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GUÍA PARA ELABORAR UN PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN LA TOXINA BOTULÍNICA: Veneno que cura Laura Elvira Ruiz Saúl.

Materia Fundamentos de Investigación. PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN INTRODUCCION. El botulismo producido por las toxinas de la bacteria anaerobia Clostridium botulinum ha representado un problema de salud pública que incluso en años recientes afectó a recién nacidos. Los principales efectos de estas sustancias se manifiestan en las terminaciones nerviosas somáticas y se caracterizan por inhibir las descargas del neurotransmisor acetilcolina en las terminaciones nerviosas produciendo una parálisis muscular sostenida. Es un veneno muy potente, ya que un solo gramo de toxina botulínica cristalizada y adecuadamente dosificada, dispersada en los alimentos, en el agua, o inhalada en forma de aerosol; bastaría para matar a más de un millón de personas. Sin embargo el estudio de este microorganismo y sus toxinas ha avanzado hasta el grado de que la purificación del subtipo A y su posterior utilización en el tratamiento del estrabismo abrió las puertas para emplear esta sustancia en diversas enfermedades en las que la contracción muscular se halla comprometida. Gracias a su efecto paralizante sobre la musculatura, una vez que la toxina se ha podido dosificar y administrar en dosis muy pequeñas, se ha aprovechado para tratar contracturas musculares anormales como la tortícolis espasmódica (contracción de uno de los músculos del cuello), blefaroespasmo (contracción forzada de los párpados), estrabismos, etc. De su éxito en el tratamiento de estas y otras afecciones se dedujo que podría utilizarse también para evitar la acción de aquellos músculos de expresión que producen arrugas cutáneas y ahora su uso es muy popular en cosmetología con el nombre de botox. En el presente trabajo se propone un estudio preclínico para determinar los efectos nocivos de esta sustancia cuando se utiliza en el tratamiento de enfermedades o como factor de embellecimiento. JUSTIFICACIÓN Las toxinas botulínicas son consideradas un veneno porque a dosis muy pequeñas pueden causar daños orgánicos e incluso la muerte del individuo. Se considera que estas sustancias son el veneno más potente conocido, al grado que se han considerado emplear como una potente arma biológica, así sucedió en la década de 1930 cuando la Unidad 731 del ejército japonés administró toxina botulínica a prisioneros durante la ocupación de Manchuria. También fue la primera arma biológica producida por el ejército estadounidense y Alemania la tuvo en sus arsenales durante la Segunda Guerra Mundial, aunque se supone que nunca llegó a emplearla. La Unión Soviética intentó introducir el gen de la toxina botulínica en otras cepas de bacterias más infecciosas y resistentes que el Clostridium botulinum, aunque se desconoce si tuvieron éxito. Los medios de información dieron a conocer que miles de litros de toxina botulínica producidos y almacenados por el régimen de Sadam Hussein fueron oficialmente destruidos por los observadores de la ONU tras el fin del Conflicto del Golfo Pérsico. En la actualidad no se conoce acerca de si grandes cantidades de toxina botulínica permanecen en los arsenales biológicos de algunos países. No obstante lo anterior, un tipo de toxina botulínica (A) se ha producido y utilizado para el tratamiento de diferentes enfermedades, así como por miles de

Esta sustancia que puede ser considerada un veneno tiene múltiples aplicaciones terapéuticas y es necesario conocer. La actividad biológica de cada una de ellas es neutralizada específicamente por su correspondiente antitoxina. Posteriormente se pudo observar que el veneno causante de esta intoxicación. Por otra parte durante la década que va de 1960-1970 el Dr. La historia de este bacilo se inicia oficialmente en 1820 cuando el médico Justinus Kerner (1786-1862) realizó investigaciones sobre envenenamientos producidos por salsas con carne. Posteriormente se demostró que el botulismo era causado por la toxina de un bacilo anaerobio. disfagia (dificultad para deglutir) y sequedad de boca. van Ermengem y se llegaron a aislar 7 toxinas antigénicamente distintas. En caso de curación. La enfermedad producida por estas toxinas se conoce con el nombre de botulismo y puede llegar a ser incluso letal. La muerte puede sobrevenir por fallo respiratorio. sus efectos adversos cuando se emplea en las dosis necesarias para estos diversos procedimientos terapéuticos. a visión doble y