conteo. Esto implica solamente contar el numero de colonias para esto se tiene que observar bien el medio de cultivo.

El factor para convertir el nmero de colonias a unidades depende de la dilucin de la muestra.

CUESTIONARIO

1. Qu son medios de cultivo?

Medio de cultivo: substrato ptimo para el mantenimiento y crecimiento de

microorganismos en el laboratorio. Medio variar dependiendo del tipo de microorganismo.

Un cultivo que contiene solamente una clase de microorganismo se conoce como cultivo puro o axnico. Un cultivo que contiene ms de una clase de microorganismo se conoce como cultivo mixto, en el caso especial de que contenga slo dos clases de microorganismos, deliberadamente mantenidos en mutua asociacin, se trata de un cultivo bimembre. 2. defina los siguientes trminos: rehidratacin, refundido de medios slidos

3. Qu alteraciones se producen debido a la incorrecta reconstitucin?, cite las causas posibles.

4. defina las siguientes designaciones: Agar, Medio fluido, caldos. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo, (a partir de 1014 g/l es un medio de cultivo slido; para valores inferiores, medios semislidos).

Caldos. Son los medios liquidos y se preparan en tubos o erlenmeyers, ejemplo caldo nutritivo, c aldo selenito

5. Cmo define Ud. Los medios selectivos? Cite ejemplos

Permiten el crecimiento de un solo tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems ejemplo: agar Mc Conkey, Kenamicina-Vancomicina

6. Qu son medios diferenciales? Cite ejemplos son medios diferenciales los cuales poseen dentro de sus ingredientes, carbohidratos, aminocidos y otos sustratos que van a ser utilizado por el microorganismo, siendo interpretados e identificados posteriormente. Ejm. Agar Hierro tres azucares ( TSI) Agar Lisina hierro (LIA) Sim medio fluido (Sulfuro-indol-movilidad) Agar citrato de Simmons Caldo Urea

7. formule la composicin del caldo Urea.

I.

BIBLIOGRAFIA

www.medicoscubanos.com/diccionario_medico.aspx?q=suero html.rincondelvago.com/control-microbiologico-de-calidad.html