Utilizacion de Señales Fluorescentes para El Analisis y Caracterizacion de Vinos

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DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
TESIS DOCTORAL MENCIN DOCTOR EUROPEO
UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL ANLISIS Y CARACTERIZACIN DE VINOS. MEJORA DE LA SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE DERIVATIZACIN FOTOQUMICA
USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS AND CLASSIFICATION OF WINES. IMPROVEMENT OF SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION
Diego Airado Rodrguez Badajoz, 2008
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Edita: Universidad de Extremadura Servicio de Publicaciones

Caldereros 2. Planta 3 Cceres 10071 Correo e.: publicac@unex.es http://www.unex.es/publicaciones
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UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL ANLISIS Y CARACTERIZACIN DE VINOS. MEJORA DE LA SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE DERIVATIZACIN FOTOQUMICA USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS AND CLASSIFICATION OF WINES. IMPROVEMENT OF SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION por Diego Airado Rodrguez VISADO en Badajoz a 30 de Abril de 2008
Dra. D Teresa Galeano Daz Profesora Titular Dpto. de Qumica Analtica Facultad de Ciencias Universidad de Extremadura
Dra. D Isabel Durn Martn-Mers Profesora Titular Dpto. de Qumica Analtica Facultad de Ciencias Universidad de Extremadura
Memoria de Investigacin presentada para optar al Grado de Doctor Europeo, dentro del Programa de Doctorado Ciencias Qumicas, Bienio 2004-2006, y realizada en el Departamento de Qumica Analtica de la Universidad de Extremadura.
Fdo.: Diego Airado Rodrguez
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DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
Campus Universitario Avda. de Elvas, s/n 06071-BADAJOZ (ESPAA) Telfono (+34 924) 28.93.00 y 28.93.75 FAX (+34 924) 28.93.75
ARSENIO MUOZ DE LA PEA CASTRILLO, Catedrtico y Director del Departamento de Qumica Analtica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Extremadura I N F O R M A: Que el trabajo que se presenta en esta TESIS DOCTORAL, con el ttulo de "UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL ANLISIS Y CARACTERIZACIN DE VINOS. MEJORA DE LA SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE DERIVATIZACIN FOTOQUMICA", ha sido realizado bajo la direccin de las Dras. D Teresa Galeano Daz y D Isabel Durn Martn-Mers, en el Departamento de Qumica Analtica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Extremadura y rene todos los requisitos para poder optar al Grado de Doctor Europeo en Ciencias Qumicas.
Badajoz, 30 de Abril de 2008
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OBJETO DE LA TESIS DOCTORAL El objeto de esta Memoria de Investigacin es doble: Por una parte se centra en el desarrollo de nuevos mtodos analticos para la determinacin en vino de resveratrol y sus derivados, compuestos con importantes implicaciones en la salud humana y que han despertado un gran inters en la sociedad en los ltimos aos. Se pretende mejorar los mtodos anteriormente propuestos para la determinacin de estos compuestos, fundamentalmente en lo referido a su sensibilidad, rapidez y sencillez. Para ello nos basaremos en la fotorreaccin que sufren estos compuestos estilbenoides, la cual, probablemente es una reaccin de ciclacin en la cual se originan derivados del fenantreno, molcula altamente fluorescente. Otro objetivo de este trabajo es aportar nuevas metodologas para facilitar la tipificacin de muestras de vino y la deteccin de fraude en la industria del vino, para lo que se pretende hacer uso de seales fluorescentes de tres vas, en combinacin con herramientas quimiomtricas.
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DOCTORAL THESIS OBJECTIVE The purposes of this Report of Investigation are: On the one hand, the development of new analytical methods for the determination of resveratrol derivatives in wine samples. It has been demonstrated that these compounds have beneficial effects on human health, and a great interest has been aroused in society in recent years. The main objective is improving the previously proposed methods for the analysis of these compounds, in terms of sensitivity, speed and simplicity. For that, we will use the photoreaction that stilbenoids compounds suffer, which is probably a cyclation reaction in which phenanthrene derivatives are originated. On the other hand, new methodologies for wine classifications and fraud detection will be developed. Threeway fluorescence signals will be used, in combination with chemometric tools.
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NDICE CAPTULO I: Introduccin Parte I: Resveratrol. El Compuesto3 Resveratrol en vino...10 Efectos biolgicos de resveratrol14 Los compuestos fenlicos de la uva..18 Parte II: Antecedentes bibliogrficos para el anlisis de resveratrol........................28 Aparatos, reactivos y software utilizados en este trabajo de investigacin...55 Captulo II: Determinacin de resveratrol en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada y extraccin lquido-lquido ANTECEDENTES...73 RESULTADOS Y DISCUSIN Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-resveratrol...76 Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrol....87 Estudio extracto-espectrofluorimtrico de trans-resveratrol. Aplicacin al anlisis de muestras de vino.98 Perspectivas de futuro..109
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Captulo III: Anlisis de piceido en vinos mediante fluorescencia fotoinducida aplicando segunda-derivada a los espectros de emisin ANTECEDENTES.113 RESULTADOS Y DISCUSIN Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-piceido...115 Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-piceido.......124 Estudio extracto-espectrofluorimtrico de trans-piceido. Aplicacin al anlisis de muestras de vino...135 Perspectivas de futuro..149 Captulo IV: Determinacin de resveratrol y piceido totales en vino, sin tratamiento previo, mediante derivatizacin fotoqumica off line-HPLC ANTECEDENTES.153 RESULTADOS Y DISCUSIN Estudios fluorescentes previos...156 Estudios cromatogrficos previos..158 Optimizacin quimiomtrica de la composicin de la fase mvil para el anlisis de vino..165 Determinacin de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino..171 Perspectivas de futuro..177
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Captulo V: Anlisis de los ismeros de resveratrol y piceido en vinos mediante HPLC isocrtica, con deteccin fluorescente previa derivatizacin post-columna en lnea ANTECEDENTES.181 RESULTADOS Y DISCUSIN Estudios fluorescentes previos...186 Estudios cromatogrficos previos..187 Optimizacin quimiomtrica de las condiciones cromatogrficas para el anlisis isocrtico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino.190 Foto-isomera cis-trans. Evidencia de la presencia de cis-ismeros de resveratrol y piceido en vinos.205 Aplicacin: Anlisis de los ismeros de resveratrol y piceido en vinos...219 Captulo VI: Utilizacin de seales fluorescentes de tres vas (matrices de excitacin-emisin) para caracterizacin de vinos ANTECEDENTES.229 RESULTADOS Y DISCUSIN Muestras de vino incluidas en el modelo..235 Matrices de excitacin-emisin de fluorescencia.237 Construccin del modelo PARAFAC.242 Anlisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-score..249 Identificacin de los fluorforos presentes en vino..258 Utilizacin de las seales de autofluorescencia total del vino en combinacin con herramientas quimiomtricas para asegurar la pertenencia del vino a una DO.267 Perspectivas de futuro..273
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Captulo VII: Anlisis de resveratrol en vinos tintos mediante voltamperometra de redisolucin adsortiva de onda cuadrada ANTECEDENTES.277 RESULTADOS Y DISCUSIN Puesta a punto del procedimiento.....281 Parmetros analticos de calidad...304 Anlisis de trans-resveratrol en muestras de vino..306 Seguimiento cromatogrfico de las etapas de limpieza.311 Perspectivas de futuro..312
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CAPTULO I INTRODUCCIN
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CAPTULO I. Introduccin
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PARTE I: RESVERATOL. EL COMPUESTO Se conocen hasta 30 estilbenoides y estilben-glucsidos, que se encuentran naturalmente en diversas especies del reino vegetal, dentro de las espermatofitas1. Como su propio nombre indica, el esqueleto estructural de todos ellos consta de un puente vinlico, que sirve de unin a dos anillos aromticos (esqueleto estilbenoide). A partir de esta estructura qumica, relativamente sencilla, la naturaleza ha sido capaz de crear una gran variedad de compuestos, variando entre ellos tanto el nmero como la posicin de grupos hidroxilos, la extensin en que dichos grupos hidroxilos se encuentran a su vez sustituidos por azcares, por grupos metilo, metoxi u otros residuos y la configuracin estrica de molculas qumicamente idnticas. Otra causa de variacin que aumenta mucho ms el nmero de sustancias integrantes de esta familia es su habilidad para existir como dmeros, trmeros o polmeros mayores. Uno de los compuestos ms conocidos dentro de este grupo de estilbenoides es la molcula en la que se centra gran parte del trabajo que se describe en esta memoria, el resveratrol, 3,4,5-trihidroxiestilbeno, cuya frmula estructural es la siguiente:
OH HO
4' 3
OH
Figura 1.- Frmula estructural de trans-resveratrol
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Respecto al origen del nombre resveratrol, el profesor Yutaka Ebizuka, de la Universidad de Tokio, propone lo siguiente2:
res: puede estar relacionado con la clase de molculas a las que pertenece el resveratrol: los resorcinoles veratr: abreviatura del nombre de la planta Veratrum grandiflorum, en la que se encontr resveratrol por primera vez en 1940. ol: indicativo de la presencia de grupos hidroxilo.
La sntesis de resveratrol en el laboratorio, puede llevarse a cabo a travs de una reaccin de Witting, uniendo dos anillos fenlicos, apropiadamente sustituidos, a travs de un doble enlace de estireno, como describen inicialmente Moreno-Maas y Pleixats3. Cuando la sntesis se lleva a cabo mediante esta ruta, se parte de precursores metilados, para proteger los grupos hidroxilos, los cuales son posteriormente liberados mediante tribromuro de boro. El producto final de esta ruta sinttica es el trans-resveratrol, que es el nico ismero del resveratrol que existe en la naturaleza y el nico que se comercializa (Sigma-Aldrich). Como ocurre con otros estilbenoides, el trans-resveratrol se produce de forma natural en un amplio nmero de familias vegetales, encontrndose en 72 especies vegetales (distribuidas en 31 gneros y 12 familias) y est ampliamente distribuido tanto en gimnospermas como en dicotiledneas1, algunas de las cuales constituyen productos empleados en la dieta humana, como los cacahuetes o las moras. El resveratrol es identificado en 1940 por primera vez en la raz del elboro blanco (Veratrum Grandiflurum O. Loes), y despus en las races secas de la planta Poligonum Cuspidatum, llamada Ko-jo-kon en japons, siendo sta una de las fuentes ms ricas de resveratrol. La planta es ampliamente empleada en la
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medicina tradicional china y japonesa en el tratamiento de enfermedades tales como dermatitis supurativa, gonorrea, tia favosa, pie de atleta ehiperlipidemia4-7. En 19768 se descubri la existencia de este compuesto en la vid, Vitis vinifera. El trans-resveratrol es una fitoalexina producida en las plantas, a nivel celular y para tratar de ubicar dicha molcula, debe considerarse en primer lugar cmo y por qu se genera. El metabolismo celular de las plantas puede definirse a travs de la suma de todas las reacciones enzimticas que tienen lugar en la clula, pudindose diferenciar dos fases claramente diferenciadas: la fase en la que intervienen todos los procesos degradativos y que es conocida como catabolismo, y la fase constructiva o biosinttica del metabolismo conocida como anabolismo. Bajo este punto de vista, puede decirse que el trans-resveratrol es un anabolito, ya que esta molcula se genera en las clulas de las plantas, con el objetivo de cumplir una misin especfica: ser un pesticida natural, a travs del cual y junto con otros anabolitos, la plata se defiende de agresiones externas. Cuando una planta es infectada por un agente patgeno, la primera respuesta est localizada en las clulas con las que dicho agente entra en contacto directo. Estas clulas reconocen la estructura del patgeno, o alguna de las molculas fundamentales para el desarrollo de su actividad, siendo la respuesta primaria ms frecuente de la planta la reaccin por necrosis, en la que las clulas infectadas por el agente patgeno mueren, fenmeno conocido como muerte celular programada (PCD). Adems, estas clulas, directamente afectadas por el
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patgeno, producen una serie de molculas que alertan a las clulas adyacentes de la infeccin, y que reciben el nombre de molculas elicitadoras9, desarrollndose en dichas clulas adyacentes la conocida como respuesta secundaria, al reconocer a las molculas elicitadoras producidas en la interaccin primaria. Estas vas de defensa implican que las clulas de las plantas poseen sistemas permanentes de vigilancia, capaces de detectar los estmulos generados por el agente patgeno, elicitando de este modo la respuesta defensiva en la planta10. El tercer tipo de respuesta defensiva es inducida hormonalmente en la planta11, y es a travs de la cual la planta forma compuestos conocidos como fitoalexinas, que tratarn de frenar la actividad patgena. Muchas plantas producen metabolitos secundarios (no implicados en las reacciones metablicas vitales para la planta) con funciones antifngicas. Estos compuestos antifngicos pueden encontrarse en plantas saludables que no han sufrido infeccin patgena alguna, actuando como mecanismo de barrera frente a las mismas y recibiendo en este caso el nombre de fitoancipinas. Se reserva la denominacin de fitoalexinas para los metabolitos secundarios antifngicos que son sintetizados en respuesta al ataque patgeno, con el fin de cesar su invasin12. En general, las fitoalexinas pueden definirse como molculas antimicrobianas de bajo peso molecular, acumuladas en las plantas como resultado de una infeccin patgena o tras haber sido sometidas a condiciones de estrs13. Entre los efectos desencadenantes de la produccin de trans-resveratrol en plantas, se pueden citar los siguientes: Infecciones fngicas como la Botrytis Cinerea14, la Plasmopara Vitcola15, la Phomopsis Vitcola16 o la Rhizopus Stonifer17. Dao de la planta Tratamiento con sales como tricloruro de aluminio18.
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Tratamiento con ozono19. Radiacin Ultravioleta Como se ve en la Figura 2, los precursores inmediatos de resveratrol son el p-cumaril-CoA y el malonil-CoA, en una relacin molar de 1:3.
Figura 2.- Ruta biosinttica desde p-cumaril-CoA hasta resveratrol
El p-cumaril-CoA se genera a partir de la fenilalanina, la cual, en las plantas, es sintetizada a partir de azcares mediante la ruta del cido shikmico20: en primer lugar se produce la prdida del grupo amino de la fenilalanina mediante deaminacin oxidativa, catalizada por la enzima especfica fenilalanina-amonioliasa, dando lugar a cido cinmico, el cual es hidroxilado a cido p-cumrico por
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accin de la enzima cinamato-4-hidroxilasa, y finalmente transformado en pcumaril-CoA, por accin de una CoA-ligasa. Sobre este sustrato, pueden entrar en accin dos enzimas clave: la calcona-sintasa (CHS) o la estilbeno-sintasa (STS). En ambos casos, tal y como se indica en la ruta biosinttica representada en la Figura 2 (las tres condensaciones son las marcadas en color), se produce la condensacin de p-cumaril-CoA con tres molculas de malonil-CoA, dando lugar a una tetracetona. Hasta este punto, ambas enzimas actan de manera idntica. A continuacin se produce la ciclacin de la tetracetona lineal, y es precisamente la manera en la que esta ciclacin se lleva a cabo la principal diferencia entre ambas enzimas. En el caso de la CHS, se liberan 3 molculas de CO2 en el proceso, y el producto final de esta ruta es la calcona, el cual es el precursor comn de la familia de los flavonoides, familia a la que pertenece la quercetina. Cuando la enzima que acta es la STS, el producto final de la reaccin es el trans-resveratrol, liberndose cuatro moles de CO2, por mol de resveratrol formado. La mayora de las especies de la familia Vitaceae poseen ambos enzimas. Como dato curioso puede citarse el siguiente: Hain et al21 aslan el gen de la STS de la vid, y lo transfirieron al tabaco, encontrando que las plantas de tabaco transgnicas resultantes son mucho ms resistentes a la infeccin por Botrytis cinerea. Las fitoalexinas, dado su carcter antifngico, son candidatos idneos para ser utilizados como pesticidas naturales. Dichos pesticidas naturales se plantean como una buena alternativa a los sintticos, teniendo en cuenta la inmunidad desarrollada por ciertas especies patgenas, la toxicidad y los grandes tiempos necesarios para la degradacin de estos ltimos.
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El tratamiento post-cosecha de la uva con luz ultravioleta (concretamente UVC) produce un estrs en la uva que hace que sta, en respuesta a dicho dao, induzca la sntesis de resveratrol. Esta misma tecnologa se est aplicando actualmente a uvas de mesa y a uvas de vinificacin para obtener nuevas frutas funcionales22, 23 y vinos enriquecidos en resveratrol24. Las fuentes de resveratrol en la naturaleza no son muchas, y menos an las plantas y vegetales de consumo humano conteniendo este compuesto. En la Figura 3 se representan las fuentes naturales ms importantes de aporte de resveratrol y no existe duda acerca de que las fuentes que ms aportan a la dieta humana son los productos derivados de la vid, esto es, la uva y el vino25.
Figura 3.- Fuentes de resveratrol en la naturaleza
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En la uva, los mayores niveles de resveratrol se encuentran en las pieles, estando prcticamente ausente en la pulpa y en las pepitas del fruto26. Otras fuentes de resveratrol son: el cacahuete27, Hordeum, Poa, Stipa, y Lolium spp.) Respecto a la existencia de este compuesto en rboles, merece la pena destacar su presencia en eucalipto, pcea y pino, as como en el rbol tropical de hoja caduca Bauhinia racemosa. Son pocas las plantas florales en las que se encuentra resveratrol. Las dos nicas que se conocen son la ya mencionada Veratrum Grandiflurum, en la que se encuentran altas concentraciones de resveratrol en las hojas cuando la planta es daada por tratamiento con agentes qumicos30, y la Veratrum formosanum, cuya raz y rizomas son relativamente ricos en resveratrol, tanto que ha sido empleada en Oriente como tratamiento alternativo para la hipertensin31. Tambin est descrita la presencia de resveratrol en Pterolobium hexapetallum, una legumbre no comestible32. Recientemente, Counet et al33 describen la presencia de trans-resveratrol y trans-piceido, por primera vez, en chocolate negro (al menos 0.4 gmL-1 de transresveratrol y 1.0 gmL-1 de trans-piceido) y licor de cacao (al menos 0.5 gmL-1 de trans-resveratrol y 1.2 gmL-1 de trans-piceido).
28,
los arndanos29, la Reynoutria
Japonica, las moras y en especies herbceas (Poaceae incluyendo Festuca,
Resveratrol en vino La identificacin de resveratol en vinos es relativamente reciente y data de 1992, ao en que el ismero trans es identificado por Siemman y Creasy34. Estos
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autores llevan a cabo la cuantificacin de este compuesto en vinos tintos y blancos, encontrando que las concentraciones varan entre 0.66 gmL1 y 0.68 ngmL1, en vinos tintos y desde 100 ngmL1 a menos de 0.23 ngmL1, para vinos blancos. Justifican los menores niveles encontrados en vinos blancos en base al hecho de que, en la uva, el resveratrol se encuentra en las pieles y no en la pulpa, y el proceso de elaboracin del vino blanco implica un prensado ms ligero del fruto y un menor tiempo de contacto entre el mosto y los hollejos. Se pone de manifiesto en este primer trabajo una gran variabilidad en el contenido de resveratrol en vino, y su dependencia de factores tales como la casta de la uva, el origen geogrfico, la cosecha y las tcnicas de vinificacin. Entre las variables que ms influyen en el contenido de los cuatro compuestos en vino, adems de las ya mencionadas, se ha encontrado que son muy importantes ciertos aspectos de las tcnicas de vinificacin, como por ejemplo la maceracin con hollejos35. Un ao ms tarde, Jeandet et al36, describen la presencia del ismero cis en vino. En 1994, Waterhouse y Lamuela-Ravents37 publican la existencia de resveratrol-3--D-glucsido (piceido) en uvas. Ese mismo ao Roggero y Archier38, basndose en su espectro de absorcin en el ultravioleta, describen la existencia de un glucsido indefinido del resveratrol en vino. Posteriormente, en el ao 1995, Lamuela-Ravents et al39 identifican este glucsido en vino tinto como piceido, utilizando un estndar de piceido extrado de la raz del Poligonum Cuspidatum, y proponen un mtodo para el anlisis de los ismeros trans y cis del glucsido y la aglicona (Figura 4) en vino.
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HO OH HO
OH HO
OH
trans - Resveratrol cis -Resveratrol
H H H HO H O O
HO OH OH HO H OH
H OH
H H H O HO OH H O
HO
OH
OH
trans-Piceido
cis-Piceido
Figura 4.- Estructuras qumicas de las formas de resveratrol objeto de esta tesis
Los mismos autores40 proponen en 1996 un mtodo para la cuantificacin de los cuatro analitos en vinos blancos y rosados, siendo en este caso necesario una etapa de preconcentracin, dados los menores niveles encontrados en estos vinos. Fremot, en el ao 2000 publica un trabajo de recopilacin donde se recogen las cantidades de resveratol y/o piceido encontradas en vinos de diferentes pases y en distintos tipos de vino. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
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Tabla 1.- Concentraciones de resveratrol y/o piceido en vinos tinto41
Origen USA Francia Francia (Burgundy) USA (California) Comparacin entre vinos de Norte Amrica, Australia y Europa USA (California) Francia Francia USA (California) Espaa
Concentracin de Resveratrol (g.mL-1) (1) Chardonnay, hasta 0.1 Los vinos de California presentan concentraciones ms bajas que los de New York Burdeaux, entre 0.3 - 0.6 Pinot noir, entre 0.4 - 2 Pinot noir, entre 0.2 - 0.7 Cabernet Sauvignon, < 0.09 Todos contienen entre 0.1 - 12 Los procedentes de California, Australia e Italia presentan concentraciones ms bajas que los de Oregn, Canad y Francia < 0.02-1.7 (mximas concentraciones en Pinot noir, 5) Beaujolais (Gamay), entre 3.2 - 3.6 Resveratrol: 0.5 - 5; piceido: 0 - 14.5 Vinos procedentes de uvas Cabernet franc, Gamay y Grenache presentan concentraciones menores que los procedentes de Pinot noir, Mourvdre y Cabernet Sauvignon Ismeros del resveratrol entre 0.3 3 Resveratrol total (aglicona+glucsido) entre 2.5 - 13.8 (trans>cis). Cantidades totales segn el tipo de uva : Pinot noir, 5.1; Merlot, 4; Grenache, 2.4; Cabernet Sauvignon, 1.4; Tempranillo, 1.3 Ismeros de la aglicona (trans>cis), Contenido medio segn pas: Francia, 3.7 - 7.1; Italia, 1.2; Espaa, Portugal, 2.8; Europa central, 3.1; Suiza, 6.9.
Ref 34 36
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43
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44
38
39
Europa
(1)
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concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa
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Tabla 1.- Concentraciones de resveratrol y/o piceido en vinos tinto (continuacin)
Origen Amrica Comparacin entre vinos de Italia USA (Sureste) Japn USA (California)
(1)
Concentracin de Resveratrol (g.mL-1) (1) Contenido medio segn el origen: Amrica del Sur, 1.8 < California, 3 < Oregon, 6.3 Reccioto y Amarone (area de Verona), entre 0.05 - 0.8 Ismeros de la aglicona, 0.1-42, concentraciones mximas en Muscadine: trans, hasta 13.4; cis hasta 31.9 Presencia de Tetrahidroxiestilbeno. Estilbenos totales, 0.8-13.4; aglicona (media 1.8, trans > cis), piceido (media 2.5, cis > trans); concentraciones mximas en los tipos de uva Pinot Noir y Merlot. Contenido segn el tipo de uva : Cabernet Sauvignon, 0.4-2; Pinot noir, 1.2; Merlot, 3.5
Ref 45 25
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concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa
Debido a la generalmente alta razn entre las concentraciones de trans a cis ismeros encontradas en vino, se sugiere que el nico ismero sintetizado en la uva es el trans, proviniendo el cis de la exposicin a la luz del mosto durante el proceso de elaboracin del vino, o del vino durante el almacenamiento39. Efectos biolgicos de resveratrol Ya se ha comentado el carcter antifngico de las fitoalexinas. No obstante, debe tenerse en cuenta que un compuesto natural no tiene por que estar exento de riesgos toxicolgicos para el ser humano, ya que los mayores venenos son productos naturales producidos por plantas o animales. Sin embargo, en el caso concreto de algunas fitoalexinas, como el trans-resveratrol no slo se ha demostrado la ausencia de dicho carcter txico, sino que adems presenta grandes beneficios para la salud.
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Este compuesto, como otros polifenoles, es un antioxidante muy efectivo por derecho propio, por lo que ha atrado la atencin particular como solucin potencial a la denominada paradoja francesa. Este es el trmino usado para describir el fenmeno, que ha sido por mucho tiempo un rompecabezas para la ciencia mdica, de que los ndices de la enfermedad cardiovascular en Francia son muy bajos con respecto al resto del mundo desarrollado, a pesar del elevado consumo de grasa animal y colesterol, y un hbito firmemente atrincherado del tabaco. Por supuesto Francia tambin goza de muchas de las ventajas de la dieta mediterrnea, pero hay buenas razones para pensar que es el consumo de vino tinto, y en gran medida el resveratrol contenido en ste, el que puede ser la explicacin verdadera de la paradoja evidente. "La paradoja francesa" y "el resveratrol" han abierto las puertas a nuevas investigaciones, pero no se puede olvidar que las bondades del vino ya las prescribi Hipcrates, padre de la medicina moderna, quien afirmaba que "el vino es cosa admirablemente apropiada al hombre, tanto en el estado de salud como en el de enfermedad, si se le administra oportunamente y con justa medida, segn la constitucin individual". El resveratrol contribuye al efecto cardioprotectivo del vino tinto, ya que este compuesto ha demostrado inhibir la oxidacin del LDL, la peroxidacin de lpidos, la agregacin plaquetaria, y la sntesis de eicosanoides49, etapa inicial de la patognesis de la arteriosclerosis. Actualmente se estn realizando numerosos estudios sobre las propiedades del resveratrol, de los cuales se le han atribuido diversas propiedades in vitro e in vivo como son:
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Proteccin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL) frente a la oxidacin50-52. Inhibicin de la agregacin plaquetaria y la sntesis de eicosanoides31, 53. Proteccin del hgado de peroxidacin de lpidos54. Estudios recientes en ratones han demostrado que ratones obesos cuya dieta estaba suplementada con resveratrol no slo son ms longevos, sino adems ms activos, presentando en menor medida los efectos negativos de una dieta hipercalrica55. Reduccin de la muerte celular por estrs oxidativo56. Propiedades antiinflamatorias debido a su efecto inhibidor sobre la ciclooxigenasa57. Regulacin del metabolismo de los lpidos34. Proteccin cardiovascular como fitoestrgeno. Efectos citoprotectores sobre el rin58. Propiedades anticancergenas, puesto que inhibe la actividad de la enzima protein-tirosina kinasa, enzima implicada en la alteracin de las clulas tumorales59, 60. Previene enfermedades como el Parkinson y el Alzheimer. An no se han estudiado con profundidad las acciones benficas del resveratrol en funcin de la dosis y no se sabe si los efectos observados in vitro e in vivo se pueden extrapolar al ser humano. En los estudios en animales y en los limitados estudios en humanos, se ha observado que el resveratrol se absorbe en el aparato gastrointestinal. Sin embargo, la eficacia de su absorcin, as como su distribucin, metabolismo y excrecin, no est bien definida. Hasta la fecha, son escasos los estudios que se han realizado sobre el metabolismo del resveratrol en humanos, si bien se ha puesto de manifiesto recientemente que el resveratrol se
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metaboliza en el hgado para producir metabolitos resveratrol-glucurnido y resveratrol-sulfato52. Actualmente, el resveratrol se comercializa para la investigacin mdica; adems, tambin est disponible como complemento nutricional (no como un agente teraputico) en forma de extracto seco purificado cuya fuente principal son las uvas tintas. En cuanto a las precauciones de uso, se desaconseja para las personas que padecen trastornos mentales y hepticos graves y en mujeres embarazadas y en periodo de lactancia, adems es un producto reservado a los adultos. El ismero cis y los ismeros trans y cis del piceido son fisiolgicamente tan importantes como el trans-resveratrol. cis-Resveratrol posee una actividad similar a la del ismero trans inhibiendo a la enzima protein-tirosina kinasa61 y la agregacin plaquetaria62. Los ismeros de piceido tienen propiedades similares a los de resveratrol inhibiendo la agregacin plaquetaria31 y la oxidacin del LDL en humanos63. Por otra parte, de una manera menos activa que el trans-resveratrol, el trans-piceido reduce la elevacin de los niveles lipdicos64 e inhibe la sntesis de eicosanoides53. En los estudios llevados a cabo con Poligonum Cuspidatum, se ha comprobado que la actividad biolgica de piceido es bastante diferente que la de la aglicona, no obstante, el tracto digestivo humano tiene actividad glucosidasa65, de manera que es probable la liberacin de la aglicona a partir del glucsido durante la digestin.
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Los compuestos fenlicos de la uva Dado que la gran mayora de los mtodos que se ponen a punto en este trabajo estn basados en fluorescencia molecular, y muchos de los integrantes de este grupo de sustancias presentan fluorescencia nativa o fotoinducida, el ltimo apartado de esta introduccin general se dedica a la descripcin del grupo de los compuestos fenlicos en vino, en el cual se engloba el resveratrol. No obstante, aparte de los compuestos fenlicos, merece la pena nombrar tambin como potenciales fluorforos del vino los aminocidos fluorescentes triptfano, tirosina y fenilalanina, as como algunas vitaminas. Los constituyentes fenlicos revisten una gran importancia en enologa debido al papel que juegan directa o indirectamente sobre la calidad de los vinos. En efecto, son el origen del color y de la astringencia, siendo atribuida esta ltima en particular a la presencia de taninos. Adems, segn su naturaleza, pueden tener un inters nutricional y farmacolgico. Desde el punto de vista qumico, los compuestos fenlicos estn caracterizados por un ncleo bencnico que lleva uno o varios grupos hidroxilos. Los compuestos fenlicos se clasifican en no flavonoides y flavonoides. Estos ltimos tienen un esqueleto en C6-C3-C6. Los polifenoles incluyen tambin a los derivados (steres, metil steres, glucsidos, etc) que resultan de las sustituciones de la estructura base. La reactividad de este tipo de molcula es debida tanto a la presencia de la funcin fenol que presenta un carcter cido, como al ncleo bencnico que puede sufrir sustituciones electroflicas. Los compuestos polifenlicos estn distribuidos en las distintas partes de la uva: pulpa, hollejos, pepitas y raspones. De esta manera, la transformacin
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tecnolgica adoptada condiciona la extraccin de los polifenoles a partir de las diferentes partes del racimo, contribuyendo as de manera esencial a la composicin polifenlica de los vinos. Un conocimiento profundo de las diversas estructuras polifenlicas presentes en la uva y de los mecanismos de su evolucin durante el transcurso de la vinificacin es una base indispensable en la evaluacin de su papel en enologa y en el desarrollo de los procesos tecnolgicos adaptados a la vez a la materia prima y al tipo de producto deseado. Compuestos no flavonoides Esta denominacin abarca a los cidos fenlicos, divididos en cidos benzicos (C6-C1) y cidos cinmicos, portadores de una cadena lateral insaturada (C6-C3), pero tambin a otros derivados fenlicos, como los estilbenos. cidos fenlicos En la uva, los cidos fenlicos son principalmente cidos hidroxicinmicos que se encuentran en las vacuolas de las clulas del hollejo y de la pulpa, bajo la forma de steres tartricos. En el vino, se pueden encontrar en forma libre, procediendo de la hidrlisis de otros polifenoles, especialmente de los antocianos, que se degradan en presencia de oxgeno y calor, lo que supone un mecanismo de la destruccin del color; o bien en forma combinada, parcialmente esterificados, especialmente con el cido tartrico o con cidos hidroxicinmicos, destacando entre ellos los cidos cafeoil tartrico (cido caftrico), p-cumaroil tartrico (cido cutrico) y feruloil tartrico (cido fertrico), Figura 5. La forma natural es la trans, pero los ismeros cis, largo tiempo confundidos con los derivados glucosilados, tambin existen aunque en dbil cantidad. Slo el derivado glucosilado del cido trans-cutrico ha podido ser identificado.
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COOH HC HO CH COOH O C O C
C H
OH
Figura 5.- steres hidroxicinmicos: cido trans-cafeoil tartrico (R = OH), trans- p-cumaroil tartrico (R = H) y trans-feruloil tartrico (R = OCH3)
En lo que concierne a los cidos benzicos, la uva contiene principalmente cido glico (Figura 6).
OH
HOOC
OH
OH
Figura 6.- cido glico
Estilbenos Es de destacar la presencia en la uva de otros compuestos fenlicos como el ismero trans del resveratrol, como aglicona o 3--D-glucsido (piceido). Compuestos Flavonoides Los flavonoides estn caracterizados por un esqueleto de base de 15 tomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2-fenil benzopirona (Figura 7).
20
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5' 6' 1 9 4'
B
1' 2 2' 3'
8 7
A
6 10 5 4
C
3
Figura 7.- 2-Fenil benzopirona
Esta gran familia se divide en varias subclases, que se distinguen por el grado de oxidacin de su ncleo pirano. Los flavonoides en sentido estricto, basados en su estructura fenil-2-benzopirona, estn principalmente representados en la uva por los flavonoles, mientras que los flavonoides en sentido amplio comprenden igualmente los flavanos 3-ol (3-flavanoles) y los antocianos. Las estructuras generales de las subclases ms frecuentes en el vino se encuentran en la Figura 8:
Figura 8.- Estructuras qumicas de las subclases de flavonoides ms usuales en el vino
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Flavonoles Estos flavonoides en sentido estricto estn nicamente presentes en los hollejos, bajo forma de glicsidos en posicin 3. En la Figura 9 se representan los cuatro flavonoles principales de la uva, bajo su forma aglicona.
R OH
HO
O R'
OH OH O
Figura 9.- Flavonoles de la uva: kaempferol (R = H; R = H), quercetol (R = OH; R = H), miricetol (R = OH; R = H) e isoramnetol (R = OCH3; R = H)
Las formas glucosiladas son las ms abundantes, pero se encuentran igualmente cantidades importantes de glucurnidos. Flavanos 3-oles (3-Flavanoles) Los flavanos 3-oles (3-flavanoles) estn presentes en la uva en estado de monmeros y bajo formas ms o menos polimerizadas que constituyen los taninos catquicos. En el seno de la baya de uva, se localizan principalmente en las semillas, aunque se han detectado tambin trazas de monmeros y dmeros en la pulpa. Los principales 3-flavonoles monmeros de la uva son la (+)-catequina y su ismero la (-)-epicatequina, pudiendo ser encontrado este ltimo bajo forma de
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ster glico (3-galato de epicatequina). Las estructuras de los flavanoles monmeros de la uva estn representadas en la Figura 10.
R3 OH
HO
O OH
6 4
R1 R2
OH
Figura 10.- Estructura de los flavanoles monmeros de la uva: catequina (R1= H; R2= OH; R3= H), galocatequina (R1= H; R2= OH; R3= OH), epicatequina (R1= OH; R2= H; R3= H) y epigalocatequina (R1= OH; R2= H; R3= OH)
Flavanonoles y flavonas Los compuestos pertenecientes a esta familia han sido identificados en el hollejo de uva blanca. Estos son la astilbina (3-ramnsido del dihidroquercetol) y la engelatina (3-ramnsido del dihidrokaempferol), cuyas estructuras se recogen en la Figura 11.
R OH
HO
O OH O
Ramnosil
Figura 11.- Flavanonoles de la engeletina (R = H) y astilbina (R = OH)
uva:
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En cuanto a las flavonas se han identificado hasta 7-glucsidos de apigenol y luteolina en las hojas de Vitis vinifera. Antocianos Los antocianos representan una parte importante tanto a nivel cualitativo como cuantitativo de los flavonoides de la baya de uva tinta. Contribuyen de manera preponderante al color de las especies tintas. Desde un punto de vista general, los antocianos se corresponden con unos glicsidos de ncleo flavilium polihidroxilado y/o metoxilado. Las formas agliconas, que responden a la frmula general, son denominados antocianidinas (o antocianidoles), Figura 12, y las formas heterosdicas se denominan antocianinos, siendo estas ltimas ms estables.
3' 2' 4'
8 7
O
2
B
1' 6' 5'
A
6 5 4 3
Figura 12.- Estructura de los antocianidinas (forma flavilium)
Los antocianos se diferencian por sus niveles de hidroxilacin y de metilacin, por la naturaleza, el nmero y la posicin de las osas unidas a la molcula, y tambin por la naturaleza y el nmero de los cidos que esterifican los azcares. Los antocianos del gnero Vitis son: cianidol, peonidol, delfinidol y malvidol (Figura 13); pero el contenido y la composicin en antocianos en la uva vara enormemente en funcin de la especie y de la variedad.
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MEN
SALIR
R
3' 2' 4'
OH
HO
7
O
2
B
1' 6' 5'
R'
A
6 5 4 3
OH
OH
Figura 13.- Antocianidinas de la uva en forma de catin flavilium: cianidol (R = OH; R = H), peonidol (R = OCH3; R = H), delfinidol (R = OH; R = OH), petunidol (R = OCH3; R = OH) y malvidol (R = OCH3; R = OCH3)
La V. vinifera presenta la particularidad de contener nicamente 3glucsidos de antocianidoles, mientras que otras especies del gnero Vitis contienen 3,5 diglucsidos. Las numerosas posibilidades de sustitucin del ncleo B y las funciones hidroxilo confieren a los antocianos propiedades especficas, concretamente color y estabilidad, que estn directamente ligadas a la estructura. As, el aumento del nmero de hidroxilos sobre el ncleo B conduce al desplazamiento del mximo de absorcin hacia longitudes de onda ms altas (efecto batocrmico), lo que se traduce en una modificacin del color de la molcula. Por otra parte, la presencia de sustituyentes osdicos se traduce en un ligero efecto hipsocrmico y aumenta la estabilidad de las molculas antocinicas. Por ltimo, la esterificacin de los azcares, concretamente por cidos hidroxicinmicos, estabiliza la molcula y sus capacidades colorantes, debido al establecimiento de interacciones hidrfobas intramoleculares (copigmentacin intramolecular). El color de los antocianos en solucin depende del medio. En efecto, los antocianos existen en solucin bajo diversas formas en equilibrio, de colores diferentes. Estos equilibrios estn regidos por el pH de la solucin. A pH inferior a
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2, la forma flavilium coloreada en rojo, estabilizada por resonancia, domina ampliamente. Adems, las interacciones de los antocianos entre ellos y con los otros constituyentes del medio (copigmentacin) y la formacin de complejos con los iones metlicos, se traducen en modificaciones del color. Taninos Bajo el nombre genrico de taninos se agrupan una serie de sustancias fenlicas que pueden contener los vinos; se clasifican en hidrolizables y condensados. Los primeros se basan en fenoles no flavonoides y generalmente se encuentran en forma de steres, y los taninos condensados son polmeros ms o menos complejos derivados de los 3-flavanoles, especialmente de la (+)-catequina, y de la (-)-epicatequina. Estas molculas presentan la propiedad de liberar antocianidinas, en medio cido y en caliente, de donde toman el nombre de procianidinas o proantocinidinas. Los taninos condensados ms sencillos son las procianidinas dmeras, que se agrupan en dos categoras: procianidinas tipo A (C30H26O12) y las procianidinas tipo B (C30H24O12), Figura 14. Del mismo modo tambin existen procianidinas trmeras, agrupadas en los tipos C y D.
Figura 14.- Estructuras de procianidinas dmeras
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Otros taninos ms complejos son las procianidinas oligmeros, formados por 3 a 10 unidades de flavanoles, as como las procianidinas condensadas, formadas por ms de 10 unidades de flavanoles, alcanzando un peso molecular superior a 3.000, o proantocianidoles. En definitiva, las formas polmeras cuya estructura general viene dada en la Figura 15, representan la mayor parte de los 3-flavanoles tanto de la uva como de los otros vegetales.
R3 OH
HO
O OH
6 4
R1 R2
OH
Figura 15.- Proantocianidoles de tipo B
Se localizan en el hollejo, especialmente en las capas externas de la hipodermis, en forma libre dentro de las vacuolas de las clulas, o en forma combinada, estando ligados a los polisacridos de las paredes celulares. Se encuentran tambin de forma abundante en las pepitas, localizados en la envoltura externa situada inmediatamente por debajo de la epidermis, y tambin en la envoltura interna que rodea al albumen. La pulpa no contiene apenas taninos, mientras que el raspn posee una buena cantidad de estas sustancias. En general, los contenidos en flavanoles de las semillas son siempre superiores a los de los hollejos, ya se trate de monmeros, oligmeros o de polmeros.
27
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SALIR
PARTE II: ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS PARA EL ANLISIS DE RESVERATROL La prctica totalidad de los mtodos encontrados en la bibliografa para el anlisis de resveratrol y compuestos relacionados hacen uso de tcnicas separativas, fundamentalmente cromatografa de lquidos de alta eficacia (LC), cromatografa de gases (GC) y electroforesis capilar (CE). As, estas tcnicas se han utilizado para analizar dichos compuestos en muestras muy diversas tales como alimentos, entre ellos fundamentalmente uvas21,66-71, cacahuetes79, 72, arndanos73 o chocolate32 o bien en hojas de parra74, grnulos de lpulo75, 76 y plantas77-80 usadas con fines medicinales. En general, en las etapas previas de aislamiento y limpieza se utilizan diferentes tcnicas separativas tales como extraccin slido-lquido (SPE), extraccin lquido-lquido (LLE) y extraccin con fluidos supercrticos (SFE), para obtener finalmente una disolucin de resveratrol y los restantes compuestos de inters que se analiza mediante cromatografa. En cuanto a los mtodos encontrados para anlisis de estos compuestos en vino, en la Tablas 2, 3 y 4, se recogen los antecedentes encontrados acerca de los mtodos mediante cromatografa lquida, electroforesis capilar y cromatografa de gases, respectivamente. En este ltimo caso la separacin se acopla generalmente a la espectrometra de masas. En cromatografa de lquidos se utiliza ms frecuentemente cromatografa en fase inversa y los detectores usuales son el detector de serie de diodos (DAD), el detector fluorescente (FLD) o el espectrmetro de masas (MS). Tambin se han usado, en algunos casos, detectores electroqumicos (ECD).
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SALIR
Tambin se encuentran algunos mtodos de cromatografa en capa fina, en concreto el desarrollado por Chen et al81 que muestran la utilidad del anlisis de resveratrol y piceido para distinguir rpidamente entre vinos naturales y falseados y el de Kiraly-Veghely et al82 que utilizan cromatografa en placa a elevada presin y encuentran mayores contenidos de piceido que de aglicona.
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MEN
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Tabla 2.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de lquidos
Analito(s)
Parmetros analticos de calidad
cis y transresveratrol
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Estudio de los procesos de transformacin fotoqumica con luz UV de diferente y con luz solar Transformacin cuantitativa de trans 83 en cis con irradiacin de 360 nm Identificacin de otro fotoproducto no ismero de resveratrol, de menor PM
trans-resveratrol, epicatequina y catequina
84
trans- y cisresveratrol y piceido y otros polifenoles
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin ODS2 (35 C) Gradiente de cido actico 6% a agua:acetonitrilo:actico, 65:30:5 DAD (290 nm; barridos 250 a 600 nm) FLD ( exc/ em = 300/392 nm; barridos de emisin y excitacin) MS (APCI, modo full scan) con elucin isocrtica acetonitrilo:agua, 30:70 C18 Gradiente de acetonitrilo: cido actico acuoso al 5%, 9:91 a acetonitrilo:cido actico acuoso al 5%, 25:75 FLD ( exc/ em = 280/315nm, 10 min, y 324/370 nm en adelante) ODS2 (35 C) Gradiente de agua:acetonitrilo:cido actico, DAD (280 nm) FLD (( exc/ em = 300/392 nm)
Centrifugacin e inyeccin directa Identificacin de analitos, por comparacin de sus tR y espectros UV en el pico con los de patrones 20 min por cromatograma Aumento de la concentracin de los tres desde el mosto hasta el vino a intra-da e inter-da Inyeccin directa de la muestra RSD (n=6) entre 0.4 % y 4 % Cuantificacin de cis partir de la LODb 0.02 gmL-1 para disminucin de trans trans- y cis- resveratrol y trans-piceido
85
30
MEN
SALIR
Tabla 2.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de lquidos (continuacin)
Analito(s)
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento DAD y MS: Extraccin con acetato de etilo, evaporacin a sequedad y reconstitucin en metanol:agua DAD, FLD y ECD: Filtrado del vino y anlisis directo. 86 Contenido fenlico total por el mtodo de Folin-Ciocalteu Los dos ismeros de resveratrol y piceido presentan propiedades electroqumicas.
87
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin C18 Compuestos fenlicos: cidos Gradiente de 100 % A a 100 % B: A fenlicos, estilbe- (cido frmico 0.5 % o cido fosfrico nos (ismeros 0.1 %), B (A:acetonitrilo: agua, trans y cis de 5:400:595). 0.7 mLmin-1. resveratrol y MS (Modo full scan); DAD (200-800 piceido), flavonm); FLD: ex/em 280/320, 260/400 (cisnoles como la resve-ratrol y cis-piceido) y 300/390 quercetina (trans-resve-ratrol y trans-piceido); (aglicona y ECD (integracin de voltamperograma glucsido) entre -1. y 1 V) Polifenoles, Fase inversa y elucin gradiente antocianos y trans- DAD (280 y 520 nm polifenoles y resveratrol 306 nm trans-resveratrol) Derivados de res- Fase inversa y elucin gradiente veratrol: resvera- DAD (310 nm para trans-ismeros y trol y piceido, 286 nm para cis-ismeros) ismeros
El contenido en trans-resveratrol depende en gran medida de la variedad y del ao de cosecha. No se detecta ningn Filtracin de las muestras e derivado por debajo de 3 inyeccin directa en el sistema ngmL-1 cromatogrfico Contenido total de polifenoles por el mtodo de Folin-Ciocalteu. Capacidad antioxidante: TEAC-test
88
31
MEN
SALIR
Analito(s)
Parmetros analticos de calidad LOD (S/N = 3) 1 y 4 ngmL-1 para trans- y cisresveratrol, respectivamente
Referencia
Observaciones Muestra / Tratamiento Vinos almacenados a 4 C en la oscuridad. Botellas abiertas inmediatamente antes del anlisis. Filtrado e inyeccin directa de las muestras
89
90
Recta de Calibrado entre Cantidades encontradas en vinos tintos (0.352-1.99 gmL-1) mayores 0.5 y 16 gmL-1 que en blancos (5-570 ngmL-1) Anlisis cualitativo de cis-resveratrol Uvas Rango lineal 0.11-2.75 Acoplamiento entre SPE con gmL-1 sistemas de extraccin con lquidos LOD 3 ngmL-1 c 4 ngmL-1 a presin (PLE) LOQ
66
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin Compuestos C18 fenlicos, entre Gradiente de cido frmico en agua, ellos trans y cispH 3 (A) y cido frmico en resveratrol acetonitrilo, pH 3 (B) a 0.2 mLmin-17 DAD (200- 600 nm. 305 y 285 nm para trans- y cis-resveratrol, respectivamente) MS (ESI, SCAN m/z 50-700; modo SIM trans-resveratrol C18 (40C) Gradiente de agua:metanol, 5:5, a agua:acetonitrilo, 7:3, 0.6 mLmin-1 DAD (308 y 288 nm) trans-resveratrol Fase inversa columnas monolticas Elucin isocrtica 30 % (cido actico 0.1 % en metanol) 70 % (cido actico 0.1 % en agua) 5 mLmin-1 FLD ex/em 310/403 nm; DAD 310 nm trans- y cis-resve- C18 ratrol Gradiente de cido actico, pH 2.4 a cido actico:acetonitrilo, 20:80, 1.5 mLmin-1 DAD (285 y 306 nm, para cis y trans)
trans-resveratrol 0.32 4.44 y 0.12 2.80 gmL-1 en tintos y rosados, respectivamente. cis-resveratrol 0.20 5.84 y 0.02 3.17 gmL-1 en tintos y rosados, respectivamente
91
32
MEN
SALIR
Analito(s)
Parmetros analticos de calidad LOD 0.2 gmL-1, 0.2 gmL-1 y 0.32 gmL-1 para trans-piceido, transy cis-resveratrol, respectivamente
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Extraccin con acetato de etilo limpieza con resina intercambiadora de cationes y mediante 92 cromatografa de particin (centrifugal partition chromatography) y HPLC semipreparativa Inyeccin directa de muestras filtradas Deteccin CL altamente sensible 93 (LOD de 1 a 2 rdenes de magnitud menores que los lmites en DAD)
trans-Resveratrol: Rango lineal 0.03- 150 gmL-1 LOD (S/N=3) 84.7 y 6.6 ngmL-1 en DAD y CLD, respectivamente El empleo de una columna LOD 32 y 34 ngmL-1 y -1 monoltica implica bajas presiones y LOQ 0.10 y 0.11 gmL para tran- y ciscortos tiempos de anlisis. resveratrol, respectivamente
94
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin Estilbenos : C18 viniferina, transGradiente de cido actico en agua, astringina, trans- pH 2.4 a cido actico en agua, pH piceido, cis- y 2.4: acetonitrilo 20:80, 0.5 mLmin-1 trans-resveratrol y UV (280, 286, 306 y 321 nm) -viniferina 20 compuestos XDB-C8 fenlicos, entre Gradiente de metanol y cido actico 1 ellos trans% DAD (306 nm para trans-resveratrol) resveratrol CLD (Ce(IV) rodamina 6G compuesto fenlico en medio cido sulfrico) Ismeros cis y C18 monoltica (Chromolith trans de Performance RP-18e) resveratrol y Gradiente de agua:cido actico, 94:6, piceido a agua:acetonitrilo:cido actico, 65:30:5, 7 mLmin-1 DAD (285 y 306 nm para cis- y transresveratrol, respectivamente) trans- y cis- resve- Fase inversa ratrol y piceido
Estudia la influencia de la variedad del la levadura en la concentracin de los cuatro compuestos en vino
95
33
MEN
SALIR
Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Se sigue el patrn de evolucin de estos compuestos en el vino durante el envejecimiento en botella
96
97
SPE
98
cidos hidroxibenzoicos, cidos hidroxicinmicos y derivados, estilbenos (ismeros de resveratrol y piceido), alcoholes fenlicos y compuestos relacionados, flavanoles y flavonoles. trans-resveratrol y trans-piceido cis- y trans- resve- Hypersil C18 ratrol y piceido Gradiente lineal acetonitrilo- agua DAD (288 y 306 nm para cis- y transismeros
34
MEN
SALIR
Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin C8 Elucin isocrtica con methanol:agua 35:65, 1 mLmin-1 DAD (306 nm) CLD (Eluato + luminol + K3Fe(CN)6)
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Inyeccin directa de muestras filtradas Contiene una revisin importante de 99 mtodos entre 1996 y 2002. Encuentra entre 0 y 1.607 gmL-1 en vinos tintos chinos
Vino. Filtrado e inyeccin directa Uvas y hojas. Maceracin con etanol al 80%. Equilibrio entre los dos ismeros tras 5 horas de exposicin a la luz del da. Equilibrio no influenciado por la temperatura
100
Parmetros analticos de calidad trans-resveratrol Linealidad 0.075-10 gmL-1 y 0.5-750 ngmL-1 en DAD y CLD, respectivamente. LOD(S/N=3) 25 y 0.166 ngmL-1 en DAD y CLD, respectivamente. cis- y trans-resve- C18 Linealidad 0.01-10 ratrol Elucin isocrtica con 25 % gmL-1 trans-resveratrol. acetonitrilo, 0.1 % de H3PO4 y NaCl (5 LOD (S/N=3) menores de 30 y 100 ngmL-1 (306 mmolL-1), 1 mLmin-1 DAD (306 nm para ambos ismeros) nm) y 3 y 15 ngmL-1 ECD (electrodo de carbn vitrificado a (0.75 V) para trans- y cis+0.75 V) resveratrol, respectivamente. Resveratrol total DAD (287 y 307 nm para cis- y transismeros)
101
cis- y trans- resve- Fase inversa ratrol y piceido DAD
Hidrlisis enzimtica ( -glucosidasa) de resveratrol-glucsidos SPE Se encuentra del 82 al 91% de resveratrol como glucsido en estos vinos espaoles de uvas Monastrell.
102
35
MEN
SALIR
Analito(s)
Screening de polifenoles, entre ellos transresveratrol
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad Fase inversa DAD - MS/MS
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Pieles y pepitas de uvas blancas y tintas Se encuentran hasta 13 antocianos, 103 11 cidos hidroxibenzoicos e hidroxicinmicos y 13 catequinas y flavanoles, as como 2 estilbenos en pieles y pepitas
104
cidos orgnicos y polifenoles ((-)-epicatequina, quercetina y resveratrol) Flavonoles, antocianinas, cidos fenlicos y trans-resveratrol.
Fase inversa (en silica modificada con Linealidad resveratrol grupos fenilo) 0.025-0.4 mgmL-1 Gradiente de cido trifluoactico al 0.2 % en agua y acetonitrilo. 1.5 mLmin-1 DAD a 210 y 280 nm C18 Gradiente de cido actico al 5 % en agua y acetonitrilo, 1 mLmin-1 DAD (313 nm para trans-resveratrol y cidos fenlicos) Estudian el efecto de distintos mtodos de maceracin sobre la concentracin de estos cuatro estilbenos ECD (deteccin coulomtrica multielectrodo)
105
cis- y trans- resveratrol y piceido
106
Polifenoles
107
36
MEN
SALIR
Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad
Referencia
Resveratrol, piceido y flavonoides.
Deteccin electroqumica multicanal con detector coulomtrico
Observaciones Muestra / Tratamiento Vinos experimentales de uvas sometidas a diferentes tratamientos con pesticidas Contenido fenlico total por el mtodo de Folin-Ciocalteu Cerveza
108
27 compuestos fenlicos, incluyendo derivados de los cidos benzoico y cinmico, flavonas, y nuevos glucsidos relacionados cis- y trans- resveratrol y piceido C18 Elucin isocrtica etanol:cido actico al 0.05 %, 23:77, 1 mLmin-1 DAD a 306 nm Linealidad para los cuatro ismeros 0.2-50 gmL-1 LOD 0.81, 1.20, 0.40 y 0.46 ng para cis- y transresveratrol y cis- y transpiceido, respectivamente
109
Hidrlisis con -glucosidasa para liberacin de agliconas contenidos de cis- y trans- resveratrol antes y despus de la hidrlisis Resveratrol total 0.84-7.33 y 0.12-6 gmL-1 en vinos tintos y zumos, respectivamente
110
37
MEN
SALIR
Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad NMR NMR/MS
Referencia
Compuestos aromticos, entre ellos transresveratrol
Observaciones Muestra / Tratamiento Vino: preparacin de extracto fenlico con acetato de etilo. Cerveza: degasificacin y concentracin a 2/3 del volumen inicial Zumo de uva: dilucin con agua
111
Fase inversa Antocianos DAD (520 nm) Estilbenos FLD ( ex/em 330/374 nm)
112
C18 Gradiente de agua y acetonitrilo conteniendo ambos 1% de cido actico, 0.6 mLmin-1 PDAD/API-MS
113
Antocianinas y estilbenos (cis- y trans- resveratrol y piceido) 32 Polifenoles de bajo peso molecular, entre ellos cis- y transresveratrol y piceido Estilbenos (resveratrol)
114
Estilbenos (resve- DAD-MS/MS ratrol, piceido, piceatannol)
Influencia de diferentes tcnicas de maceracin en el contenido en estilbenos Induccin de estilbenos mediante irradiacin UV post-cosecha
115
38
MEN
SALIR
Analito(s)
Flavanoles, antocianinas, y 6 derivados de resveratrol: transastringina, trans- y cis-piceido, transy cis-resveratrol y pallidol (dmero de resveratrol)
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Filtrado e inyeccin directa de las muestras Se aportan por primera vez datos sobre contenido de pallidol en vinos tintos y no se encuentra en vinos 116 blancos Contenidos de los ismeros de resveratrol ms elevados en vinos tintos SPE-C18 Nivel medio encontrado en vinos tintos embotellados 2.89 gmL-1
trans-resveratrol
Parmetros analticos de calidad Linealidad 0.5-10, 0.1-10, 1-10, 0.5-10, 1-10 y 0.510 gmL-1 y LOD (FLD) 0.01, 0.01, 0.03, 0.01, 0.02 y 0.02 gmL-1, para transastringina, trans-piceido, cis-piceido, transresveratrol, cisresveratrol y pallidol LOD en muestras reales 20 y 3 ngmL-1 en DAD y FLD, respectivamente
117
cis- y transresveratrol y piceido
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin C18 Gradiente de 1 % cido trifluoroactico a acetonitrilo:1 %, cido trifluoroactico, 80:20, 1 mLmin-1 DAD (290 nm) FLD ( ex/em 290/390, 290/390, 260/400, 300/390, 260/400 y 260/400 nm para trans-astringina, trans-piceido, cispiceido, trans-resveratrol, cisresveratrol y pallidol C18 Gradiente de metanol : cido actico : agua, 10:2:88 a metanol:cido actico :agua 90:2:8, 1 mLmin-1 DAD (280 nm) FLD ex/em 360/374 nm ODS Hypersil Elucin isocrtica, acetonitrilo:cido frmico acuoso 0.5 %, 1 mLmin-1, 25:75 DAD (307 nm)
Vinos, uvas, cacahuetes, manteca de cacahuete y t Uvas, cacahuetes y t contienen fundamentalmente trans-piceido. Vinos tintos son fuente de agliconas
29
39
MEN
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Analito(s)
Referencia
Observaciones Muestra / Tratamiento Primer informe sobre contenidos de viniferina y pallidol en diferentes tipos de vino
118
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad Oligmeros de es- DAD tilbenos (viniferina y pallidol) y estilbina Resveratrol total Hypersil ODS Linealidad en el rango Gradiente de metanol con cido fr0.52-2260 pmol de transmico al 0.5 % en agua,.0.25 mLmin-1 resveratrol APCI-MS (SIM m/z 229)
119
Polifenoles, incluyendo estilbenos como trans- y cis-resveratrol Resveratrol y piceido
Columna monoltica C18 Gradiente de metanol:agua 2.5:97.5 a 50:50, pH 3 con H3PO4, 2.1 mLmin-1 DAD (256, 324 y 365 nm)
120
79
trans- y cisresveratrol y
Vino, jugo de uva y jugo de arndanos Hidrlisis de vino con -Dglucosidasa, extraccin con acetato de etilo, evaporacin y redisolucin con metanol : agua Filtracin e inyeccin directa de la LOD (S/N=3) 10 y 30 -1, para trans- y cis- muestra ngmL resveratrol, respectivamente. La concentracin de piceido y resveratrol en el vino y zumo de uva depende del tiempo de extraccin de la piel. Los niveles mayores se encuentran en vinos tintos por estar ms tiempo en contacto con la piel durante la fermentacin Mosto. Variabilidad en el contenido de resveratrol segn el proceso de
121
40
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piceido
fermentacin
Analito(s)
Resveratrol
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad Combinacin de NP-HPLC y RP-HPLC
trans-resveratrol y C18 otros polifenoles Gradiente de metanol : cido actico : agua 10:2:88 a 90:2:8, 1 mLmin-1 DAD 280 nm Linealidad transresveratrol 0.02-40 gmL-1
trans-resveratrol
Linealidad 0.72-18 gmL-1 LOD 2 ngmL-1
Polifenoles, entre ellos, trans- y cisresveratrol y piceido.
ODS-Hypersyl Gradiente de cido perclrico (0.6 mLL-1) en agua y acetonitrilo, 1 mLmin-1 DAD a 310 nm RP-18 Gradiente de cido actico al 1 y 6 % en agua y cido actico : agua : acetonitrilo, 5:65:30, 0.5 mLmin-1 DAD 280 y 313 nm
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Efecto de las condiciones meteorolgicas y de maduracin en 122 la concentracin de resveratrol en vinos tintos Preparacin de muestra: mejores resultados extrayendo con ter etlico a pH 2 123 Valores medios de 2.26, 3.10 y 3.80 -1 de trans-resveratrol en gmL vinos de Gran Canaria, Lanzarote y Tenerife, respectivamente SPE-C18: lavado a pH 8, elucin de trans-resveratrol con acetato de etilo, 124 evaporacin y reconstitucin en metanol Niveles entre 0.55 y 2.534 gmL-1 Un pool de 14 polifenoles y 25 vinos se someten a un test en fluidos 125 gstricos e intestinales. Se determina la concentracin de polifenoles antes y despus del tratamiento
41
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Analito(s)
Parmetros analticos de calidad Linealidad 50 ngmL-1 50 gmL-1
Observaciones Muestra / Tratamiento Deteccin fluorescente altamente sensible para resveratrol
Referencia
126
0.1 a 15 gmL-1
Filtrado e inyeccin directa de la muestra
127
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin Flavonoides y Fase inversa estilbenos (trans- y ESI-MS/MS cis-resveratrol) DAD (320 y 377 nm para estilbenos y flavonoides, respectivamente) FLD cido glico, ODS Hypersyl trans-resveratrol, Gradiente entre cido actico, metanol quercetina y rutina y agua DAD (306 nm para trans-resveratrol) trans- y cisC18 resveratrol y gradiente de agua a pH 2.5 con cido piceido sulfrico y acetonitrilo, 0.2 mLmin-1 DAD (280 y 305 nm para cis y trans respectivamente) SIM a m/z 228 LOD 1.202, 0.948, 2.558 y 0.834 gmL-1 para trans- y cis-resveratrol en MS y DAD
128
Extraccin con ter etlico a pH 2

