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CAPÍTULO 2.9.7.

LISTERIA MONOCYTOGENES

RESUMEN
Listeria monocytogenes puede infectar a una amplia variedad de especies animales, pero la listeriosis clínica es esencialmente una enfermedad de los rumiantes, con casos esporádicos y ocasionales en otras especies. Las principales manifestaciones clínicas de la listeriosis animal son la encefalitis, la septicemia y el aborto, y se trata de una enfermedad transmisible, sobre todo a través de los alimentos. Los hallazgos post-mortem y la histopatología dependen de la presentación clínica. La listeriosis es una de las enfermedades más importantes transmitida por los alimentos. Las manifestaciones de la enfermedad en el hombre comprenden la septicemia, la meningitis (o meningoencefalitis) y la encefalitis, habitualmente precedidas de síntomas parecidos a los de la gripe, incluida la fiebre. En las mujeres gestantes, las infecciones intrauterinas o cervicales pueden provocar abortos espontáneos o nacidos muertos. También se ha asociado Listeria monocytogenes con las manifestaciones gastrointestinales acompañadas de fiebre. Aunque la morbilidad de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad de la enfermedad sistémica/encefalítica puede ser muy alta, con valores cercanos al 30%. Se considera que los ancianos, las mujeres gestantes, los recién nacidos y los individuos inmunodeprimidos corren un grave riego de contraer la enfermedad. Se han identificado varios determinantes moleculares y celulares de la virulencia de este patógeno intracelular y, aunque existen evidencias de polimorfismo entre las distintas especies de L. monocytogenes respecto a algunos de estos determinantes de virulencia, dicha heterogeneidad no se puede correlacionar con la capacidad o la incapacidad de este microorganismo para producir la enfermedad. Por tanto, todas las cepas de L. monocytogenes se consideran patógenas potenciales. Identificación del agente: se dispone de una variedad de métodos convencionales y rápidos para la detección e identificación de L. monocytogenes en muestras de alimentos y en muestras clínicas procedentes de animales con listeriosis. Los métodos convencionales siguen siendo el “patrón de oro” con el que se comparan los restantes métodos. Habitualmente, son muy sensibles. En estos métodos se utilizan agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento para reducir el número de microorganismos contaminantes y permitir la multiplicación de L. monocytogenes. Aunque no se necesite con fines reglamentarios, se dispone de diferentes niveles de tipificación de las cepas de L. monocytogenes, entre los que se incluyen la serotipificación, la fagotipificación, la electroforesis de enzimas multilocus, los patrones de digestión del ADN mediante enzimas de restricción (mediante electroforesis convencional o electroforesis en gel de campo pulsado, la tipificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos y la amplificación aleatoria del ADN polimórfico). Pruebas serológicas: las pruebas serológicas utilizadas para la detección de anticuerpos no se han utilizado tradicionalmente para el diagnóstico de la listeriosis. Se han probado varios formatos y todos han resultado ser poco fiables y carentes de sensibilidad y de especificidad. Los ensayos serológicos experimentales basados en la detección de anti-listeriolisina O se han empleado en algunas investigaciones epidemiológicas y como apoyo al diagnóstico de infecciones del sistema nervioso central con resultado de cultivo negativo. La identificación inmunohistoquímica de los antígenos de L. monocytogenes es una herramienta útil para el diagnóstico de la forma encefalítica de la enfermedad.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

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septicemia y aborto. INTRODUCCIÓN L. El periodo de incubación de la forma encefalítica es normalmente de 2–3 semanas y el curso de la enfermedad es normalmente corto en las ovejas y en las cabras. pero la listeriosis puede producirse esporádicamente o de forma epidémica. monocytogenes mediante una serie de enfoques diferentes. entre las que se encuentran los mamíferos. generalmente. las aves. sobre todo. y es la manifestación más común de la enfermedad en los rumiantes. La forma septicémica es relativamente poco común y por lo general. monocytogenes puede infectar a una amplia gama de especies animales. el fluido cerebroespinal puede estar turbio y los vasos meníngeos congestionados. y aparentemente es más relevante para la Salud Pública la contaminación a partir del ambiente en el que se procesan los alimentos (50). El periodo de incubación puede ser de tan solo 1 día. la enfermedad muestra una histopatología característica que consiste en focos de células inflamatorias con manguito perivascular adyacente. cuando comienzan a aparecer en la literatura informes documentados sobre brotes de listeriosis 2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . En la forma septicémica. por lo general. pueden detectarse focos múltiples de necrosis en el hígado y. en el caso de una listeriosis septicémica abortiva. las células plasmáticas y ocasionalmente los neutrófilos. Los síntomas comprenden depresión. Son raras las lesiones patológicas globales del cerebro. A. especialmente en ovejas. Los hallazgos post mórtem y la histopatología. Las pruebas indican que la listeriosis animal es. La mayor parte de las infecciones en animales son subclínicas.9. la manifestación primaria es la septicemia y son menos frecuentes los casos de encefalitis y raros los abortos.monocytogenes inactivada por calor. al ser un organismo intracelular. en el bazo. La forma encefalítica se denomina a veces “enfermedad en círculo” debido a la tendencia a dar vueltas en una dirección. Además del impacto económico de la listeriosis en animales. monocytogenes que. después de la ingestión oral. una enfermedad relacionada con el almacenamiento de forraje y con el medio ambiente como fuente principal de contaminación. 66). Cuando se produce listeriosis en cerdos. Puede presentarse una patología más amplia de tipo malácico. y la inmunización con antígenos de Listeria y IL-12.Capítulo 2. 64). aunque la mayoría de casos de listeriosis clínica tienen lugar en rumiantes. En raras ocasiones se ha asociado la mastitis de rumiantes con la infección por L. los cerdos raras veces desarrollan la enfermedad y. especialmente durante el parto de las vacas o las ovejas (65). incluyendo la inmunización con ADN plasmídico. pero puede producirse autolisis si el feto estuvo retenido antes del parto (47. fiebre y muerte. entre 1 y 4 días (50). se han descrito casos esporádicos de listeriosis. Aunque las aves son portadoras subclínicas habituales. La importancia relativa de la transmisión zoonósica de la enfermedad al hombre no está clara. su papel significativo como patógeno humano transmitido por los alimentos solo se hace evidente a partir de 1980. pero no de manera invariable. en la última etapa (después de 7 meses en vacas y 12 semanas en ovejas) (33.7. inapetencia. los peces y los crustáceos. En la forma encefalítica. debida en primer lugar a la consumición de productos animales contaminados. La infección puede deberse al contacto directo con animales infectados. necesita la participación de los linfocitos T efectores para desencadenar una respuesta inmune efectiva. — Listeria monocytogenes Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: se ha comprobado que es muy difícil desarrollar vacunas efectivas contra L. las aves son portadoras subclínicas del microorganismo. predominando los linfocitos e histiocitos. anorexia. el empleo de mutantes deficientes en listeriolisina O inoculados junto con listeriolisina O encapsulada en liposomas. El aborto se produce. La listeriosis aviar puede ser el resultado de una infección secundaria en condiciones de enfermedad vírica y salmonelosis (65). También se han descrito la oftalmitis bovina y ovina (63). en la listeriosis animal. 64). la médula muestra áreas de reblandecimiento. con menor frecuencia. Se han estudiado vacunas experimentales utilizando animales de laboratorio con el fin de conferir protección frente a la infección por L. estas infecciones son muy raras. Los fetos abortados de los rumiantes muestran muy pocas lesiones globales. Se caracteriza por depresión. la señalización de los CD40 junto con L. Sin embargo. Aunque Listeria monocytogenes se ha considerado durante muchos años como un microorganismo patógeno de los animales. El ensilado es la fuente más frecuente (27. En ocasiones. existe una conexión entre los animales y su papel como fuente de infección para el hombre. Los microabscesos en el tronco cerebral a menudo afectan más gravemente a un lado del cerebro. solo tiene lugar una forma clínica de listeriosis en un grupo particular de animales. caída de la cabeza o torsión de la cabeza hacia un lado y parálisis facial unilateral. sin embargo. siendo más frecuente la septicemia y mucho menos común la aparición de meningoencefalitis. Normalmente. monocytogenes. Las manifestaciones clínicas de la listeriosis en los animales incluyen encefalitis. La mucosa intestinal es la vía de entrada principal. En raras ocasiones pueden ocurrir infecciones gastrointestinales en ovejas (20). aunque puede ser más prolongado en el ganado vacuno. se produce en el recién nacido. cabras y vacas. dependen de la presentación clínica. La mayoría de las veces están implicadas la médula y la protuberancia.

