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ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD FOSFOLIPASA Y PRODUCCIN DE BIOFILM COMO FACTORES DE VIRULENCIA EN CEPAS DE LEVADURAS PROVENIENTES DE MUESTRAS CLNICAS

Puigdomenech, G; Bulacio, L. Garca M. Laboratorio de Microbiologa Instituto Superior La Salle Rosario - Argentina germanpuigdomenech@hotmail.com

Resumen La incidencia de infecciones causadas por especies de Candida se ha incrementado en los ltimos aos. Entre los factores que confieren ms virulencia a estos organismos, las enzimas hidrolticas como fosfolipasas y proteasas juegan un papel importante, ya que actan en la invasin de los tejidos. Otro factor importante a considerar es la capacidad de formar biopelculas. Palabras clave: biofilm, candidiasis, fosfolipasas, virulencia Abstract The incidence of infections caused by Candida species has increased in recent years. Among the more virulence factors that confer to these organisms, hydrolytic enzymes such as phospholipases and proteases play an important role, since they act in the invasion of tissues. Another important factor to consider is the ability to form biofilms. Introduccin Candida sp. son organismos comensales de mucosa oral, intestino, etc. de individuos sanos. La colonizacin de este microorganismo, especialmente Candida albicans puede llevar a la infeccin sistmica cuando el husped tiene factores de riesgo como uso continuo de antibiticos de amplio espectro, esteroides u otros agentes inmunosupresores, diabetes mellitus, SIDA, depresin de las funciones fagocticas o alteraciones locales del sistema gastrointestinal, situaciones que pueden ocasionar candidiasis y hasta diseminacin hematgena 1. Tanto C. albicans como otras especies del gnero, es un microorganismo verstil por su capacidad de sobrevivir como comensal en varios sitios anatmicamente distintos (intestino, cavidad oral, vagina) siendo oportunista ante la mnima posibilidad. La limitacin de nutrientes, la competencia entre bacterias y hongos de la microbiota en la superficie de mucosas proporcionan una presin selectiva que ocasiona la eliminacin de aquellos microorganismos menos adaptados. Candida tiene atributos de virulencia para colonizar el husped ocasionando dao de forma directa, al activar, resistir o desviar mecanismos de defensa del hospedero. Los factores de virulencia expresados por el microorganismo para causar infeccin varan segn el tipo, sitio y naturaleza de las defensas del husped2. El frgil equilibrio entre el husped y el hongo patgeno deriva en una relacin parsita y resulta en enfermedad, a veces, grave. La interaccin entre el hongo y el medio ambiente est afectada por su variabilidad antignica, el cambio fenotpico y la transicin dimrfica. Existen diversos factores potenciales de virulencia como la morfologa celular, actividad enzimtica extracelular, cambio fenotpico y factores de adherencia (formacin de biopelculas). C. albicans es polimrfica que existe en forma de levadura (blastospora) o como filamentos (pseudohifa), la morfognesis se refiere a la transicin entre la forma levaduriformes y la forma de crecimiento filamentosa

del microorganismo. Esta conversin es esencial en cuanto a la virulencia de C. albicans y otras especies, atributo que capacita al microorganismo para invadir tejidos. Se ha comprobado que el crecimiento de la forma filamentosa tiene ventajas sobre la levadura en la penetracin de la clula o tejido, y aunque la hifa puede ser idnea para atravesar barreras tisulares, la secrecin de enzimas capaces e degradar protenas, lpidos y otros componentes celulares, est facilita su infiltracin en sustratos slidos y tejidos3. En general, las levaduras predominan durante la colonizacin de la mucosa en el husped sano pero la hifa emerge cuando las defensas de ste declinan, por lo tanto, ambas formas de crecimiento podran desempear un papel importante en la patognesis y encontrarse en varios microambientes diferentes en el husped4. Existen hallazgos que sustentan la hiptesis de que la filamentizacin es uno de los factores de virulencia del hongo: la formacin de filamentos a 37C en suero humano o de conejo a pH neutro, los filamentos recin formados (tubos germinales) son ms adherentes a clulas mamferas que las levaduras, y la adherencia en el requisito para la penetracin celular, y por ltimo, las levaduras capturadas por macrfagos producen filamentos y son capaces de lisar a stos, por lo tanto la formacin de filamentos es una forma de evadir los mecanismos de defensa del husped5-6. En cuanto a las enzimas, se proponen a stas como determinantes de virulencia en Candida ya que tienen la capacidad de romper polmeros que proporcionan nutrientes accesibles para el crecimiento de l hongo. Las principales enzimas extracelulares relacionadas con la patognesis en Candida son proteasas, fosfolipasas y lipasas. Se han descrito varios miembros de una familia de enzimas de secrecin asprtico proteinasa (SAP) muy estudiadas en este hongo, en particular, las aspartil proteinasas (Saps) codificadas por genes de la familia SAP. Las protenas que compren esta familia no se limitan slo a C. albicans sino tambin a C. dubliniensis, C. tropicalis y C. parapsilosis. Otras enzimas hidrolticas secretadas son las fosfolipasas, relacionadas con la patologa causada por C. albicans. Se ha demostrado cuatro tipos de fosfolipasas (PLA, PLB, PLC y PLD) de las cuales slo PLB ja demostrado ser necesaria para la virulencia del hongo a fin de llevar a cabo una candidiasis, la que se secreta y detecta en la punta de la hifa durante la invasin en tejidos7. Las lipasas secretadas por Candida se codifican por una familia de genes con al menos diez miembros (LIP1-LIP10). El patrn de expresin se ha investigado en infeccines experimentales y en pacientes con candidiasis oral8. En cuanto a la formacin de biopelculas (biofilm) las especies de Candida se reconocen como los principales agentes de infecciones adquiridas en el hospital. Son el tercer o cuarto patgeno aislado en sangre, sobrepasa la frecuencia de los bacilos gramnegativos. Los dispositivos como catteres intravasculares o urinarios y tubos endotraqueales como as tambin los sistemas de respiracin mecnica se asocian con infecciones detectndose la formacin de biopelculas en su superficie 9. Otros dispositivos como vlvulas cardacas, marcapasos y reemplazos de articulaciones (cadera y rodilla) son susceptibles de infeccin por Candida. La mayor capacidad de C. albicans para formar biopelculas en superficies es la razn por la que esta especie es ms patognica que las que son menos capaces de formar estas estructuras, como es el caso de C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis. La formacin de biofilm se distingue por adhesin inicial de las clulas de levaduras seguida por la germinacin y formacin de microcolonias, filamentizacin, desarrollo, formacin e monocapa, proliferacin y maduracin: esta formacin de biopelculas se lleva a cabo en tres fases, temprana (de 0 a 11 horas), intermedia (de 12 a 30 horas), y por ltimo la fase madura (de 38 a 72 horas). La estructura detallada del biofilm despus de las 72 horas de incubacin consiste en una densa red de levaduras, hifas y pseudohifa, esta mezcla sumada al material matriz en medio lquido10-11. Objetivo El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de secrecin de fosfolipasas y produccin de biofilm por parte de levaduras del gnero Candida recuperadas de pacientes con candidiasis oral. Material y mtodo Se analizaron 93 cepas provenientes de pacientes: 48 de Candida albicans, 16 de C. parapsilosis, 7 de C. krusei, 5 de C. dubliniensis, y 17 de C. tropicalis, identificadas por mtodos de rutina.