129
Catequina, cido vanllico, cido sirngico, epicatequina y trans-resveratrol
C18 Gradiente de metanol : cido actico : agua, 10:2:88 a 90:2:8, 1 mLmin-1 DAD 280 nm FLD
LOD 20 y 3 ngmL-1 en DAD y FLD, respectivamente
42
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Analito(s)
trans-resveratrol
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad C18 Elucin isocrtica agua:acetonitrilo 75:25 DAD a 306 nm
Polifenoles
Compuestos fenlicos con propiedades antioxidantes, entre ellos transresveratrol Resveratrol FLD
exc/em
C18 (40 C) Gradiente de agua:acetonitrilo, 95:5 a 50:50, a pH 1.8, de 95:5 a 55:45. DAD (280, 350 y 520 nm)
270/372 nm
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Comparacin RP-HPLC-MS y 130 CE-MS Niveles entre 0.82 y 5.75 gmL-1 Extractos etreos Mayor eficacia de la separacin en CE, pero mayor poder de elucidacin 131 estructural en LC. 22 compuestos identificados mediante LC-MC y solo 13 mediante CE-MS Vino y Uva. Inyeccin directa de vinos y extractos de uva Dado el bajo pH de la fase mvil, los 132 antocianos son detectados en forma de catin flavilium y ello no refleja su situacin en la muestra real Transformacin de resveratrol en un compuesto altamente fluorescente con irradiacin ultravioleta intensa 133 con luz En vino, generacin de un compuesto similar proveniente de piceido, as como uno desconocido, F-3.
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Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin trans- y cisODS-2 resveratrol, Gradiente de acetonitrilo:cido actico catequina, al 5% de 9:91 a 70:30. epicatequina, DAD (280, 300 y 360 nm) quercetina y rutina FLD ( exc/em 280/315 para catequina y epicatequina, 324/370 para transresveratrol y 260/370 para cisresveratrol)
Parmetros analticos de calidad 300 nm: LOD 0.06 y 0.21 gmL-1 para trans- y cisresveratrol FLD: Rango de linealidad de 0.01 1 y 0.01 0.1 gmL-1 y LOD de 3 y 1 ngmL-1 para trans- y cisresveratrol
Estilbenoides (trans-piceido, trans-resveratrol, trans-astringina, cis-piceido, cisresveratrol)
C18 (30 C) Gradiente de 100 % A (cido actico en agua a pH 2.40) hasta 100 % B (A:metanol 20:80). DAD 286 nm.
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Obtencin de cis-resveratrol por irradiacin a 254 nm durante 20 min de trans-resveratrol Inyeccin directa de las muestras Catequina y epicatequina presentes en todos los vinos analizados, niveles de la primera 134 considerablemente superiores Altos niveles de quercetina en muchas muestras, rutina se detecta slo en mosto Niveles de resveratrol menores que los del resto de polifenoles, predominando siempre su forma trans LOD (25 L): 8, 8, 5, 5 y Extraccin con acetato de etilo, 8 ng, para transevaporacin a sequedad y astringina, cis-resveratrol, redisolucin en metanol-agua 135 trans-resveratrol, trans- Limpieza en resina intercambiadora piceido y cis-piceido, de cationes respectivamente.
44
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Analito(s)
trans- y cisresveratrol y piceido
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad C18 (40 C) Gradiente de cido actico en agua y acetonitrilo
trans-resveratrol
C18 (40 C) Gradiente lineal de cido frmico 50 mM:metanol, 80:20, a cido frmico 50 mM:metanol, 20:80 FLD ( exc/em 330/374 nm)
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Muestras de jugo de uva blanca y tinta. Inyeccin directa de la muestra sin tratar Obtencin de cis- ismeros por exposicin de los trans- a la luz solar. 90 % de conversin en 10 min 136 y cuantificacin de cis-ismeros Niveles en jugos de uva tinta 10 veces superiores a los de uva blanca. Cantidades de resveratrol como glucsido superiores a las de aglicona Pieles de uva, jugo de uva y vino Vino: SPE-C18 Concentraciones de trans-resveratrol en vinos japoneses blancos 137 (Chardonnay) y tintos (Cabernet Sauvignon) bajas, del orden de las encontradas en vinos de las mismas variedades, de California, Suiza, Francia y Nueva York
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Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; F. Mvil; Sistema de Deteccin Diversas C18 fitoalexinas de la Elucin en gradiente con acetonitrilo y vid agua, desde el 10 al 85 % de acetonitrilo. FLD a exc/em 330/374 nm para transresveratrol, trans-pterostilbeno y trans-viniferina. DAD a 285 nm para cis-resveratrol trans- y cisODS Hipersil. Elucin en gradiente entre actico, resveratrol y piceido, catequina, metanol y agua, desde 5:15:80 hasta epicatequina, 5:45:50. DAD: 265, 280, 306, 317 y 369 nm. quercetina y rutina.
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Cuantificacin de trans-piceido a travs de la recta de calibrado de trans-resveratrol, ya que ambos compuestos presentan semejantes 138 propiedades fluorescentes Cuantificacin de cis-piceido utilizando la recta de calibrado de cis-resveratrol a 285 nm LOD oscilando entre 30 40 minutos por cromatograma. ngmL-1 para transRecuperaciones en torno al 100 % resveratrol y 1.5 gmL-1 para todos los analitos en vinos para catequina (48, 75 y blanco, tinto y rosado 139 135 ngmL-1 para trans- Niveles estables una vez abierta la piceido, cis-piceido y cis- botella durante una semana, pero resveratrol, prdidas que oscilan entre el 10 y el respectivamente). 40 % a las seis semanas
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Analito(s)
trans- y cisresveratrol como aglicona y glucsido.
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad C18. Gradiente entre cido actico en agua (pH 2.40):acetonitrilo
Ismeros de resveratrol
ODS Hipersil (40 C). Gradiente de agua:metanol, 100:0 a 0:100 en 15 minutos. DAD (306 y 286 nm, mximos de absorcin de trans- y cis-resveratrol, respectivamente)
LOD (S/N = 3) de 0.6 molL-1 para ambos analitos a 286 nm.
Ismeros de resveratrol y piceido
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Obtencin de cis-ismeros por exposicin a la luz del sol de los trans. Cuantificacin de los ismeros de piceido asumiendo idnticos que para trans- y cis-resveratrol a 140 306 y 285 nm, respectivamente Anlisis de vinos tintos y rosados sin tratamiento previo. Concentracin por evaporacin de vinos blancos para la cuantificacin de los cisismeros Se comprueba la transformacin de trans en cis-resveratrol por irradiacin con luz UV a 254 nm 141 Se aportan valores de 288 nm y 308 nm de cis y trans Isomerizacin de cis a la forma trans- ms estable, en medio cido Al igual que otros polifenoles, son buenos marcadores quimiotaxa142 nmicos del vino, permitiendo la distincin entre variedades de vino blanco de diferentes D.O.y bodegas
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Analito(s)
trans-resveratrol
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad C18 Elucin isocrtica con agua:actico:acetonitrilo 75:5:20. DAD (306 nm)
Resveratrol
Ismeros de resveratrol y piceido
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento Se concluye que el secado de las uvas no es una prctica que induzca la sntesis de resveratrol 25 Niveles en vinos de uvas secas (Recioto y Amarone) entre 0.05 y 0.8 mgL-1. C18 Se estudia la influencia del proceso Elucin isocrtica con agua:acetonitrilo de vinificacin y el nivel de 55:45. podredumbre por Botritis en la uva, 143 DAD (307 nm, trans-resveratrol), 280 sobre el contenido en resveratrol nm, cis-resveratrol) Vinos macerados presentan cantidades10 superiores C18 (40 C) LOD y LOQ para trans- Obtencin de cis ismeros por Gradiente de cido actico en agua resveratrol 3 y 10 ngmL-1 exposicin de los trans a la luz solar. (pH 2.40) y acetonitrilo Produccin de estilbenoides en uva DAD (306 nm, trans, y 285 nm, cis) parece depender de la variedad, posible control gentico de su biosntesis 39 Elevados valores de la relacin trans/cis, que apoyan al trans como nico ismero natural naturalmente es el, originndose el cis por exposicin a la luz del mosto o vino
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Tabla 2.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de lquidos (continuacin) Analito(s) Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos Observaciones Referencia F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad Muestra / Tratamiento C18 Estudian los efectos de la irradiacin Elucin en gradiente desde de resveratrol y sus derivados en Resveratrol actico:agua 1:99, a actico:agua 6:94, pieles de uva 144 y actico:agua:acetonitrilo 5:65:30. En primer lugar se produce la DAD (306 y 262 nm) isomerizacin de trans a cis, FLD ( exc/em 270/372 nm) generndose a continuacin derivados altamente fluorescentes Ismeros de Lichrosphere 100 CN. LOD 0.11 y 0.16 molL-1 Generacin de cis-resveratrol por resveratrol y Elucin isocrtica con para trans-resveratrol y irradiacin de trans-resveratrol a 254 piceido agua:actonitrilo:metanol , 90:5:5 piceido, respectivamente; nm durante 5-10 minutos UVD (306 nm) 0.20 y 0.30 molL-1 para Cuantificacin de cis-resveratrol cis-resveratrol y piceido, basada en la cada del trans 145 respectivamente. Transformacin de cis en transresveratrol a 70 C durante 30 minutos Identificacin de glucosidos mediante hidrlisis enzimtica con glucosidasa Resveratrol y C18 Inyeccin directa de la muestra sin piceido. Gradiente de cido actico:agua 1:99, tratamiento previo a cido actico:agua 6:94, y cido 38 actico:agua:acetonitrilo 5:65:30. DAD (entre 230 y 450 nm)
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Tabla 2.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de lquidos (continuacin) Analito(s) Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos Observaciones Referencia F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad Muestra / Tratamiento trans-resveratrol y C18 No es necesario tratamiento previo trans-pterostilbeno Gradiente de metanol:cido frmico de la muestra de vino, gracias a la 146 DAD (305.6 y 306.4 nm para especificidad de la FLD resveratrol y pterostilbeno) FLD ( exc/em 330/374 nm para ambos) Piceido Describen el primer procedimiento de extraccin de piceido de P. 37 Cuspidatum trans-resveratrol C18 trans-resveratrol sintetizado Elucin con: A (cido fosfrico 0.2 M a Vino: preconcentracin en el pH 1.5 por adicin de amoniaco) y B rotavapor, limpieza con cloroformo, (A:acetonitrilo 20:80), al 23.5 % B. extraccin con acetato de etilo, 42 DAD a 306, 316, 280 y 250 nm. lavado con agua saturada en cloruro sdico. La fase orgnica es evaporada a sequedad y se redisuelve en agua:acetonitrilo 1:1 Resveratrol Columna de slice Lichrosorb. Vino: Extraccin con acetato de etilo, Elucin isocrtica con metanol:cloruro se renen los extractos orgnicos y de metileno 3:97. se lavado con agua destilada. 34 Evaporacin a sequedad se redisuelve en metanol.
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Tabla 3.- Anlisis de resveratrol mediante electroforesis capilar
Analito(s)
Observaciones Muestra / Tratamiento
Referencia
147
Optimizacin del proceso SPE mediante redes neuronales artificiales y diseo de experimentos
148
149 150
SPE Valores de pKa de resveratrol 9.22, 10.55, 11.16
151
Sistema electrofortico: Modalidad; Parmetros analticos Inyeccin; Deteccin de calidad trans- y cisCromatografa electrocintica micelar. resveratrol Inyeccin electrocintica (2 kV; 5s) 306 nm Resveratrol CZE. Inyeccin hidrodinmica (4 s; 50 mbar) 305 nm trans-resveratrol, Deteccin electroqumica. (-)-epicatequina y Electrodo de disco de carbn a +0.85 (+)-catequina V Resveratrol y CZE piceido Polifenoles, entre NACE. LOD 2.5 molL-1 ellos, resveratrol Capilares recubiertos a elevado pH y resveratrol metanol UV (214 y 223 nm) Polifenoles, entre CZE LOD 18 y 50 ngmL-1 paellos trans- y cis- DAD ra cis- y trans-resveratrol resveratrol
152
Desviacin estndar relativa; b Lmite de deteccin; c Lmite de cuantificacin
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Tabla 3.- Anlisis de resveratrol mediante electroforesis capilar (continuacin)
Analito(s)
trans-resveratrol y cido srbico
Sistema electrofortico: Modalidad; Inyeccin; Deteccin CZE DAD a 305 nm
Parmetros analticos de calidad LOD 0.04 gmL-1 transresveratrol.
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento SPE-C18 para resveratrol e inyeccin directa para cido srbico Utiliza la misma recta de calibrado 153 de trans-resveratrol para cisresveratrol, dividiendo la pendiente entre la razn de los coeficientes de absorcin trans/cis a 305 nm (2.69)
154 155
trans-resveratrol
Resveratrol y piceido trans-resveratrol Ultra-low-temperature NACE-77K FLD
Inyeccin electrocintica (10 kV; 6s) Rango lineal 0.5-100 Deteccin electroqumica. Electrodo de gmL-1 disco de carbn a +0.85 V LOD 59.6 ngmL-1 DAD
156
trans- y cisresveratrol
NACE-77K FLD
Determinacin mediante CE, sntesis y estabilidad de resveratrol y piceido Identificacin on-line de los fotoproductos de trans-resveratrol. Se propone un esquema de fotorreaccin para resveratrol similar al de estilbeno: trans-resveratrol cis-resveratrol 2,4,6-trihidroxifenantreno Incluye estudio de fotoestabilidad de resveratrol
157
52
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Tabla 4.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de gases-masas
Analito(s)
Resveratrol total libre
Parmetros analticos de calidad Linealidad entre 12.5 y 250 gmL-1
trans-resveratrol
Linealidad entre 0.02 2.0 gmL-1
trans-resveratrol
Sistema cromatogrfico: Columna; Caractersticas; In para deteccin HP Innowax (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) Metano como gas portador. Analizador de trampa de iones. Para la cuantificacin se selecciona el in m/z 135 HP-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) Helio como gas portador. Gradiente de temperatura desde 100 hasta 300 C. Ionizacin mediante impacto electrnico. Se trabaja en modo full scan en un intervalo de m/z entre 35 a 550 amu HP-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) Helio como gas portador. Ionizacin mediante impacto electrnico. Se trabaja en modo SIM. Gradiente de temperatura desde 110 hasta 300 C, seleccionando para cuantificar el in de masa molecular 444 y para identificar los iones de masa 443 y 446. Linealidad entre 10 pgmL-1 y 1 gmL-1 LOD: 5 pgmL-1
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento 5 mL de vino se diluyen con agua (1:3) y la disolucin se pasa por un 158 cartucho C18. El resveratrol se eluye con metanol. El contenido en vinos oscila entre 11.8 y 17.2 mg.L-1 Microextraccin en fase slida realizando posteriormente, y en la misma fibra, una derivatizacin con 159 bis-[trimetilsilil]-trifluoro-acetamida o con anhdrido actico Se realiza una comparacin con cromatografa bidimensional Microextraccin en fase slida realizando posteriormente, y en la misma fibra, una sililazin con bis[trimetilsilil]-trifluoro-acetamida. La 160 desorcin se realiza a 280 C durante 7 min
53
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Tabla 4.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de gases-masas (continuacin)
Analito(s)
Parmetros analticos de calidad LOD: 10 ngmL-1
trans-resveratrol
Sistema cromatogrfico: Columna; Caractersticas; In para deteccin DB-5HT (30 m x 0.25 mm x 0.10 m) Gradiente de 110 hasta 300 C. SIM, (in de masa molecular 444); iones de masa 445 y 446 para identificar. DB-5 Gradiente de temperatura desde 190 hasta 315 C. Para cuantificar in de masa molecular 228, iones cualitativos de 229 y 227 de masa. Linealidad hasta 10 gmL-1 LOD: 10 ngmL-1
Observaciones Referencia Muestra / Tratamiento SPE-C18, elucin con acetato de etilo y evaporacin a sequedad. Deri161 vatizacin con bis-[trimetilsilil]-trifluoo-acetamida a 70 C durante 60 min SPE-C18, elucin con acetato de etilo e introduccin directa del extracto en el cromatgrafo. Se ana162 lizan vinos de los principales pases productores. El contenido en vinos blancos es inferior a 0.1 g.mL-1 SPE-C18, elucin con acetato de etilo e introduccin directa del extracto en el cromatgrafo 45 Tiempos de retencin de cis y trans: 4.3 y 5.7 min respectivamente
trans-resveratrol
DB-17(15 m x 0.25 mm x0.15 m) Gradiente de 150 hasta 305 C. Detector de masas de cuadrupolo. Los datos se adquieren en modo SIM (in de masa molecular 228) iones de masa 227 y 229 para identificar DB-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) Detector de masas de cuadrupolo. Gradiente de temperatura desde 150 hasta 305 C. Se selecciona para cuantificar el in de masa molecular 228.
Linealidad hasta 10 gmL-1 LOD: 0.05 gmL-1
SPE-C18, elucin con acetato de etilo e introduccin directa del extracto en el cromatgrafo (1l del 1er ml eluido)
43
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APARATOS, REACTIVOS Y SOFTWARE UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIN Se recoge a continuacin el instrumental, as como los reactivos, disoluciones y los programas informticos, utilizados para la realizacin de esta memoria a) Aparatos Espectrofluormetro Perkin Elmer, LS-50B, equipado con una lmpara de descarga de Xenon equivalente a 20 KW durante 8 s de duracin y conectado a travs de una interfase RS-232 a un PC IBM PS/2. La adquisicin de datos se lleva a cabo con el software de Perkin-Elmer Fluorescence Data Manager, versin 2.70. Espectrofluormetro Varian, Modelo Cary Elipse equipado con una lmpara contina de Xenon. Est conectado a un PC va una interfase IEE. El paquete de sofware Cary Eclipse Versin 1.0 se utiliz para la adquisicin e interpretacin de datos. Espectrofotmetro UV-Visible Varian, modelo Cary 50 Bio con lmpara de Xenon, ordenador DELL Optiplex GX 280, Intel Pentium 4 incorporado y software propio de Varian Cromatgrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA) compuesto por una bomba cuaternaria Agilent, un desgasificador de disolventes G1322A Agilent, un detector de fotodiodos G1315B Agilent UV-Vis, y un detector fluorescente
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G1321A Agilent. El sistema cromatogrfico est controlado por el HP ChemStation para LC 3D software (Agilent Technologies Inc.). Cromatgrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) equipado con un inyector automtico termostatizado a 6 C y un espectromtro de masas de trampa inica (MSD XCT) conectados a travs de una interfase de ionizacin mediante electrospray (ESI). Se realiza un barrido desde m/z 100 hasta 2200, con una velocidad de 27000 amu/s Potenciostato Autolab PSTAT 10 y stand Metrohm 663VA dotado de una celda con tres electrodos, uno de Ag/AgCl (electrodo de referencia), otro de platino (electrodo auxiliar) y el tercero de carbn vitrificado (electrodo de trabajo, Metrohm 6.1204.040), estando controlado todo el sistema por un PC 486/66 MHz, equipado con el paquete de software GPES 3.4. Espectrmetro de resonancia magntica nuclear Broker AM 400 (400 MHz para protones y 100 MHz para 13C). pH-metro Crison 2001 con electrodo combinado de vidriocalomelanos saturado. Lmpara de mercurio HBO Osram de 200 W, con una fuente de energa Oriel, modelo 8500, protegida con una carcasa metlica.
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Fotoreactor (Softron, Gynkotek HPLC, Alemania), equipado con una lmpara de Xenon de 4 W y un tubo de tefln enrollado alrededor. Bao termosttico Frigiterm 6000382, marca p-Selecta Balanza analtica ER-60A, marca AND, con una sensibilidad de 0.1 mg. Sistema de obtencin de agua ultrapura, Milli-Q equipado con un mdulo RIOs/Elix y un A-10. b) Reactivos trans-Resveratrol (3,4' ,5-trihidroxi-trans-estilbeno), suministrado por Sigma-Aldrich; nmero CAS: 501-36-0. trans-Piceido (3,4',5-trihidroxiestilbeno-3--D-glucopiranosa) suministrado por Aldrich Chem Co; nmero CAS: 65914-17-2. Fenantreno 98%, suministrado por Aldrich Chem . trans-Estilbeno, suministrado por Aldrich Chem . cis-Estilbeno, suministrado por Aldrich Chem. cido glico, suministrado por Sigma-Aldrich. cido p-cumrico, suministrado por Sigma-Aldrich. cido eglico, suministrado por Sigma-Aldrich. cido ferlico, suministrado por Sigma-Aldrich. Quercetina, suministrado por Sigma-Aldrich. Rutina, suministrado por Sigma-Aldrich.
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Catequina, suministrado por Sigma-Aldrich. Epicatequina, suministrado por Sigma-Aldrich. cido vanillico, sumistrado por Fluka. cido cafeco, sumistrado por Fluka. cido sinpico, sumistrado por Fluka. Tartrato disdico dihidratado, suministrado por Scharlau. Perclorato sdico monohidratado, suministrado por Merck. cido perclrico 70%, suministrado por Merck. cido fosfrico suministrado por Panreac. cido clorhdrico, suministrado por Panreac. Reactivo de Folin-Ciocalteu, suministrado por Panreac. c) Disoluciones Disolucin etnolica de trans-resveratrol de 100 g.mL-1, conservada en la obscuridad y a 4 C. Disolucin etnolica de trans-piceido de 100 g.mL-1, conservada en la obscuridad y a 4 C. Disolucin reguladora tartrato monosdico/ tartrato disdico, de pH 5.0, preparada a partir de la sal disdica dihidratada (0.26 M) y aadiendo HCl hasta conseguir el pH deseado. d) Disolventes Etanol, suministrado por Panreac (Espaa). N,N-Dimetilformamida, suministrado por Panreac (Espaa). Dimetilsulfxido, suministrado por Panreac (Espaa).
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Cloroformo, suministrado por Panreac (Espaa). Metanol, suministrado por Panreac (Espaa). Acetonitrilo, grado HPLC , suministrado por Merck (Alemania). ter dietlico, grado HPLC, suministrado por Merck (Alemania). Acetato de etilo, suministrado por Panreac (Espaa). Hexano, grado HPLC, suministrado por Merck (Alemania). e) Programas informticos Grapher 3.0, 2-D Graphing System. Golden Software Inc. Colorado, Usa 2001 PLS Toolbox (Eigenvector Research Inc., WA, USA) MATLAB ver. 7.1.0; The MathWorks Inc., MA, USA. Software THE UNSCRAMBLER Versin 6.11 (Camo A/S Olav Tryggvasonsgt N-7011, Trondheim, Norway), utilizado tanto para el diseo de experimentos, permitiendo la optimizacin a travs de las superficies de respuesta como para el tratamiento de datos multivariantes, permitiendo entre otros mtodos aplicar Anlisis de Componentes Principales (PCA) con fines clasificatorios. ACOC V 2.0 163: Herramienta estadstica para Qumica Analtica en entorno MATLAB 5.3, programa realizado en el Departamento de Qumica Analtica de la UEX que permite realizar todos los clculos de la calibracin univariante, calcular los distintos
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parmetros estadsticos y de calidad de las rectas de calibrado, as como para aplicar diversos test de comparacin. HyperChem versin 7.5 para Windows. Molecular modeling system. 2002, Hypercube, inc.
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Cabanis J.C., Mrillon J.M., J. Agric. Food Chem., 1999, 47:2666-2670