Capítulo 2. y un incremento del número de personas con un gran riesgo de sufrir la enfermedad (ancianos. El aislamiento e identificación de L. Algunas desventajas de este grupo de métodos incluyen el periodo de tiempo relativamente largo que se necesita para completar los protocolos. monocytogenes y el hecho de que todavía no sea conocido su mecanismo de acción. nacidos muertos o nacimientos prematuros (51. innocua. explotando la capacidad del microorganismo de multiplicarse a temperaturas de refrigeración. dicho procedimiento necesita tiempos de incubación muy largos. entre otros. estos métodos son muy sensibles y no requieren un equipamiento sofisticado o caro. 45). procesamiento y distribución de los alimentos. muestras medioambientales y muestras clínicas procedentes de animales. A pesar de que la morbilidad de la listeriosis es relativamente baja. dos fosfolipasas. monocytogenes hasta niveles que sean suficientes para poder detectar este microorganismo. una metaloproteasa. Se han identificado diversos determinantes moleculares de virulencia que juegan un papel en la infección celular por L. 60). pero aún no ha sido resuelta la cuestión de si todas las cepas de L. Se dispone de una tipificación de cepas de L. de relevancia a nivel de salud pública. En embarazadas. Aunque existe polimorfismo entre diferentes cepas de L.9. monocytogenes para algunos de estos determinantes de virulencia. Normalmente. particularmente respecto a la comodidad de los alimentos ya preparados. 28. 57). la posibilidad de que algunos microorganismos contaminantes enmascaren la presencia de las bacterias diana. Aunque L. Siguen siendo el los métodos de referencia frente a los cuales se comparan y validan otros métodos. Estos determinantes de virulencia comprenden. Los métodos bacteriológicos convencionales son importantes por varias razones: su empleo permite obtener el microorganismo en cultivo puro. la listeriolisina O (LLO). la proteína Vip. habitualmente precedida de síntomas parecidos a los de la gripe. 58). en los primeros tiempos de la bacteriología clínica de Listeria. la proteína Act A. aunque se han publicado algunos casos raros de infección debidos a L. Hoy en día. también es un importante contaminante medioambiental. monocytogenes posee un potencial zoonósico evidente. 21. pero también se han registrado infecciones por L. Sin embargo. — Listeria monocytogenes relacionados con el consumo de alimentos contaminados (54). Listeria ivanovii ha sido relacionada con abortos y se la ha considerado como causa de la meningoencefalitis en ovejas. Identificación del agente En la actualidad existen varios métodos convencionales y rápidos disponibles para la detección e identificación de L. monocytogenes es responsable de la mayoría de las infecciones. un sistema de exclusión de la bilis (BilE) y una hidrolasa de sales biliares (17. mientras que las bacterias contaminantes no se desarrollarían bajo estas condiciones. los cambios en los hábitos alimenticios de la población. monocytogenes en muestras de alimentos y en muestras procedentes de listeriosis animal. a menudo meses. lo que será útil para fines reglamentarios. ivanovii y L. las internalinas. se utilizaba regularmente el enriquecimiento en frío (31). La posible explicación de la emergencia de la listeriosis humana transmitida por alimentos como un asunto del máximo interés de Salud Pública ha de buscarse en los importantes cambios en la producción. la utilización cada vez mayor de la refrigeración como principal medio de conservación de los mismos. monocytogenes son o no capaces de causar la enfermedad (30. la infección puede dar lugar a abortos. gestantes. la mortalidad puede alcanzar valores de alrededor del 30%. 44. La manifestación primaria de la listeriosis humana puede incluir la presencia de septicemia. 41. incluyendo una posible falta de detección de variantes atípicas del microorganismo diana y la subjetividad relativa que supone la interpretación del crecimiento bacteriano en placas de agar con un medio selectivo y diferencial (1). seeligeri. En animales. Con este fin. la necesidad de productos químicos. hace de L. B. monocytogenes a partir de alimentos. Listeria monocytogenes es un bacilo Gram-positivo responsable de la mayor parte de las infecciones por Listeria que afectan al hombre. L. incluida la fiebre. También se presentan manifestaciones gastrointestinales acompañadas de fiebre. la experiencia práctica que se precisa en varias manipulaciones. monocytogenes establecida mediante una variedad de métodos y con fines de investigación epidemiológica. por lo que resulta inadecuado para las investigaciones actuales de brotes de transmisión alimentaria y de casos esporádicos. recién nacidos e inmunodeprimidos) (51. tanto a nivel celular como molecular. meningitis (o meningoencefalitis) y encefalitis. requiere el uso de agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento que mantengan los niveles de microorganismos contaminantes en valores razonables y permitan la multiplicación de L.7. monocytogenes uno de los modelos más interesantes de interacción patógeno-hospedador. ivanovii y L. este hecho no puede correlacionarse con la capacidad o la incapacidad del organismo para producir la enfermedad (41). TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1. así como para la puesta en práctica de programas efectivos de análisis de riesgos y control de Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 3 . monocytogenes se considera uno de los agentes más importantes de enfermedades de transmisión por alimentos. L. reactivos y medios muy diferentes. 24.