borrosa con dificultad en la acomodación. P. midriasis (pupila dilatada). blefarospasmo (cierre involuntario de los párpados). salsa). prueba la eficacia de la toxina para tratar el estrabismo con toxina botulínica de tipo A y crea la compañía Oculinum Inc. identificado en 1895 por el microbiólogo belga E. debido a la afectación de músculos respiratorios o neumonía. la convalecencia es muy gradual y lenta.mujeres que quieren desaparecer sus arrugas del rostro. por ingestión de miel contaminada con esporas del bacilo. excepto por una débil reactividad cruzada entre los tipos E y F. Una misma cepa bacteriana puede producir varios tipos de toxina. fotofobia (molestia grave producida por la luz). Las toxinas botulínicas son producidas principalmente por la bacteria Clostridium botulinum. al poseer toxinas similares a las F y E. las discinesias (movimientos involuntarios semejantes a tics). conocidos como botulismo (de botulus. G. Otras especies del mismo género. comenzándose a usar en la práctica clínica a comienzos de los 80. se encontraba en el centro de los embutidos. nauseas y vómitos. de varias semanas o meses. contracción inapropiada de esfínteres corporales como acalasia (incapacidad . trastornos autonómicos: como hiperhidrosis (sudoración excesiva). F. En 1976 se describieron casos de botulismo infantil. Los síntomas y signos más comunes son: debilidad general. Alan Scout de la Smith-Kettlewell Eye Research Foundation de San Francisco. respectivamente. como C. butyrum podían también producir intoxicaciones. en el reino de Würtenburg en la actual Alemania. pupilas fijas y sequedad del ojo. D. retención urinaria e hipotensión postural. B. estreñimiento. A partir de entonces se han demostrado múltiples usos terapéuticos para esta sustancia. que los alimentos responsables no mostraban signos de putrefacción y que muchas veces eran frescos e incluso estaban recién preparados. especialmente los más gruesos una característica de mismo es que no se producía en presencia de oxígeno. para realizar pruebas en humano. designadas con letras A. entre estos están: los trastornos de hiperactividad muscular como la distonía (contracciones involuntarias permanentes de los músculos). C. así mismo. lengua y faringe. aunque se han reportado casos de otras especies de clostridios que también producen este tipo de toxinas. es decir no hay neutralización cruzada. barati y C. EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN. E. donde con frecuencia se presentaban intoxicaciones debidas a embutidos causando una alta mortalidad.

De estos siete tipos de toxina la A y B tienen aplicaciones clínicas vigentes. su mecanismo de acción básico es el bloqueo de la salida de neurotransmisores en la terminación neuroefectora. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Determinar la dosis letal 1% en una muestra de 100 ratones de laboratorio machos de 20 g de peso de la cepa Balbc. C. y existe otro preparado conocido por Dysport.para relajar las fibras de músculo liso del aparato gastrointestinal). la seguridad de la toxina botulínica tipo A. hiperhidrosis. HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN La toxina botulínica puede causar efectos no deseados en los pacientes. además de en dolor miofascial y espasmos . B. la mejoría funcional y la reducción del dolor. la parálisis cerebral en niños. Los efectos terapéuticos de la toxina botulínica incluyen la reducción de la hiperactividad de músculo. la hiperactividad del detrusor tanto de origen neurogénico como idiopático así como en tratamientos cosméticos. El primer uso clínico autorizado fue en el tratamiento del estrabismo. estas sustancias son polipéptidos con un peso molecular similar y comparten secuencias en sus cadenas y tienen funciones similares. El principal neurotransmisor bloqueado es la acetilcolina pero ahora se piensa que también actúan en la liberación de la sustancia P. D. E. Además a partir de los años 90 se ha empleado en el tratamiento de parálisis cerebral en niños. MARCO TEORICO La bacteria Clostridium botulinum produce siete serotipos de toxina antigénicamente diferentes. En el mercado existen dos preparaciones que contienen toxina botulínica tipo A: la más conocida es el Botox fabricado en Estados Unidos. OBJETIVO GENERAL • Determinar por medio de un estudio toxicológico en ratones de laboratorio. porque uno de ellos se paraliza. espasmo anal y vaginismo. la hiperhidrosis. • Determinar el margen de seguridad de esta sustancia. El presente trabajo propone realizar un estudio para determinar los efectos no deseados de