136
J. Agric. Food Chem., 1999, 47:1533-1536

137 138
Bessis R., Anal. Chem., 1997, 69:5172-5177

139
Chem., 1996, 68:1688-1694

140
C., J. Agric. Food Chem., 1996, 44:2124-2128

141 142
Agric. Food Chem., 1996, 44:1975-1978

143
Chem., 1995, 43:316-319

144 145
Chromatogr. A, 1995, 708:89-98

146 147 148 149 150 151
4271
68
MEN
SALIR
152
Minussi R., Rossi M., Bologna L., Cordi L., Rotilio D., Pastore G.M., Duran N., Food Dobisov Z, Pazourek J, Havel J., Electrophoresis, 2002, 23:263-267 Gao L., Chu Q., Ye J., Food Chem., 2002, 78:255-260 Brandolini V., Maietti A., Tedeschi P., Durini E., Vertuani S., Manfredini S., J. Agric. Chen Y.H., Chung Y.L., Lin C.H., J. Chromatogr. A, 2002, 943:287-294 Lin C.H., Chen Y.H., Electrophoresis, 2001, 22:2574-2579 Flamini R., Dall Vedova A., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2004, 18:1925-1931 Shao, Y., Marriot, P., Hgel, H., Chromatographia, 2003, 57:S349-S353 Luan T., Li G., Zhang Z., Anal. Chim. Acta, 2000, 424:19-25 Soleas G.J., Goldberg D.M., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Yan J., Ng E., Am. J. Goldberg D.M., Yan J., Ng E., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Soleas G.J., Espinosa-Mansilla A., Muoz de la Pea A., Gonzlez Gmez D., Chem. Educator,
Chem., 2003, 82:409-416

153 154 155
Food Chem., 2002, 50:7407-7411

156 157 158 159 160 161
Enol. Vitic., 1995, 46:346-352

162
Waterhouse A.L., Am. J. Enol. Vitic., 1995, 46:159-165

163
2005, 10:1-9
69
MEN
SALIR
MEN
SALIR
CAPTULO II DETERMINACIN DE RESVERATROL EN VINO MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA DE SEGUNDA DERIVADA Y EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO
MEN
SALIR
CAPTULO II. Determinacin fluorimtrica de resveratrol en vino
72
MEN
SALIR
ANTECEDENTES Como ya se explicado en la introduccin general de esta memoria, el resveratrol (3,4,5-trihidroxiestilbeno) es un estilbenoide producido por ciertas plantas como respuesta a infecciones fngicas o a un estrs abitico producido, por ejemplo, por iones metlicos. Aparece en moras, cacahuetes y uvas. Concretamente en uvas, forma parte del amplio grupo de compuestos polifenlicos presentes en la piel, pulpa y semilla, que se extraen parcialmente en la elaboracin del vino y son responsables de caractersticas sensoriales de stos como color, sabor, astringencia o dureza. El rango en que se puede encontrar la concentracin del resveratrol en los vinos es muy amplio, As, en la bibliografa se encuentran valores comprendidos entre 0.66 gmL1 a menos de 0.68 ngmL1, para vinos tintos, y desde 100 a menos de 0.23 ngmL1, para vinos blancos1, y segn los datos ms recientes2, el vino tinto contiene una media de 1.9 1.7 g trans-resveratrol/mL siendo no detectable esta compuesto en algunos vinos, y el comportamiento es similar respecto a los niveles de cis. No se puede decir que exista una regin o variedad que produzca vinos con contenidos significativamente diferentes del resto. La diferente concentracin en vinos est motivada tanto por factores relacionados con el cultivo, variedad de uva, factores ambientales en la via, tiempo de vendimia, como por factores relacionados con la elaboracin del vino3. Tambin se ha explicado en la introduccin que el resveratrol presenta un equilibrio cis-trans, y que cuando el trans-resveratrol en disolucin alcohlica se
Siemann E.H., Creasy L.L., Am. J. Enol. Vitic., 1992,43:4952 Stervbo U., Vang O., Bonnesen C., Food Chem., 2007, 101:449 457 3 Kallithraka S., Arvanitoyannis I., El-Zajouli A., Kefalas P., Food Chem., 2001, 75:355363
1 2
73
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SALIR
somete a irradiacin con luz UV intensa se induce, primero, la isomerizacin a cisresveratrol y, posteriormente, la formacin de un compuesto muy fluorescente4, 5. El cis-resveratrol no est presente en las uvas pero s lo est en los vinos6. En cuanto a los mtodos de anlisis de resveratrol encontrados en la bibliografa, se han utilizado ampliamente las tcnicas de separacin, como cromatografa de lquidos o gases y electroforesis capilar7,8, en diferentes alimentos. As, en los ltimos aos, la mayora de los mtodos publicados para el anlisis de trans-resveratrol en vinos, son mtodos de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) y muchos de ellos se recogen en un artculo publicado en el ao 20059, que realiza una extensa revisin de los mtodos de HPLC para el anlisis de este compuesto en diferentes producto alimenticios. En esta revisin se pone de manifiesto que la mayora son mtodos de fase inversa (RP), utilizando metanol o acetonitrilo como disolventes orgnicos y cido actico para modificar la acidez de la fase acuosa. En muchos casos se hace uso de una elucin en gradiente y, en lo referente a la deteccin, se utilizan sobre todo detectores de serie de diodos y las longitudes de onda seleccionadas son 300-308 nm para trans-resveratrol y 285-286 nm para cis-resveratrol. En algunos casos tambin se utilizan otros detectores que proporcionan mejor sensibilidad como detectores fluorescentes o electroqumicos. En el caso de la deteccin fluorescente, las longitudes de ondas utilizadas son 324330/370 y 260/370 nm para trans- y cis-resveratrol, respectivamente. Ms
Roggero J.P, Garcia-Parrilla C., Sci. Aliments, 1995, 15:411422 Roggero J.P., J. Food Comp. and Anal., 200, 13:93-97 6 Trela B.C., Waterhouse A.L., J. Agric. Food Chem., 1996, 44:1253-1257 7 Orea J.M., Montero C., Jimnez J.B., Gonzlez Urea A., Anal. Chem. 2001, 73:59215929 8 Gu X., Chu Q., ODwyer M., Zeece M., J Chromatogr A, 2000, 881:471481 9 Rudolf J.L., Resurreccion V.A., Saalia F.K., Phillips R.D., Food Chem., 2005, 89:623-638
4 5
74
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SALIR
recientemente, X. Vitrac et al10 utilizan los pares 300/390 para el trans y 260/400 nm para el cis y Z. Pieiro et al11 llevan a cabo la deteccin de trans-resveratrol a 310/403 nm, en un medio cido actico al 0.1 % en 70/30 agua/metanol, aportando los espectros fluorescentes de ambos compuestos en dicho medio. Segn los resultados anteriormente expuestos, las caractersticas fotomtricas y fluorimtricas de estos compuestos se recogen en diferentes artculos. Podemos mencionar el publicado por Trela y Waterhouse6, que comparan los espectros UV y los valores de absortividad molar que obtienen para ambos ismeros, en etanol, con los resultados reportados por otros autores y hacen un estudio del proceso de isomerizacin inducido fotoqumicamente. Segn estos autores, las disoluciones de trans-resveratrol en etanol/agua, 50/50, son estables al menos 28 das (CV < 4.7 %), a pH entre 1 y 7, si se protegen de la luz, pero si se irradian se degradan a cis en un 90.6 % en dos horas, si bien valores bajos de pH causan de nuevo la isomerizacin del cis a trans, estricamente ms estable. Estos autores, sin embargo, no hacen referencia alguna al comportamiento fluorescente de trans-resveratrol, que s es descrito anteriormente por Roggero y Garca Parrilla4. Segn sus resultados, mientras que tanto trans como cis-resveratrol son dbilmente fluorescentes, pero al irradiarlos con luz UV intensa, no slo se isomeriza el trans a cis sino que aparece un compuesto muy fluorescente, en cuyo espectro UV, la de mxima absorcin, 260 nm, coincidiendo dicho espectro con el atribuido por Siemann y Creasy1 al cis-resveratrol. A pesar de los datos existentes acerca de las propiedades espectroscpicas del trans-resveratrol, y de la influencia de la irradiacin sobre este compuesto, no se han encontrado antecedentes acerca de la determinacin
Vitrac X., Monti J.P., Vercauteren J., Deffieux G., Mrillon J.M., Anal. Chim. Acta, 2002, 458:103 110 11 Pieiro Z., Palma M., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2006, 1110:6165
10
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fotomtrica o fluorimtrica de este compuesto en vino. Ello, unido al hecho de que an existen, en los artculos citados, resultados discrepantes o no totalmente explicados nos anim a realizar estudios sobre las propiedades espectrales de trans-resveratrol y su modificacin mediante irradiacin UV, con el objetivo ltimo de llegar a proponer un mtodo fluorimtrico de determinacin de este compuesto en vino. RESULTADOS Y DISCUSIN Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-resveratrol Caracterizacin absorbente y luminiscente en distintos disolventes Los estudios bsicos se han iniciado con el estudio del comportamiento absorbente y luminiscente del trans-resveratrol en distintos disolventes. Para ello, en matraces de 10.0 mL se preparan disoluciones que contienen 1.02 gmL-1 de trans-resveratrol (0.20 mL de la disolucin etanlica de trans-resveratrol de 51.0 gmL-1). Los disolventes ensayados son agua y disolventes orgnicos de distintas polaridades como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfxido, N,Ndimetilformamida, 1,4-dioxano, ciclohexano y hexano, as como mezclas hidroetanlicas de diferente composicin. En la Figura 1, se representa el espectro de absorcin de una disolucin acuosa de trans-resveratrol. Presenta una banda de absorcin centrada a 310 nm con un ancho de banda de 20 nm, en la que se distinguen dos mximos centrados a 306 y 319 nm, respectivamente. La forma del espectro, la situacin de los mximos y la absortividad molar no se ven afectados por la naturaleza del
76
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SALIR
disolvente.
0.12
Absorbancia
0.08
0.04
0 240 280 320 (nm) 360 400
Figura 1.- Espectro de absorcin de una disolucin acuosa (2.0 % v/v etanol) conteniendo 1.02 gmL-1 de trans-resveratrol
Este compuesto presenta una dbil fluorescencia nativa y los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia, registrados en algunos de los disolventes ensayados se recogen en la Figura 2. En la mayora de los disolventes ensayados (acetonitrilo, etanol, agua o mezclas hidroetanlicas), los espectros de excitacin presentan dos mximos centrados a 225 y 318 nm, y un nico mximo de emisin centrado a 390 nm. En dimetilformamida se observa un aumento del rendimiento cuntico de fluorescencia del analito, as como la desaparicin del primer mximo de excitacin. En hexano, ciclohexano y 1,4-dioxano, el espectro de emisin se desplaza hipsocrmicamente hasta 373 nm.
77
MEN
SALIR
120 Intenisidad de Fluorescencia
80
40
0 200 250 300
(nm)
350
400
450
Figura 2.-Espectros de excitacin y emisin de disoluciones conteniendo 1.02 gmL-1 de trans-resveratrol en distintos disolventes: () etanol:agua 40:60, v:v (exc/em 318/390 nm), () dimetilformamida (2.0 % etanol) (exc/em 318/390 nm), () hexano (2.0 % etanol) (exc/em 310/373 nm)
Influencia de la acidez del medio. Clculo de constantes de ionizacin de trans-resveratrol Una vez estudiado el efecto que ejerce el disolvente sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes del analito, se procede a estudiar la influencia de la acidez del medio. Dicho estudio se ha llevado a cabo tanto en medio acuoso como en medio hidroetanlico conteniendo el 40 % (v/v) de etanol. Se preparan disoluciones que en un volumen final de 100.0 mL contienen 2.28 gmL-1 de trans-resveratrol, fijndose la fuerza inica del medio con KCl 0.10 M. La variacin del pH se efecta por adicin de pequeos volmenes de disoluciones diluidas de HCl y NaOH. Dado que en principio no se sabe nada acerca de la reversibilidad de los equilibrios en
78
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SALIR
los que el analito participa, se toma la precaucin de utilizar alcuotas independientes de la disolucin, una para acidular y otra para alcalinizar. En las Figuras 3 y 4 se recogen los espectros de absorcin ms representativos en ambos medios, registrados a distintos valores de pH, as como la variacin de la absorbancia a las longitudes de onda de mxima variacin.
0.3
2.0 - 6.0 12.1 10.2
0.3
B 306 nm
Absorbancia
Absorbancia
0.2
0.2 343 nm 0.1
0.1
0 250 300
(nm)
350
400
pH
10
12
14
Figura 3.- (A) Espectros de absorcin correspondientes a trans-resveratrol (2.28 gmL-1) en medio etanol:agua 40:60, v:v, a distintos valores de pH. (B) Variacin de la absorbancia, medida a 306 y 343 nm, con el pH
0.25 0.2 Absorbancia 0.15 0.1 0.05 0
A 1.0 - 7.0
12.2
0.25 0.2 Absorbancia
306 nm
10.0 9.2
0.15 0.1 0.05 0
343 nm
250
300
(nm)
350
400
8 pH
10
12
14
Figura 4.- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcin de trans-resveratrol (1.52 gmL-1) en medio acuoso. (B) Variacin de la absorbancia, medida a 306 y 343 nm, con el pH
79
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SALIR
En los dos medios de trabajo, se observa un comportamiento similar, no producindose cambios en el espectro de absorcin para pH inferiores a 7.0. Para pH superiores se observa una disminucin en la absorbancia a 306 nm, a medida que la banda de absorcin sufre un desplazamiento batocrmico, centrndose a 343 nm en medio fuertemente alcalino (pH > 12). En la Figura 3B, se detecta un cambio brusco de la seal en el intervalo de pH 9.0-12.0, correspondiente a la ionizacin del analito. El valor de pKa de este equilibrio, se ha calculado mediante los mtodos de Stenstrm y Goldsmith12 y de Wilson y Lester13. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1. El caso del estudio en medio acuoso, es algo ms complejo, porque, como se aprecia en la Figura 4B, en la variacin de la absorbancia medida a 343 nm se pueden observar dos tramos diferentes, correspondientes a dos disociaciones muy cercanas entre si, uno en el intervalo de pH 8.0-9.0 y otro en el intervalo 10.0-12.0, con una pequea meseta intermedia en el intervalo de pH 9.0-10.0. Debido a la proximidad de ambos equilibrios, los mtodos de clculo anteriores no pueden ser aplicados para el clculo de los valores de pKa, ya que no existe una meseta claramente definida entre ambos equilibrios, no pudiendo relacionar los valores de absorbancia correspondientes a la regin de pH 9.0-10.0, con la concentracin de la especie intermedia. En este caso, los valores de pKa se han calculado mediante el uso de diagramas de absorbancia (diagramas-A). Un diagrama-A es una representacin de la absorbancia a una longitud de onda frente a la absorbancia a una segunda longitud de onda, de manera que el diagrama refleja los cambios relativos de
12 13
Stenstrm W., Goldsmith N., J. Phys. Chem., 1926, 30:1683-1687 Wilson R.F., Lester G.W., Talanta, 1963, 10:319-322
80
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SALIR
absorbancia a ambas longitudes de onda, en funcin del pH. Para un sistema en el que est implicado un nico equilibrio, la absorbancia a cualquier longitud de onda, debe ser proporcional a la absorbancia a cualquier otra longitud de onda, de manera que los diagramas sern lineales. No obstante, cuando un sistema est gobernado por dos o ms equilibrios, los diagramas de absorbancia cambiarn de direccin cada vez que un nuevo equilibrio domine el sistema14. Estos diagramas son particularmente tiles para sistemas en los que los espectros no revelan claramente el nmero de equilibrios implicados.
0.24 Absorbancia (306 nm) 0.2 0.16 0.12 0.08 0.04 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 Absorbancia (343 nm) 0.24 H3Re HRe2H2Re-
Figura 5.- Diagrama de absorbancia A306 nm vs A343 nm de trans-resveratrol en medio acuoso. Rango de pH 7.5-11.5
En este caso, se han empleado los valores de absorbancia a 306 y 343 nm, como longitudes de onda caractersticas de sus formas cida y bsica, respectivamente, para construir el diagrama-A, representado en la Figura 5. En dicho diagrama se pueden distinguir dos tramos rectos, lo que sugiere la presencia de dos equilibrios. La primera ionizacin predomina en el rango de pH 7.5-8.9 (primer tramo lineal) y la segunda en el rango 10.0-11.5 (segundo tramo lineal). El
14 Polster J., Lachmann H., Spectrometric Titration, Analysis of Chemical Equilibria; VCH, Weinheim, 1989
81
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SALIR
punto del diagrama correspondiente a pH 7.5 se encuentra sealado como H3Re (resveratrol en forma neutra, como especie predominante) y el correspondiente a pH 11.5 como HRe2- (resveratrol-difenxido, como especie predominante). En el punto de interseccin entre los dos tramos lineales, la especie resveratrolmonofenxido coexiste en equilibrio, por ello este punto se ha etiquetado como H2Re-. Los valores de pKa calculados, son 8.2 y 9.7, respectivamente. El estudio de la influencia de la acidez del medio sobre la fluorescencia del trans-resveratrol se ha llevado a cabo igualmente en medio acuoso y en medio hidroetanlico 60:40 (agua:etanol), preparando disoluciones que en un volumen final de 25.0 mL contienen 0.98 gmL-1 de analito y KCl 0.1 M. En las Figuras 6 y 7 se recogen, los espectros de excitacin y emisin a distintos valores de pH, en cada uno de los medios de trabajo ensayados, as como la variacin de la seal de fluorescencia, a las longitudes de onda correspondientes a las formas cida y bsica, con el pH.
600 Intensidad de Fluorescencia