las muestras deberían escogerse de acuerdo a la presentación clínica de la enfermedad: material procedente de lesiones del hígado. Para la enumeración de L. 64). las Normas ISO 11290 (38. a) Métodos de aislamiento Los métodos convencionales para el aislamiento de L. 4). acriflavina. calentamiento. 62). Ningún procedimiento se puede considerar lo bastante sensible para detectar L. tanto en términos de tiempo requerido para el aislamiento e identificación del microorganismo como en tasas de aislamiento (25). colistina. Microbiología. Ejemplos de estos compuestos selectivos son la cicloheximida. 38. el aislamiento es difícil cuando el microorganismo está presente en número reducido. protuberancia y médula. 49. el enriquecimiento en frío y una ligera modificación de lo que se convirtió en el método de la AOAC. en el caso de la forma septicémica. 4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . En el caso de la listeriosis animal. conservación y transporte de muestras. 8. El procedimiento tradicional de aislamiento de L. en paralelo.Capítulo 2. fluido espinal. con subcultivos semanales durante 12 semanas (31. ácido nalidíxico. y placenta (cotiledones). pero. monocytogenes a partir de alimentos. 43). afirma que la Norma ISO 11290. ceftazidima. 40) puede utilizarse para la detección de L. Subcomité SC 9. todavía existe la posibilidad de mejorar en diversas áreas. El método del USDA-FSIS se recomienda para la carne roja y la carne de ave (cruda o lista para comer). La introducción de procedimientos alternativos de enriquecimiento y agentes selectivos para el aislamiento de L. A pesar de los avances conseguidos en el aislamiento de L.7. monocytogenes en tejidos fijados en formalina ha resultado ser más sensible que la siembra directa en placas y el cultivo bacteriano enriquecido en frío para el diagnóstico de la variante encefalítica de la enfermedad en rumiantes (20. — Listeria monocytogenes puntos críticos (HACCP) en las plantas de procesamiento y producción de alimentos. polimixina B y moxalactam (3. Si la muestra ya está congelada. monocytogenes a partir de alimentos que han ganado aceptación con propósitos reglamentarios internacionales son el método de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) (34). La detección inmunohistoquímica de antígenos de L. parte 2 (39).9. riñones y/o bazo. monocytogenes a partir de tejidos animales consiste en la siembra directa de las muestras en placas con medio agar sangre de oveja u otro medio de cultivo rico y la utilización en paralelo de la técnica de “enriquecimiento en frío”. de este modo se acorta el tiempo requerido para el desarrollo selectivo del microorganismo. monocytogenes en una gran variedad de alimentos y productos alimenticios. Además. 62). Se deben emplear temperaturas de refrigeración (4°C) para la manipulación. 34. monocytogenes a temperaturas de incubación normales. 40). monocytogenes en estado subletal en alimentos procesados debido a la refrigeración. se debería mantener congelada hasta su análisis. sin embargo. El Comité Técnico de la Organización Internacional para la Estandarización ISO/TC 34. La comparación de la eficacia de la siembra directa en placa. partes 1 y 2 (38. cefotetan. así como los protocolos opcionales mencionados en los métodos de la FDA y del USDA-FSIS (34. monocytogenes a partir de alimentos y de muestras medioambientales ha abierto la posibilidad de utilizar algunas de estas técnicas para el análisis bacteriológico de muestras procedentes de animales con listeriosis. cloruro de litio. El diagnóstico bacteriológico de la listeriosis animal ha consistido tradicionalmente en la siembra directa de las muestras en placa con medio de agar sangre o en otros medios de enriquecimiento y. el método oficial de la Asociación Oficial de Químicos Analistas (AOAC) (8). antes de poderse detectar en el cultivo. un método particular puede ser más adecuado que otro. contenido del abomaso fetal y/o secreciones uterinas. como sucede en el caso de la forma septicémica de la enfermedad. monocytogenes a partir de todos los tipos de alimentos (22). los huevos y derivados y las muestras medioambientales. ha permitido establecer la superioridad de este último sobre los otros dos para el aislamiento de L. en el caso del aborto. Dependiendo de la naturaleza de la muestra. Estas bacterias en estado subletal necesitan condiciones especiales de cultivo para reparar el daño. El aislamiento mediante siembra directa en placa es relativamente fácil si el microorganismo está presente en gran número en un lugar normalmente estéril. de Productos Agroalimentarios. acidificación y otros tipos de tratamientos físicos o químicos. feniletanol. pueden encontrarse células de L. 64). como sucede en el caso de la forma encefalítica o si las muestras están fuertemente contaminadas con otros microorganismos. fosfomicina. en el caso de la forma encefalítica. Se han incorporado compuestos selectivos en los medios de cultivo que permiten el crecimiento de L. recomiendan que se lleve a cabo el máximo esfuerzo para aplicar este método en la medida de lo posible. Aunque reconocen que este estándar puede no ser el más apropiado en ciertos casos. el método del Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria (FSIS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) (62) y los Estándares franceses (3. el empleo de la técnica de “enriquecimiento en frío”. Los métodos de la FDA y de la AOAC pueden utilizarse para el análisis de la leche y los productos lácteos. monocytogenes se aplica la Norma ISO 11290. con subcultivos semanales durante 12 semanas (31. monocytogenes a partir de una amplia variedad de material procedente de la necropsia animal. 49.

Se observa el crecimiento de bacterias transcurridas 24 y 48 horas. que contiene cloruro de litio. la actividad hemolítica en agar sangre (sangre de caballo desfibrinada). el agar MOX (USDA-FSIS). La naturaleza de los medios y los agentes selectivos varían con el método. el tamaño de la muestra para el inóculo puede ser limitado y menor que el recomendado para las muestras de alimentos (25 g o ml). debe inocularse la mayor cantidad posible de material de muestra (10–25 g o ml) (25). cefotetan y fosfomicina como agentes selectivos. basado en el aislamiento selectivo. El método de la FDA emplea TSB YE con acriflavina. monocytogenes en agar ALOA son de color verde azulado. 9.  i) Procedimiento para el aislamiento a partir de material de necropsias de animales Se inoculan 10–25 g o ml de muestra (dependiendo de la cantidad de muestra disponible) en 225 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria. Si ese es el caso. ácido nalidíxico y cicloheximida. el preenriquecimiento se lleva a cabo a 30°C durante 4 horas en caldo tripticasa-soja con extracto de levadura (TSB YE) sin agentes selectivos. Los dos medios selectivos de siembra en placa utilizados en el método estándar ISO son: Agar Listeria de Ottaviani y Agosti (ALOA). contiene cloruro de litio. colistina. Las colonias típicas de L. monocytogenes en estado subletal. son pequeñas. dependiendo del método. La cepa de referencia debería cultivarse en paralelo a las muestras sospechosas para asegurar que las pruebas se están realizando correctamente. cloruro de litio y acriflavina. La Norma ISO indica el caldo Fraser para el enriquecimiento “secundario” con agentes selectivos a la concentración normal. agua. Los laboratorios Bio-Rad han desarrollado el RAPID’L. y cualquier otro medio selectivo elegido por el laboratorio. empleado en el método del USDA-FSIS. Los métodos de la FDA (34) e ISO incluyen una etapa de preenriquecimiento para tratar de recuperar las células de L. Es posible que este protocolo pueda mejorarse incorporando las actualizaciones recientes del método de la AOAC y nuevos avances para la identificación y confirmación de aislamientos de Listeria.7. a excepción del método de la Norma ISO. Las muestras se enriquecen durante 24–72 horas a 30°C. para la detección directa y enumeración de L. la fermentación de la glucosa (+). 11. Después del enriquecimiento selectivo. agentes selectivos: acriflavina. pero aún no existe evidencia publicada en apoyo de esta hipótesis. ceftazidima. En el caso del método de la FDA.2 mg. rodeado por un halo opaco (40). ácido nalidíxico. y las colonias de Listeria spp. Cuando se trate de muestras de listeriosis animal. 6 g. Se extiende 0.Capítulo 2. monocytogenes.3 mg. Se ensayan cinco colonias (o todas si se dispone de pocas) con apariencia típica de L. como se indica anteriormente.1 ml de cultivo con caldo para enriquecimiento sobre placas con agar de Oxford. Las muestras utilizadas en el análisis deben ser representativas del alimento. cicloheximida. El agar de Oxford contiene cloruro de litio. un medio cromogénico selectivo. 30 g. incluyendo la superficie externa y el interior del mismo.9. que contiene cloruro de litio. colistina y moxalactam. acriflavina. monocytogenes de material de necropsias de animales se describe más adelante como el primero en publicarse (25). El método del USDAFSIS utiliza dos etapas de enriquecimiento: el enriquecimiento “primario” se realiza en medio de la Universidad de Vermont (UVM) y contiene ácido nalidíxico y acriflavina. la hidrólisis de la esculina y la producción de catalasa. mientras que en los métodos del USDA-FSIS (62) y de la AOAC (8) las muestras se procesan directamente en caldo de enriquecimiento. El protocolo ISO emplea un “enriquecimiento primario” durante 24 horas a 30°C en presencia de agentes selectivos. ácido nalidíxico. el método de la FDA incluye cloruro de litio/feniletanol/moxalactam (LPM) o agar PALCAM. ii) iii) iv) v) Todos los medios de cultivo preparados tienen que someterse a un control de calidad y ser capaces de mantener el crecimiento del microorganismo objeto de la prueba a partir de un inóculo pequeño. El agar MOX. Además del agar de Oxford. El método EOAC considera el enriquecimiento selectivo en caldo triptona de soja que contenga acriflavina. la detección Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 5 . En todos los métodos. Se incuban las placas a 37°C. la ramnosa (+) y la xilosa (–). polimixina B. plimixina B y anfotericina B (o cicloheximida). los cultivos se siembran en placas de agar con un medio selectivo/diferencial para el aislamiento de las colonias presuntivas de L. acriflavina y ceftazidima. ácido nalidíxico y cicloheximida (“medio de enriquecimiento selectivo”). el enriquecimiento “secundario” se lleva a cabo en caldo Fraser con ácido nalidíxico. Se incuba el caldo a 30°C durante 48 horas. 35°C ó 37°C. extracto de levadura Difco. cicloheximida. (Caldo base de enriquecimiento para Listeria: caldo de triptona y de soja (Oxoid). 2. monocytogenes para observar la forma celular. la movilidad en agitación a 20°C. pero a un medio de su concentración (“caldo Fraser a un medio”).5 mg. se utiliza el agar de Oxford o una modificación. tales como Oxford o PALCALM. 1 litro. mientras que el enriquecimiento “primario” se lleva a cabo en “caldo Fraser a un medio”. se añaden agentes selectivo a 225 ml de caldo base). monocytogenes. la reacción de Gram. negras y rodeadas de un halo negro.Mono. Los métodos de cultivo convencional conllevan un procedimiento de enriquecimiento basado en la utilización de medios de cultivo líquidos que contengan agentes selectivos. — Listeria monocytogenes El protocolo recomendado para el aislamiento de L.