la toxina botulínica tipo A cuando se emplea en dosis terapéuticas. lo cual es ocasionado por esfuerzo desigual de uno o más de aquellos músculos que se encargan de mover los globos oculares. cuando se emplea en dosis terapéuticas para el tratamiento de enfermedades como el estrabismo. la parálisis cerebral en niños. cuando se emplea en dosis terapéuticas para el tratamiento de diversas enfermedades como el estrabismo. o bien. • Con base en los reportes de la literatura determinar las dosis efectivas 99% para los siguientes tratamientos: estrabismo. F y G. la hiperhidrosis. hiperactividad del detrusor tanto de origen neurogénico como idiopático y tratamiento cosmético. parálisis cerebral en niños. la hiperactividad del detrusor tanto de origen neurogénico como idiopático así como en tratamientos cosméticos. . que consiste en la desviación de un ojo que tiene como característica que ambos órganos oculares no se dirijan al mismo objeto en el mismo momento. glutamato y péptido relacionado con el gen de la calcitonina cuando se buscan efectos analgésicos. que se denominan por las letras A.

la hiperhidrosis. muchas veces resulta vergonzoso para ellas. por ejemplo lesión de la columna que afectan los nervios que irradian a la vejiga. Este tratamiento debe repetirse con frecuencia (al menos cada 60 días) para mantener su efecto embellecedor. la hiperhidrosis. Las personas con hiperhidrosis pueden sudar incluso cuando la temperatura está fresca o cuando están en reposo. La parálisis cerebral se caracteriza por afectar a los músculos esqueléticos y por lo tanto a la postura y el movimiento. Es causada por alguna lesión cerebral durante su desarrollo. • Elaboración de una base de datos en el programa Excel para determinar las dosis terapéuticas empleadas en el tratamiento de diversas enfermedades como el estrabismo. el parto. en más de 40 países para uso cosmético. arriba (hipertropía) y abajo (hipotropía). la hiperactividad del detrusor tanto de origen neurogénico como idiopático así . lo cual además de molesto. En ocasiones se presenta desde el nacimiento. pero en otras ocasiones las condiciones que afectan al músculo no pueden determinarse con precisión y entonces será denominada como una afección ideopática. se inyecta en el tercio superior de la cara para evitar la formación de arrugas que tienen su origen en la contracción muscular. con o sin retraso mental o convulsiones. lo que puede suceder el embarazo. las personas afectadas con esta enfermedad sufren de incontinencia urinaria. la severidad de la afectación es variable y puede ir desde formas ligeras a formas graves con importantes alteraciones físicas. Particularmente en el empleo de esta sustancia considerada como un veneno. Como todo fármaco empleado con uso terapéutico. sino de un grupo de condiciones que provocan un mal funcionamiento permanente de las vías motoras (áreas del cerebro encargadas del movimiento) en un cerebro en desarrollo aunque esta condición no es progresiva. se deben extremar las precauciones por lo que la determinación del margen de seguridad es esencial. En la actualidad se emplea la toxina botulínica en su presentación comercial conocida como botox. Este músculo puede afectarse por condiciones neurogénicas. va a presentar reacciones adversas que pueden afectar la integridad de los pacientes que la emplean. La hiperactividad del detrusor es una patología que afecta al músculo de esta nombre que forma parte de la vejiga. la parálisis cerebral en niños. cuya función es la de vaciar la vejiga. lo que impedirá una respuesta adecuada del músculo. la hiperactividad del detrusor tanto de origen neurogénico como idiopático así como en tratamientos cosméticos. METODOLOGÍA • Búsqueda documental exhaustiva de información sobre las dosis empleadas en el tratamiento de el estrabismo. durante la maduración de los músculos oculares. Pero es más común que ocurra durante los primeros dos meses de vida. Como se ha expuesto previamente la toxina botulínica es empleada en diversas patologías que tienen comprometida la función relajante de los músculos. La hiperhidrosis es una condición patológica por la cual una persona suda excesivamente y de manera impredecible. No se trata de una enfermedad como tal. la parálisis cerebral en niños.El estrabismo afecta principalmente a niños. Así mismo. o desarrollarse más adelante. tiene cuatro variantes de acuerdo con la orientación del ojo afectado: hacia dentro (esotropía) afuera (exotropía). y durante el crecimiento hasta los 5 años (momento en que el cerebro alcanza el 90% de su peso).