< 6.0
I.F.(exc 318 nm) (385 nm)
400
400
200
> 10.0
200 I.F.(exc 342 nm) (459 nm) 0
0 200 300 400 (nm) 500 600
pH
10
12
14
Figura 6.- (A) Espectros de excitacin y emisin correspondientes a una disolucin conteniendo 0.98 gmL-1 de trans-resveratrol en etanol:agua 40:60, v:v, en medio cido (exc/em = 318/385 nm) y bsico ( exc/em = 342/459 nm). (B) Variacin de las seales de fluorescencia a exc/em = 318/385 nm y 342/459 nm, con el pH
82
MEN
SALIR
250 Intensidad de Fluorescencia 200 150 100 50 0 200 300 400 (nm) 500 600 > 10.0

< 6.0
I.F.(exc 318 nm) (404 nm)
200 150 100 50 0 0 2 4 6 pH 8 10 12 14 I.F.(

exc 341 nm
) (460 nm)
Figura 7.- (A) Espectros de excitacin y emisin correspondientes a una disolucin conteniendo 0.98 gmL-1 de trans-resveratrol en agua, a pH cido (exc/em = 318/404 nm) y bsico (exc/em = 341/460 nm). (B) Variacin de las seales de fluorescencia a exc/em = 318/404 nm y 341/460 nm, con el pH
Al disminuir la acidez, se produce un desplazamiento batocrmico en los espectros de excitacin de 318 a 342 nm y de 318 a 341 nm, y de emisin de 385 a 459 nm y de 404 a 460 nm, en medio hidroetanlico y acuoso, respectivamente, adems de una disminucin del rendimiento cuntico de fluorescencia, en ambos casos. En base a las curvas de variacin de la seal de fluorescencia con el pH, se han calculado valores de pKa, cuyos resultados se encuentran en la Tabla 1. Los valores de las constantes de ionizacin del trans-resveratrol se encuentran recogidos en dos artculos. En el primero de ellos15, se describen valores de pKa de pKa1= 8.01, pKa2= 9.86 y pKa3= 10.5 en medio acuoso, obtenidos fotomtricamente por extrapolacin de los valores obtenidos en distintos medios hidrometanlicos. Estos valores de pKa1 y pKa2 son bastante coincidentes con los calculados fotomtricamente en nuestro caso, mediante el mtodo del diagrama-
15 Takagai Y., Kubota T., Kobayashi H., Tashiro T., Takahashi A., Igarashi S., Anal. Sci., 2005, 21:183-186
83
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SALIR
A14, para trans-resveratrol en medio acuoso. En el segundo trabajo16, se describe la obtencin de las constantes de disociacin de primer orden de trans-resveratrol y trans-piceido, en medio acuoso, mediante datos electroforticos, proporcionando valores de pKa1= 9.49 y 9.40, respectivamente. El valor de pKa1 calculado en este trabajo para trans-resveratrol es bastante cercano al valor de pKa2 calculado por nosotros fotomtricamente, mediante el mtodo del diagrama-A.
Tabla 1.- Valores de pKa calculados para el trans-resveratrol en diferentes medios, mediante fotometra y fluorescencia, utilizando diferentes mtodos de clculo
Mtodo de Clculo
FOTOMETRA
pKa trans-resveratrol 10.4 0.1 10.4 pKa1= 8.2 pKa2= 9.7
Etanol:Agua 40:60, v:v Agua Etanol:Agua 40:60, v:v Agua
Stenstrm y Goldsmith* Wilson y Lester Diagrama-A Stenstrm y Goldsmith* Wilson y Lester Stenstrm y Goldsmith* Wilson y Lester
FLUORESCENCIA
9.1 0.5 9.2 8.5 0.1 8.5
* Valor medio Desviacin Estndar
Para estudiar la reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra involucrado el trans-resveratrol, al variar el pH, se alcaliniza una muestra, en las mismas condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del pH, hasta un pH en torno a 12, y se acidula a continuacin, hasta un pH prximo al inicial. Se encuentra que el espectro correspondiente a la muestra original y el
16 Cao J., Chen G.H., Du Y.S., Hou F.F., Tian Y.L., J. Liquid Chromatogr. and Rel. Technol., 2006, 29:1457-1463
84
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SALIR
registrado una vez que se alcaliniza y acidula posteriormente son idnticos, de donde se deduce que se trata de un equilibrio cido-base reversible. Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad Se procede a estudiar la relacin entre la concentracin de transresveratrol y las seales fotomtrica y fluorescente, y al establecimiento de las correspondientes rectas de calibrado. Para obtener las seales fotomtricas se procede aadiendo directamente en la cubeta de medida 2.00 mL de agua ultrapura y volmenes crecientes, comprendidos entre 0.020 y 0.25 mL, de una disolucin etanlica de transresveratrol de 49 gmL-1. Los espectros de absorcin se registran en un rango de longitudes de onda comprendido entre 240 y 360 nm. Las medidas de fluorescencia se realizan aadiendo directamente en la cubeta de medida 1.80 mL de agua y 1.20 mL de etanol absoluto, con el objetivo de mantener la composicin ptima del medio de trabajo, ya que la emisin fluorescente depende del % de etanol en el medio. Sobre esta mezcla hidroetanlica, una vez desgasificada por ultrasonidos, se aaden volmenes sucesivos de una disolucin etanlica de trans-resveratrol, de 49 gmL-1, en incrementos de 5.0 L, hasta llegar a 0.050 mL. Tras cada nueva adicin, se registran los espectros de emisin (exc = 318 nm) en las siguientes condiciones instrumentales: 20C, rendijas de excitacin y emisin 5 nm respectivamente, voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V.
85
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SALIR
Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas tcnicas, as como los parmetros analticos de calidad, se encuentran recogidos en la Tabla 2.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin fotomtrica y fluorimtrica de trans-resveratrol
trans-resveratrol Fotometra Seal Analtica Rango Lineal (gmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mLg-1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (-1) (gmL-1) LOD, Long y Winefordner17 (gmL-1) LOD, Clayton18 (==0.05) (gmL-1) A306 nm 0.50 5.00 -0.0037 0.0025 0.127 0.001 0.0077 0.999 0.999 99.3 0.0604 0.0583 0.135 Fluorescencia I.F.318/385 nm 0.080 0.80 12.8 5.5 938 13 13.1 0.999 0.997 98.6 0.0140 0.0179 0.0345
17 18
Long G.L., Winefordner J.D., Anal. Chem., 1983, 55:712724 Clayton C.A., Hines J.W., Elkins P.D., Anal. Chem., 1987, 59:25062514
86
MEN
SALIR
Repetitividad de los mtodos Para llevar a cabo este estudio se siguen los procedimientos que se describen a continuacin: Mtodo fotomtrico: Para realizar el estudio de la repetitividad se preparan, segn el mtodo anteriormente descrito, 11 rplicas de una muestra que contiene 1.43 gmL-1 de trans-reveratrol y se miden las absorbancias correspondientes a 306 nm. Aplicando el clculo estadstico a los datos obtenidos, la desviacin estndar relativa resulta ser del 2.2 %. Mtodo fluorimtrico: Mediante fluorescencia, el estudio de la repetitividad del mtodo se lleva a cabo con 11 rplicas de una muestra que en este caso contiene 0.32 gmL-1 de trans-reveratrol. Las seales obtenidas a 385 nm (exc = 318 nm) se tratan estadsticamente obtenindose un valor para la desviacin estndar relativa del 4.7 %. Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrol En esta seccin se describe el estudio realizado sobre la fotorreaccin que sufre el analito, en distintos disolventes. Se ha investigado el efecto de diversas variables, como la composicin y la acidez del medio, tanto sobre el proceso de fotodescomposicin como sobre las propiedades del fotoproducto.
87
MEN
SALIR
Influencia del disolvente En primer lugar, se procede a estudiar la influencia de la composicin del medio en el desarrollo de la fotorreaccin que tiene lugar cuando las disoluciones de trans-resveratrol son irradiadas bajo una lmpara de mercurio de alta presin. Para ello, se preparan disoluciones de trans-resveratrol por dilucin de una disolucin madre concentrada con disolventes orgnicos de diferentes polaridades, as como agua y mezclas hidroetanlicas. Se examinan las propiedades absorbentes y fluorescentes de estas disoluciones, previa irradiacin de las mismas durante distintos intervalos de tiempo, en diferentes medios de trabajo. Absorcin molecular.- Se comprueba que el porcentaje de etanol en el medio no influye sobre el espectro de absorcin de trans-resveratrol, como se explic anteriormente, siendo ste exactamente igual, en intensidad y fisonoma, en etanol, en agua y en mezclas hidroetanlicas de diferente composicin. Sin embargo, s lo hace sobre los espectros de absorcin de los fotoproductos que se van generando durante la irradiacin de las respectivas disoluciones bajo una lmpara de mercurio de alta presin, as como sobre la cintica de la fotorreaccin. Para realizar este estudio, se preparan disoluciones, conteniendo todas ellas 2.04 gmL-1 de trans-resveratrol, en etanol absoluto y en mezclas hidroetanlicas de composicin variable. En la Figura 8 se recoge la evolucin de los espectros de absorcin de cuatro de estas disoluciones, con el tiempo de irradiacin bajo una lmpara de mercurio de alta presin.
88
MEN
SALIR
0.3
0.3
Absorbancia
0.1
Absorbancia 240 280 320 360
0.2
0.2
0.1
0 (nm)
0 240 280 (nm) 320 360
0.3
0.3
Absorbancia
0.1
Absorbancia 240 280 320 360
0.2
0.2
0.1
0 (nm)
0 240 280 (nm) 320 360
Figura 8.- Influencia del tiempo de irradiacin sobre disoluciones de trans-resveratrol en etanol absoluto (A) y en etanol:agua 60:40, v:v (B), 40:60, v:v (C) y 4:96, v:v, (D), sin irradiar () e irradiadas durante 5 segundos (), 30 segundos (), 60 segundos () 120 segundos () y 300 segundos (). [trans-resveratrol] = 2.04 gmL-1
Como se observa, al irradiar las disoluciones de resveratrol en etanol, agua o en cualquier medio hidroetanlico, la fisonoma del espectro cambia totalmente, desapareciendo en todos los casos la banda ancha de absorcin caracterstica del trans-resveratrol y observndose un nuevo mximo de absorcin centrado a 290 nm, correspondiente, segn aparece descrito en la bibliografa, a cis-resveratrol6. La intensidad de este mximo prcticamente no vara con el tiempo de irradiacin.
89
MEN
SALIR
Cuando el porcentaje de etanol est comprendido entre 40 % y 60 % y las disoluciones son irradiadas durante 120 segundos, se observa la aparicin de un segundo mximo de absorcin centrado a 260 nm, tanto o ms importante que el anterior, que sin embargo a penas se aprecia en etanol puro, o con elevados contenidos de agua. En etanol absoluto, dicho mximo se observa de una forma muy tenue para tiempos de irradiacin en torno a 60 segundos. En cualquier caso, la irradiacin de las disoluciones durante tiempos mayores implica la destruccin de este ltimo fotoproducto, como puede observarse en los espectros registrados para las disoluciones irradiadas durante cinco minutos. Por ltimo, es importante destacar que se ha comprobado que el tiempo de irradiacin necesario para la obtencin de los fotoproductos est directamente relacionado con el rango de concentraciones de la disolucin inicial del analito, en su forma trans original. Fluorescencia molecular.- Con el objetivo de evaluar la influencia de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades fluorescentes de los fotoproductos en diferentes disolventes, se prepara, en primer lugar, una disolucin conteniendo 57 ngmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, y se registran los espectros de excitacin y emisin, de la disolucin recin preparada, y tras ser irradiada durante 60 segundos bajo una lmpara de mercurio de alta presin. Dichos espectros se recogen en la Figura 9, y como puede observarse, se comprueba que la irradiacin ultravioleta externa de disoluciones hidroetanlicas de trans-resveratrol tiene como consecuencia la generacin de fotoproductos altamente fluorescentes. Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por presentar un intenso y agudo mximo de excitacin centrado a 260 nm, y dos mximos de emisin, en torno a 364 y 382 nm respectivamente.
90
MEN
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Se han ensayado otros disolventes, concretamente metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfxido, N,N-dimetilformamida, 1,4-dioxano, ciclohexano y hexano, encontrndose que la naturaleza del fotoproducto es independiente del disolvente, como puede deducirse de los espectros prcticamente idnticos obtenidos en todos disolventes ensayados. De dicho estudio, se deduce tambin que la velocidad de las fotorreacciones est altamente influida por el disolvente, siendo mayor en medios puramente orgnicos que en medios hidroorgnicos. Por otra parte, se encuentra que el rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos es mximo en medios hidroetanlicos en los que las proporciones de etanol y agua son similares, por lo que elegimos este medio para posteriores estudios.
200
100
0 200 300 (nm) 400 500
Figura 9.- Espectros de excitacin y emisin correspondientes a una disolucin conteniendo 57 ngmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, aislada de la luz () (exc/em 318/390 nm), e irradiada durante 60 segundos (), bajo una lmpara de mercurio de alta presin (exc/em 260/364 nm)
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MEN
SALIR
Con el objetivo de encontrar la composicin del disolvente en el que se obtengan las mayores seales, en pro de la sensibilidad de los mtodos, se preparan una serie de disoluciones, conteniendo todas ellas 2.28 gmL-1 de transresveratrol, en etanol, en agua, y en diferentes proporciones de ambos disolventes. En cada caso, se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccin, por irradiaciones acumulativas de la misma disolucin bajo la lmpara de mercurio de alta presin, registrando los espectros de excitacin y emisin de la disolucin que est siendo irradiada, a las longitudes de onda de mxima seal de los fotoproductos. En la Figura 10A se encuentra representada la evolucin de la seal de fluorescencia fotoinducida, con el tiempo de irradiacin de las disoluciones de trans-resveratrol, en los distintos medios de trabajo ensayados. En todos los casos, se observa un aumento de la seal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacin, hasta alcanzar un mximo, seguido por un decaimiento de la seal, probablemente debido a la destruccin de los fotoproductos y a la generacin de otros fragmentos no fluorescentes.
500 I. F. (364 nm) (exc = 260 nm) 400 300 200 100 0 0
500 I. F. (364 nm) (exc = 260 nm) 400 300 200 100 0
50 100 150 200 250 Tiempo de Irradiacin (s) 300
20
40 60 % v. Etanol
80
100
Figura 10.- (A) Evolucin de la intensidad de fluorescencia a 364 nm (exc= 260 nm) con el tiempo de irradiacin de disoluciones conteniendo 2.28 gmL-1 de trans-resveratrol en etanol absoluto (), agua (), y etanol:agua 80:20, v:v (), 60:40, v:v (), 40:60, v:v () y 20:80, v:v (). (B) Influencia del porcentaje de etanol en el medio sobre la seal de fluorescencia a 364 nm (exc= 260 nm) para un tiempo de irradiacin de 120 segundos
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En disoluciones puramente etanlicas, el tiempo de irradiacin ptimo est en torno a 25 segundos y la fluorescencia de los fotoproductos es muy dbil. A medida que disminuye el porcentaje de etanol en el medio aumenta el tiempo de irradiacin necesario para lograr la mxima seal, as como las seales de fluorescencia fotoinducida. En la Figura 10B se representa la intensidad de fluorescencia obtenida para cada una de las disoluciones al irradiarlas durante 120 segundos. Se observa que, en este caso, la mxima seal se obtiene en medios con un porcentaje de etanol comprendido entre el 30 % y el 50 %. Por ello, para futuras experiencias se elige como medio de trabajo ptimo una mezcla etanol:agua 40:60, v:v. No obstante, se encuentra que el tiempo de irradiacin ptimo es dependiente de la concentracin de trans-resveratrol inicial, siendo necesario optimizar dicho parmetro una vez establecido el rango de concentraciones de trabajo. Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes del fotoproducto de resveratrol Una vez establecidas las condiciones ptimas para la obtencin del fotoproducto fluorescente de resveratrol, y caracterizado el mismo fotomtrica y fluorimtricamente, se procede a estudiar la influencia de la acidez del medio sobre sus propiedades espectroscpicas. En todos los casos se fija la fuerza inica del medio por adicin de KCl, en una concentracin final de 0.10 M. Se obtiene el fotoproducto y estas disoluciones se dividen en dos porciones, de las cuales una ser alcalinizada y la otra acidulada
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mediante la adicin de pequeos volmenes de disoluciones diluidas de NaOH y HCl, respectivamente, ya que inicialmente no se tienen datos acerca de la reversibilidad de los procesos que ocurren. El estudio fotomtrico se lleva a cabo sobre una disolucin conteniendo 1.20 gmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, irradiada durante 60 segundos. En la Figura 11 se han recogido los espectros ms significativos a distintos valores de pH, as como la variacin de la seal fotomtrica a las longitudes de onda caractersticas de las formas cida y bsica.
0.12
0.12
8.4 9.8 10.7 11.0

Absorbancia 0.08
261 nm
Absorbancia
0.08
0.04
3.5
0.04
303 nm
0 240 260 280 300 320 (nm) 340 360
0 0 2 4 6 pH 8 10 12 14
Figura 11.- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcin del fotoproducto del transresveratrol en medio etanol:agua 40:60, v:v. (B) Variacin de la absorbancia a 261 y 303 nm con el pH, [trans-resveratrol ]inicial = 1.20 gmL-1
El espectro de absorcin del fotoproducto, en medio neutro y cido, est caracterizado por un mximo centrado a 261 nm, y otro de menor importancia centrado a 287 nm. Para valores de pH superiores a 10, el primer mximo desaparece y el segundo se desplaza batocrmicamente hasta 303 nm.
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El estudio de la influencia del pH sobre la fluorescencia del fotoproducto se lleva a cabo sobre una disolucin conteniendo 98 ngmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, irradiada durante 60 segundos. En la Figura 12A se representan los espectros de excitacin y emisin a diferentes valores de pH. La curva de variacin de la seal de fluorescencia con el pH, Figura 12B, muestra una meseta para valores de pH inferiores a 7.0, y un decaimiento drstico de la seal para valores de pH superiores a 7.0, obtenindose una seal inapreciable para pH superiores a 11.0. Se comprueba que el producto resultante de la degradacin alcalina del fotoproducto de resveratrol no es fluorescente.
800 Intensidad de Fluorescencia 600 400 200 0 200 250 300 350 (nm) 400 450 9.9 > 12.0 0 0 2 4 6 pH 8 10 12 14 800 < 7.0 I. F. (364 nm) (exc= 260 nm) 600 400 200
Figura 12.- (A) Espectros de excitacin y emisin del fotoproducto de trans-resveratrol a distintos valores de pH. (B) Variacin de la intensidad de fluorescencia con el pH. [trans-resveratrol] = 98 ngmL-1, exc= 260 nm, em= 364 nm
Adicionalmente,
se
estudia
fotomtrica
fluorimtricamente
la
reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra involucrado el fotoproducto de resveratrol, al alcalinizar. Para ello, se alcalinizan muestras en las mismas condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del pH, hasta un pH en torno a 12, y se acidulan a continuacin, hasta un pH prximo al inicial. Por comparacin de los espectros correspondientes a las muestras neutras originales y los registrados tras la variacin del pH, se deduce que la
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transformacin que sufre el fotoproducto del resveratrol en medio alcalino no es reversible. Por ello, no ha sido posible calcular el valor de pKa correspondiente al fotoproducto de resveratrol, por no tratarse de un equilibrio cido-base, sino de una hidrlisis alcalina irreversible. Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad Una vez establecida la influencia de las variables qumicas, y determinados sus valores ptimos, y dada la mejora de sensibilidad y selectividad que supone, en general, utilizar seales fluorimtricas, se procede a estudiar la relacin entre la concentracin de trans-resveratrol puesta y la seal de fluorescencia fotoinducida, as como al establecimiento de la correspondiente recta de calibrado. Para ello, se preparan muestras conteniendo entre 6.6 y 66 ngmL-1 de analito en etanol:agua 40:60, v:v, y se irradian durante 60 segundos. A continuacin, se registran los espectros de emisin de las disoluciones irradiadas, en las siguientes condiciones experimentales: 20C, rendija de excitacin 5 nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y exc = 260 nm. En la Tabla 3 se recogen los parmetros analticos de calidad correspondientes a la determinacin de resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida, utilizndose como seal analtica la intensidad de fluorescencia a 365 nm.
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Tabla 3.- Parmetros analticos para la determinacin de trans-resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida (exc/em = 260/365 nm)
Rango Lineal (ngmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mL ng -1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (-1) (ngmL-1) LOD, Long y Winefordner (ngmL-1) LOD, Clayton (==0.05) (ngmL-1)
6.6 66 21.1 3.5 7.77 0.12 10.5 0.998 0.996 98.5 1.35 1.56 3.08
Repetitividad del mtodo Para determinar la repetitividad del mtodo, se prepara una serie de once disoluciones independientes, conteniendo 19.2 ngmL-1 de trans-resveratrol, se irradian en las mismas condiciones utilizadas para el establecimiento de las rectas de calibrado, y se registran sus espectros de emisin, manteniendo igualmente las condiciones instrumentales empleadas en dicha experiencia. La desviacin estndar relativa calculada sobre las seales medidas resulta ser 3.6%.
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Estudio extracto-espectrofluorimtrico de trans-resveratrol. Aplicacin al anlisis de muestras de vino Los mtodos de anlisis de resveratrol en muestras de vino, descritos en la bibliografa, siempre hacen uso de tcnicas separativas, bien cromatogrficas o bien electroforticas, pero no se han encontrado antecedentes sobre mtodos espectroscpicos de anlisis de este analito en muestras de vino. Por ello, en este apartado se describen los estudios encaminados a proponer un nuevo mtodo de anlisis de resveratrol en vino, en presencia de su principal interferencia, su glucsido, mediante fluorescencia fotoinducida. Como paso previo a la determinacin mediante fluorescencia fotoinducida, es necesaria una etapa de limpieza de la muestra para reducir la seal de fondo de la matriz. Con este objetivo se lleva a cabo el estudio extracto-espectrofluorimtrico del analito, con objeto de optimizar las condiciones para la extraccin lquidolquido que se usar en dicha etapa.
Influencia de la naturaleza del disolvente orgnico en la extraccin En primer lugar se realizan ensayos mediante absorcin molecular, con diferentes disolventes, y se comprueba que los mayores rendimientos de extraccin se obtienen empleando ter etlico o acetato de etilo, y que, sin embargo, al emplear cloroformo, prcticamente el 100 % del analito permanece en fase acuosa. Por otra parte, el rendimiento cuntico de fluorescencia del fotoproducto de resveratrol en ter etlico o en acetato de etilo est muy por debajo del observado en el medio hidroetanlico anteriormente optimizado, por lo que ser necesario
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evaporar a sequedad los extractos orgnicos y reconstituir el residuo con la mezcla hidroalcohlica. En base a estos estudios previos, se elige ter etlico como agente extractante por dos motivos fundamentales: las recuperaciones del analito estn en torno al 100 % y la elevada volatilidad del disolvente facilita su eliminacin, lo que acortar sustancialmente el tiempo de anlisis. Antes de optimizar las variables que influyen en la extraccin, se realizan pruebas de extraccin en la matriz del vino, ya que ste va a ser el objeto final de nuestro anlisis. Se aprecia una importante contribucin de la matriz en la seal de fluorescencia, en las condiciones necesarias para la obtencin del espectro de emisin del fotoproducto del trans-resveratrol. Sin embargo, se ha comprobado que esta contribucin se reduce en gran medida, por obtencin de las seales derivadas, fundamentalmente de la segunda derivada. Por ello, a partir de estos resultados previos, para evaluar la recuperacin del trans-resveratrol en ter, se sigue el siguiente procedimiento: se preparan 10.0 mL de disolucin acuosa de trans-resveratrol conteniendo 57 ngmL-1 y se extraen con 10.0 mL de ter etlico, agitando vigorosamente durante dos minutos. Se recoge el extracto orgnico, que se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitrgeno a temperatura ambiente. El residuo se redisuelve en 4.0 mL de etanol y se aade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 10.0 mL. Se registran los espectros de fluorescencia y se obtiene la segunda derivada, mediante el algoritmo de Savitzky-Golay19 ( = 5 nm). Los espectros sin derivar y derivados, correspondientes a la disolucin reconstituida, sin irradiar e irradiada durante 60 segundos en la lmpara de mercurio de alta presin, se recogen en la Figura 13. Por comparacin del espectro segunda derivada de fluorescencia fotoinducida correspondiente al extracto evaporado y reconstituido, con el espectro
19
Savitzky A., Golay M.J.E., Anal. Chem., 1964, 36:16271639
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segunda derivada correspondiente a un patrn de la misma concentracin en etanol:agua 40:60 (v:v) e irradiado durante 60 s, se comprueba que la recuperacin es prcticamente del 100 %. Por otra parte, como puede observarse en la misma figura, la seal procedente de las muestras sin irradiar prcticamente se hace cero en todo el intervalo de longitudes de onda al emplear la segunda derivada.
800 Intensidad de Fluorescencia 600 400 200 0 330
8 4 0 -4 -8
360
390 em (nm)
420
450
330
360
390 em (nm)
420
450
Figura 13.- A) Espectros de fluorescencia (exc= 261 nm) correspondientes al extracto etreo evaporado y reconstituido con etanol:agua 40:60 (v:v) () y a un patrn de idntica concentracin en el mismo medio disolvente (), sin irradiar () e irradiadas () durante 60 s. B) Segunda derivada de los espectros de fluorescencia
Se procede a continuacin a estudiar la influencia de distintas variables experimentales sobre la extraccin de resveratrol con ter etlico. Influencia del pH en la extraccin Para fijar el pH de la fase acuosa, se ensayan diversos tampones y finalmente se decide utilizar tampones cido tartrico/tartrato monocido de sodio o tartrato monocido de sodio/tartrato disdico, ya que no producen quenching de la seal de fluorescencia, y adems son tampones presentes en el vino de forma natural.
100
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Se preparan una serie de muestras conteniendo 57 ngmL-1 de resveratrol y una concentracin 0.10 M de tampones cido tartrico/tartrato monocido de sodio o tartrato monocido de sodio/tartrato disdico de distintos valores de pH, en un volumen final de 10.0 mL de fase acuosa. Las muestras se extraen con 10.0 mL de ter etlico, agitando durante dos minutos y dejando decantar las fases. Se recoge la fase orgnica y se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitrgeno a temperatura ambiente; el residuo se redisuelve en 4.0 mL de etanol y se aade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 10.0 mL. Se registran los espectros de fluorescencia de estas muestras tras irradiarlas durante 60 segundos y se calculan los espectros segunda derivada, mediante el algoritmo de Savitzky-Golay ( = 5 nm). Tambin se registran los espectros de fluorescencia, y se calculan los espectros segunda derivada, en idnticas condiciones, de disolucines patrn conteniendo la misma concentracin de resveratrol en etanol:agua 40:60 (v:v), a los distintos valores de pH e irradiadas durante 60 segundos. La recuperacin se calcula por comparacin de la amplitud de los espectros segunda derivada de fluorescencia fotoinducida, entre 364 y 374 nm (2D364-374), con la seal correspondiente al patrn. En la Figura 14 se muestra el porcentaje de recuperacin para cada uno de los valores de pH ensayados y se observa que las recuperaciones son mximas y prximas al 100 % para valores de pH comprendidos entre 4.5 y 6.0.
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120 100 % Recuperacin 80 60 40 20 0 2 3 4 pH 5 6 7
Figura 14.- Influencia del pH de la fase acuosa sobre el porcentaje de recuperacin en la extraccin
Para posteriores experiencias, se fija el pH por adicin de tampn tartrato monocido de sodio/tartrato disdico de pH 5.0. Se procede a continuacin a optimizar la concentracin de la disolucin reguladora de pH en la fase acuosa. Para establecer la influencia de la concentracin de disolucin reguladora se preparan disoluciones conteniendo 57 ngmL-1 de resveratrol, volmenes variables de tampn tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.26 M de pH 5.0 y agua desionizada hasta 10.0 mL. Estas disoluciones se extraen con 10.0 mL de ter etlico agitando durante dos minutos. Cuando la separacin de fases es completa, se recogen los extractos orgnicos y se opera como en el caso anterior. La recuperacin est prxima al 100 % cuando la concentracin de tampn en fase acuosa es de 0.15 M, que se selecciona como concentracin de tampn ptima para futuras experiencias.
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Influencia del tiempo de agitacin Para este estudio se preparan cuatro muestras acuosas conteniendo 57 ngmL-1 de resveratrol, cuyo pH se fija por adicin de 5.0 mL de tampn tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.30 M de pH 5.0 en un volumen final de 10.0 mL. Dichas muestras, tras la adicin de 10.0 mL de ter etlico se agitan durante tiempos variables comprendidos entre 30 y 120 segundos. Una vez separadas las fases, se recoge en cada caso la fase orgnica y se procede como en experiencias anteriores. El tiempo de agitacin no influye apreciablemente en la extraccin del analito, y para posteriores experiencias se fija un minuto como tiempo de agitacin adecuado.
Influencia de la relacin de fases Para establecer la influencia de la relacin de fases se opera sobre disoluciones acuosas conteniendo 0.57 g de resveratrol, el volumen necesario de etanol absoluto para que el porcentaje de etanol en la fase acuosa sea del 3 %, volmenes variables de disolucin reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.30 M de pH 5.0, tales que la concentracin final de tampn sea 0.15 M y volmenes variables de agua desionizada. Todas ellas se extraen con 10.0 mL de ter etlico, agitando durante un minuto. Se dejan en contacto ambas fases hasta su completa separacin y se toma la fase orgnica, sobre la que se aplica el tratamiento anteriormente descrito. La relacin de fases no afecta prcticamente a la extraccin del analito, al menos hasta un valor 4:1 (fase acuosa:fase orgnica), ya que en todos los casos la
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recuperacin est en torno al 100 %. Para posteriores experiencias se fija como relacin de fases 2:1, ya que para mayores valores de dicha relacin se dificulta mucho la recogida cuantitativa del extracto etreo. Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad Dada la necesidad de recurrir a la tcnica de derivadas para minimizar la seal de la matriz del vino, se procede a comprobar la linealidad entre la concentracin de trans-resveratrol en la muestra original y la amplitud del espectro segunda derivada. Para ello, se preparan disoluciones conteniendo entre 6.6 y 66 ngmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, y se irradian durante 60 segundos. Se registran los espectros de fluorescencia de las disoluciones irradiadas, en las siguientes condiciones experimentales: 20C, rendija de excitacin 5 nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y exc= 260 nm. Por ltimo, se obtienen los correspondientes espectros segunda derivada, mediante el algoritmo de Savitzky-Golay ( = 5 nm). La mxima sensibilidad se obtiene al emplear como seal analtica la amplitud de la derivada entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm). En la Tabla 4 se recogen los parmetros analticos de calidad para la determinacin de resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida segunda derivada.
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Tabla 4.- Parmetros analticos para la determinacin de trans-resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida segunda derivada
Rango Lineal (ngmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mL ng -1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (-1) (ngmL-1) LOD, Long y Winefordner (ngmL-1) LOD, Clayton (==0.05) (ngmL-1)
6.6 66 -0.0904 0.1310 0.182 0.004 0.397 0.995 0.991 97.6 2.18 2.20 4.98
Repetitividad del mtodo Se preparan once disoluciones conteniendo 19.2 ngmL-1 de transresveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, y se irradian durante 60 segundos. Se registran sus espectros de emisin de fluorescencia, manteniendo las condiciones experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado, y se obtienen los espectros segunda derivada, mediante el algoritmo de Savitzky-Golay ( = 5 nm). es 4.8 %. La desviacin estndar relativa (n = 11) calculada sobre 2D356-364nm,
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Determinacin de resveratrol en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada El procedimiento de extraccin y posterior medida de la fluorescencia fotoinducida, anteriormente optimizado, se aplica al anlisis de trans-resveratrol en muestras de vino. Dicho procedimiento se puede enunciar como sigue: en un embudo de decantacin se aaden 0.10 mL de vino tinto 0.5 mL de vino blanco, 5.0 mL de disolucin reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.30 M, de pH 5.0, y se diluye hasta un volumen final de 10.0 mL con agua ultrapura. La solucin acuosa resultante se extrae con 5.0 mL de ter etlico, agitando durante 1 minuto. Se asla la fase etrea y se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitrgeno a temperatura ambiente. El residuo se redisuelve con 4.0 mL de etanol absoluto y se aade agua ultrapura hasta completar 10.0 mL. Esta disolucin es irradiada durante 60 segundos, bajo una lmpara de mercurio de alta presin. Se registra el espectro de fluorescencia (exc= 260 nm) del fotoproducto generado y se calcula su espectro segunda derivada, mediante el algoritmo de Savytzki-Golay ( = 5 nm). Se toma como seal analtica la amplitud de dicho espectro derivado entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm). En la Figura 15 se recogen los espectros de fluorescencia fotoinducida, as como los espectros de primera y segunda derivada, correspondientes a una muestra de vino tinto sin resveratrol aadido, y a otra a la que se le ha aadido trans-resveratrol, sometidas al procedimiento de extraccin anteriormente optimizado. Puede observarse cmo la seal fluorescente correspondiente a la matriz del vino queda totalmente atenuada en el espectro segunda derivada.
106
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1
360 400 em (nm) (exc= 260 nm)
440
20 10 0 -10
320
2
360 400 (nm) (exc= 260 nm)