L. como por ejemplo Vitek. innocua L. (+): reacción débil.7. equi. descritos con anterioridad. aureus y negativo con la de R. Listeria monocytogenes se desarrolla en colonias azules (positivas a la PI-PLC) sin halo amarillo (negativo a la xilosa). monocytogenes. monocytogenes. Las estrías deben tener la suficiente separación para permitir que las cepas de Listeria de prueba y de control se puedan sembrar perpendicularmente. MICRO-ID. son blancas (negativas a la PI-PLC). Otras colonias de Listeria spp. monocytogenes es positivo con la siembra de S.9. en una placa de agar sangre de oveja o en una placa por la técnica de la doble capa de agar.. — Listeria monocytogenes cromogénica de fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol (PI-PLC) y el uso de xilosa. La serología. orientada al gen hly. Además de los agares RAPID’L. NC 27712. monocytogenes y las de otras Listeriae: agar cromogénico (Oxoid) para Listeria (OCLA). La prueba es fácil de realizar e interpretar. EE. mientras que la prueba con L.UU. 100 Akzo Ave. grayi subsp. equi – – + – – – – V: variable. mediante los métodos de la FDA y del USDA-FSIS. se han elaborado otros medios cromogénicos para diferenciar entre las colonias de L.. ivanovii L seeligeri L. la tipificación lisogénica y el ensayo de patogenicidad en ratones inmunodeprimidos se consideran como métodos opcionales.) que ha sido validado por la AOAC (método 992. Grayi L. Consiste en sembrar en estría una cepa ß-hemolítica de Staphylococcus aureus (ATCC cepa 49444 o 25923. Murrayi + – + (+) – – – + V – – V – V Xilosa – – + + + – – Prueba CAMP S. se seleccionan para la identificación adicional de L.Capítulo 2. Se ha descubierto que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). monocytogenes L. una vez crecidas en el medio selectivo diferencial. grayi subsp. NCTC cepa 1621) formando unas únicas líneas rectas y paralelas..Mono y ALOA. Cuadro 1. kits de enzimoinmunoensayo (ELISA) y de pruebas de ácido nucleico para facilitar la identificación de L. API. sin que los toquen (separados 1–2 mm). c) Métodos de identificación rápida Los siguientes protocolos incluyen pruebas convencionales y no convencionales disponibles en el mercado.18) (4) para la identificación presuntiva de las especies de Listeria aisladas a partir de muestras medioambientales y de alimentos. L. Durham. –: sin reacción. es sensible y rápida para la confirmación de la identificación de L. Supone una alternativa a las pruebas bioquímicas convencionales de los aislamientos de Listeria spp. y CHROMagar Listeria. ivanovii produce las reacciones inversas (49). Diferenciación de especies de Listeria Especie Hemólisis Producción de ácido Ramnosa L. NCTC cepa 7428 o 1803) y de Rhodococcus equi (ATCC cepa 6939. Se emplea en los protocolos ISO y de la AOAC y se considera opcional en los métodos de la FDA y del USDA-FSIS. welshimeri L. La diferenciación de las especies de Listeria se basa en un derivado de un código octal después de introducir 6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Después de una incubación de 24–48 horas a 35–37°C (12–18 horas si se emplea la doble capa de agar). fabricado por CHROMagar Microbiology. entre los dos microorganismos indicadores. +: >90% reacciones positivas. La prueba Christie–Atkins–Munch–Peterson (CAMP) es una herramienta muy útil que facilita la identificación de las especies de Listeria spp a partir de los aislamientos. b) Métodos de identificación convencional Las colonias típicas de Listeria spp. aureus + – – (+) – – – R. Se basa en el principio de que el inóculo de la prueba contiene enzimas preformados que pueden detectarse después de 24 horas de incubación a 37°C. monocytogenes sospechoso aislado en placas de agar selectivo-diferencial (29). i) MICRO-ID Listeria El MICRO-ID Listeria es un sistema disponible comercialmente (Organon Teknika Corp. con la capa de agar sangre superior muy delgada. se considera una reacción positiva la aparición de una zona destacada de ß-hemólisis en la intersección de las cepas de prueba/control con las cepas indicadoras. ivanovii produce colonias verde-azuladas (positivas a la PI-PLC) con halo amarillo (positivo a la xilosa).

productos agrícolas y verduras frescas. Cada tarjeta de identificación de las bacterias Gram-positivas (GPI) y de las Gram-negativas (GNI+) contiene 30 pruebas bioquímicas. es el método oficial 2002.. 100 Akzo Ave. El sistema utiliza una cámara incubadora con un lector óptico. con protocolos de enriquecimiento para alimentos adicionales y sin el agente cicloheximida. Los cultivos de enriquecimiento que den positivo siguiendo este método se siembran por estría en medios selectivos y las colonias sospechosas se identificarán mediante pruebas bioquímicas como L. que se ensayan por separado. 55). Los cultivos de enriquecimiento que den positivo deben sembrarse en medios selectivos y las colonias sospechosas se identificarán de acuerdo a los criterios especificados en los métodos de la FDA y del USDA.9.. — Listeria monocytogenes los valores numéricos de cada grupo de tres pruebas y en las reacciones obtenidas a partir de la prueba CAMP y las características de hemólisis. Box 788. carnes procesadas.. Inc. La identificación de las especies de Listeria requiere la utilización de una tarjeta GPI y dos reacciones con la tarjeta GNI+. • Método Assurance® de enzimoinmunoensayo policlonal El enzimoinmunoensayo Assurance® Listeria es el método oficial 996. en productos lácteos. grayi o L. Una versión mejorada. La AOAC lo ha validado como método 992. carnes y mariscos.UU. seeligeri.22 de la AOAC (10) y se ha diseñado para la detección de Listeria spp. el Sistema de Identificación Microbiana Sherlock (MIS) (Microbial ID.O. como L. iii) Métodos inmunológicos de detección rápida Se han desarrollado varios métodos inmunológicos para identificar L. 595 Anglum Dr. una unidad de llenado/sellado para la inoculación del kit de la prueba y un ordenador. el ensayo de hemólisis y/o la prueba de reducción de nitratos. monocytogenes. Los microorganismos situados en la categoría “LM” se identifican como L. innocua. Los microorganismos de la categoría O se clasifican como especies no-Listeria. Se deben realizar pruebas posteriores para identificar las especies dentro de cada categoría de acuerdo con el método de la FDA. welshimeri. en la categoría “LI”. monocytogenes en alimentos y los siguientes métodos disponibles comercialmente están validados por uno o más sistemas oficiales de validación (23. Australia.7. por tanto. ivanovii o L. carne de ave y carnes (excepto carne cruda picada) y verduras. en productos lácteos. y en la categoría “LG”. si los controles negativo y positivo dan unas lecturas de absorbancia aceptables. Willoughby.. en la categoría “LW”. alimentos lácteos procesados o sin procesar. como L. mariscos.19 (6). monocytogenes según el método de la FDA. Sin embargo. P. Solo será válido un resultado positivo. NC 27704.UU. el Sistema MicroLog (Biolog. incluyendo L. un antifúngico tóxico. • Método colorimétrico de detección mediante un enzimoinmunoensayo policlonal (TECRA® Listeria Visual Immunoassay [TLVIA]) El TLVIA es el método oficial 995. como se describe en el método de la FDA. • Enzimoinmunoensayo colorimétrico monoclonal (Listeria-Tek) El Listeria-Tek es el método oficial 994. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 7 . El kit comercial está disponible en TECRA International Pty Ltd. como L.Capítulo 2. EE. El kit comercial se puede adquirir en Organon Teknika Corp. que asigna al microorganismo problema un género y/o una especie. el MICROBACT 12L (Microgen). Como en la prueba se utilizan anticuerpos monoclonales (MAb) pueden producirse reacciones cruzadas con otras Listeria spp.. carnes rojas. en productos lácteos. cerdo.03 de la AOAC (9) y se ha diseñado para la detección de Listeria spp.). ii) Sistema de identificación microbiana automatizada Vitek (Vitek Automicrobic System) El Vitek Automicrobic System (bioMérieux Vitek. basado en patrones de ácidos grasos) y el Sistema Walk/Away (MicroScan).14 de la AOAC (11) y puede utilizarse para la detección de Listeria spp. para la identificación de algunas listerias el análisis debe llevarse a cabo mediante la prueba CAMP. Hazelwood. Los cambios se analizan mediante el ordenador. NSW. Durham. monocytogenes. murrayi (una subespecie de L. MO. EE. marisco. grayi).) es un sistema automatizado de identificación microbiana que puede emplearse para la identificación presuntiva de las especies de Listeria de transmisión alimentaria y para la detección de aislamientos diferentes a Listeria. Otros métodos disponibles comercialmente para la identificación de especies de Listeria incluyen el API LISTERIA (bioMérieux). en carnes crudas. monocytogenes o L. fruta y zumos de fruta.09 de la AOAC (14). la prueba no es confirmatoria para L. que es un procedimiento analítico para la detección de Listeria spp.