• Se tomarán muestras de hígado y riñón y serán fijadas en parafina. para determinar lesiones macroscópicas que indique algún daño producido por la toxina. durante los cuales además de registrar la mortalidad. se inyectará igual cantidad de líquido consistente en la sustancia que se emplee para diluir la toxina botulínica a 10 ratones de las mismas características que el lote en estudio. • Con base en los datos antes obtenidos se harán preparados de toxina botulínica con diluciones iguales o menores a las dosis efectivas 99%. y los del lote control y se les realizarán las necropsias correspondientes. • Elaboración de reporte final. Además de haber sido identificados los animales se mantendrán en jaulas diferentes (de 10 en 10) según la dosis de toxina botulínica recibida • Estos ratones se mantendrán en jaulas individuales de preferencia con agua y alimento ad libitum durante dos días. Metodología calendarización de actividades. se realizarán cortes histológicos que se fijarán en portaobjetos. a cada lote se le aplicarán las diferentes diluciones de la toxina botulínica. • Se llevará un registro exacto de todos estos datos en una base de datos de Excel. dichas muestras se teñirán con hematoxilina eosina. se registrarán cualquier anomalía o alteración que sufran. Se tomarán fotografías y registros de cualquier alteración en los ratones tratados con la toxina. Como experimento control. lo que será documentado con todo cuidado. los animales serán identificados con una marca en la cola de diferente color para saber que dilución fue la que recibió.como en tratamientos cosméticos. • Con los resultados de mortalidad se calculará la dosis letal 1% para calcular el margen de seguridad que se define como dosis letal 1% entre dosis efectiva 99%. • Determinación de las dosis efectivas 99% (dosis necesarias para que el 99% de los pacientes tratados respondan favorablemente al tratamiento) para las diferentes afecciones descritas. • Con los registros de las lesiones tanto microscópicas como macroscópicas del lote experimental y del control se determinará si la toxina produce daños sistémicos. 1er mes Búsqueda bibliográfica 2° mes Búsqueda bibliográfica 3er mes Búsqueda bibliográfica Elaboración de base de datos 4° mes Búsqueda bibliográfica Elaboración de base de datos 5° mes Búsqueda bibliográfica Elaboración de base de datos 6° mes Búsqueda bibliográfica Elaboración de base de datos 7 ° mes Búsqueda bibliográfica Elaboración de base de datos . y se aplicaran por vía peritoneal con jeringuillas de insulina. • Se realizará un estudio estadístico basado en t de student para comprobar o rechazar la hipótesis de trabajo. Se repartirán los ratones al azar en lotes de 10 animales. y se compararán con el lote control. Se tomarán fotografías de los órganos internos tanto de los ratones inoculados con la toxina como del lote control para determinar si el daño fue causado por la toxina. a 100 ratones machos de 20 g de peso de la cepa Balbc. • Se sacrificarán los ratones supervivientes del experimento. • Se revisarán microscópicamente las inclusiones de los órganos para determinar si existen lesiones microscópicas producidas por el veneno.

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