em
440
1.5 1 0.5 0 -0.5 -1
320
360 400 em (nm) (exc= 260 nm)
440
Figura 15.-Espectros de fluorescencia (exc = 260 nm) y espectros primera y segunda derivada, correspondientes a una mezcla de vinos tintos de crianza sin resveratrol aadido (-----) y con 1.57 gmL-1 de trans-resveratrol (), extradas con ter etlico, y sometidas a una dilucin final de 100 veces
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El mtodo propuesto se aplica entonces al anlisis de distintas muestras de vino de la regin. Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes grupos: -Vinos tintos jvenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos y se prepara, dentro de cada grupo, una mezcla, conteniendo volmenes idnticos de todos lo vinos que integran ese grupo, con el objetivo de que estn representadas las interferencias ms comunes en el anlisis de cualquier muestra de vino. Se aplica el mtodo de adicin patrn por triplicado, en cada mezcla de vinos, y se construyen las correspondientes curvas seal medida vs concentracin de trans-resveratrol aadida. Se aplica el test de comparacin de pendientes entre las rectas obtenidas y la de calibrado, comprobndose que no existen diferencias significativas entre las pendientes de ninguna de las rectas de adicin patrn y la recta de calibrado, pudindose concluir, por tanto, que no existe efecto de matriz. Se comprob mediante cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC)20 que las concentraciones de resveratrol en las muestras analizadas estn por debajo de los lmites de deteccin de la tcnica. Los porcentajes medios de recuperacin para cada mezcla de vinos y para cada nivel de concentracin, se han resumido en la Tabla 5, observndose que son muy satisfactorios en todos los casos.
20
Galeano Daz T., Durn Mers I., Airado Rodrguez, D., J. Sep. Sci., 2007, 30:3110-3119
108
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Tabla 5.- Resultados obtenidos en la determinacin de trans-resveratrol en mezclas de vinos tintos jvenes y de crianza y blancos
VINO
Aadido (gmL-1) 0.63 0.94
% Recuperacin (% RSD) Tinto Joven 107 (5); 110 (4); 104 (2); 98 (4); 104 (3); 100 (8) 94 (7) 102 (4) 96 (5) 102 (3) Tinto Crianza 109 (4) 108 (8) 111 (3) 105 (3) 101 (3)
Tinto
1.6 3.1 4.7 0.13 0.19
Blanco
0.31 0.63 0.94
Se ha analizado tambin un vino tinto comercial (vino tinto de mesa Carrefour), conteniendo una cantidad mayor de resveratrol, y el resultado obtenido (1.12 gmL-1 (8 % RSD)) ha sido tambin satisfactoriamente validado mediante HPLC. Perspectivas de futuro Se ha comprobado la retencin de trans-resveratrol sobre membranas de nylon, de manera que las principales perspectivas de futuro pasaran por el desarrollo de mtodos de determinacin sobre soporte slido.
109
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SALIR
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CAPTULO III ANLISIS DE PICEIDO EN VINOS MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA APLICANDO SEGUNDA-DERIVADA A LOS ESPECTROS DE EMISIN
MEN
SALIR
CAPTULO III. Determinacin fluorimtrica de piceido en vino
112
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ANTECEDENTES El piceido es el principal derivado glucosilado del resveratrol e igual que l presenta los ismeros trans y cis. Este compuesto ha recibido la misma atencin que el resveratrol, porque en los productos derivados de la uva, la concentracin de la forma glucosada es significativamente mayor que la de la forma aglicona1, 2, y la relacin entre las dos formas depende entre otros factores de la fermentacin y de las condiciones ecolgicas2. La tcnica ms utilizada para su determinacin en vinos es mediante HPLC, efectuando en casi todos los casos una elucin en gradiente utilizando como disolvente menos activo una disolucin reguladora de carcter cido y llevando a cabo la deteccin mediante sistema de diodos3-6, fluorescencia7, combinacin en lnea de diodos y fluorescencia8 y mediante acoplamiento con
Lamuela Ravents R.M., Romero Prez A.I., Waterhouse A.L., de la Torre Boronat M.C., J. Agric. Food Chem., 1995 43:281-283 2 Moreno-Labanda J.F., Mallavia R., Prez-Fons L., Lizama V., Saura D., Mico V., J. Agric. Food Chem., 2004, 52:5396-5403 3 Ribeiro de Lima M.T., Waffo-Tguo P., Teissedre P.L., Pujolas A., Vercauteren J., Cabanis J.C., Mrillon J.M., J. Agric. Food Chem., 1999, 47:2666-2670 4 Burns J., Yokota T. , Ashihara H. , Jean M.E.J., Crozier A. , J. Agric. Food Chem., 2002, 50:33373340 5 Vitrac X., Bornet A.,Vanderline R., Valls J., Richard T., Delaunay J.C., Mrillon J.M., Teissdre P.L., J. Agric. Food Chem. 2005, 53:5664-5669 6 Abert Vian M., Tomao V., Gallet S., Coulomb P.O., Lacombe J.M., J. Chromatogr. A, 2005, 1085:224-229 7 Vitrac X., Monti J.P., Vercauteren J., Deffieux G., Mrillon J.M., Anal. Chim. Acta, 2002, 458:103110 8 Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M., Weston L.A., Debord S., Meunier P., Maume G., Bessis R., Anal. Chem.,1997, 69:5172-5177
1
113
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espectrometra de masas9-11. La electroforesis capilar con deteccin de diodos tambin ha sido empleada para su anlisis12. Con respecto a las etapas previas de tratamiento las muestras de vino para su posterior anlisis, lo mas usual es realizar una extraccin lquido-lquido con acetato de etilo, seguida de una evaporacin y redisolucin del residuo en la fase mvil utilizada9, 11. Tambin se han propuesto realizar una etapa de limpieza a travs de una columna de intercambio inico3. La extraccin en fase slida es otra posibilidad muy utilizada tanto en cromatografa como en electroforesis10, 12. En algunos casos, las muestras de vino son introducidas directamente en el sistema cromatogrfico, previa filtracin a travs de un filtro de celulosa 4, 6, 7. En cuanto a sus propiedades espectroscpicas, este compuesto no presenta fluorescencia nativa pero se ha comprobado que la irradiacin con luz UV provoca la conversin del trans al cis-ismero13, 14, el cual rpidamente evoluciona hasta formar un compuesto que presenta elevada fluorescencia. Este hecho es lo que nos ha permitido explorar la posible determinacin mediante fluorescencia fotoinducida del piceido en muestras de vino.
Bravo M.N., Silva S., Coelho A.V., Vilas Boas, L., Bronze M.R., Anal. Chim. Acta, 2006, 563: 84-92 Domnguez C., Guilln D.A., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2001, 918:303-310 11 Pozo-Bayn M.A., Hernndez M.T., Martn-lvarez P.J., Polo M.C., J. Agric. Food Chem., 2003, 51: 2089-2095 12 Brandoline V., Maietti A., Tedeschi P., Durini E., Vertuani S., Manfredini S., J. Agric. Food Chem., 2002, 50:7407-7411 13 Roggero J.P., J. Food Comp. Anal., 2000, 13:93-97 14 Roggero J.P., Garca-Parrilla C., Sci. Aliments 1995, 15, 411-422
9 10
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RESULTADOS Y DISCUSIN Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-pieido Caracterizacin absorbente y luminiscente en distintos disolventes Con el objetivo de caracterizar fotomtricamente y fluorimtricamente el trans-piceido, se preparan disoluciones de dicho analito, por dilucin de alcuotas de 0.50 mL de una disolucin de 57 gmL-1 de analito en etanol con distintos disolventes, hasta un volumen final de 25.0 mL. El porcentaje de etanol (2 %) en estas disoluciones es suficientemente pequeo para no modificar las propiedades de los mismos. Los disolventes empleados son agua y disolventes orgnicos de distintas polaridades como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfxido, N,Ndimetilformamida, 1,4-dioxano, ciclohexano y hexano, as como mezclas hidroetanlicas de diferente composicin. En todos los casos se registran los espectros de absorcin utilizando como blanco el correspondiente disolvente, igualmente con un 2 % de etanol. En la Figura 1 se recoge el espectro en medio acuoso observndose una banda de absorcin centrada a 312 nm con un ancho de banda de 20 nm, en la que se distinguen dos mximos centrados a 306 y 318 nm, respectivamente. La fisonoma del espectro no se ve afectada por la naturaleza del disolvente.
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0.08 0.06 Absorbancia 0.04 0.02 0 240 280 320 (nm) 360 400
Figura 1.- Espectro de absorcin correspondiente a una disolucin acuosa (2.0 % v/v etanol) conteniendo 1.14 gmL-1 de trans-piceido
Los espectros fluorescentes de excitacin y emisin, en algunos de los disolventes utilizados, se recogen en la Figura 2. Se observa que en todos los medios ensayados este compuesto es dbilmente fluorescente, y que en acetonitrilo, etanol, agua o mezclas hidroetanlicas presenta dos mximos de excitacin, centrados a 225 y 318 nm, y un nico mximo de emisin centrado a 390 nm. En dimetilformamida se observa un aumento de su rendimiento cuntico de fluorescencia, as como la desaparicin del primer mximo de excitacin. Por otra parte, el espectro de emisin se desplaza hipsocrmicamente hasta 373 nm en hexano, ciclohexano y 1,4-dioxano.
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16 Intensidad de Fluorescencia 12 8 4 0 200 300 (nm) 400 500
Figura 2.- Espectros de excitacin y emisin de disoluciones de trans-piceido en diferentes medios: etanol:agua 40:60, v:v (exc/em 318/390 nm) (), dimetilformamida (2.0 % etanol) (exc/em 323/390 nm) () y hexano (2.0 % etanol) (exc/em 315/373 nm) (). [trans-piceido] = 1.14 gmL-1
Influencia de la acidez del medio y clculo de contantes de ionizacin de trans-piceido Una vez caracterizado el analito espectroscpicamente en distintos disolventes, se procede al estudio de la influencia de la acidez del medio sobre sus propiedades absorbentes y fluorescentes. El estudio se lleva a cabo en medio acuoso y en medio hidroetanlico, conteniendo un 40 % (v/v) de etanol. La fuerza inica se fija en todos los casos por adicin de KCl, en una concentracin final de 0.10 molL-1. La variacin del pH se efecta por adicin de pequeos volmenes de disoluciones diluidas de HCl y NaOH. La acidulacin y la alcalinizacin de la disolucin se llevan a cabo sobre alcuotas independientes de la misma, puesto que no se dispone de datos acerca de la reversibilidad de los equilibrios en que este compuesto participa.
117
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Los espectros ms representativos, registrados en todo el rango de pH, as como la variacin de las seales fotomtricas a distintas longitudes de onda, con el pH, en los dos medios de trabajo ensayados, se recogen en las Figuras 3 y 4. Tanto en medio hidroetanlico como acuoso, a medida que disminuye la acidez se produce un desplazamiento batocrmico del mximo de absorcin desde 306 a 344 nm. Los datos derivados de estas experiencias nos han permitido calcular los valores de pKa en ambos medios y los resultados obtenidos, mediante los mtodos de Stenstrm y Goldsmith15 y Wilson y Lester16, se resumen en la Tabla 1.
0.2 0.16 Absorbancia 0.12 0.08 0.04 0
< 7.0 10.5
> 12.0
0.2 0.16 Absorbancia 0.12 0.08 0.04 0
B 306 nm
344 nm
240
280
320 (nm)
360
400
pH
10
12
14
Figura 3.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de absorcin de disoluciones hidroetanlicas de trans-piceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm. [trans-piceido] = 2.28 gmL-1, etanol:agua, 40:60 v:v
15 16
Stenstrm W., Goldsmith. N., J. Phys. Chem., 1926, 30:1683-1687 Wilson R.F., Lester G.W., Talanta, 1963, 10:319-322
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SALIR
0.2 0.16 Absorbancia 0.12 0.08 0.04 0 240 280 320 (nm) 360 400
A < 7.0 9.8 > 11.0
0.2 0.16 Absorbancia 0.12 0.08 0.04 0 0
B 306 nm
344 nm
pH
10
12
14
Figura 4.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de absorcin de disoluciones acuosas de transpiceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm. [trans-piceido] = 2.00 gmL-1
El comportamiento cido-base de este analito tambin se ha estudiado mediante fluorescencia, siguiendo el mismo mtodo operatorio que en absorcin molecular y trabajando con disoluciones que contienen 0.97 gmL-1 de transpiceido. En las Figuras 5 y 6 se recogen los espectros de excitacin y emisin del analito en medio cido y bsico, en cada uno de dos medios de trabajo ensayados, as como la variacin de la seal de fluorescencia, medida a las longitudes de onda correspondientes a los mximos de fluorescencia de las formas cida y bsica, con el pH. Como se observa en la Figura 5, los espectros de excitacin y emisin fluorescente de trans-piceido en etanol:agua 40:60, v:v, se desplazan batocrmicamente de 292 a 344 nm y de 392 a 447 nm, respectivamente, como consecuencia del aumento del pH.
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SALIR
exc/em= 292/392 nm
< 7.0
> 11.5
exc/em= 344/447 nm
200
300
(nm)
400
500
pH
10
12
14
Figura 5.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de excitacin y emisin de disoluciones hidroetanlicas de trans-piceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia. [trans-piceido] = 0.97 gmL-1, etanol:agua, 40:60 v:v,

> 11.0
B exc/em= 344/457 nm
400 > 6.0 200
400
200
exc/em= 318/405 nm
0 200 300 400 (nm) 500 600
0 0 2 4 6 pH 8 10 12 14
Figura 6.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de absorcin de disoluciones acuosas de transpiceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia. [trans-piceido] = 1.14 gmL-1
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SALIR
En medio acuoso, adems del desplazamiento batocrmico de los mximos de excitacin y emisin de 318 a 344 nm y de 405 a 457 nm, respectivamente, se observa un aumento del rendimiento cuntico de fluorescencia en medio bsico. En ambos casos se observa un punto isoemisivo, lo que indica la presencia de dos especies en equilibrio, es decir la existencia de un equilibrio de disociacin cido-base. Para dichos equilibrios, se han calculado valores de pKa en medio hidroetanlico, y en medio acuoso. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1.- Valores de pKa calculados para el trans-piceido en distintos medios, mediante fotometra y fluorescencia
Mtodo de Clculo
FOTOMETRA
pKa trans-piceido 10.2 0.1 10.3 9.9 0.9 9.3 10.4 0.1 10.4 8.8 0.3 8.8
Etanol:Agua 40:60, v:v Agua Etanol:Agua 40:60, v:v Agua
Stenstrm y Goldsmith* Wilson y Lester Stenstrm y Goldsmith* Wilson y Lester Stenstrm y Goldsmith* Wilson y Lester Stenstrm y Goldsmith* Wilson y Lester
* Valor medio Desviacin Estndar
FLUORESCENCIA
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Solamente se ha encontrado un artculo17 en el cual se describe el clculo de la constante de disociacin de primer orden de trans-piceido en medio acuoso, mediante electroforesis, obtenindose un valor de pKa1 = 9.40, valor bastante en consonancia con el calculado por nosotros, mediante fotometra en medio acuoso, empleando el mtodo de Wilson y Lester. Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad Se procede a estudiar la relacin entre la concentracin de trans-piceido puesta y la seal fotomtrica o fluorescente medida, y al establecimiento de las correspondientes rectas de calibrado. Para obtener las seales fotomtricas se procede aadiendo en la cubeta de medida 2.00 mL de agua ultrapura y volmenes crecientes, comprendidos entre 0.020 y 0.25 mL, de la disolucin de 57 gmL-1 de trans-piceido en etanol, y registrando los espectros de absorcin en el rango de longitudes de onda comprendido entre 240 y 360 nm. Las medidas de fluorescencia, se realizan aadiendo directamente en la cubeta de medida 1.80 mL de agua y 1.20 mL de etanol absoluto, con el objetivo de mantener la composicin ptima del medio de trabajo porque la emisin fluorescente depende del % de etanol en el medio. Sobre esta mezcla hidroetanlica, una vez desgasificada por ultrasonidos, se aaden volmenes sucesivos de una disolucin etanlica de trans-resveratrol conteniendo 19 gmL-1, en incrementos de 10 L, hasta llegar a 0.10 mL. Tras cada nueva adicin, se registran los espectros de emisin de fluorescencia en las siguientes condiciones
17 Cao J., Chen G.H., Du Y.S., Hou F.F., Tian Y.L., J. Liquid Chromatogr. & Rel. Technol., 2006, 29:1457-1463
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instrumentales: 20 C, rendija de excitacin 5 nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V y exc = 318 nm. Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas tcnicas, as como los parmetros analticos de calidad, se encuentran recogidos en la Tabla 2.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin fotomtrica y fluorimtrica de trans-piceido
Fotometra Seal Analtica Rango Lineal (gmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mLg-1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (-1) (gmL-1) LOD, Long y Winefordner18 (gmL-1) LOD, Clayton19 (==0.05) (gmL-1) A306 nm 0.60 6.00 -0.0037 0.0010 0.0727 0.0003 0.0033 0.999 0.999 99.6 0.0450 0.0433 0.101
Fluorescencia I.F.318/390 nm 0.060 0.60 26.7 4.0 687 11 10.1 0.997 0.995 98.4 0.0147 0.0326 0.0352
18 19
Long G.L., Winefordner J.D., Anal. Chem., 1983, 55:712724 Clayton C.A., Hines J.W., Elkins P.D., Anal. Chem., 1987, 59:25062514
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Repetitividad de los mtodos Este estudio se realiza siguiendo los procedimientos que se describen: Mtodo fotomtrico: En la cubeta de medida, se depositan 2.0 mL de agua ultrapura y 50 L de disolucin etanlica de trans-piceido, conteniendo 57 gmL-1, y se mide su absorbancia a 306 nm. El proceso se repite once veces. Se calcula la media y la desviacin estndar de las mediciones realizadas, as como la desviacin estndar relativa, como la razn entre ambas. Mtodo fluorimtrico: En la cubeta de medida de fluorescencia se depositan 1.20 mL de etanol absoluto y 1.80 mL de agua ultrapura, la mezcla hidroetanlica se pasa por un bao de ultrasonidos para ser desgasificada, y sobre ella se aaden 50 L de disolucin etanlica diluida de trans-piceido, conteniendo 19 gmL-1. Se registra su espectro de emisin de fluorescencia, en condiciones idnticas a las empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado. El proceso se repite once veces. Se calcula la media y la desviacin estndar de las seales medidas a 385 nm, as como la desviacin estndar relativa del conjunto de mediciones. Las desviaciones estndar relativas, calculadas en cada caso sobre las seales medidas, resultan ser 1.9 % y 5.8 % respectivamente. Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-piceido Se lleva a cabo un estudio sobre la fotorreaccin que sufre el trans-piceido, al exponerlo a radiacin UV intensa, mediante fotometra y fluorescencia molecular, estudindose como influye el disolvente y la acidez del medio.
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Influencia del disolvente Se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccin que sufre el trans-piceido en distintos medios de trabajo, mediante fotometra y fluorescencia molecular. Para ello, se preparan disoluciones del analito, con disolventes orgnicos de diferentes polaridades, as como en agua y en mezclas hidroetanlicas, y, en cada uno de los casos, se realiza una influencia del tiempo de irradiacin, bajo una lmpara de mercurio de alta presin. Cronolgicamente, los ensayos mediante fluorescencia se realizaron previamente a los de fotometra, de manera que mediante fotometra slo se estudi la fotorreaccin en medios hidroetanlicos, por los motivos que ms adelante se exponen. Absorcin molecular.- Como ya se ha comentado, el espectro de absorcin de trans-piceido, no se ve afectado por el disolvente, siendo idntico en etanol, en agua, y en medios hidroetanlicos de diferente composicin. No ocurre lo mismo con los fotoproductos que se obtienen como consecuencia de la irradiacin de sus disoluciones bajo una lmpara de mercurio de alta presin. La cintica de los foto-procesos tambin se ve influenciada por la composicin del medio de trabajo. Para estudiar la influencia del disolvente sobre las fotorreacciones que sufre este analito, se preparan disoluciones, en presencia de porcentajes crecientes de etanol, conteniendo todas ellas 1.14 gmL-1 de trans-piceido. Cada una de estas disoluciones se irradia durante intervalos de tiempo acumulativos y se registran los correspondientes espectros de absorcin entre 240 y 360 nm, Figura 7.
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Como puede observarse, la irradiacin ultravioleta de las disoluciones acuosas, etanlicas o hidroetanlicas de trans-piceido, provoca la desaparicin inmediata de la banda de absorcin centrada a 312 nm, en favor de un nuevo mximo de absorcin centrado a 290 nm, correspondiente a cis-piceido, segn se encuentra descrito en la bibliografa13, 14. Para tiempos de irradiacin superiores a 60 segundos, se observa la aparicin de un nuevo mximo centrado a 261 nm, que alcanza su mxima intensidad para disoluciones conteniendo un 40 % de etanol, e irradiadas durante 180 segundos, y que es insignificante en disoluciones puramente etanlicas y muy dbil en disoluciones con porcentajes acuosos superiores al 60 %. Cuando las disoluciones de trans-piceido son irradiadas durante un tiempo de 10 minutos tiene lugar la destruccin de este ltimo fotoproducto. Para concluir, merece la pena destacar que se ha comprobado, a travs de los estudios llevados a cabo mediante absorcin molecular que el tiempo de irradiacin necesario para la obtencin de los fotoproductos es mayor cuanto mayor es la concentracin de trans-piceido en la disolucin original.
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0.09
0.09
0.03
Absorbancia
240 280 320 360
Absorbancia
0.06
0.06
0.03
0 (nm)
0 240 280 (nm) 320 360
0.09
0.09
Absorbancia
0.03
Absorbancia
0.06
0.06
0.03
0 240 280
(nm)
320
360
240
280
(nm)
320
360
Figura 7.- Influencia del tiempo de irradiacin sobre los espectros de absorcin de disoluciones conteniendo 1.14 gmL-1 de trans-piceido en etanol absoluto (A) y etanol:agua 60:40, v:v (B), 40:60, v:v (C) y 4:96, v:v (D), sin irradiar () e irradiadas durante 5 segundos (), 30 segundos (), 60 segundos (), 120 segundos (), 180 segundos () y 600 segundos ()
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Fluorescencia molecular.- Para examinar los efectos de la irradiacin ultravioleta externa sobre el comportamiento fluorescente de trans-piceido, se prepara una disolucin, conteniendo 0.30 gmL-1 de analito, en etanol:agua 40:60, v:v, y se registran los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia de dicha disolucin, recin preparada, y tras ser irradiada durante un tiempo, bajo una lmpara de mercurio de alta presin. Se comprueba que la irradiacin ultravioleta externa de disoluciones hidroetanlicas de trans-piceido, tiene como consecuencia la generacin de fotoproductos altamente fluorescentes, como puede observarse en la Figura 8. Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por presentar un intenso y agudo mximo de excitacin centrado a 261 nm, y dos mximos de emisin, no menos agudos, a 361 y 379 nm, respectivamente.
1600 Intensidad de Fluorescencia 1200 800 400 0 200 300 (nm) 400 500
Figura 8.- Espectros de excitacin y emisin correspondientes a una disolucin conteniendo 1.20 gmL-1 de trans-piceido, en etanol:agua 40:60, v:v, aislada de la luz () (exc/em 318/390 nm), e irradiada durante 180 segundos (), (exc/em 261/361 nm )
128
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El estudio de la influencia del tiempo de irradiacin se lleva a cabo en disolventes orgnicos de distintas polaridades. Se ensayan, concretamente, metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfxido, N,N-dimetilformamida, 1,4-dioxano, ciclohexano y hexano. Se observa que la naturaleza del fotoproducto es independiente del disolvente, sin embargo la velocidad de las fotorreacciones s est influida por el disolvente, siendo mayor en medios puramente orgnicos que en medios hidroorgnicos. Por otro lado, tambin depende del disolvente el rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos, que es mximo en medios hidroetanlicos, con proporciones similares de etanol y agua. Se selecciona, por tanto, el medio hidroetanlico como ptimo para el desarrollo de la fotorreaccin, procedindose a continuacin a la optimizacin de las proporciones relativas de etanol y agua en el medio de trabajo. Para ello se preparan una serie de disoluciones, en mezclas de etanol y agua, con distintas proporciones de ambos disolventes, conteniendo todas ellas 0.60 gmL-1 de transpiceido y se irradian durante diferentes tiempos. Las seales obtenidas se representan en la Figura 9A. El comportamiento general, en todas las mezclas ensayadas, consiste en un aumento de la seal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacin, hasta alcanzar un mximo, seguido por un decaimiento de la seal, probablemente debido a la destruccin de los fotoproductos y a la generacin de otros compuestos no fluorescentes. En disoluciones puramente etanlicas, el tiempo de irradiacin ptimo est en torno a 50 segundos, pero el rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos es muy pequeo. A medida que disminuye el porcentaje de etanol, aumentan tanto el tiempo de irradiacin ptimo como las seales de fluorescencia fotoinducida. Las mximas seales se obtienen en medios con un porcentaje de etanol comprendido entre el 30 % y el 50 % con un tiempo de
129
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irradiacin de 180 segundos. Por ello para las siguientes experiencias se elige como medio de trabajo ptimo una mezcla etanol:agua 40:60, v:v.
600 I. F. (361 nm) (exc = 261 nm)
600 I. F. (361 nm) (exc = 261 nm)
400
400
200
200
0 0 100 200 Tiempo de Irradiacin (s) 300
0 0 20 40 60 % v. Etanol 80 100
Figura 9.- (A) Influencia del tiempo de irradiacin sobre disoluciones de trans-piceido en etanol absoluto () y etanol:agua 80:20, v:v (), 40:60, v:v () y 10:80, v:v (). (B) Influencia del porcentaje de etanol sobre la intensidad de fluorescencia irradiando durante 180 segundos. [trans-piceido] = 0.60 gmL-1, exc = 261 nm, em = 361 nm
Adicionalmente, se estudia por separado cmo afecta la presencia de etanol a la fotorreaccin y al rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos, encontrndose que en el caso del piceido, se obtienen mayores seales irradiando muestras 100 % acuosas y aadiendo etanol hasta completar el 40 % v/v. previamente a la medida de la fluorescencia. Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de los fotoproductos de piceido Para llevar a cabo el estudio de la influencia de la acidez del medio sobre las propiedades espectroscpicas de los fotoproductos de piceido, se procede irradiando disoluciones puramente acuosas de trans-piceido, y aadiendo posteriormente etanol absoluto hasta completar el 40 % v/v. Se preparan de esta manera dos disoluciones conteniendo 3.7 y 0.57 gmL-1, para ser estudiadas
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mediante fotometra y fluorescencia, respectivamente. Los espectros de absorcin y los espectros fluorescentes de excitacin y emisin, a distintos valores de pH, se encuentran recogidos en las Figuras 10 y 11, respectivamente, as como la variacin de las seales fotomtrica y fluorescente con el pH.
0.3 8.0 > 12 Absorbancia Absorbancia 0.2 11.1 0.1 10.8 10.4 10.0 0 240 260 280 300 320 (nm) 340 360 0.28 261 nm 0.24 0.2 0.16 0.12 0.08 0 2 4 6 pH 8 10 12 14 282 nm
Figura 10.- Influencia del pH sobre: (A) Espectros de absorcin de los fotoproductos del transpiceido (3.7 gmL-1) en etanol:agua 40:60, v:v y (B) sobre la absorbancia medida a 261 y 282 nm
El espectro de absorcin de disoluciones cidas, neutras y ligeramente bsicas de los fotoproductos de piceido muestra un slo mximo centrado a 261 nm, como puede observarse en la Figura 10A, cuya posicin e intensidad permanecen constantes a pH inferiores a 8.0. Para valores superiores de pH se observa un decaimiento de la seal y la aparicin de un nuevo mximo, centrado a 271 nm, que existe slo en el intervalo de pH 10.5-11.0. En medios ms bsicos se observa un desplazamiento batocrmico y un efecto hipercrmico, apareciendo un nuevo mximo centrado a 282 nm, cuya posicin e intensidad se mantiene prcticamente constante a partir de pH 12.0.
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600 < 8.0 I. F. (361 nm) (exc= 261 nm) 400
400
200
9.9
200
> 11.5 0 200 250 300 350 (nm) 400 450
0 0 2 4 6 pH 8 10 12 14
Figura 11.- Influencia del pH sobre: (A) Los espectros de excitacin y emisin de los fotoproductos de trans-piceido (0.57 gmL-1) y (B) sobre la intensidad de fluorescencia (exc/em = 261/361 nm)
Los espectros de excitacin y emisin de los fotoproductos de piceido en medio cido y neutro estn caracterizados por mximos centrados a 261 nm y 361 y 379 nm, respectivamente, Figura 11A. Los fotoproductos son muy poco fluorescentes a pH superiores a 11.0, no obstante puede observarse un desplazamiento batocrmico del mximo de emisin hasta 271 nm, as como la aparicin de un nico mximo de emisin centrado a 420 nm. La variacin de la seal fluorescente (exc/em = 261/361 nm) con el pH, Figura 11B, muestra un drstico decaimiento a partir de pH 8.0, obtenindose una seal prcticamente nula para pH superiores a 11.0. Finalmente, se ha estudiado fotomtrica y fluorimtricamente la reversibilidad de los equilibrios cido-base de los fotoproductos de piceido. Para ello, se alcalinizan las muestras, hasta un pH en torno a 12, y se acidulan a continuacin, hasta un pH prximo al inicial. Por comparacin de los espectros correspondientes a las muestras neutras originales, y los registrados tras la variacin del pH, se deduce que, en el caso de trans-piceido, el proceso cido base es totalmente reversible, tratndose pues, de un autntico equilibrio cido-base.
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No obstante, no se ha calculado el valor de la constante de ionizacin porque cromatogrficamente se ha comprobado la formacin de dos fotoproductos fluorescentes. Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad Establecida la influencia de las variables qumicas anteriormente detalladas, se procede a continuacin a estudiar la relacin entre la concentracin de piceido puesta y la seal de fluorescencia fotoinducida medida, y al establecimiento de la correspondiente recta de calibrado. Para ello, se preparan disoluciones, en el rango de concentraciones entre 6.0 y 30 ngmL-1 de trans-piceido. La irradiacin se lleva a cabo en medio acuoso, durante 180 segundos, con la posterior adicin de etanol absoluto hasta completar el 40 % v/v. Se registran los espectros de emisin de fluorescencia de las disoluciones irradiadas, en las siguientes condiciones experimentales: 20 C, rendija de excitacin 5 nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y exc = 261 nm. Los parmetros analticos se resumen en la Tabla 3.
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Tabla 3.- Parmetros analticos para la determinacin, mediante fluorescencia fotoinducida de trans-piceido
Seal Analtica Rango Lineal (ngmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mL ng -1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (-1) (ngmL-1) LOD, Long y Winefordner (ngmL-1) LOD, Clayton (==0.05) (ngmL-1)
I.F. 261/361 nm 6.0 30 18.2 1.9 6.68 0.11 4.55 0.998 0.997 98.4 0.681 0.850 1.68
Repetitividad del mtodo Se preparan once disoluciones independientes, conteniendo 14.3 ngmL-1 de trans-piceido, previamente irradiadas en las mismas condiciones que en el la recta de calibrado, y se registran sus espectros de emisin, manteniendo las condiciones experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado. La desviacin estndar relativa resulta ser del 2.3 %.
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Estudio extracto-espectrofluorimtrico del trans-piceido. Aplicacin al anlisis de muestras de vino Los mtodos descritos en la bibliografa para el anlisis de piceido en diversas muestras complejas siempre hacen uso de tcnicas separativas, bien cromatogrficas o electroforticas, pero actualmente no existen propuestos mtodos espectroscpicos de anlisis de este compuesto. Se pretende desarrollar un nuevo mtodo de anlisis de piceido en vino, en presencia de su principal interferencia, su aglicona, mediante fluorescencia fotoinducida. Como paso previo a la determinacin mediante fluorescencia fotoinducida, es necesario una etapa de limpieza de la muestra, que se llevar a cabo mediante una extraccin lquido-lquido de las muestras de vino, para reducir la seal de fondo de la matriz. Por ello, se lleva a cabo un estudio extractoespectrofluorimtrico del analito, con objeto de optimizar las condiciones para la extraccin. Estudios previos
La extraccin de piceido de la matriz acuosa, con disolventes orgnicos, es ms problemtica que la extraccin de resveratrol. Al emplear ter etlico como disolvente, prcticamente el 100 % del analito permanece en la fase acuosa, probablemente debido a la elevada polaridad del residuo de glucosa, presente en la molcula de piceido. Se ha comprobado que las mejores recuperaciones se obtienen al extraer con acetato de etilo no el trans-piceido, sino sus fotoproductos. As, se consiguen los mejores resultados extrayendo disoluciones acuosas de
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piceido irradiadas durante 180 segundos. El pH de estas disoluciones se fija a 5.0, tras la irradiacin, por adicin de tampn tartrato monocido de sodio/tartrato disdico, ya que se comprueba tambin que la presencia de tampn en el proceso de irradiacin supone una disminucin drstica en la seal de fluorescencia fotoinducida, debido posiblemente a que el in tartrato impide de alguna manera que se complete la reaccin fotoqumica. Dado que la recuperacin no es total y se observa una acusada influencia de diversas variables sobre la extraccin de los fotoproductos de piceido, se ha utilizado en este caso el Diseo de Experimentos y la Metodologa de Superficie de Respuesta para la optimizacin del proceso. Diseo de experimentos y metodologa de la superficie de respuesta La metodologa de superficie de respuesta es un conjunto de tcnicas estadsticas y matemticas para el descubrimiento del mejor valor de una variable de respuesta (variable de salida) y los valores de los factores (variables de entrada) que producen dicho valor ptimo.
En este mtodo, el sistema se representa por una ecuacin emprica, basada en ecuaciones preseleccionadas, usando los datos experimentales obtenidos del sistema para el ajuste de los correspondientes coeficientes. Normalmente se usan modelos polinmicos de segundo orden con trminos cruzados, que permiten describir concavidades o convexidades de la superficie. La superficie representada por dicho modelo polinmico se denomina Superficie de Respuesta. As, para el estudio de dos variables, se puede considerar que la superficie de respuesta se ajusta al modelo:
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Respuesta = b0 + b1A + b2B + b12AB + b11A2 + b22B2 y, en general, Respuesta = b0 + biXi + bijXiXj + biiXi2 El ajuste de esta ecuacin implica la realizacin de experiencias a ms de dos niveles para cada factor, llevndose a cabo la seleccin de las experiencias por medio del uso de algn Diseo Experimental apropiado. El fin de un diseo experimental consiste fundamentalmente en obtener la mxima informacin posible con el menor nmero de experimentos y centrarse nicamente en la recogida de la informacin estrictamente necesaria. Se disean o seleccionan un pequeo nmero de experimentos, que se realizan en unas condiciones controladas. Existen diferentes tipos de diseo, en funcin de las caractersticas del sistema y el objetivo que se pretende conseguir. En el presente caso, dado que lo que se persiguen son los valores ptimos de las variables significativas implicadas en la extraccin, se utiliza un Diseo Central Compuesto. En este diseo cada factor tiene cinco niveles. En el caso de tres factores, Figura 12, estos sern: estrella bajo, cubo bajo, central, cubo alto y estrella alto. Cubo alto y bajo son los niveles superior e inferior que se especifican al definir las variables del diseo. Las muestras estrellas estn localizadas fuera del cubo. Como consecuencia, todas las muestras, excepto la central, estn localizadas en la misma esfera, si se dispone de tres factores, o en una hiperesfera, en los dems casos y, por consiguiente, la informacin que llevan tendr el mismo peso en los anlisis (rotatividad). La dificultad de ajustar estos niveles es la principal desventaja de este tipo de diseo que, por otra parte, posee muy buenas propiedades estadsticas.
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Una vez realizados los experimentos determinados por el tipo de diseo elegido, se procede a la determinacin de los coeficientes polinmicos del modelo experimental. Del estudio del mismo puede deducirse no slo la forma de dependencia de la respuesta con las variables consideradas, sino tambin las condiciones ptimas buscadas.
Figura 12.- Diseo Central Compuesto para tres factores
Habitualmente se realiza un Anlisis de la Varianza (ANOVA), con el que se comprobar la significancia del modelo, la utilidad de las interacciones y los trminos cuadrados, la calidad del ajuste del modelo y, en ltimo trmino, la bondad de la superficie de respuesta. Para ello se utiliza el software informtico THE UNSCRAMBLER20, que permite realizar, entre otros, el ANOVA, estudio de residuos, anlisis de efectos, representacin grfica de la superficie de respuesta en el espacio tridimensional, as como mapas de contorno para cada dos variables. La bondad de la superficie de respuesta la indica el ANOVA a travs de los parmetros: coeficiente de determinacin (R2), falta de ajuste del modelo cuadrtico (Lack of Fit) y chequeo del modelo cuadrtico (Model Check
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Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway
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Cuadratic). Estos dos ltimos parmetros tienen unos determinados palores p (nivel de significacin) de tal forma que para un nivel de confianza del 95 %, un valor de p inferior a 0.05 para Model Check Cuadratic, indica que la parte cuadrtica del modelo es significativa, es decir, que las interacciones y trminos cuadrados incluidos en el modelo son tiles; un valor de p superior a 0.05 para Lack of Fit, indica que la prdida o falta de ajuste del modelo no es significativa. Por otra parte, R2 interesa que sea prximo a 0.9. El ANOVA que presenta un buen valor de R2 lleva asociado un buen valor de Model Check Cuadratic y Lack of Fit, y en definitiva se concluye que la superficie de respuesta es vlida para elegir el punto ptimo, que generalmente son las condiciones de las variables que maximizan la respuesta elegida. Dicho punto tambin lo presenta el ANOVA, aunque se puede deducir analizando la superficie de respuesta en su forma tridimensional o como mapas de contorno. En el caso del mapa de contorno se puede deducir una zona alrededor del punto ptimo donde la respuesta no presenta una diferencia significativa respecto a la respuesta mxima. Dicha zona ser interesante, puesto que describe unos valores de las variables que pueden ser considerados tambin como ptimos. Adems el ANOVA presenta los valores de p para cada uno de los factores y las interacciones entre ellos, de forma que un valor de p inferior a 0.05 indica que ese factor o interaccin influye de forma significativa con un 95 % de probabilidad. El estudio de los residuos permite la deteccin de posibles outliers (muestras que no se ajustan al modelo) y, por ltimo, la visualizacin de las superficies o de las grficas de contorno, posibilita una interpretacin final.
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Planificacin y realizacin de las experiencias Las variables qumicas implicadas en el proceso de extraccin de los fotoproductos fluorescentes del trans-piceido con acetato de etilo y los niveles considerados para cada una de ellas, son las siguientes: - concentracin de disolucin reguladora tartrico monocido de sodio/tartrato disdico (NaHTr/Na2Tr) de pH 5.0: 0.026 0.19 M relacin de fases (mL F. Acuosa / mL F. Orgnica): 0.99 3.4 tiempo de agitacin: 12 298 s
Con el diseo central compuesto, se genera un total de 17 experimentos, Tabla 4. Las muestras se preparan de manera que el volumen final de la fase acuosa sea siempre igual a 10.0 mL, conteniendo 0.20 mL de disolucin etanlica 2.86 gmL-1 de trans-piceido y volmenes variables de agua ultrapura y disolucin reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.30 M, de pH 5.0, irradindolas durante 180 segundos, previamente a la adicin del tampn. La fase acuosa se extrae con el volumen de acetato de etilo que marque la relacin de fases, agitando durante el tiempo correspondiente en cada caso. Se registra el espectro de emisin de fluorescencia de la fase acuosa antes y despus de ser extrada en las siguientes condiciones instrumentales: 20C, rendija de excitacin 5 nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V y exc = 261 nm.
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Tabla 4.- Diseo Central Compuesto para tres variables Posicin en el diseo * Low A * High A * Low B * High B * Low C * High C Cube 1 Cube 2 Cube 3 Cube 4 Cube 5 Cube 6 Cube 7 Cube 8 Central a Central b Central c Experiencia N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 [NaHTr/Na2Tr] M pH 5.0 0.026 0.19 0.11 0.11 0.11 0.11 0.06 0.16 0.06 0.16 0.06 0.16 0.06 0.16 0.11 0.11 0,11 Relacin de fases 2.5 2.5 2.5 2.5 0.99 4.0 1.6 1.6 1.6 1.6 3.4 3.4 3.4 3.4 2.5 2.5 2.5 Tiempo de agitacin (s) 155 155 12 298 155 155 70 70 240 240 70 70 240 240 155 155 155
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Anlisis de la superficie de respuesta La seal empleada para construir la superficie de respuesta es la diferencia entre las intensidades de fluorescencia, medidas a 361 nm, sobre los espectros de emisin registrados a la fase acuosa antes y despus de ser extrada. Las caractersticas de la superficie de respuesta son -R2 = 0.862 -Multiple Correlation: 0.928 -Model Check Cuadratic (p < 0.05): p = 0.7170 -Lack of Fit (p > 0.05): p = 0.5182 El valor de p para Lack of Fit indica que la prdida de ajuste no es significativa, adems el valor de R2 indica la bondad del modelo. No obstante, el valor de p para Model Check Cuadratic es superior a 0.05, lo que indica que la parte cuadrtica del modelo no es significativa, es decir que las interacciones y trminos cuadrados incluidos en el modelo no son del todo tiles. Aplicando el ANOVA al anlisis de los valores p, para la superficie de respuesta (Tabla 5), se deducen qu variables influyen de forma significativa (p < 0.05). En este caso, dichas variables son la concentracin de tampn y la relacin de fases, mientras que el tiempo de agitacin, las interacciones entre las variables y los trminos cuadrticos no son significativas. En la Figura 13 se recogen las superficies de respuesta para las tres combinaciones de las tres variables estudiadas. El ptimo estar en la zona de mxima respuesta, que es la zona de color negro. En esta zona existe un punto que presenta el valor mximo de respuesta, que ser tomado como ptimo. Este punto corresponde a los siguientes valores para las variables:
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-[ NaHTr/Na2Tr] = 0.16 M -Tiempo de agitacin = 150 s -Relacin de fases = 0.7