. monocytogenes y ha sido validado por la AFNOR. mariscos.06 de la AOAC) y no se encontraron diferencias significativas entre este método y el método oficial 999.. chocolate. validado por la AFNOR. validado por el Instituto de Investigación de la AOAC. WA 98005. Inc. el gen prfA (51a) y el gen ssrA (48a) en un formato de PCR en tiempo real. huevos y harina de huesos. verduras. el método inmunocromatográfico REVEAL para Listeria (Neogen Corporation).y el ensayo Listeria Rapid Test EIA (Oxoid). 8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . Las pruebas con resultado presunto positivo deben confirmarse mediante los procedimientos de cultivo e identificación que se describen en el método de la FDA. en carnes procesadas y de ave.Capítulo 2. así como para la detección de antígenos de Listeria spp. Diffchamb Ltd). a efectos de diagnóstico.UU.. frutas. 12822 SE 32nd St. y la prueba Listertest (Vicam) basada en la separación inmunomagnética validada por el Instituto de Investigación de la AOAC (15). MO 63042. También ha sido validado por la Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) y por el Plan de Evaluación de los Métodos Microbiológicos Europeos (EMMAS) (15). EE. superficies medioambientales y huevos. la prueba Microscreen Listeria de aglutinación en latex (Microgen BioProducts Ltd). d) Métodos de reconocimiento de los ácidos nucleicos Se han desarrollado varios métodos basados en el reconocimiento de los ácidos nucleicos para identificar L. • Método de detección mediante ensayo VIDAS LIS Este enzimoinmunoensayo fluorescente (ELFA) es el método oficial 999. La prueba se lleva a cabo con un cultivo enriquecido de las muestras problema.03 de la AOAC (12). frutos secos. Inc. Algunos se han validado mediante uno o más sistemas oficiales de validación y están disponibles comercialmente (48). El sistema VIDAS lo comercializa bioMérieux. que consistía en el uso de caldos semi-Fraser y Fraser (método oficial 2004. Hazelwood. validado por el Instituto de Investigación de la AOAC. En un estudio multilaboratorial. Diffchamb Ltd). validado por la AFNOR. monocytogenes en alimentos.. carnes rojas. El kit comercial se puede adquirir en BioControl Systems. el Listeria UniQueTM ELISA (TECRA). marisco. superficies medioambientales.06 de la AOAC (56). pastas . monocytogenes y otras Listeria spp. el Transia Plate Listeria ELISA (Transia. Las unidades VIP las comercializa BioControl Systems. validado por la AFNOR. chocolate. frutas. verduras. Otros métodos inmunológicos disponibles comercialmente son el Transia Plate Listeria monocytogenes ELISA (Transia.. Las secuencias diana nuevas.. Otros métodos inmunológicos disponibles comercialmente han conseguido la validación mediante sistemas oficiales entre los que se encuentra el VIDAS Listeria species Xpress (bioMérieux). 595 Anglum Rd. quesos.UU. incluyen el gen de la metaloproteasa (kit de detección LightCycler foodproof Listeria monocytogenes.9. el EMMAS y el Instituto de Investigación de la AOAC. el EIAFOSS Listeria automated ELISA (Foss Electric). pastas. la prueba con Dynabeads anti-Listeria (Dynal Ltd) basada en la separación inmunomagnética. — Listeria monocytogenes productos avícolas. incluida su utilización con muestras medioambientales. Inc. verduras. Se emplea para la detección de productos lácteos. el método inmunocromatográfico Clearview Listeria Rapid Test (Oxoid). El método VIDAS Listeria monocytogenes 2 (LMO 2) incluye MAb específicos para la captura de antígenos de L. carnes crudas y de ave. Roche Applied Science). harina de huesos. El ordenador compara el valor obtenido con un patrón y se genera un informe positivo o negativo. Bellevue. Bellevue. frutos secos. Puede utilizarse para la detección de L. 12822 SE 32nd St. Los resultados positivos deben confirmarse mediante métodos de cultivo estándar como se describe en el método de la FDA. cerdo.06 de la AOAC (13). EE. mariscos. • Ensayo visual de inmunoprecipitación (VIPTM) El ensayo VIPTM es el método oficial 997. Las lecturas por encima del valor de corte se consideran presuntos positivos y a continuación los cultivos enriquecidos se confirman mediante los procedimientos de cultivo e identificación que se describen en el método de la FDA. WA 98005. en productos lácteos. Este inmunoensayo se realiza con un instrumento automatizado VIDAS®. USA.7. aves y productos derivados. se evaluó una modificación de este protocolo de enriquecimiento.