La deteccin de actividad Fosfolipasa de evalu mediante el cultivo en placas de Agar Sabouraud y Agar Extracto de Malta suplementados 8% con yema de huevo, cultivo a 37C durante cinco das. Luego se determin el ndice Pz que es la relacin entre el dimetro de la colonia y el dimetro de la colonia ms halo de precipitacin. La produccin de biofilm se evalu por incubacin de cada una de las cepas en caldo Sabouraud 2% a 30C durante 72 horas, utilizando tubos Eppendorf, seguida de coloracin con solucin de cristal violeta y lectura de absorbancia a 530 nm.

Fosfolipasa de cepas de Candida en agar Extracto de Malta suplementado con yema de huevo

Cultivos de levaduras en Caldo Sabouraud 2%

Produccin de biofilm

Resultados En cuanto a la actividad Fosfolipasa, 35 cepas de C. albicans, 1 de C. dubliniensis, 6 de C. krusei, 14 de C. tropicalis y 4 de C. parapsilosis mostraron ndice [Pz] menor a 0,69; por otro lado 5 cepas de C. albicans, 1 de C. dubliniensis, 2 de C. tropicalis, 1 de C. parapsilosis, arrojaron Pz entre 0,7-0,8, mientras que 5 cepas de C. albicans, 1 cepa de C. dubliniensis y 1 de C. parapsilosis, Pz entre 0,81-0,9. El resto de las cepas no presentaron actividad enzimtica (Pz =1). Con respecto a la produccin de biofilm: resultaron fuertes productoras de biofilm 7 cepas de C. albicans, 6 de C. parapsilosis, 3 de C. krusei y 11 de C. tropicalis, en tanto que fueron productoras dbiles 7 cepas de C. albicans, 8 de C. parapsilosis y 3 cepas de C. tropicalis. El resto de las cepas estudiadas no produjeron biopelculas. El punto de corte establecido para la formacin de biopelcula fue: lectura de 0-0.12 negativo; de 0.13 a 0.24 produccin dbil y mayor a 0.24 fuerte productor de biopelcula.

Discusin Las candidiasis se desarrollan cuando ocurre un desequilibrio en la relacin hospedero-parsito que favorezca al hongo y le permita invadir tejidos ms a ll de las mucosas donde habita en forma comensal. El factor de virulencia ms eficiente en la penetracin de tejidos es la produccin de hifas, por esta razn, la capacidad de producir tubo germinativo, y por lo tanto, desarrollar micelio se considera uno de los factores de virulencia ms importante de este hongo. En la prctica, sta caracterstica es muy til en el diagnstico microbiolgico de esta micosis ya que el hallazgo de hifas en el examen directo es sugestivo de infeccin. Tanto la produccin de biofilm y la secrecin de enzimas hidrolticas facilitan la adherencia y posterior invasin de los tejidos del hospedero por parte de las levaduras. Es sumamente importante detectar estas caractersticas a los efectos de establecer estrategias para evitar la diseminacin, instaurando tratamientos efectivos y precoces. Referencias Zernotti ME, Villegas NA, Revol MR, Baena Cagnani CE, Arce Miranda JE, Paredes ME, Paraje MG: Evidence of Bacterial Biofilms in Nasal Polypsis. J Investig Allergol Clin Immunol 2010; Vol. 20(5): 380-385 Ortolan Rrig KC, Colacite J, Abegg MA: Produccin de factores de virulencia in vitro especies patgenas del gnero Candida. Rev. Soc. Bras. Trop. Vol. 42(2) 2009 Pardi G: Determinantes de patogenicidad de Candida albicans. Acta Odontolgica Venezolana. Vol. 40(2). 2002 Panizo MM, Revikina V, Flores Y, Montes W, Gnzales G: Actividad de fosfolipasas y proteasas en aislados clnicos de Candida sp. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiologa. Vol. 25(2) 2005 Castrilln Rivera L, Palma Ramos A, Padilla Desgarennes C: Factores de virulencia en Candida sp. Dermatologa Rev Mex. Vol. 49: 12-27