Tabla 5.- Anlisis de los valores p para las variables estudiadas
Variable A: [Tampn] (M) B: Tiempo de agitacin (s) C: Relacin de fases AB AC BC AA BB CC
Valor p 0.0422 0.6673 0.0020 0.4561 0.9239 0.7689 0.2931 0.1602 0.3235
El valor de relacin de fases predicho como ptimo se encuentra fuera de los lmites ensayados para esta variable. No obstante, se comprob que el porcentaje de recuperacin obtenido al emplear como relacin de fases 1 0.7 es el mismo, fijando por tanto 1 como relacin de fases ptima. El rendimiento de la extraccin, calculado por comparacin de la pendiente de la recta de calibrado recogida en la Tabla 6 y una recta (r = 0.995) construida extrayendo patrones en el mismo rango de concentraciones, y en las condiciones determinadas como ptimas, resulta ser del 61 %.
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Figura 13.- Superficies de respuesta para cada par de variables instrumentales
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Determinacin de piceido en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada A pesar del paso de extraccin lquido-lquido de las muestras de vino, la seal fluorescente procedente de la matriz, en las condiciones necesarias para la obtencin de los espectros de fluorescencia fotoinducida de piceido, no puede ser despreciada. No obstante, al igual que en caso de resveratrol, dicha seal se atena en gran medida por obtencin de los espectros segunda derivada. Los espectros segunda derivada se obtienen en todos los casos mediante el algoritmo de Savitzsky-Golay21, empleando = 5 nm. Se comprueba la linealidad entre la amplitud del espectro segunda derivada entre 353 y 361 nm (2D353-361) y la concentracin de trans-piceido en la muestra original, como queda reflejado en la Tabla 6, por lo que se propone utilizar sta como seal analtica para el anlisis de piceido en vino.
El tratamiento al que se someten las muestras de vino objeto del anlisis es el siguiente: en una celda de cuarzo se aaden 0.10 mL de vino tinto o 0.50 mL de vino blanco, que se diluyen con agua ultrapura hasta un volumen final de 5.0 mL, en presencia de un 2.0 % v. de etanol. La disolucin resultante se irradia durante 180 segundos bajo una lmpara de mercurio de alta presin, y a continuacin se transfiere a un embudo de decantacin. Se fija el pH a 5.0 por adicin de 5.0 mL de disolucin reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato disdico, 0.30 M, y se extrae con 10.0 mL de acetato de etilo, agitando vigorosamente durante 150 segundos. Se asla la fase orgnica y se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente. El residuo resultante se
21
Savitzky A., Golay M.J.E., Anal. Chem., 1964, 36:16271639
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redisuelve con 4.0 mL de etanol absoluto y se aade agua ultrapura hasta completar 10.0 mL.
Tabla 6.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin de piceido mediante fluorescencia fotoinducida segunda derivada
Seal Analtica Rango Lineal (ngmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mL ng -1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (-1) (ngmL-1) LOD, Long y Winefordner (ngmL-1) LOD, Clayton (==0.05) (ngmL-1) Repetitividad (14.3 ngmL-1) % R.S.D. (n = 11)
(exc = 261 nm) 6.0 30 -0.165 0.064 0.181 0.004 0.156 0.997 0.995 98.0 0.862 1.34 2.12
2D 353-361 nm
5.9
El mtodo se aplica al anlisis de distintas muestras de vino de la regin. Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes grupos: -Vinos tintos jvenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos
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Se prepara, dentro de cada grupo, una mezcla conteniendo volmenes idnticos de todos lo vinos que integran ese grupo, con el objetivo de que estn representadas las interferencias ms comunes en el anlisis de cualquier muestra de vino. Se aplica el mtodo de adicin patrn por triplicado, sobre cada mezcla de vinos y se construyen las correspondientes curvas 2D353-361 nm vs concentracin de trans-piceido puesta. Se aplica el test de comparacin de pendientes entre las rectas obtenidas y una recta de calibrado construida sometiendo a los patrones al mismo tratamiento que al vino, comprobndose que existen diferencias significativas entre las pendientes de las tres rectas de adicin patrn y la recta de calibrado, concluyendo por tanto que existe efecto de matriz. Se elige el mtodo de la adicin patrn, como mtodo de calibracin para el anlisis de piceido. Las concentraciones de piceido calculadas en cada mezcla de vinos, teniendo en cuenta que el rendimiento de la extraccin es 61 %, en comparacin con las calculadas mediante el mtodo cromatogrfico de validacin22 se encuentran recogidas en la Tabla 7, observndose que los resultados son muy aceptables.
22
Galeano Daz T., Durn Mers I., Airado Rodrguez, D., J. Sep. Sci., 2007, 30:3110-3119
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Tabla 7.- Concentraciones de piceido encontradas en las muestras de vino, calculadas mediante el mtodo extracto-fluorimtrico de derivadas y mediante HPLC
gmL-1 de piceido Mtodo Extractofluorimtrico de derivadasa HPLC