y el GeneDisc (para todo tipo de alimentos. elaborado por BioRad. Este método consigue reducir el tiempo del resultado de las muestras negativas verdaderas en 24 horas y reduce los resultados falsos-positivos.9. iv) Prueba confirmatoria Gen-Probe (AccuProbe®) para Listeria monocytogenes La prueba Gen-Probe (AccuProbe®) Listeria monocytogenes Confirmatory Test (Gen-Probe) es otro método basado en la hibridación con una sonda que ha sido validado por la AFNOR (15). Otros métodos disponibles comercialmente y que están basados en el reconocimiento de los ácidos nucleicos son el ensayo de la PCR Foodproof® Listeria monocytogenes (Biotecon Diagnostics) y el ensayo de la PCR PROBELIATM (L. A continuación todas las muestras que se identifiquen como presuntas positivas respecto a L. 35) demostrando tener un buen potencial para ser utilizado en análisis de rutina. Las muestras positivas deben confirmarse mediante procedimientos convencionales como se describe en el método de la FDA.UU. como se describe en el método de la FDA. MA 01748. monocytogenes utilizando el oligonucleótido sonda AD13 y la detección del gen de la proteína asociada a la invasión mediante una sonda sintética. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 9 . EE. iii) Prueba GENE-TRAK para Listeria monocytogenes La prueba GENE-TRAK para L. 94 South Street. la AD07. — Listeria monocytogenes i) Ensayo GENE-TRAK para Listeria El ensayo GENE-TRAK para Listeria es un método colorimétrico de hibridación del ADN para la detección de las secuencias de Listeria. v) Método AD713 La FDA utiliza el método AD713 (32) para detectar L. monocytogenes se deben confirmar mediante cultivo según el método convencional. menos los productos lácteos) elaborado por GeneSystems. Francia. monocytogenes) (Sanofi Diagnostics). monocytogenes que consiste en una combinación de sondas: para el gen de la proteína asociada a la invasión y para el de la hemolisina (hly). monocytogenes en muestras enriquecidas de carne roja y de ave.Capítulo 2. que ha sido validado por la AOAC como método 993. Las partes de la prueba que den resultado positivo en el ensayo de hibridación del ADN deben confirmarse mediante la siembra en estría en placa de una suspensión microbiana en tampón fosfato salino empleando un medio selectivo para Listeria. las muestras positivas deben confirmarse mediante métodos de cultivo estándar. con un límite de detección superior a 1 ufc/g en 25 g de muestra. El ensayo GENE-TRAK para Listeria se puede adquirir en GENE-TRAKTM Systems. seguido de la identificación bioquímica de los aislamientos presuntos Listeria. Hopkinton. Debido a que existe la posibilidad de reacciones falsas positivas. El kit IQ-Check Listeria monocytogenes (para todos los productos alimenticios y muestras del medio ambiente). ii) Sistema BAX® El USDA-FSIS ha adoptado el sistema BAX® basado en la PCR (Qualicon) (61) como el nuevo método de detección de L. Ambas sondas se utilizan en combinación (se denomina AD713) para evitar los resultados falsos negativos debidos a las mutaciones “silenciosas” en el gen (cambios de nucleótidos que afectan a la capacidad de unión de la sonda al ADN pero no modifican la función del gen). están basados en la detección mediante la PCR en tiempo real y han sido validados por la AFNOR (2).09 (7) para ser utilizado con productos lácteos. carnes y mariscos.7. monocytogenes (18. monocytogenes (GENE-TRAKTM Systems) es un método basado en la hibridación con una sonda que ha sido validado por la AFNOR (15). La AFNOR también ha validado este ensayo. Se ha desarrollado la aplicación de la PCR en tiempo real como un método de detección cuantitativo y específico para L. Este método combina la detección del gen de la hemolisina (también llamada listeriolisina O) de L.

Separación inmunomagnética Immunocromatografía Immunocromatografía Separación inmunomagnética Dynal Neogen Oxoid Detección Detección Detección Listeria spp.Capítulo 2. 15. monocytogenes Principio Reacción enzimática Pruebas bioquímicas Pruebas bioquímicas Uso de sustratos como fuente de carbono Utilización de carbohidratos y prueba de microhemólisis Patrones de ácidos grasos Aglutinación con látex Inmunocromatografía Tiempo aproximado de la prueba2 24 horas 24 horas 24 horas 4 o 24 horas Compañía Organon Teknika bioMérieux bioMérieux Biolog Utilización principal Confirmación Confirmación Confirmación Confirmación MICROBACT 12L L. monocytogenes L. monocytogenes/innocua complejo Listeria spp. 24–48 horas Vicam Detección 1: Adaptado y extendido a partir de la ref. L. Listeria spp. Principio ELISA ELISA Tiempo aproximado de la prueba2 50 horas 50 horas Compañía Organon Teknika TECRA Utilización principal Detección Detección Listeria spp. monocytogenes EIAFOSS Listeria Nivel ID Listeria spp. ELISA ELISA ELISA automático 50 horas 50 horas 48 horas Diffchamb Diffchamb Foss Electric Detección Detección Detección 1: Adaptado y extendido a partir de la ref. Algunos sistemas ELISA de tipo comercial para la detección rápida de Listeria Prueba Listeria Tek Inmunoensayo visual TECRA para Listeria (TLVIA) Assurance Listeria EIA VIDAS Listeria (LIS) VIDAS Listeria monocytogenes (LMO) Transia Plate Listeria Transia Plate L. monocytogenes/innocua complejo L. la duración indicada de la prueba incluye el tiempo de enriquecimiento y aislamiento en placas de agar. — Listeria monocytogenes Cuadro 2. Listeria spp. monocytogenes 4–6 o 24 horas Microgen Confirmación Sherlock Microbial Identification System (MIS) Microscreen VIP Listeria L. Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. 2: Cuando se emplea para confirmación. monocytogenes/innocua complejo L. monocytogenes Listeria spp. 15 10 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . L. Cuadro 3.7. monocytogenes ELISA ELISA ELISA 50 horas 50 horas 50 horas BioControl Systems bioMérieux bioMérieux Detección Detección Detección Listeria spp.9. Algunos sistemas de tipo comercial convencionales y basados en anticuerpos para la detección y confirmación rápidas de Listeria1 Prueba MICRO-ID Listeria Vitek System API Listeria MicroLog System Nivel ID L. 90 minutos Microbial ID Confirmación 1 minuto 2 minutos (después del enriquecimiento) 48–72 horas 43 horas 43 horas Microgen BioProducts BioControl Systems Confirmación Detección Dynabeads antiListeria REVEAL para Listeria Clearview Listeria (Prueba rápida para Oxoid Listeria) Listertest Listeria spp.

la duración indicada de la prueba incluye el tiempo de enriquecimiento y aislamiento en placas de agar. 258–259). basándose en su combinación de antígenos somático (O) y flagelar (H).Capítulo 2. y 4b. de procedimientos que aseguren una calidad rigurosa y de algún equipamiento sofisticado. monocytogenes PCR 48 horas Sanofi Diagnostics Pasteur Roche Applied Science Detección Kit de detección LightCycler foodproof Listeria monocytogenes Kit de detección LightCycler foodproof Listeria monocytogenes L. monocytogenes PCR en tiempo real 65 minutos3 Detección Listeria spp. la mayoría (>95%) de los aislamientos clínicos humanos. L. 3. Algunos sistemas moleculares de tipo comercial para la detección y confirmación rápidas de Listeria1 Tiempo aproximado de la prueba2 30 minutos Prueba Nivel ID Principio Compañía Utilización principal Confirmación Gen-Probe (AccuProbe) VIT Listeria Kit L. monocytogenes BAX para la detección de Listeria Genus PROBELIA 48 horas 50 horas Biotecon Diagnostics Gene Trak Detección Detección L. los esquemas de tipificación pueden ser de utilidad en las investigaciones epidemiológicas. Después del cultivo de enriquecimiento. 16 (pp. 15. el polimorfismo del locus intergénico amplificado (AILP) y la amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD). 3 horas Vermicon Confirmación Foodproof Listeria monocytogenes Gene Trak Listeria Assay Prueba Gene Trak para L. PCR 48 horas Qualicon Detección L. monocytogenes 48 horas Qualicon Detección Listeria spp. monocytogenes se remita al centro de referencia apropiado debido a la necesidad de reactivos específicos. e) Métodos de subtipificación La identificación reglamentaria de L. monocytogenes/ Listeria spp. 2: Cuando se emplea para la confirmación. monocytogenes no exige ninguna tipificación específica de los aislamientos.7. i) Serotipificación Las cepas de Listeria pueden asignarse a 13 serotipos diferentes. Se recomienda que la tipificación de los aislamientos de L. la electroforesis de enzimas multilocus (MEE). — Listeria monocytogenes Cuadro 4. PCR en tiempo real 75 minutos3 Roche Applied Science Detección 1: Adaptado y extendido a partir de la ref. el análisis mediante hibridación con microarrays. la fagotipificación. Comparado con Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 11 . el análisis del ADN mediante enzimas de restricción (empleando enzimas con alta frecuencia de corte y electroforesis en gel convencional o utilizando enzimas con baja frecuencia de corte y electroforesis en gel de campo pulsado [PFGE] para separar los fragmentos). Aunque todas ellas se consideran patógenos potenciales. monocytogenes Listeria spp.9. monocytogenes Sonda para hibridación de ácido nucléico Sonda para hibridación de ácido nucléico PCR Sonda para hibridación de ácido nucléico Sonda para hibridación de ácido nucléico PCR Gen Probe L. Listeria monocytogenes puede tipificarse mediante diferentes aproximaciones incluyendo la serotipificación. tipificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos. Sin embargo. monocytogenes BAX para la detección de L. pertenecen a tres serotipos: 1/2a. Se puede encontrar una lista de centros internacionales y métodos de tipificación en la ref. 1/2b. monocytogenes 50 horas Gene Trak Detección L. en el seguimiento de los casos medioambientales y en la vigilancia de los casos de Salud pública.

