RATONES HUMANIZADOS GENOMICAMENTE TECNOLOGIAS Y PROMESAS Sobre los pasados 30 aos la genetica molecular de los ratones ha sido refinada

a para producir una impresionante cantidad de mutantes Knock in ( raton que carga un reemplazo o insercion de un gen) y knock out ( raton en el que la capacidad codificante de proteinas de un gen ha sido alterada) Estos modelos transgenicos de ratones pueden tener tambien mutaciones condicionales(mutaciones que son expresadas bajo 1 control experimental por ejm induccion a la deleccion de 1 exon por la expresion de recombinasas) Incluso estas razas de ratones pueden ser transcromosomicas (donde 1 cromosoma entero o parte de este ha sido transferido de otra especie) Casi todos los modelos de enfermedades humanas para ser explicadas han sido basados en modelos de ratones ya sea por inyeccion pronuclear o por gene targeting la inyeccion pronuclear (donde se inyecta dna de simple cadena en uno de los 2 pronucleos de del huevo fertilizado) y el gene targeting ( metodo de intercambio de info genetica desde 1 vector donador a 1 genoma recipiente explotando 1 mecanismo de reparacion de dna que reconoce homologias de secuencia entre el donador y el recipiente la inyeccion pronuclear (donde se inyecta dna de simple cadena en uno de los 2 pronucleos de del huevo fertilizado) y el gene targeting ( metodo de intercambio de info genetica desde 1 vector donador a 1 genoma recipiente explotando 1 mecanismo de reparacion de dna que reconoce homologias de secuencia entre el donador y el recipiente Los transgenicos se han hecho con secuencias de hebra simple de dna (cDNA) humanas y el targeting consiste en localizar estas sequencias coding en 1 gen ortologo de raton, Esto es mas exacto que trabajar con 1 proteina mutante de raton Estudios con la enciclopedia de los elementos de DNA Y gwass han demostrado que variaciones en regiones non coding confieren suseptibilidad y resistencia a enfermedades Entender la biologia humana en el aspecto de modelos de enfermedades requerira modelos de ratones humanizados Laboratorios alrededor del mundo estan generando tecnicas para la creacion de ratones humanizados Los cuales son generados al transmitirse 1 loci genomico humano al genoma de raton En este paper se ven diferentes aproximaciones que han sido desarrolladas para la creacion de ratones humanizados Por que la humanizacion genomica sigue siendo 1 desafio, que tecnologias son las mas prometedoras Futuras direcciones para avances en el campo

TRANSGENICOS BAC y YAC

1. 2. Las primeras tecnologias para producir ratones humanizados hicieron uso de : YACS : cromosomas artificiales de levaduras BACS: cromosomas artificiales de bacterias Las lineas transgenicas pueden ser creadas por inyeccin pronuclear de DNAs BACS O YACS y este dna ocupara posiciones cromosomicas al azar La ventaja de YACS Y BACS es su pequeo tamao hasta 300kb (BACS) Y pocas megabases para (YACS) Y este YAC puede ser transferido a ESCs por fusion de speroplastos de levadura que tienen el YAC seguida por la seleccin de 1 marker de resistencia a 1 droga (FIG 1 A) La produccion de un raton que solo exprese genes humanos ha sido lograda procreando lineas transgenicas con una linea que tiene alelos knock out (fig a)

TARGETED GENOMIC REPLACEMENT

Integracion direccionada de una secuencia humana en su region equivalente del genoma del raton es el metodo mas preciso de humanizacion. En un principio es posible generar ratones homozigotos humanizados entrecruzando ratones heterozigotos con el reemplazo humano Ahora reemplazos son posibles en los cuales un locus entero de raton incluyendo secuencias non coding upstream y downstream que son reemplazadas por secuencias humanas equivalentes usando constrictos de BACS Ahora hay 2 vias para lograr esta meta: Recombinacion homologa del vector BAC Recombinasa mediada por 1 intercambio casette y mediada por remplazo genomico

Recombinacion homologa del vector BAC

Reemplazos genomicos pueden ser logrados por 1 recombinacion homologa con hibrido vector BAC (FIG 1 B) Este vector esta ensamblado de clones BAC de humanos y ratones por tecnologia recombinante en E.Coli PARA CREAR 1 CONSTRICTO CON UNA LARGA REGION DE SECUENCIA HUMANA Y UN MARCADOR RESISTENTE A UNA DROGA INSERTADO ENTRE LARGAS REGIONES DE SECUENCIA GENOMICA DE RATON (mayor a 100kb) (fig 1b)

Como consecuencia de los brazos homologos de la secuencia de raton este vector direccionado resulta en una eficiente recombinacion homologa en ESCs La ventaja de este procedimiento es que puede ser insertado en ESCs no modificadas Y es esencialmente 1 procedimiento de 1 solo paso

Recombinasa mediada por 1 intercambio casette y mediada por remplazo genomico

La segunda aproximacion para la humanizacion por reemplazo es por el uso de SSR (sitios especificos de recombinacion) para alcanzar un eficiente intercambio de secuencias cromosomales con secuencias de un entrante plasmido o BAC Esto incluye una estrategia denominada RECOMBINACION POR MEDIO DE 1 INTERCAMBIO DE CASETTE (rmce) consiste en 2 pasos: 1 casette marker que es flanqueado por 1 sitio heteroespecifico SSR es integrado al genoma por recombinacion homologa siendo deleccionada la region que va a ser reemplazada Otro vector donador que lleva la secuencia humana que es flanqueada por el mismo sitio SSR es introducido en prescencia de 1 recombinasa resultando en la recombinacion de la secuencia humana en el genoma (FIGURA 1 C)

1.

2.

En este metodo los SSR son los barcodes del casette de deleccion y estas ayudan a integrar el gen humano al locus target para su reemplazamiento La ventaja de RMCE es que despues que el casette marker ha sido integrado en la deseada posicion del cromosoma, la resultante linea celular puede ser usada en ilimitadas rondas de intercambio casette

Realizando ingenieria a cromosomas humanos

Ratones humanizados cargando cromosomas humanos enteros han sido creados. En este caso se usaron cromosomas artificiales humanos (HACS) y fueron movidos a ratones por (MMCT) que es 1 metodo para transferir parte de 1 cromosoma de 1 donador a 1 receptor, esto creando ratones transcromosomales, y estos pueden transmitir el cromosoma humano durante dif generaciones (FIGURA 1 D) Los HACS son vectores no integrales que pueden ser creados para contener secuencias deseables y luego moverlas por MMCT a ESCs de ratones para crear ratones transcromosomales, este HAC es circular de 1-10bp, este HAT es mitoticamente estable y es mantenido como 1 cromosoma extra dejando al genoma del raton sin modificaciones En los 4 metodos una vez que el gen alterados se transfecta a (ESCs) Estas celulas se introducen a 1 blastocito de raton

Este blastocisto se implanta en una madre adoptiva Y esta madre adoptiva al dar a luz produce descendientes Quimera Estos ratones quimera se aparean con ratones normales Y la descendencia tiene el gen humanizado completamente

CONCLUSIONES
Los modelos de ratones humanizados son importantes para el desarrollo de terapias genicas A medida que las tecnologias necesarias para producir ratones humanizados progresa entonces es posible introducir grandes cantidades de material genetico humano en ratones y otras especies Algo para mencionar es que cuando 1 cromosoma humano es insertado en 1 ambiente perteneciente al organismo del raton, la secuencia de DNA humana dirige 1 patron de modificaciones de la cromatina mas parecida a la humana que a la del raton