a
Vinos Tintos Jvenes 0.75 0.11 0.72 0.05
Vinos Tintos de Crianza 0.84 0.14 0.76 0.08
Vinos Blancos
0.17 0.03 0.20 0.01
Adicin Patrn (tres adiciones, por triplicado)
En ltimo lugar, para mejorar el mtodo, en trminos de simplicidad y rapidez, se examinan los resultados obtenidos llevando a cabo la adicin patrn en la etapa de medida. As, se comparan los resultados resumidos en la Tabla anterior, obtenidos dopando muestras de vino diluidas individuales, antes de ser extradas, con los obtenidos realizando la adicin patrn sobre la disolucin hidroetanlica resultante de la irradiacin, extraccin, evaporacin y reconstitucin de la muestra de vino diluida sin dopar, por adicin sucesiva, en la cubeta de medida de fluorescencia, de pequeos volmenes de disolucin patrn de piceido irradiada en idnticas condiciones que la muestra de vino diluida. Se comprueba que los resultados del anlisis no son afectados al llevar a cabo de esta manera la adicin estndar, lo que supone un recorte sustancial en el tiempo de anlisis, ya que habr que realizar una sola vez el proceso de extraccin y evaporacin, por muestra de vino analizada.
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Interferencias Los espectros de fluorescencia de los fotoproductos de resveratrol y piceido son prcticamente iguales, lo que significa que un analito es la principal interferencia del otro. Con los mtodos propuestos para el anlisis de cada uno de ellos, se consigue evitar dicha interferencia mediante distintos mecanismos: - el piceido no se extrae en ter etlico, lo que permite la determinacin de resveratrol en presencia de su glucsido. - la irradiacin durante 180 segundos de las muestras, en el proceso de determinacin de piceido, supone la destruccin y la prdida total de la fluorescencia del fotoproducto de resveratrol, en los intervalos de concentraciones normales en los que se trabaja en el anlisis de vino. Perspectivas de futuro Al igual que en el caso de la aglicona, el piceido tambin es retenido en membranas de nylon, de manera que se est trabajando en el desarrollo de mtodos de determinacin en soporte slido. Se estudiar tambin la posible resolucin de la mezcla aglicona-glucsido por aplicacin de quimiometra (mtodos de calibracin multivariantes) sobre seales de fluorescencia.
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CAPTULO IV DETERMINACIN DE RESVERATROL Y PICEIDO TOTALES EN VINO, SIN TRATAMIENTO PREVIO, MEDIANTE DERIVATIZACIN FOTOQUMICA OFF LINEHPLC
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CAPTULO IV. Resveratrol y piceido mediante derivatizacin-fotoqumica off line HPLC
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ANTECEDENTES Los compuestos fenlicos se encuentran entre los compuestos qumicos no nutrientes presentes en la dieta y que podran contribuir a los efectos beneficiosos de la misma. Histricamente, cuando se habla de vino, su compuesto fenlico prototpico sera el resveratrol. En las uvas y en compuestos derivados, el resveratrol se encuentra en forma libre o como piceido (resveratrol-3-O-glucsido) en sus respectivas formas isomricas trans y cis. Los glucurnidos y sulfatos conjugados del trans y cis-resveratrol se forman en las posiciones 3 y 4. Otros metabolitos del resveratrol descritos son el producto hidroxilado en posicin 3, tambin conocido como piceatannol, y el dihidroresveratrol que ha perdido el doble enlace que conecta ambos anillos bencnicos. No obstante, stos se encuentran en proporciones inferiores al trans-resveratrol y trans-piceido, que son los que centran la mayor parte de los estudios. El piceido, glucsido del resveratrol, recibe tanta atencin como la aglicona (resveratrol) ya que en derivados de las uvas su concentracin es significativamente mayor1. La proporcin relativa entre ambas formas depende de una serie de factores tales como las condiciones de fermentacin2. En un reciente artculo de revisin3 se comparan los niveles de resveratrol y piceido en vinos tintos de diferentes regiones y se encuentra que stos pueden llegar a contener hasta 14.3 gmL-1 de trans-resveratrol y 29.2 gmL-1 de trans-piceido, es decir que el nivel de trans-piceido puede llegar a ser tres veces superior al del trans-resveratrol. En cuanto a los vinos blancos, el resveratrol, en todas sus formas, se encuentra en stos en una concentracin bastante inferior a la encontrada en vinos tintos. Los
Lamuela Raventos R. M., Waterhouse A. L., Methods Enzymol., 1999, 299:184-190 Moreno-Labanda J. F., Mallavia R., Prez-Fons L., Lizama V., Saura D., Micol, V., J. Agric. Food Chem., 2004, 52:5396-5403 3 Stervbo U., Vang O., Bonnesen C., Food Chem., 2007, 101:449-457
1 2
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niveles ms elevados de trans-resveratrol que aparecen en la bibliografa4 son del orden de 0.1 gmL-1 Por otro lado, debido a la elevada proporcin entre los ismeros trans y los cis, se sugiere que estos ltimos pueden aparecer como consecuencia de la exposicin de los vinos a la luz durante su elaboracin o incluso en el almacenamiento5. En cuanto al anlisis de resveratrol y piceido en vino, si bien existen mtodos de cromatografa de gases, que requieren generalmente un paso de derivatizacin pre-columna6, 7, o de electroforesis capilar8, 9, fundamentalmente se efecta por cromatografa de lquidos y, como ya se ha mencionado anteriormente en esta memoria, la mayora de los mtodos utilizan cromatografa en fase inversa con fases mviles agua/metanol o agua/acetonitrilo conteniendo cido actico o cido frmico para fijar la acidez. En casi todos los casos se utiliza una elucin en gradiente, incluso utilizando dos columnas monolticas en serie10, y los tiempos de anlisis son elevados. Sin embargo, cuando se utilizan detectores electroqumicos es ms frecuente el uso de la elucin isocrtica, como en los mtodos desarrollados por McMurtrey et al11 y por Kolouchova-Hanzlkov et al12. Los sistemas de deteccin ms utilizados son los detectores UV de serie de diodos en
Siemann E.H., Creasy L.L., Am. J. Enol. Vitic., 1992,43:4952 Lamuela Ravents R. M., Romero Prez A. I., Waterhouse A. L., de la Torre Boronat M. C., J. Agric. Food Chem., 1995, 43:281283 6 Goldberg D.M., Yan J., Ng E., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Soleas G.J., Anal. Chem., 1994, 66:3959-3963. 7 Flamini R., Dalla Vedona A., Rapid Commun.. Mass. Spectrom., 2004, 18:1925-1931 8 Brandolini V., Maietti A., Tedeschi P., Durini E., Vertuani S.,Manfredini S., J. Agric. Food Chem., 2002, 50:7407-7411 9 Demianov Z., Sirn H., Kuldvee R., Riekkola M.L., Electrophoresis, 2003, 24:42644271 10 Abert Vian M., Tomao V., Gallet S., Coulomb P.O., Lacombe J.M., J. of Chromatogr. A, 2005, 1085:224-229 11 Mc Murtrey K.D., Minn J., Pobanz K., Schultz T.P., J. Agric. Food Chem., 1994, 42:2077-2080 12 Kolouchova-Hanzlkov I., Melzoch K., Filip V., midrkal J., Analytical, Nutritional and Clinical Methods, 2004, 87:151-158
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fila13-17, pero tambin se han usado otros ms sensibles y selectivos como los fluorescentes18-20, los ya mencionados electroqumicos21, quimiluminiscentes22, 23 o de espectrometra de masas24, a veces acoplados entre s25, 26. Los mtodos de HPLC ms sensibles de los encontrados10, 16, 18, 19, 23, 25 presentan lmites de deteccin en el orden de los ngmL-1, y slo en un caso se reporta un valor de menor orden de magnitud, en concreto 0.2 ngmL-1, obtenido utilizando deteccin quimiluminiscente22. El objetivo del trabajo de investigacin descrito en este captulo es el desarrollo de un mtodo de cromatografa lquida con deteccin fluorescente, rpido y sencillo, que permita analizar el total (trans + cis) de resveratrol y el total de piceido con una mayor sensibilidad que los mtodos similares descritos hasta el momento. Para ello se planea hacer uso de la transformacin que sufren estos compuestos, al irradiarlos con luz UV intensa, cuyo resultado son compuestos de eficacia cuntica de fluorescencia muy superior a la de los compuestos de partida.
Rudolf J.L., Resurreccion V.A., Saalia F.K., Phillips R.D., Food Chem., 2005, 89:623-638 Abert Vian M., Tomao V., Gallet S., Coulomb P. O., Lacombe J.M., J. Chromatogr. A, 2005, 1085:224-229 15 Abril M., Negueruela A. I., Prez C., Juan T., Estopan G., Food Chem., 2005, 92:729736 16 Nikfardjam M.S.P., Lszl G., Dietrich H., Food Chem., 2006,96:7479 17 Vitrac X., Bornet A., Vanderline R., Valls J., Richard T., Delaunay J. C., Mrillon J. M., Teissdre P. L., J. Agric. Food Chem., 2005, 53:56645669. 18 Vitrac X., Monti J.P., Vercauteren J., Deffieux G., Mrillon J.M., Anal. Chim. Acta, 2002, 458:103110 19 Pieiro Z., Palma M., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2006, 1110:6165 20 Rodriguez-Delgado M.A., Gonzlez G., Prez-Trujillo J.P., Garca-Montelongo F.J., Food Chem. 2002, 76:371-375 21 Bocchi C., Careri M., Groppi F., Mangia A., Manini P., Mori G., J.Chromatogr. A, 1996, 753:157170 22 Zhou J., Cui H., Wan G., Xu H., Pang Y., Duan C., Food Chem., 2004, 88:613620 23 Zhang Q., Cui H., Myint A., Lian M., Liu L., J. Chromatogr. A, 2005, 1095:94101 24 Wang Y., Catana F., Yang Y., Roderick R., Van Breemen R.B., J. Agric. Food Chem., 2002, 50:431-435 25 Loredana La Torre G., Saitta M., Vilasi F., Pellican T., Dugo G., Food Chem., 2006, 94, 640650 26 Bravo M.N., Silva S., Coelho A.V., Vilas Boas L., Bronze M.R., Anal. Chim. Acta, 2006, 563:84-92
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Para la optimizacin de las variables cromatogrficas se har uso de herramientas quimiomtricas, con el objetivo de reducir en lo posible el trabajo experimental.
RESULTADOS Y DISCUSIN Estudios fluorescentes previos Como se ha descrito en los captulos II y III de esta memoria, transresveratrol y trans-piceido, al igual que sus ismeros cis, presentes los cuatro analitos en el vino de forma natural, son dbilmente fluorescentes. En resumen, las disoluciones hidroetanlicas de trans-resveratrol y trans-piceido presentan dbiles seales de fluorescencia nativa, con mximos de excitacin centrados a 225 y 318 nm, y 230 y 300 nm, respectivamente, y mximos de emisin en torno a 385 y 395 nm, respectivamente. Sin embargo, la irradiacin con luz ultravioleta intensa de sus disoluciones hidroalcohlicas tiene como consecuencia primeramente el desplazamiento del equilibrio cistrans, totalmente, hacia las formas cis de ambos analitos, que rpidamente desaparecen en favor de nuevos fotoproductos altamente fluorescentes, cuyos espectros de fluorescencia estn caracterizados por agudos mximos de excitacin a 260 nm, y dos mximos en los espectros de emisin a 364 y 382 nm en el caso de resveratrol, y 361 y 380 nm en el caso de piceido. Tambin se ha comprobado que las seales de fluorescencia proporcionadas por estos fotoproductos, son lineales con la concentracin de resveratrol en las disoluciones originales, siendo posible por tanto el anlisis de las cantidades totales (trans- ms cis-ismeros) de resveratrol y piceido en las muestras originales, a travs de estas seales de fluorescencia fotoinducida.
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En esta memoria se describen distintas estrategias para explotar este comportamiento fotoqumico, en favor de la sensibilidad y la selectividad de los mtodos para el anlisis de resveratrol y piceido en muestras de vino. En este captulo se persigue el desarrollo de un mtodo de cromatografa de lquidos con deteccin fluorescente, para el anlisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido en vino, previa irradiacin off-line de las muestras, en una lmpara de mercurio de alta presin. En los captulos anteriores de esta memoria tambin se describe el estudio del efecto de variables tales como la composicin del medio de trabajo en la etapa de irradiacin y medida de fluorescencia, y el tiempo de irradiacin de las muestras, deducindose que los valores ptimos de ambos parmetros son distintos para ambos analitos. Concretamente, se dedujo que el rendimiento de las fotorreacciones depende en gran medida del porcentaje de etanol en el medio, siendo la composicin ptima del mismo etanol:agua 40:60, v:v, agua 100 % para resveratrol y piceido, respectivamente. Por su parte, el tiempo de irradiacin ptimo, teniendo en cuenta el rango de concentraciones de trabajo, result ser de 60 y 180 segundos para resveratrol y piceido, respectivamente. Esto no supone un problema cuando se determinan individualmente, sino que, en este caso en particular, la utilizacin de un tiempo de irradiacin ms alto en el caso de piceido supone la eliminacin de la interferencia de resveratrol en su anlisis, como ya se ha explicado anteriormente, constituyendo esto una gran ventaja. Sin embargo para realizar la determinacin cromatogrfica simultnea de resveratrol y piceido en forma de sus fotoproductos, en una solo inyeccin, es necesario llegar a alcanzar una situacin de compromiso, en lo que a estas
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variables se refiere. Teniendo en cuenta, por una parte que los niveles de aglicona en vino son menores que los de glucsido, y por otra parte la menor polaridad de la molcula de resveratrol y de su fotoproducto, y por tanto la mayor retencin en la columna cromatogrfica (C18), lo que provocar que el efecto de la dispersin sea ms notable en este caso, se seleccionan unos valores de compromiso para el porcentaje de etanol en el medio de irradiacin y el tiempo de irradiacin ms favorables para la formacin del fotoproducto del resveratrol que para la del piceido. Se fija un medio de irradiacin etanol:agua 40:60, v:v, y un tiempo de irradiacin de 90 segundos para posteriores experimentos. La seleccin de un tiempo de irradiacin lejos del ptimo para ambos analitos supone prdida de sensibilidad, tanto si es menor que el ptimo, caso del piceido, ya que el rendimiento de la fotorreaccin es inferior al 100 %, como si es mayor, caso del resveratrol, por destruccin del fotoproducto. Sin embargo se hace factible la determinacin de ambos conjuntamente. Estudios cromatogrficos previos Con el objetivo de estudiar los respectivos procesos de transformacin fotoqumica de resveratrol y piceido, se prepara, en un matraz de 10.0 mL, una disolucin conteniendo 0.10 mL de sendas disoluciones madre de trans-resveratrol y trans-piceido de 98 y 114 gmL-1, 3.9 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase. Se inyectan en el cromatgrafo dos alcuotas de esta disolucin, una sin irradiar y una irradiada en la lmpara de mercurio de alta presin durante 90 segundos. Ambas muestras son eludas isocrticamente con una mezcla acetonitrilo:cido actico (3.2 %), 22:78, v:v, y el eluato se monitoriza fotomtricamente a 306 nm, y fluorimtricamente a exc/em 260/364 nm, longitudes de onda correspondientes, respectivamente, a los mximos de absorcin de los ismeros trans, dbilmente fluorescentes, y a los mximos de los espectros de
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fluorescencia de sus respectivos fotoproductos, altamente fluorescentes. Los cromatogramas correspondientes a esta disolucin patrn, antes y despus de ser irradiada, se recogen en la Figuras 1A y 1B, respectivamente. En el perfil fotomtrico, obtenido a 306 nm, correspondiente a la muestra sin irradiar, se observan dos picos cromatogrficos a 2.4 y 6.1 minutos, correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol, respectivamente. En el perfil fluorimtrico tambin se observan ambos compuestos, pero en este caso los picos cromatogrficos son muy pequeos, debido a la dbil fluorescencia nativa de los analitos. Al irradiar esta disolucin durante 90 segundos en la lmpara de mercurio de alta presin, se observan cambios en los cromatogramas obtenidos tanto fotomtrica como fluorimtricamente. En el perfil fotomtrico a 306 nm se produce un decaimiento importante en los picos cromatogrficos correspondientes a los ismeros trans, as como la aparicin de nuevos picos, correspondientes a las formas fluorescentes generadas como consecuencia de la fotorreaccin y a los restos de cis-ismeros. Existen dos picos que podran atribuirse al cis-piceido y otros dos para cis-resveratrol, tal y como se indica en la Figura 1A. Se ha comprobado que, cuando la isomerizacin de trans a cis se lleva a cabo en condiciones menos energticas que las que proporciona esta lmpara de alta presin, se genera un nico compuesto cis a partir de cada trans, como se discute en el siguiente captulo. En este caso, dada la existencia de ms de un pico, cuyo espectro de absorcin presenta un mximo a 290 nm, tpico de las formas cis, puede indicar la formacin de fotoproductos secundarios de la reaccin, y que no son necesariamente los cis-ismeros. Por comparacin con los resultados obtenidos posteriormente en el captulo V, se postula que trans-piceido y transresveratrol son los picos a 3.9 y 11.3 minutos, respectivamente, correspondiendo los picos a 2.9 y 10.6 a otros productos de fotodescomposicin de piceido y resveratrol, respectivamente. Es de destacar que cis-piceido coeluye con FP1. Los
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resultados ms interesantes producidos como consecuencia de la irradiacin se observan en el perfil obtenido al monitorizar fluorimtricamente el eluato a exc/em 260/364 nm. En dicho perfil se observan tres nuevos picos cromatogrficos a 3.6, 4.9 y 12.6 minutos.
18 15 A (306 nm) 12 9 6 3 0 0
trans-piceido
9 trans-resveratrol 6
cis-piceido ? FP2
cis-resveratrol ? FR 6 7 t (min) 8 9 10 11 12 13 14
5 4 3 2 1 0 0
FP2
40 30 FR 20
F. I. (exc/em 260/364)
FP1 10 0 1 2 3 4 5 6 7 t (min) 8 9 10 11 12 13 14
Figura 1.- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo 0.98 y 1.14 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, sin irradiar () e irradiada durante 90 segundos (). Fase mvil acetonitrilo:cido actico (3.2 %), 22:78, v:v, 0.8 mLmin-1; UVD a 306 nm (A), y FLD a exc/em 260/364 nm (B)
Se comprueba la formacin de un nico fotoproducto fluorescente a partir de resveratrol, en adelante FR, responsable del pico cromatogrfico a 12.6 minutos de la Figura 1B, lo cual est de acuerdo con los resultados previamente publicados por Roggero et al27. Por otra parte, los picos cromatogrficos a 3.6 y 4.9 minutos
27
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Roggero J.P., Garca-Parrilla C., Sci. Aliments 1995, 15:411-422
F. I. (exc/em 260/364)
A (306 nm)
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corresponden a los dos fotoproductos originados a partir de piceido, en adelante FP1 y FP2, respectivamente. Los espectros de fluorescencia obtenidos en el pice de ambos picos son idnticos, y en base a los datos encontrados en la literatura28, que nos permiten asumir que los fotoproductos de la reaccin son derivados del fenantreno, es totalmente lgica la formacin de dos fotoproductos a partir de piceido (2,6-dihidroxifenantreno-4--D-glucopiransido y 4,6-dihidroxifenantreno-2-D-glucopiransido) y un nico fotoproducto a partir de resveratrol (2,4,6trihidroxifenantreno), de acuerdo con los esquemas de reaccin representados en la Figura 2. En la Figura 1B se observa tambin que el pico cromatogrfico correspondiente a FP1 es mucho menos intenso que el correspondiente a FP2. Teniendo en cuenta que los espectros de emisin de fluorescencia en el pice de ambos picos son idnticos, parece bastante lgica la hiptesis de que ambos compuestos son ismeros, entre los que la nica diferencia consiste en la distribucin relativa de los grupos hidroxilo y el residuo de glucosa (Figura 2), conservando en ambos casos el esqueleto fenantrenoide, responsable mximo del comportamiento fluorescente. Partiendo de esta base, puede afirmarse que la diferencia entre la intensidad de ambos picos, se debe nicamente a que uno de los fotoproductos es ms abundante que el otro, estando ms favorecido, en este caso concreto, el camino de reaccin que conduce a FP2, que el que desemboca en FP1. Con el objetivo de asignar las estructuras correctas a FP1 y FP2, se llevan a cabo clculos tericos de energa de enlace y momento dipolar, utilizando le mtodo semiemprico AM1, mediante el paquete de software HyperChem. Los resultados obtenidos de estos clculos se resumen en la Tabla 1.
28
Chen Y.H., Chen Y.L., Lin C.H., J. Chromatogr. A, 2002, 943:287-294
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OH
h
OH HO HO OH OH
h
OH HO OH
OH Glc O OH
OH
h
OH Glc Glc O O OH
OH OH HO O Glc
Figura 2.- Esquemas sugeridos para las fotorreacciones Tabla 1.- Resultados de los clculos tericos y asignacin de picos Estructura Energa de enlace (Kcalmol-1) Momento dipolar (Debye) Asignacin
OH Glc O OH
-5244.01
1.194
FP2
OH HO O Glc
-5242.98
4.524
FP1
Para asignar las estructuras presentadas en la Tabla a los picos correspondientes se ha tenido en cuenta que se est trabajando en fase inversa, y por tanto el orden de elucin de los compuestos, en principio, debe ser inverso a su
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orden de polaridad, es decir, de entre los dos ismeros FP1 y FP2, eluira en primer lugar el ms polar. As, a la vista de los valores de momento dipolar calculado, se observa que la estructura de FP1 es la que presenta mayor valor de momento dipolar, concretamente 4.524 D, siendo la estructura de FP2 la que presenta menor valor de esta propiedad (1.194 D). Adems, los datos de energa de enlace tambin estn de acuerdo con esta asignacin de estructuras, ya que la energa de enlace correspondiente a la estructura ms polar revela que este compuesto es ligeramente ms inestable que su ismero, lo que concuerda con las abundancias relativas de ambos compuestos. Dada la mayor intensidad del pico correspondiente a FP2, ser este compuesto el que sea utilizado para la cuantificacin de la cantidad total de piceido, a favor de la sensibilidad del mtodo. En el caso de resveratrol no existen dudas, y su cuantificacin en la muestra inicial se llevar a cabo a travs de su nico fotoproducto, FR, una vez comprobada, en ambos casos, la linealidad entre las seales obtenidas de estos picos y la concentracin de piceido y resveratrol, en la muestra inicial. Antes de proceder a la optimizacin de la composicin de la fase mvil para el anlisis de ambos compuestos en vino, se lleva a cabo el mismo estudio que se ha descrito hasta ahora, en presencia de vino, con el objetivo de comprobar la formacin de los mismos fotoproductos en presencia de la matriz. Para ello, se deposita en un matraz de 10.0 mL, 2.0 mL de vino tinto fortificado con 9.8 y 11.4 g de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, etanol hasta completar el 40 %, y agua ultrapura hasta enrase. Se inyectan en el sistema cromatogrfico, alcuotas de esta disolucin, antes y despus de ser irradiada durante 90 s en la lmpara de mercurio de alta presin, y se procede a su elucin y monitorizacin en idnticas condiciones a las empleadas anteriormente con los patrones. Los
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cromatogramas registrados en los detectores, fotomtrico y fluorimtrico, en serie, se recogen en la Figura 3.
100 80 A (306 nm) 60 40 20 0 0
35 28 21 14 7 0 2
trans-piceido trans-resveratrol
7 t (min)
10
11
12
13
14
80 60 40 20 0 0
F. I. (exc/em 260/364)
7 t (min)
10
11
12
13
14
Figura 3.- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo una alcuota de 2 mL de un vino tinto comercial fortificado con 9.8 y 11.4 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente en etanol al 40 %, sin irradiar () e irradiadas durante 90 segundos (). Fase mvil acetonitrilo:cido actico (3.2 %), 22:78, v:v, 0.8 mLmin-1; UVD a 306 nm, y FLD a exc/em 260/364 nm
En las condiciones en las que la separacin se ha llevado a cabo, slo el trans-resveratrol es fotomtricamente detectado a 306 nm como un pico totalmente resuelto, mientras que trans-piceido coeluye con otros componentes del vino (Figura 3A). Por lo dems, se comprueba como la fotorreaccin se da exactamente igual en presencia del vino, comprobndose en el perfil de fluorescencia la formacin de FP1, FP2, y FR.
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Optimizacin quimiomtrica de la composicin de la fase mvil para el anlisis de vino Como se ha descrito en la introduccin de este captulo, en los mtodos de cromatografa de lquidos previamente propuestos para el anlisis de resveratrol y piceido, se lleva a cabo la elucin en gradiente. Los disolventes orgnicos ms comnmente empleados en estas fases mviles son metanol y acetonitrilo, y los cidos actico y frmico son los ms empleados para fijar la acidez, siendo este ltimo comn a todos los mtodos en los que la deteccin se lleva a cabo mediante espectrometra de masas. En nuestro caso concreto se ha seleccionado acetonitrilo como componente orgnico de la fase mvil, debido principalmente a su menor viscosidad, menor solubilidad de aire y mayor transparencia en el ultravioleta, y cido actico para fijar la acidez de la fase mvil. En estas condiciones se procede a la optimizacin de la composicin de una fase mvil isocrtica acetonitrilo:cido actico:agua, que proporcione una adecuada resolucin de FR y FP2 del resto de componentes fluorescentes del vino, en un tiempo razonable. Tambin se ha contemplado como objetivo que la fase mvil escogida fuese til para futuros estudios acerca del proceso de fotodescomposicin en vino, y para el desarrollo de un mtodo en el que la irradiacin tenga lugar detrs de la separacin, lo que implica tener en cuenta la resolucin de los picos correspondientes a los ismeros trans del resto de picos debidos a los restantes componentes del vino en el proceso de optimizacin. Se utiliza el diseo de experimentos para la optimizacin del porcentaje de cido actico y disolvente orgnico en la fase mvil isocrtica. Concretamente se emplea un diseo central compuesto, con el objetivo de calcular simultneamente el efecto de cada variable, as como sus posibles interacciones, sobre la funcin de
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respuesta. Este tipo de diseo trabaja con cinco niveles para cada variable. Tambin incluye tres rplicas de una muestra central, lo que da lugar a un total de 11 experimentos (Figura 4). Dicho diseo es posee rotatividad, lo que implica que la precisin en el clculo de la respuesta es uniforme en todo el rango ensayado de cada variable.
16 20 24 28
3.6 % v. cido Actico
3.6
2.4
2.4
1.2
1.2
16
20 24 % v. Acetonitrilo
28
Figura 4.- Diseo central compuesto. Niveles ensayados para las variables: % v. Acetonitrilo: 14.92, 17, 22, 27, 29.07; % v. cido actico: 0.24, 0.9, 2.5, 4.1, 4.76
Se selecciona la siguiente funcin de respuesta (F.R.):
F .R. =
k ' Rs t
donde Rs es la suma de los valores de resolucin (Rs) correspondientes a los picos de FP1 y FP2 (obtenidos en los cromatogramas proporcionados por el detector de fluorescencia, FLD) y de trans-resveratrol (obtenidos en los cromatogramas proporcionados por el detector de serie de diodos, UVD), respecto a los picos correspondientes a sustancias interferentes del vino, k es el factor de capacidad para trans-piceido (UVD), ya que este compuesto es el menos retenido en la columna, eluyendo siempre muy cerca del frente y de las interferencias
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menos retenidas del vino, y t es el tiempo de retencin de ltimo pico, FR, el cual siempre est resuelto de las interferencias del vino, pero cuyo tiempo de retencin es demasiado alto con alguna de las fases mviles ensayadas. En el clculo de los valores de funcin de respuesta en los distintos puntos del diseo, se ha asignado un valor mximo de 1.5 a Rs, para evitar as que este parmetro tenga demasiado peso frente al resto de los incluidos en dicha funcin. Es decir, si en uno de los puntos del diseo, alguno de los picos correspondientes a los compuestos FP1, FP2 o trans-resveratrol, presentara un valor muy alto de la resolucin, mientras que los otros no estuvieran resueltos, y se incluyera el valor obtenido para ese pico en la funcin de respuesta, se obtendra un valor elevado para la funcin en esas condiciones experimentales, lo que conducira a la eleccin de unas condiciones ptimas que no suponen una solucin real al problema. Se prepara en un matraz de 25.0 mL una disolucin conteniendo 5.0 mL de vino tinto (12 % etanol), volmenes de sendas disoluciones madre, conteniendo 9.8 y 11.4 g de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, etanol hasta completar 10.0 mL y agua ultrapura hasta enrase. En cada una de las condiciones cromatogrficas marcadas por el diseo, se inyectan en el sistema cromatogrfico sendas alcuotas de dicha disolucin, una sin irradiar y otra irradiada durante 90 segundos en la lmpara de mercurio de alta presin, y se procede a su elucin. El flujo se mantiene en todo momento constante a 0.8 mLmin-1, y el eluato se monitoriza fotomtrica y fluorimtricamente a 306 nm y exc/em 260/364 nm, respectivamente. Los valores de factor de capacidad del pico de trans-piceido y resolucin del pico de trans-resveratrol se calculan sobre el cromatograma obtenido fotomtricamente a 306 nm de la muestra sin irradiar, y los parmetros correspondientes a las formas fluorescentes, sobre el cromatograma de la muestra irradiada obtenido mediante deteccin fluorimtrica.
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Los resultados se interpretan con la Metodologa de la Superficie de Respuesta y la optimizacin del modelo se lleva a cabo con el paquete de software THE UNSCRAMBLER (Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N7011, Trondheim, Norway). En el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA), se asume un modelo cuadrtico de segundo grado (Model Check Quadratic, valor p (95 %) = 0.0004). El valor de p calculado (95 %) para la falta de ajuste (Lack of Fit), 0.0760, indica que sta no es significativa a un nivel de confianza del 95 %, y que, por tanto, el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de respuesta. Por otra parte, aplicando el ANOVA al anlisis de los valores p, para las variables estudiadas, se deduce que el porcentaje de acetonitrilo (p-value = 0.0002), as como el trmino cuadrtico % ACN - % ACN (p-value = 0.0002) y la interaccin % ACN - % actico (p-value = 0.0010) contribuyen significativamente al modelo, para un nivel de confianza del 95 %. Sin embargo, el efecto % actico (pvalue = 0.0639) y el trmino cuadrtico % actico - % actico (p-value = 0.0539), no son significativas para el modelo, al nivel de confianza considerado.
Figura 5.- Superficie de respuesta estimada para el par de efectos estudiados
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En la Figura 5 se muestra la superficie de respuesta estimada por el modelo para el par de variables consideradas. Las variables estudiadas toman en el mximo de esta superficie valores de: 19 % de acetonitrilo y 3.3 % de cido actico. Una vez deducida la composicin ptima de la fase mvil, se ensayan distintos caudales, comprendidos entre 0.6 y 1.2 mLmin-1. Se aprecia que caudales inferiores a 0.8 mLmin-1 suponen un aumento del tiempo de anlisis sin que se consiga aumentar la eficacia de la separacin, mientras que caudales por encima de este valor implican prdida de la eficacia y unas presiones demasiado elevadas, seleccionndose finalmente un valor de 0.8 mLmin-1 para esta variable. Por tanto, se fijan las siguientes condiciones para futuras experiencias: Fase mvil: acetonitrilo:cido actico (4.1 %), 19:81, v:v Flujo = 0.80 mL/min Deteccin fluorimtrica: exc/em 260/364 nm En estas condiciones, como se muestra en la Figura 6, los tres fotoproductos fluorescentes son eluidos, resueltos a lnea base, en menos de 20 minutos. Siendo los tiempos de retencin y factores de capacidad para FP1, FP2 y FR, 5.1, 7.3 y 17.9 minutos, y 2.7, 4.4 y 12.2, respectivamente.
16 FP2 F. I. (exc/em 260/364) 12 8 FP1 4 0 0 2 4 6 8 10 t (min) 12 14 16 18 20 FR
Figura 6.- Cromatograma (FLD exc/em 260/364 nm) correspondiente a una muestra patrn conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de resveratrol y piceido, respectivamente, irradiada durante 90 segundos en la lmpara de mercurio de alta presin y eluda en las condiciones determinadas como ptimas
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Validacin del mtodo. Parmetros analticos de calidad Una vez optimizadas las variables implicadas en la separacin cromatogrfica, se procede a estudiar la linealidad entre las reas de los picos correspondientes a FP2 y FR, y la concentracin de piceido y resveratrol, respectivamente, en la muestra original. Para evaluar la linealidad del mtodo se prepara una serie de disoluciones estndar conteniendo entre 1.00 y 1000 ngmL-1 de cada analito. Cada una de estas mezclas patrn, se irradia durante 90 segundos en la lmpara de mercurio de alta presin, se introduce por triplicado en el sistema cromatogrfico, y se eluye en las condiciones previamente determinadas como ptimas. La cuantificacin de resveratrol y piceido totales en las muestras originales, en trminos de transresveratrol y trans-piceido, se lleva a cabo a travs de los picos cromatogrficos correspondientes a FR y FP2, respectivamente. Los parmetros analticos de calidad correspondientes a la determinacin cromatogrfica de ambos analitos utilizando en rea de los picos como seal analtica, se recogen en la Tabla 2. Los lmites de deteccin (LOD) y cuantificacin (LOQ) se obtienen como 3 y 10 veces, respectivamente, la relacin seal/ruido. Para ello, se mide la amplitud de la lnea base en los cromatogramas correspondientes a los patrones empleados en el establecimiento de la recta de calibrado, en varias zonas, en intervalos de aproximadamente dos minutos. Dicha amplitud se multiplica por 3 o por 10, y se transforma en unidades de concentracin de trans-resveratrol o trans-piceido, a travs de rectas de calibrado construidas para cada analito empleando en este caso como seal analtica la altura de pico.
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Para evaluar la repetitividad del mtodo se realizan once inyecciones sucesivas de una disolucin conteniendo 490 y 570 ngmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, irradiada durante 90 segundos.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin cromatogrfica de resveratrol y piceido
Resveratrol Rango de concentracin examinado(ngmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mLng-1) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) Resolucin Analtica (-1) (ngmL-1) LOD (S/N=3) (ngmL-1) LOQ (S/N=10) (ngmL-1) Repetitividad (% RSD)a
a
Piceido 1-1000 7.36 1.56
1-1000 12.5 2.5
1.22 0.01 0.732 0.004 0.999 0.999 10.09 0.29 0.97 9.5 0.999 0.999 10.54 0.28 0.95 4.6
n=11. 490 y 570 ngmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente.
Determinacin de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino El mtodo previamente optimizado y validado en trminos de linealidad, lmites de deteccin y repetitividad, se aplica al anlisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido (trans + cis), en muestras de vino. En primer lugar, se realiza una adicin patrn sobre una muestra de vino tinto comercial, con el objetivo de determinar si existe o no efecto de matriz y calcular las recuperaciones de cada analito a los distintos niveles de concentracin.
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En la Figura 7 se representan las rectas de calibrado y adicin patrn para resveratrol y piceido (ntese que las concentraciones que figuran en el eje de las abscisas no son concentraciones en vino, sino en las disoluciones inyectadas en el cromatgrafo). Como puede apreciarse en dicha Figura, y se ratifica por aplicacin de los tests estadsticos de comparacin de pendientes, se deduce que las pendientes de cada par de rectas son indistinguibles a un nivel de confianza del 95 %.
2500 2000 rea FP2 0 0.4 0.8 [trans-resveratrol] (gmL -1) 1.2 rea FR 1500 1000 500 0 2500 2000 1500 1000 500 0 0 0.4 0.8 [trans-piceido] (gmL -1) 1.2
Figura 7.- Rectas de patrones externos () y adicin patrn (), para resveratrol (izquierda) y piceido (derecha)
Las pendientes de las rectas de calibrado y adicin patrn no presentan diferencias significativas a un nivel de confianza del 95 %, deducindose por tanto que no existe efecto de matriz y que la determinacin de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino puede hacerse mediante calibracin por patrones externos. Efectivamente, si se calculan los valores de recuperacin para las muestras fortificadas, usando para ello las rectas de calibrado de patrones externos (Tabla 3), se obtienen resultados muy satisfactorios, estando en todos los casos los valores de recuperacin, en torno al 100 %.
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Tabla 3.- Resultados del procedimiento cromatogrfico para la determinacin de las cantidades totales de resveratrol y piceido en vino tinto, utilizando la calibracin por adicin patrn RESVERATROL Puesto Encontrado Recuperacin en vino en vino (%)a (gmL-1) (gmL-1)a 0.00 1.02 2.55 3.57 5.10
amedia
Puesto en vino (gmL-1) 0.00 1.11 2.78 3.89 5.55
PICEIDO Encontrado Recuperacin en vino (%)a (gmL-1)a 31.540.39 34.980.19 33.710.84 35.560.38 37.312.1 1071 982 1061 1016
2.120.04 3.740.11 4.820.31 6.360.16 7.390.68 SD (n=2)
1194 1037 1123 1029
Por tanto, el procedimiento cromatogrfico que se propone para determinar el resveratrol y el piceido totales en vino, a travs de la medida de sus fotoproductos, es: En un matraz de 10.0 mL se aaden 2.00 mL de vino (12 % v. etanol), 3.75 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase. Se transfiere una alcuota de la disolucin resultante a una cubeta de cuarzo, y se irradia durante 90 s en una lmpara de mercurio de alta presin. Se inyectan 20 L de la disolucin irradiada en el sistema cromatogrfico, previa filtracin a travs de una membrana de nylon de 0.22 m, y se procede a su elucin isocrticamente con acetonitrilo:cido actico (4.1 %), 19:81, v:v, con un flujo de 0.80 mLmin-1. El eluato se monitoriza fluorimtricamente a exc/em 260 / 364 nm. La cuantificacin de resveratrol y piceido se hace mediante patrn externo a travs de los picos cromatogrficos de FR (17.9 minutos) y FP2 (7.3 minutos), respectivamente.
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El mtodo propuesto se aplica entonces al anlisis de distintas muestras de vino comerciales. La totalidad de las muestras de las que se dispone se divide en tres grandes grupos: -Vinos tintos jvenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos y se prepara, dentro de cada grupo, una mezcla, conteniendo volmenes idnticos de todos lo vinos que integran ese grupo. Se toman 2.0 mL de cada una de las mezclas, y se llevan a un volumen final de 10.0 mL con agua ultrapura, y etanol en una proporcin final del 40 %. Se preparan tres rplicas por pool, que se irradian durante 90 segundos, y se analizan en las condiciones previamente optimizadas. Los cromatogramas correspondientes a cada uno de estas mezclas, obtenidos monitorizando fluorimtricamente (exc/em = 260/364 nm) el eluato, se recogen en la Figura 8, en comparacin con el correspondiente a una disolucin patrn, conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de transresveratrol y trans-piceido, respectivamente. Los resultados obtenidos en el anlisis de cada uno de estas mezclas se resumen en la Tabla 4, en unidades de transresveratrol y trans-piceido.
Tabla 4.- Resultados obtenidos en el anlisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido en distintas muestras de vino, expresados como concentracin de los transismeros
Tinto Joven Resveratrol Total en vino 0.28 0.01 (ngmL-1 de trans-resveratrol)a Piceido Total en vino (ngmL-1 de trans-piceido)a
amedia
Tinto Crianza
Blanco
0.27 0.02 0.15 0.01
0.72 0.05
0.76 0.08 0.20 0.01
SD (n=3)
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80 60 40 20
I. F. (exc/em 260/364)
FP2 FP1 FR
0 0 80 60 40 20 0 0 4 8 t (min) 12 16 20 B 4 8 t (min) 12 16 20
I. F. (exc/em 260/364)
80 60 40
C 5 1
I. F. (exc/em 260/364)
0 20 0 0 4 8 t (min) 12 16 20 6 8 10 16 20
Figura 8.- Cromatogramas (FLD exc/em 260/364 nm) correspondientes a un patrn conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente (), y a un pool de vino tinto joven (A ), tinto de crianza (B, ), y blanco (C, ) oportunamente diluidos, irradiados durante 90 segundos y eluidos en las condiciones ptimas
Se observa que, adems de los picos debidos a los compuestos de inters, aparece un pico de gran magnitud, a un tiempo de retencin cercano a los 8 min. No hemos encontrado datos bibliogrficos que orienten acerca de la naturaleza del
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compuesto responsable de este pico, y tampoco corresponde a ninguno de los compuestos fluorescentes el vino de los que se dispona de patrones. Por otro lado, en ciertas muestras de vino, se encuentra que aparece otro pico cromatogrfico muy cercano al pico de FP2, como se aprecia en el ejemplo mostrado en la Figura 9A.
80 A I. F. (exc/em 260/364) 60 40 20 0 6.5 7 t (min) 7.5 8
20 16 12 I. F. 8 4 0
280
320
(nm)
360
400
440
Figura 9.- (A) Porcin de los cromatogramas (FLD exc/em 260/364 nm) correspondientes a una muestra patrn conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de resveratrol y piceido, respectivamente (), y de los obtenidos a em 348 () y 369 nm () (exc 260 nm), para un vino tinto comercial, as como el cromatograma diferencia entre ellos () (B) Espectros de emisin (exc 260 nm) obtenidos on-line en los puntos marcados en el cromatograma