reflejan las diferencias genómicas.UU. La técnica no es adecuada. por tanto. HhaI y CfoI (30). los cuales no se tipifican de forma satisfactoria mediante la mayor parte de los métodos de tipificación disponibles. esta técnica se practica solo en laboratorios especializados nacionales e internacionales de referencia y está sujeta a una considerable variabilidad experimental y biológica. que genera. Sin embargo. El método presenta un grado alto de reproducibilidad debido a la especificidad de las endonucleasas de restricción. debido al número elevado de sitios potenciales de reconocimiento enzimático en el genoma bacteriano. esta técnica tiene un poder de discriminación menor que la fagotipificación. los aislamientos procedentes de alimentos o de fuentes medioambientales no son tipificables con los antisueros de tipificación estándar. analiza y almacena los patrones de huellas de ribotipificación de diversas bacterias. Como estas enzimas son muy específicas en el reconocimiento de las secuencias de nucleótidos. iv) Análisis del ADN cromosómico mediante endonucleasas de restricción El análisis del ADN cromosómico mediante endonucleasas de restricción (REA) es un método útil de tipificación de L. Cuando se combina el REA con un análisis de hibridación de tipo Southern. la tipificación con fagos sigue siendo el método más práctico y adecuado de aplicación en casos de brotes agudos y extensos (30). El Centro para la Prevención y Control de Enfermedades (CDC) de los EE. por tanto. la técnica puede resultar complicada. A causa de su tamaño. Debido a los requisitos rigurosos de estandarización y a la naturaleza biológica de los reactivos. Frecuentemente. incluida Listeria. iii) Electroforesis de enzimas multilocus Esta técnica se basa en las diferencias en la secuencia de nucleótidos que provocan distintas movilidades electroforéticas de ciertos enzimas metabólicos seleccionados en geles de almidón y puede emplearse en la tipificación de cepas bacterianas relacionadas. monocytogenes. a través de pulsos. los fragmentos grandes pueden “avanzar lentamente” en la matriz de agarosa y separarse de acuerdo a sus diferencias de tamaño. A pesar de estos problemas. la serotipificación presenta un poder de discriminación bajo. las colecciones de fagos disponibles en la actualidad no pueden tipificar una proporción alta de cepas (20–51% en el caso de la colección internacional de tipificación de fagos). estos fragmentos grandes no se pueden separar cuando se someten a una electroforesis convencional en gel de agarosa. Sin embargo. aplicando cambios periódicos de la orientación del campo eléctrico a lo largo del gel. — Listeria monocytogenes otros métodos de tipificación.Capítulo 2. la MEE solo es moderadamente discriminatoria cuando se utiliza en investigaciones epidemiológicas que involucran a L. tales como los enzimas ApaI. para comparar un gran número de patrones de cepas o para elaborar bases de datos dinámicas (30). pero puede proporcionar una información valiosa para facilitar el descarte de aislamientos que no forman parte del brote. monocytogenes en un estudio multicentro de la Organización Mundial de la Salud (WHO). NotI o AscI.7. que emplee sondas cromosómicas marcadas. solo se detectarán los fragmentos de restricción específicos asociados con los loci cromosómicos correspondientes. Sin embargo. ha establecido la PulseNet. que son caras. una 12 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . lo que dificulta su interpretación. al igual que el equipamiento especializado necesario para llevarlo a cabo (30). ii) Fagotipificación La tipificación por bacteriófagos es una técnica con un buen poder de discriminación y que puede utilizarse para tipificar un gran número de aislamientos. se detectan únicamente los fragmentos de restricción concretos asociados con los loci cromosómicos de los ARNr. principalmente con la endonucleasa de restricción EcoRI. el RiboPrinter. lo que resulta en unas “huellas dactilares” específicas para cada una de las distintas cepas relacionadas. La compañía Qualicon ha diseñado un sistema de ribotipificación automático. Algunas cepas pueden carecer de ciertas actividades enzimáticas y. Esta técnica se conoce como análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). se obtienen fragmentos muy grandes. De las endonucleasas de restricción probadas con L. monocytogenes. los fragmentos resultantes de la digestión del ADN. la PFGE es útil para la tipificación de los aislamientos del serotipo 4b. los resultados procedentes de diferentes laboratorios son muy variables (30). a veces las huellas dactilares complejas se desarrollan con baja resolución o con solapamiento de las bandas. Las principales desventajas de la PFGE son el tiempo de duración del procedimiento (2–3 días) y el gasto de grandes cantidades de enzimas de restricción. Esta técnica se denomina ribotipificación y se utiliza ampliamente en la tipificación de L. las más utilizadas fueron HaeIII. Sin embargo. Particularmente.9. Cuando se utilizan sondas de ADN correspondientes a los RNA ribosómicos. monocytogenes. SmaI. por lo que se analizará un número significativamente reducido de fragmentos de ADN. Sin embargo. de tamaños y movilidad electroforética diferentes. el REA o la MEE. monocytogenes y se ha visto que es un método muy reproducible y discriminatorio. Si se emplean endonucleasas de restricción con baja frecuencia de corte para digerir ADN cromosómico íntegro. La PFGE se aplica en la tipificación de L. Debido precisamente a su naturaleza. Esta técnica se conoce como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y ha revolucionado la separación precisa de los fragmentos de ADN de tamaño superior a 40 kilobases.

a pesar de su simplicidad relativa y su capacidad discriminatoria. monocytogenes (30). que compara diversos métodos de tipificación diferentes mediante la utilización de una colección bien definida de aislamientos. la listeriolisina O (LLO). 2. en particular en los pacientes afectados en el sistema nervioso central. Se han intentado sin éxito varios formatos. Los elementos de secuencia corta repetitiva están ampliamente distribuidos entre las bacterias y las unidades palindrómicas. Sin embargo. Han sido poco fiables. entre ellas la estreptolisina O (SLO) de Streptococcus pyogenes. Se han utilizado con un buen grado de discriminación entre las cepas analizadas la amplificación directa y la secuenciación de nucleótidos (19. la fijación del complemento y la microaglutinación. la determinación de la variación alélica de genes múltiples se presenta como una metodología de tipificación muy prometedora para este microorganismo. pneumoniae y la perfringolisina de Clostridium perfringens. y en los casos de listeriosis perinatal. monocytogenes como molde. Pruebas serológicas Tradicionalmente las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos no se han utilizado para diagnosticar la listeriosis. Este enfoque se ha descrito para un grupo reducido de otros microorganismos y se conoce como tipificación basada en la secuencia multi locus (MLST) (59). vía Internet. La RAPD es una alternativa viable a la fagotipificación y presenta un grado elevado de discriminación. Los problemas de reactividad cruzada de los anticuerpos anti-LLO con las citolisinas.9. conocidas como palíndromes extragénicos repetitivos (REP). Los cuatro principales grupos de cepas identificados por este método coincidieron con el origen de su aislamiento (42). incluso en ausencia de inmunosupresión. Sin embargo. la LLO está relacionada antigénicamente con varias citolisinas. los perfiles de los productos de la amplificación generados son útiles para la tipificación de las cepas. Los laboratorios de la PulseNet emplean protocolos estandarizados rigurosos que pueden comparar rápidamente los patrones obtenidos por PFGE procedentes de lugares diferentes. monocytogenes es un microorganismo ubicuo y es muy común la exposición habitual de los animales y del hombre a este microorganismo. con algunas diferencias dependiendo de la especie y una tasa algo mayor durante la estación de estabulación en comparación con la de pastoreo de los animales (36. En el diagnóstico de la listeriosis experimental de ovejas se aplica un ELISA indirecto basado en la detección de los anticuerpos anti-LLO (46). Debido a que la MLST se basa en la secuencia de nucleótidos. constituyen la familia mejor caracterizada de secuencias bacterianas repetitivas. se seleccionaron para la estandarización en Fase II. 37). lo que dificulta la comparación e interpretación de los perfiles de la RAPD. carentes de sensibilidad y de especificidad. su desventaja principal es la reproducibilidad irregular de los perfiles.7. monocytogenes de la WHO (26). El descubrimiento reciente de que la hemolisina de L. es el principal factor de virulencia y que puede estimular una respuesta de anticuerpos. Las condiciones de baja estringencia para templar los cebadores provoca una polimerización con eficiencias diversas y. las cantidades de ADN producidas pueden variar ampliamente entre los diferentes productos de la amplificación procedentes de un aislamiento concreto. por tanto. La técnica requiere un gran acuerdo de estandarización y regularidad para obtener resultados fiables (30). Además. incluyendo la técnica ELISA. — Listeria monocytogenes red informática de laboratorios reguladores de los alimentos y de la salud pública que tipifica de manera rutinaria mediante PFGE las bacterias patógenas de transmisión alimentaria. en el diagnóstico de casos de listeriosis humana demostrada en cultivo.Capítulo 2. monocytogenes. particularmente con la SLO y la neumolisina. monocytogenes en un nivel tan alto como del 53%. L. monocytogenes. el REA. vi) Amplificación aleatoria del ADN polimórfico Cuando en la PCR se emplean cebadores seleccionados de forma arbitraria bajo condiciones de baja estringencia. es muy discriminatorio y proporciona resultados precisos. Se ha observado una considerable reacción cruzada con determinantes antigénicos de otros organismos Gram-positivos. Los elementos REP están presentes en L. la PFGE y la RAPD. la pneumolisina de S. Por otra parte. con ADN cromosómico de L. con líquido cerebro espinal y sangre estériles. 53) así como una aproximación alternativa que apunta a los cambios genéticos variables directamente en un formato de micromatriz de ADN (52). v) Tipificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos Aunque se han publicado trabajos acerca del análisis de la secuencia de genes únicos como medio para tipificar las cepas de L. Basándose en los resultados del estudio multicentro de tipificación de L. monocytogenes y se ha utilizado con éxito una PCR basada en la secuencia de estos elementos (repPCR) para tipificar cepas de dicho microorganismo. Finalmente este esfuerzo debería resultar en una colección seleccionada de métodos estandarizados de tipificación de L. la serotipificación. El nivel de portadores en los animales es similar al de humanos. ha hecho reanudar el interés acerca de la posibilidad de utilizar las pruebas serológicas para el diagnóstico de la listeriosis. la fagotipificación. los anticuerpos anti-LLO se encuentran en una proporción de individuos sanos y pacientes con Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 13 . han obstaculizado el desarrollo de pruebas serológicas específicas y fiables basadas en la detección de anticuerpos anti-LLO. Muchos individuos sanos son portadores intestinales (2–6%) y en el hombre se ha descrito la prevalencia de anticuerpos séricos anti-L. Listeria monocytogenes se incorporó a la red PulseNet en 1999 (60).

Las formas recombinantes de la LLO se han probado como alternativas a la LLO de tipo silvestre como antígeno de diagnóstico en ensayos de inmunoelectrotransferencia. También debe eliminarse el material que ocupa los primeros centímetros de la parte superior. Se han estudiado vacunas experimentales utilizando animales de laboratorio con el fin de conferir protección frente a la infección por L. en particular en los casos en los que se produce una fermentación ineficaz o hay un desarrollo concomitante de mohos. — Listeria monocytogenes infecciones producidas por otras bacterias. Estos enfoques experimentales comprenden la inmunización con ADN plasmídico. el mantenimiento de las carnes no cocinadas alejadas de las verduras. Estas medidas preventivas comprenden la cocción completa de los alimentos crudos de origen animal. 43). Microorganisms in Foods: Now What? American Society for Microbiology. a ese nivel. la parte frontal y los costados de la alpaca o bolsa después de abrirla. La detección inmunohistoquímica de antígenos de L. cuchillos y tablas de corte después del manejo de alimentos no cocinados y evitar leche no pasteurizada o sus productos derivados. monocytogenes que. como L. al ser un microorganismo intracelular. In: Workshop 102–15. significa que el control de la listeriosis en animales es más factible evitando las condiciones medioambientales que favorezcan su presentación. el empleo de mutantes deficientes en LLO inoculados junto con LLO encapsulada en liposomas. lo que sucede con más frecuencia a valores de pH mayores a 5. se inhibe el crecimiento de Listeria spp. DC. Habría que intentar que la producción del ensilado resultara de buena calidad. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO Se ha comprobado que es muy difícil desarrollar vacunas efectivas contra L. Igualmente. REFERENCIAS 1. USA. Se tendrían que eliminar las sobras del ensilado (47).7. Existe un nexo bien establecido entre la alimentación con ensilado y la listeriosis y. alimentos cocinados y alimentos preparados. Sin embargo. aunque con títulos inferiores a los presentados por pacientes con listeriosis. la señalización de los CD40 junto con L. La absorción de los antisueros que se van a diagnosticar con la SLO es solo parcialmente efectiva para eliminar la reactividad cruzada completa. monocytogenes en tejido fijado con formalina ha resultado ser más sensible que la siembra en placa y el cultivo bacteriano con enriquecimiento en frío para el diagnóstico de la forma encefalítica de la enfermedad en los rumiantes (20. mujeres gestantes y otros grupos de alto riesgo de contraer la listeriosis deberían evitar los alimentos que se han asociado epidemiológicamente a esta enfermedad. la falta de vacunas bien diseñadas y probadas para uso en animales. actuando como portadores los animales y las aves. La modificación genética de L. ej. hongos o virus (27%. monocytogenes en todos los puntos críticos durante la producción de alimentos y en la cadena de distribución (desde la granja al mercado). el medio más práctico y factible de reducir el riesgo de listeriosis en humanos es a través de medidas dietéticas y de preparación de alimentos que no solo reducen el riesgo de adquirir listeriosis. y la inmunización con antígenos listeriales e IL-12. no es infrecuente la contaminación del ensilado.0. Estos ensayos experimentales se han utilizado en algunas investigaciones epidemiológicas y como apoyo al diagnóstico de infecciones del sistema nervioso central con resultado negativo en cultivo. p. monocytogenes inactivada por calor. quesos frescos y paté. Current State of Conventional Microbiological Methodology for the Examination of Food. Estos individuos deberían evitar también otros alimentos ya preparados a menos que sean calentados hasta ebullición antes de ser consumidos. monocytogenes se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza. Actualmente este es un campo en evolución y todavía tendremos que esperar para conseguir el desarrollo de pruebas serológicas validadas y fiables para el diagnóstico de la listeriosis. Washington. 14 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 . ANDREWS W. el lavado de manos. Por tanto. monocytogenes mediante una serie de diferentes aproximaciones. Las personas inmunodeprimidas.Capítulo 2. en conjunto). La industria alimentaria y las agencias de salud pública desempeñan un papel crucial en la prevención de la listeriosis transmitida por alimentos mediante el desarrollo y puesta en práctica de programas efectivos HACCP para reducir la presencia de L. pero estas todavía se encuentran lejos de estar disponibles para ser utilizadas en el hombre o en los animales domésticos. necesita de la participación de los linfocitos T efectores para desencadenar una respuesta inmune efectiva. el lavado a fondo de verduras frescas antes de comerlas.9. Debería seleccionarse el mejor ensilado para la alimentación. secreción y transporte intracelular de antígenos extraños para inducir respuestas inmunes potentes frente a antígenos víricos y células tumorales. descartando el material con señales claras de contaminación con hongos. para garantizar que el pH disminuya hasta quedar por debajo de 5. se tendría que reducir la probabilidad de multiplicación del microorganismo. monocytogenes se está considerando como un vector efectivo vacunal para la expresión. con la contaminación mínima de tierra o heces y asegurando una fermentación anaeróbica óptima. sino que también contribuyen a la prevención de otras infecciones comunes transmitidas por alimentos tales como las causadas por Escherichia coli O157:H7. especialmente en el caso de las ovejas. con un corte temprano de la hierba. C. (2002). Salmonella y Campylobacter.

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