Sin embargo, los espectros de emisin de fluorescencia del compuesto interferente y de FP2, se encuentran ligeramente desplazados entre ellos, como se muestra en la Figura 9B, lo que hace posible eliminar la contribucin de este interferente, tomando, como seal analtica, la diferencia entre las reas de los picos obtenidos empleando como longitudes de onda de emisin 369 y 348 nm (exc = 260 nm), que se corresponden con puntos isoemisivos en el espectro de emisin del interferente, pero no en el de FP2. De manera que como se ve en la Figura 9A, el cromatograma diferencia est totalmente limpio de interferencia.
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As, para la construccin de la recta de calibrado en estas condiciones, se ha de hacer uso de la opcin de multiemisin en la configuracin del detector de fluorescencia, y monitorizar el eluato a una longitud de onda de excitacin constante de 260 nm, y a longitudes de onda de emisin de 369 y 348 nm. Una vez obtenido el conjunto de cromatogramas de las disoluciones patrn, se construye la recta de calibrado, tomando como seal analtica la diferencia de reas del pico FP2 obtenido en ambos canales de emisin. De esta manera se obtiene una buena relacin lineal entre seal analtica medida y concentracin de analito en el mismo rango de concentraciones indicado en la Tabla 2. Perspectivas de futuro Para la identificacin inequvoca de los fotoproductos sera conveniente el uso de tcnicas acopladas LC-MS, a las que an no tenemos acceso pero con las que se planea contar en el futuro. Otro reto es la identificacin del compuesto fluorescente responsable del pico ms intenso que aparece en los cromatogramas del vino en las condiciones de excitacin y emisin de los fotoproductos de resveratrol y piceido.
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CAPTULO V ANLISIS DE LOS ISMEROS DE RESVERATROL Y PICEIDO EN VINOS MEDIANTE HPLC ISOCRTICA, CON DETECCIN FLUORESCENTE PREVIA DERIVATIZACIN POST-COLUMNA EN LNEA
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CAPTULO V. Ismeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacin on-line
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ANTECEDENTES Las dos metas generales de cualquier tcnica de derivatizacin son: 1.- incrementar la sensibilidad den la deteccin, normalmente introduciendo los cromforos o fluorforos adecuados, o generando compuestos derivados de los originales ms fcilmente detectables. 2.- incrementar la selectividad, aplicando una reaccin de derivatizacin especfica de los compuestos de inters, en la matriz compleja. En muchos casos las reacciones de derivatizacin llevan consigo la adicin de reactivos a la disolucin conteniendo el analito, con el objetivo de transformar ste en una forma ms fcil de detectar. Las reacciones que se llevan a cabo entre el analito y el agente derivatizante son, normalmente, de esterificacin, acilacin, silanizacin, dansilacin, etc. Cuando el reactivo es la luz, el procedimiento se llama derivatizacin fotoqumica. La luz se considera uno de los agentes derivatizantes ms baratos, y normalmente las reacciones fotoqumicas son reacciones simples, requiriendo de instrumentacin muy sencilla, muy limpias y en las que no se da dilucin del analito, ya que este reactivo derivatizante no implica la adicin de disolventes. Con respecto al tipo de reacciones, que pueden ser iniciadas por activacin fotoqumica se pueden citar reacciones de oxidacin, reduccin, fotolisis, fotohidrolisis, fotoionizacin, reordenamientos moleculares, adicin, eliminacin, isomera, ciclacin, polimerizacin, etc. Inicialmente los mtodos basados en reacciones fotoqumicas como sistemas de derivatizacin, se llevaban a cabo siempre en rgimen estacionario y los primeros intentos de combinar los procesos fotoqumicos con sistemas
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dinmicos continuos, como son los mtodos cromatogrficos, fueron realizados en 1976 por Iwaoka y Tannenbaum1. Estos autores realizan un acoplamiento en lnea de un fotorreactor con un sistema de cromatografa lquida de alta resolucin, situando el fotorreactor detrs de la columna analtica, y llevan a cabo la determinacin de derivados N-nitrosos mediante hidrlisis a nitritos por irradiacin con luz ultravioleta de longitud de onda larga. El tiempo de irradiacin era excesivamente largo y la sensibilidad no se mejoraba en exceso. Twitchett et al2 obtienen en 1978 resultados ms alentadores, determinando cannabinol en fluidos corporales sin necesidad de realizar un tratamiento previo de la muestra y con un lmite de deteccin de aproximadamente 0.5 ng. A partir de aqu, se han ampliado en gran medida las aplicaciones de este tipo de sistemas para la mejora de la deteccin. En 1999 Lores et al3 publican un artculo de revisin donde se recogen varias aplicaciones en anlisis por inyeccin en flujo (FIA) y HPLC, as como las principales tendencias en instrumentacin y aspectos tcnicos. Respecto a los compuestos analizados, merece la pena resaltar diversos principios farmacolgicos, marcadores biolgicos, pesticidas, componentes naturales en alimentos, e incluso trazas de metales, en matrices cada vez ms complejas. Como ya se ha descrito en captulos anteriores, los trans-ismeros de resveratrol y piceido, apenas presentan fluorescencia nativa. Cuando sus disoluciones son irradiadas con radiacin UV, los trans-ismeros se transforman en los respectivos ismeros cis, tambin poco fluorescentes, que rpidamente evolucionan hacia compuestos altamente fluorescentes. En concreto FP1 y FP2
Iwaoka W., Tannenbaum S. R., I.A.R.C. Sci. Publ., 1976, 14:51-56 Twitchett P.J., Williams P.L., Moffat A.C., J. Chromatogr. A, 1978, 149:683-691 3 Lores M., Cabaleiro O., Cela R., Trends in Anal. Chem., 1999, 18:392-400
1 2
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son generados a partir de piceido, siendo FR el fotoproducto fluorescente de resveratrol. Este tipo de fotoreaccin es idnea para ser acoplada en lnea en un sistema cromatogrfico, y as poder llevar a cabo el anlisis de los ismeros trans y cis presentes inicialmente en la muestra, de manera sensible, con un mtodo en el que la manipulacin de la muestra es mnima. As pues, el objetivo de este captulo, es aprovechar este comportamiento fotoqumico y disear un sistema de irradiacin post-columna, en lnea, para proponer un mtodo isocrtico sencillo que permita la determinacin de trans y cis resveratrol y piceido en muestras de vino de diferente naturaleza. En el Esquema 1 se muestra la disposicin del sistema cromatogrfico con el fotorreactor acoplado. Como puede observarse, ste se sita detrs de la columna, concretamente entre los detectores fotomtrico y fluorimtrico, de manera que las fotorreacciones tendrn lugar despus de la separacin cromatogrfica. La principal ventaja de esta disposicin frente al mtodo cromatogrfico descrito en el captulo anterior es la posibilidad de determinar las concentraciones relativas para cada par de ismeros, trans y cis, en la muestra original. Una vez que se ha decidido el esquema de la fotoderivatizacin, el siguiente paso es la construccin del fotorreactor propiamente dicho. Comercialmente estn disponibles algunos modelos, pero normalmente se suele hacer uso de fotorreactores de fabricacin casera. Por otra parte, cuando se disea algn aparato para acoplarlo a un sistema cromatogrfico, debe prestarse particular atencin a su posible efecto sobre la integridad de dicho sistema. As, reactores con un excesivo volumen muerto y caractersticas de flujo muy pobres, pueden causar prdida en la eficacia de la separacin.
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En la construccin de un reactor fotoqumico estn implicados dos componentes fundamentales: El primero es el reactor, para el cual se han descrito dos diseos fundamentales: de paso de flujo y envolvente. En el primero el eluato pasa a travs de una clula de flujo de volumen interno pequeo, la cual se irradia externamente, mientras que en el segundo un tubo de tefln se enrolla helicoidalmente sobre la fuente de irradiacin, de manera que la fotorreaccin se estar dando mientras que el analito de inters circule por este tubo. La principal desventaja de los sistemas envolventes es que los volmenes muertos suelen ser mayores que en los sistemas de paso de flujo. No obstante, la experiencia demuestra que el enrollado helicoidal del tubo es la mejor solucin para los efectos de dispersin y engrosamiento de bandas, de manera que este sistema es el ms utilizado. El segundo componente del fotorreactor es la fuente de luz, la cual est caracterizada por una longitud de onda de radiacin, intensidad, tamao ms y geometra de importantes a la lmpara, en como cuenta. caractersticas tener
Tradicionalmente se han venido utilizando muchos tipos de lmparas, como son las lmparas de arco de alta, media y baja presin, conteniendo normalmente mercurio, xenon, o una mezcla de ambos, las lmparas de deuterio y de hidrgeno, as como lmparas fluorescentes, germicidas o incluso lseres.
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En nuestro caso el fotorreactor se ha construido enrollando helicoidalmente 3 m de tubo de tefln de 0.3 mm de dimetro interno sobre una lmpara de xenon de 4 W. El conjunto se guarda dentro de una caja metlica, recubierta interiormente de papel de aluminio como sistema reflectante, para aumentar as la efectividad de la lmpara (Figura 1).
Esquema 1.- Esquema del instrumento de LC con derivatizacin fotoqumica post-columna.
Figura 1.- Fotorreactor utilizado
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RESULTADOS Y DISCUSIN Estudios Fluorescentes Previos La gran mayora de los mtodos propuestos para el anlisis de resveratrol y piceido en vino mediante LC, trabajan en fase inversa y llevan a cabo la elucin en gradiente, mediante la introduccin progresiva de metanol o acetonitrilo, sobre disoluciones diluidas de cido actico (o frmico cuando se emplea la espectrometra de masas como sistema de deteccin). En nuestro caso, ya que se va a desarrollar una fotorreaccin on-line, es muy importante la eleccin tanto del cido empleado para fijar el pH de la fase mvil, como del disolvente orgnico. Se tratar de encontrar unas condiciones que favorezcan tanto la formacin de los fotoproductos, como el rendimiento cuntico de fluorescencia de los mismos. Por ello, inicialmente se llevarn a cabo una serie de estudios previos mediante espectroscopia de fluorescencia. Con respecto a la acidez del medio, ya se ha puesto de manifiesto en los captulos anteriores que la fotorreaccin transcurre en medio cido, y adems el rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos no se ve alterado como consecuencia de la presencia de una alta concentracin de protones en el medio. Se ha comprobado que la presencia de los cidos orgnicos tales como actico y frmico afecta negativamente al proceso, por lo que se elige el H3PO4 como cido para controlar el pH de la fase mvil. Con respecto al disolvente orgnico a utilizar para preparar la fase mvil, teniendo en cuenta los antecedentes bibliogrficos, se plantean dos posibilidades: metanol o acetonitrilo. Mediante espectroscopa de fluorescencia se comprueba el
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efecto de ambos modificadores sobre la fotorreaccin. Para ello, se prepara una serie de disoluciones conteniendo 0.34 gmL-1 de trans-resveratrol, en presencia de distintas proporciones de acetonitrilo o metanol, y se registran sus espectros de emisin (exc = 260 nm), tras ser irradiadas de manera acumulativa 30, 60 y 90 segundos bajo una lmpara de mercurio de alta presin. Las seales obtenidas se representan en la Figura 2, observndose que, tanto la velocidad de la fotorreaccin como la mxima seal de fluorescencia fotoinducida alcanzada, son ligeramente superiores en presencia de acetonitrilo, por lo que se elige este disolvente como modificador de la fase mvil.
80
60 I. F. (exc/em 260/364 nm)
10 % ACN 20 % ACN 40 % ACN 10 % MeOH 20 % MeOH 40 % MeOH
40
20
0 0 20 40 60 Tiempo de Irradiacin (s) 80 100
Figura 2.- Influencia del tiempo de irradiacin para disoluciones conteniendo 0.34 gmL-1 de trans-resveratrol en presencia de distintas proporciones de metanol o acetonitrilo
Estudios Cromatogrficos Previos Una vez seleccionado el cido para fijar el pH de la fase mvil y el modificador orgnico, se comienza con los estudios cromatogrficos. Se prepara una disolucin que, en un volumen final de 25.0 mL, contiene 1.02 y 1.11 gmL-1
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de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase. Se inyecta en el sistema cromatogrfico una alcuota de esta disolucin y se eluye isocrticamente, con una mezcla acetonitrilo:agua 19:81, v:v y una velocidad de flujo de 0.80 mLmin-1. Se realizan dos inyecciones de la misma, una con el fotorreactor apagado y otra con l encendido, para comprobar la eficacia de la fotorreaccin. El eluato se monitoriza fotomtricamente a 306 nm y fluorimtricamente a exc/em = 260/364 nm y los cromatogramas registrados con ambos detectores se recogen en la Figura 3.
12 A 8
trans-Resveratrol trans-Piceido
A (306 nm)
0 0 2 4 6 8 10 tiempo (min) 12 14 16 18
8 B I. F. (exc/em 260/364 nm) 6 4 2
(trans-Resveratrol)h (trans-Piceido)h
trans-Piceido
0 0 2 4 6 8 10 tiempo (min)
trans-Resveratrol
12 14 16 18
Figura 3.- Cromatogramas correspondientes a una mezcla conteniendo 1.02 y 1.11 gmLde trans-resveratrol y trans-piceido: (A) Perfil DAD a 306 nm y (B) FLD a exc/em 260/364 nm con el fotorreactor encendido () y apagado ()
En ausencia de fotorreaccin, en ambos detectores se observan dos picos cromatogrficos, correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol, respectivamente. Los tiempos de retencin son 4.4 y 14.9 minutos en el detector de
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diodos y aumentan ligeramente en el detector fluorescente, 4.9 y 15.4 min, debido al fotorreactor que separa ambas clulas de deteccin, cuya longitud es de tres metros, que produce un retardo de 0.45 minutos entre ambos perfiles. Cuando se lleva a cabo una segunda inyeccin con el fotorreactor encendido, se produce una ganancia sustancial en la intensidad de los picos observados fluorimtricamente, lo que indica que los fotoproductos originados a partir de ambos analitos han sido satisfactoriamente obtenidos, al menos en cierta extensin. Para estudiar el efecto de la presencia de H3PO4, tanto en el rendimiento de la fotorreaccin que ambos compuestos sufren en lnea, como en el rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos generados, se prepara una disolucin acuosa conteniendo 1.02 y 1.11 gmL-1 de trans-resveratrol y transpiceido, respectivamente. Esta disolucin se conserva en la oscuridad hasta el momento de ser inyectada en el cromatgrafo, y se eluye isocrticamente con distintas fases mviles, conteniendo todas ellas un 19.0% de acetonitrilo y porcentajes variables de H3PO4 entre 0 y 0.050%, resultando un pH aparente final para estas fases mviles de 4.42, 2.82, 2.50 y 2.28, respectivamente. El flujo de la fase mvil se mantiene a 0.80 mLmin-1 y el fotorreactor permanece encendido en todo momento, de manera que fotomtricamente se observarn los compuestos trans originales, y fluorimtricamente sus respectivos fotoproductos. Para ello, el eluato se monitoriza fotomtricamente a 306 nm y fluorimtricamente a exc/em = 260/364 nm. Los cromatogramas obtenidos en el detector fluorescente se representan en la Figura 4, donde se puede observar que la presencia de H3PO4 en la fase mvil, origina una ligera disminucin en el rendimiento cuntico de los fotoproductos. Por otra parte se aprecia que los tiempos de retencin disminuyen, a medida que aumenta el porcentaje de cido.
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8
6 I. F. (exc/em 260/364 nm)
6 4
2 0 4 4.5 5 5.5
0 0 2 4 6 8 10 tiempo (min) 12 14 16 18
Figura 4.- Influencia del porcentaje de H3PO4: 0% (), 0.010% (), 0.025% () y 0.050% (). [trans-resveratrol] = 1.02 gmL-1, [trans-piceido] = 1.11 gmL-1, velocidad de flujo = 0.80 mlmin-1
Para finalizar este apartado de estudios previos, es muy importante remarcar el hecho de que no se pueden utilizar filtros de nylon para filtrar disoluciones conteniendo resveratrol o piceido como trans- o cis-ismeros, previamente a su inyeccin en el sistema cromatogrfico, ya que se ha comprobado que el 100 % de los analitos resulta retenido en dicha membrana. Por ello, a lo largo de todo este captulo se utilizan filtros de membranas hidrofbicas de politetrafluoretileno (PTFE) (Millex-FG) para filtrar las muestras. Optimizacin quimiomtrica de las condiciones cromatogrficas para el anlisis isocrtico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino A la hora de optimizar las condiciones cromatogrficas, se han tenido en cuenta tanto los parmetros relacionados con la separacin cromatogrfica como los que influyen en la fotorreaccin.
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As, como variables qumicas, se seleccionan las proporciones relativas de H3PO4 y de modificador como variables a optimizar. Por otra parte, la reaccin de derivatizacin que tendr lugar en lnea es una fotorreaccin, de manera que la luz ultravioleta proporcionada por la lmpara puede ser considerada como reactivo derivatizante, cuya concentracin podr ser controlada a travs del tiempo de residencia de los analitos en el fotorreactor, esto es, a travs de la longitud del fotorreactor, o bien a travs del caudal de la fase mvil, si se mantiene constante la longitud. Por ello, la sensibilidad del mtodo estar directamente relacionada con el caudal de fase mvil, siendo sta la tercera variable a optimizar. Por otra parte, esta variable tambin incidir sobre el resultado de la separacin cromatogrfica. Se intenta encontrar una fase mvil que, mediante elucin isocrtica, permita la determinacin de estos analitos en muestras de vino, y para la optimizacin de su composicin se har uso de la estadstica multivariante, a travs del diseo experimental y la metodologa de la superficie de respuesta. Se utiliza concretamente un diseo central compuesto, con el objetivo de calcular de forma simultnea el efecto de la variacin de cada una de las variables a optimizar, as como las posibles interacciones entre ellas. Se ensayan cinco niveles para cada variable. Existen tambin tres muestras centrales, dando lugar a un total de 17 experiencias. El diseo presenta rotatividad, lo que implica que la precisin en el clculo de la respuesta es uniforme en todo el rango experimental. Los rangos considerados para cada una de las tres variables a optimizar son:
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% v. acetonitrilo en la fase mvil: 25 15 % % v. H3PO4 en la fase mvil: 0.01 0.05 % Flujo: 0.50 1.50 mLmin-1
La eleccin de estos rangos est justificada por diversos motivos: el porcentaje de acetonitrilo se vara alrededor de un valor central del 20 %, que fue el valor ptimo deducido en estudios anteriores (Captulo IV). Con respecto al porcentaje de H3PO4, se elige como valor inferior 0.01 %, ya que por debajo de ste la capacidad tamponadora de la fase mvil sera mnima, y un valor superior del 0.05 %, el cual origina una fase mvil ya muy cida cuyo pH se calcula en torno a 2.3. Respecto a la velocidad de flujo, no se baja de 0.5 mLmin-1, ya que los tiempos de anlisis seran excesivos. En la Figura 5 se representa la arquitectura del diseo, as como los niveles ensayados para cada variable.
Figura 5.- Diseo central compuesto y niveles ensayados para cada una de las tres variables en la optimizacin de las condiciones cromatogrficas: % acetonitrilo: 25.1, 23.0, 20.0, 17.0, 15.0; % H3PO4: 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01; flujo: 1.50, 1.30, 1.00, 0.70, 0.50 mLmin-1
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Para llevar a cabo las experiencias marcadas por el diseo se preparan dos disoluciones. Con una disolucin patrn se evala la extensin de la fotorreaccin a travs de la altura de los picos obtenidos. Por otra parte, para evaluar la eficacia de la separacin de los analitos de inters, se introduce tambin en cada punto del diseo una muestra de vino dopada con los analitos. As, en matraces de 25.0 mL, la disolucin patrn contiene 0.53 gmL-1 de transresveratrol, 0.58 gmL-1 de trans-piceido y agua ultrapura hasta enrase; la segunda contiene 7.50 mL de un pool de vinos tintos comerciales y las mismas cantidades de los analitos que en la disolucin patrn. Estas dos disoluciones, mientras no se utilizan en la ejecucin de los experimentos, se conservan en la oscuridad a 4 C. Las experiencias marcadas por el diseo se realizan de manera aleatoria, analizndose en cada experiencia tanto la disolucin estndar, como la de vino fortificada. El fotorreactor se mantiene en todo momento encendido, y la monitorizacin del eluato se lleva a cabo fotomtricamente a 306 nm, y fluorimtricamente a exc/em 260/364 nm. Tras cada inyeccin de la muestra de vino, una vez que se ha producido la elucin de los compuestos de inters, se limpia la columna para expulsar todos los componentes del vino que puedan originar picos fantasmas en los sucesivos anlisis. La limpieza de la columna se lleva a cabo en todos los casos por paso secuencial de: acetonitrilo:agua 25:75, 50:50, 100:0, v:v, a 1.2 mLmin-1, hasta conseguir presin constante con cada disolucin, manteniendo acetonitrilo puro hasta obtener una lnea base limpia. La eleccin de la funcin respuesta es crucial ya que de ella depender que las condiciones predichas como ptimas sean una solucin real del problema.
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Se han tenido en cuenta parmetros relacionados con la sensibilidad y la selectividad. As, la funcin de respuesta (FR) seleccionada fue:
APt R ( h ) + APt P ( h ) (AP = rea de Pico) F .R. = R * s ( t Pic ) + 2 norm
El primer trmino de la ecuacin representa la eficacia de la separacin cromatogrfica, mientras que el segundo, est relacionado con la sensibilidad del mtodo. La resolucin del pico del fotoproducto del trans-piceido, con respecto a los interferentes del vino, se toma como representativa de la eficacia. En algunas muestras del diseo este pico aparece resuelto de interferentes pre-eluidos y posteluidos, mientras que en otros puntos, este compuesto coeluye totalmente con los interferentes del vino. R*s(t-Pic) es el valor de resolucin ms desfavorable (respecto a los interferentes pre-eluidos o post-eluidos) para el pico correspondiente a transpiceido, multiplicado por dos cuando el otro valor de resolucin sea superior a 1.5, con el objetivo de dar un mayor peso a la respuesta correspondiente a las condiciones en que este compuesto est resuelto de todos los interferentes, aunque slo sea parcialmente. El pico correspondiente a trans-resveratrol aparece totalmente resuelto en todas las condiciones experimentales ensayadas y, por eso, los valores de resolucin correspondientes a este pico no han sido incluidos en la funcin de respuesta. El segundo trmino evala la sensibilidad a travs de los valores de las reas de pico de los fotoproductos. stas dependen tanto del rendimiento de la fotorreaccin, como del rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos generados. Su valor se calcula como la media normalizada del rea de los picos de los fotoproductos de trans-resveratrol y trans-piceido. Se utiliza la estrategia de normalizar el segundo trmino con el objetivo de dar igual importancia a ambos
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trminos. As, el valor de este trmino normalizado estar siempre en torno a la unidad, al igual que el trmino de las resoluciones. Los tiempos de retencin tampoco han sido incluidos en la funcin de respuesta, ya que en ningn caso fueron superiores a 30 minutos, valor bastante aceptable, en comparacin con otros mtodos propuestos. Los resultados se interpretan con la Metodologa de la Superficie de Respuesta y la optimizacin del modelo se lleva a cabo con el software THE UNSCRAMBLER (Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway). En el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA), se asume un modelo cuadrtico de segundo grado (Model Check Quadratic, valor p (95 %) = 0.0008). El valor de p calculado (95 %) para la falta de ajuste (Lack of Fit), 0.0583, indica que sta no es significativa a un nivel de confianza del 95 %, y que, por tanto, el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de respuesta. Los resultados del ANOVA revelan tambin un valor para R2 de 0.947. Por otra parte, aplicando el ANOVA al anlisis de los valores p, para las variables estudiadas (Tabla 1), se deduce qu variables influyen de forma significativa (p < 0.05) en el modelo.
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Tabla 1.- Anlisis de los valores p para las variables estudiadas
Variable % ACN % H3PO4 Flujo % ACN - % ACN % H3PO4 - % H3PO4 Flujo Flujo % ACN - % H3PO4 % ACN Flujo % H3PO4 - Flujo
Valor p 0.0310 0.0765 0.0067 0.0019 0.0002 0.0001 0.1348 0.1013 0.1725
A la vista de los resultados expuestos, se deduce que el % de acetonitrilo y el flujo, as como los trminos cuadrticos % H3PO4 - % H3PO4, % ACN - % ACN y flujo-flujo, contribuyen significativamente al modelo, para un nivel de confianza del 95 %. Sin embargo, el efecto % H3PO4 y las interacciones % ACN - % H3PO4 y % ACN - flujo, no son significativas para el modelo, al nivel de confianza considerado. En la Figura 6 se muestran las superficies de respuesta estimadas por el modelo para cada par de variables. En estas superficies, el ptimo, situado en la zona de mxima respuesta, corresponde a los siguientes valores, para cada una de las variables estudiadas: 18 % de acetonitrilo y 3.310-2 % de H3PO4 en la fase mvil y un flujo de 0.9 mLmin-1. Por tanto, la fase mvil seleccionada como ptima fue acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v, y una velocidad de flujo de la fase mvil de 0.9 mLmin-1.
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Figura 6.- Superficies de respuesta predichas para cada par de variables
Con el objetivo de comprobar que las condiciones predichas como ptimas por el modelo quimiomtrico, corresponden a una solucin real del problema, es decir, que el anlisis se puede llevar a cabo de manera sensible y libre de
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interferencias, se registran los cromatogramas correspondientes a una muestra patrn y una muestra de vino fortificada, en las condiciones determinadas como ptimas. Los cromatogramas registrados, con el fotorreactor encendido en todo momento, y monitorizando fluorimtricamente el eluato a exc/em 260/364 nm, se recogen en la Figura 7.
35 30 I. F. (exc/em 260/364 nm) 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 tiempo (min) 10 12 14 16 trans-Piceido trans-Resveratrol desconocido
Figura 7.- Cromatogramas correspondientes a una muestra patrn () y a una muestra de vino tinto fortificada con los analitos (). [trans-resveratrol] = 0.53 gmL-1, [transpiceido] = 0.58 gmL-1, fase mvil: ACN:0.04 % H3PO4, 18:82 v:v, flujo 0.9 mLmin-1
Como se observa, bajo las condiciones seleccionadas como ptimas, ambos analitos estn resueltos a lnea base, en un tiempo inferior a 15 minutos, siendo los tiempos de retencin y los factores de capacidad 4.65 y 14.37 minutos, y 2.10 y 8.58, respectivamente, para trans-piceido y trans-resveratrol, respectivamente. Influencia de la Temperatura Se lleva a cabo el estudio de la precisin inter-da, inyectando en das sucesivos, y siempre a la misma hora, una disolucin conteniendo 0.50 gmL-1 de cada analito. Se observa una pobre reproducibilidad en los tiempos de retencin de ambos compuestos, oscilando stos entre 4.65 y 4.99 minutos para trans-piceido y
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14.37 y 16.09 para trans-resveratrol. Como es lgico, esta falta de reproducibilidad en los tiempos de retencin se traduce en una falta de reproducibilidad en la resolucin de ambos picos con respecto a los interferentes del vino, sobre todo en el pico de trans-piceido, dada su cercana a una serie de interferencias menos retenidas que l. Pensamos que esta irreproducibilidad puede ser debida a fluctuaciones en la temperatura ambiente. Para comprobar como afecta la temperatura, se llevan a cabo dos experiencias en condiciones drsticamente diferentes. As, una misma muestra conteniendo 0.50 gmL-1 de cada analito, se eluye en las condiciones seleccionadas como ptimas, en primer lugar con los recipientes conteniendo la fase mvil sumergidos en hielo y, en segundo lugar, con los recipientes sin sumergir, y con un calefactor de infrarrojos dirigido hacia la columna cromatogrfica, lo que elevaba en gran medida la temperatura en el ambiente de la columna. Los tiempos de retencin para el trans-piceido varan entre 4.9 y 5.1 minutos, y para el trans-resveratrol, entre 15.6 y 16.7 minutos, cuando la elucin se lleva a cabo a alta y baja temperatura, respectivamente. Comprobado el efecto de la temperatura sobre la retencin de los analitos, se realiza el estudio de la influencia de la temperatura. La termostatizacin de la columna se consigue mediante una camisa consistente en un tubo de silicona, enrollado helicoidalmente sobre la misma, cuyos extremos estn unidos a la entrada y salida de un bao termosttico, dando lugar a un circuito cerrado por el que circula agua, cuya temperatura se controla a travs del bao termosttico. Se preparan, en sendos matraces de 10.0 mL, dos disoluciones, conteniendo la primera de ellas 1.02 y 1.11 gmL-1 de trans-resveratrol y trans199
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piceido respectivamente, y agua ultrapura hasta enrase, y la segunda, 3.0 mL de una muestra de vino tinto comercial, diluida con agua ultrapura, hasta enrase. Ambas disoluciones se inyectan en el sistema cromatogrfico y se eluyen a diferentes temperaturas comprendidas entre 10 y 30 C, en las condiciones establecidas anteriormente como ptimas. En la Figura 8 se muestran los cromatogramas correspondientes a la muestra patrn y de vino, obtenidos a 15 y 30 C.
8 I. F. (exc/em 260/364 nm) 6 4 2 0 0
10
t (min)
15
20
25
40 B I. F. (exc/em 260/364 nm) 30 20 10 0 0 5 10 t (min)
25
0 3
t (min)
15
20
25
Figura 8.- Influencia de la temperatura sobre los tiempos de retencin de: (A) disolucin patrn conteniendo 1.02 y 1.11 gmL-1 de trans-resveratrol y transpiceido, respectivamente y (B) muestra de vino a 15 C () y 30 C ()
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Como se observa, el aumento de la temperatura supone una disminucin de los factores de capacidad de ambos compuestos. Por otra parte, tambin se observa cmo a 15 C el pico correspondiente a trans-piceido est resuelto a lnea base, con respecto a las interferencias del vino menos retenidas que l, por lo que para experiencias futuras, se selecciona 15 C como temperatura de trabajo. En todas las modalidades de cromatografa lquida, la retencin de los solutos disminuye con el incremento de la temperatura, y por lo general, se obtienen relaciones lineales al representar log k frente a 1/T y se acepta como regla aproximada que un aumento de 30 C en la temperatura, supone una disminucin de dos veces en el factor de capacidad, k4. Con el objetivo de comprobar que esta tendencia general se cumple en la separacin cromatogrfica de estos analitos, se han representado, sobre un eje logartmico, los factores de capacidad para ambos compuestos, medidos sobre los picos cromatogrficos detectados mediante fluorescencia, a las distintas temperaturas ensayadas, as como la presin del sistema, frente a la inversa de la temperatura. Dicha representacin se encuentra en la Figura 9. Se comprueba que existe una relacin lineal, al representar sobre un eje logartmico los factores de capacidad de transresveratrol y trans-piceido, frente a la inversa a la temperatura, observndose como los factores de capacidad disminuyen a media que aumenta la temperatura. Por su parte, la presin del sistema disminuye al aumentar la temperatura, ya que a mayor temperatura menor es la viscosidad de la fase mvil.
Introduction to Modern Liquid Chromatography, Second Edition, L.R. Snyder y J.J. Kirkland, John Wiley & sons, inc
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100 90
80 70 60 50 40 30 20
900 800 700 600 500 400 300 200
1000
109
8 7 6 5 4 3 2
90 80 70 60 50 40 30 20
100
1 3.6 3.5 3.4 103/T (K-1) 3.3 3.2
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Figura 9.- Efecto de la temperatura (T) sobre los factores de capacidad (k) de t-resveratrol (R) y t-piceido (P) y sobre la presin del sistema (p)
Rectas de Calibrado y Parmetros Analticos de Calidad Establecidas las condiciones ptimas para la determinacin cromatogrfica de trans-resveratrol y trans-piceido en vino, antes de abordar el anlisis de muestras reales, se procede a estudiar la relacin entre la concentracin de analito puesta, y la seal analtica medida, y al establecimiento de las rectas de calibrado para ambos compuestos. En matraces de 10.0 mL, se preparan, por triplicado, disoluciones conteniendo entre 0.010 y 0.15 mL de las disoluciones madre etanlicas de 102 y 111 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, y agua ultrapura hasta enrase. Cada una de estas muestras, recin preparada y aislada de la luz, se inyecta en el sistema cromatogrfico y se eluye a 0.9 mLmin-1 con una mezcla acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v, manteniendo la temperatura de la columna
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P (bar)
k'
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constante mediante una camisa de agua recirculante a 15 C. El fotorreactor se mantiene encendido en todo momento, lo que permite el desarrollo de las fotorreacciones de ambos analitos en lnea, y los correspondientes cromatogramas se obtienen monitorizando fluorimtricamente el eluato a exc/em 260/364 nm. Los parmetros analticos de calidad correspondientes a la determinacin cromatogrfica de ambos analitos se recogen en la Tabla 2.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin cromatogrfica de trans-resveratrol y trans-piceido
trans-Resveratrol Rango de concentracin examinado (gmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mLg-1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (-1) (gmL-1) LOD (S/N=3) (gmL-1) LOQ (S/N=10) (gmL-1) Repetitividad inter- e intra-da de los mtodos 0.1 1.5
trans-Piceido 0.1 1.5
-6.7x102 3.4x102 -4.3x102 1.2x102 (105.8 3.5)x102 (436.7 1.1)x102 6.6 x102 0.9944 0.9888 96.64 0.0624 0.0012 0.0041 2.3 x102 0.9967 0.9934 97.42 0.0521 0.0014 0.0047
Con objeto de comprobar la repetitividad del mtodo propuesto, se preparan dos series de once disoluciones cada una, en un volumen final de 10.0 mL, la primera de ellas conteniendo 0.204 y 0.222 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y la segunda 1.02 y 1.11 gmL-1 de cada analito.
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Cada una de estas disoluciones se inyecta en el sistema cromatogrfico y se obtienen sus respectivos cromatogramas en condiciones idnticas a las empleadas en el establecimiento de las rectas de calibrado. En la Tabla 3 se resumen las desviaciones estndar en tiempos de retencin, reas de pico y alturas de pico, parmetros que permiten evaluar la repetitividad intra-da del mtodo cromatogrfico. Por otra parte, para estudiar la repetitividad inter-da, se preparan dos disoluciones en las mismas condiciones ya indicadas y se inyectan en el cromatogrfo durante once das consecutivos. Los resultados obtenidos de encuentran en la Tabla 3. A la vista de los resultados obtenidos, se concluye que la repetitividad intra- e inter-da del mtodo es aceptable, a los dos niveles de concentracin estudiados.
Tabla 3.- Repetitividad en la determinacin de trans-resveratrol y trans-piceido
tR (min) SD I % R.S.D. (tR) N T rea Media SD R A % R.S.D. (rea) - Altura Media SD D % R.S.D. (Altura) tR (min) SD I % R.S.D. (tR) N T rea Media SD E R % R.S.D. (rea) - Altura Media SD D % R.S.D. (Altura) 204
trans-Resveratrol 1.02 0.204 gmL-1 gmL-1 17.990.05 17.880.25 0.25 1.4 (86.77.0) (12.61.2)x102 x102 9.8 8.1 (19.680.16) 28.82.7 x102 10.0 8.2 17.600.21 17.770.20 1.2 1.1 (89.27.0) (11.22.0)x102 x102 18.2 7.9 (1.980.13) 22.54.1 x102 18.3 6.9
trans-Piceido 0.222 1.11 gmL-1 gmL-1 5.340.02 5.310.08 0.37 1.4 (4.720.37) (34.61.1) x102 x102 8.0 3.4 (1.750.20) 21.21.8 x102 8.6 11.9 5.300.02 5.300.05 0.42 0.99 (4.790.86) (34.31.7) x102 x102 17.9 4.9 (1.930.34) 20.73.7 x102 18.1 17.5
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Foto-Isomera cis-trans. Evidencia de la presencia de cis-ismeros de resveratrol y piceido en vinos La exposicin a la luz solar, de manera controlada, de disoluciones conteniendo los trans-ismeros de resveratrol y piceido, tiene como consecuencia la obtencin de los correspondientes cis-ismeros. Este hecho ha sido ampliamente discutido en la literatura cientfica, y probado espectroscpicamente por nosotros, como se ha descrito en los captulos anteriores. En el captulo IV, correspondiente al anlisis cromatogrfico de resveratrol y piceido con derivatizacin off-line pre-columna, no es posible diferenciar entre los picos cromatogrficos correspondientes a los trans- o cis-ismeros de los analitos, porque la irradiacin en la lmpara de mercurio de alta presin supone la destruccin total de los mismos, en favor de sus derivados altamente fluorescentes, de manera que los analitos originales no son eluidos como tal, sino como sus respectivos fotoproductos. Aunque la principal ventaja del mtodo propuesto en el captulo anterior es la sensibilidad, ya que el empleo de una lmpara de mercurio de alta presin supone unos rendimientos muy altos de las fotorreacciones, su principal limitacin es el hecho de que slo es posible determinar cantidades totales de resveratrol y piceido presentes en el vino, no pudiendo determinar la distribucin relativa entre las formas cis- y trans- de cada analito. En el caso de llevar a cabo las fotorreacciones en lnea post-columna, primero tiene lugar la separacin cromatogrfica, y a continuacin las respectivas fotorreacciones sobre porciones discretas del eluato. Es decir, en este caso, dada la diferente polaridad entre los trans- y cis-ismeros, en primer lugar se produce su separacin en la columna cromatogrfica, y a continuacin, cada analito, transportado de manera individual, en un bolo discreto del eluato, sufre la
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fotorreaccin, que supondr la obtencin en cierta medida de sus fotoproductos fluorescentes, lo que har posible su deteccin mediante fluorescencia molecular. De manera que, si bien, al emplear una lmpara ultravioleta en lnea, el rendimiento de las fotorreacciones es menor, no llegando a completarse en ningn caso, lo que supondr una disminucin en la sensibilidad con respecto al mtodo de derivatizacin precolumna, sin embargo tiene la ventaja de que permite la determinacin de las concentraciones relativas de los trans- y cis-ismeros de cada analito, y no cantidades totales. Al no disponer de patrones de los cis-ismeros, stos se obtendrn por exposicin controlada a la luz solar, de disoluciones de sus respectivos transismeros. Para comprobar las posibilidades de este procedimiento, se realiza la siguiente experiencia: en un matraz de 10.0 mL se depositan 0.15 mL de sendas disoluciones madre de trans-piceido y trans-resveratrol, conteniendo 111 y 102 gmL-1, respectivamente, y se completa con agua ultrapura hasta enrase. Cuando esta disolucin se inyecta en el sistema cromatogrfico, recin preparada y se lleva a cabo su elucin, en las condiciones previamente determinadas como ptimas, en el detector fotomtrico se observan nicamente dos picos cromatogrficos, a 4.8 y 16.8 minutos, correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol, respectivamente. A continuacin, dicha disolucin, se expone a la luz, evitando la radiacin solar directa, y se van aislando y guardando en la oscuridad alcuotas de la misma, a distintos tiempos de exposicin, con el objetivo de seguir el transcurso de la fotorreaccin de generacin de los cis-ismeros, durante aproximadamente dos minutos. Dichas alcuotas son inyectadas sucesivamente en el sistema cromatogrfico. Tres de los cromatogramas tridimensionales registrados en el DAD se muestran en forma de superficies y mapas de contorno en la Figura 10, y en ellos puede apreciarse como la exposicin progresiva a la luz genera dos nuevos
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compuestos correspondientes a los ismeros cis de piceido y resveratrol, a 11.2 y 35.6 minutos, respectivamente.
Figura 10.- Cromatogramas tridimensionales (tiempo longitud de onda - absorbancia) y mapas de contorno en funcin del tiempo de exposicin a la luz de una disolucin que contiene transresveratrol y trans-piceido. [trans-resveratrol] = 1.53 gmL-1; [trans-piceido] = 1.66 gmL-1
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Por otra parte, adems de realizar la deteccin fotomtrica con el objetivo de identificar los cis-ismeros, durante toda la experiencia se mantuvo encendido el fotorreactor, y se monitoriz el eluato fluorimtricamente (exc/em 260/364 nm). Como se representa en la Figura 11, se comprueba que las fotorreacciones tambin tienen lugar con xito a partir de los cis-ismeros.
*FLD1 *FLD1 *FLD1 *FLD1 LU 300 A, A, A, A, Ex=260, Ex=260, Ex=260, Ex=260, Em=364 Em=364 Em=364 Em=364 (E:\DIEGO\PST19A22.D) (E:\DIEGO\PST19A24.D) (E:\DIEGO\PST19A26.D) (E:\DIEGO\PST19A27.D)
250
200
150
100
50
0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 min
Figura 11.- Perfiles de fluorescencia correspondientes a la muestra de trans-resveratrol y trans-piceido (azul) y a las distintas alcuotas expuestas a la luz durante tiempos sucesivos (rojo, verde y rosa)
Se comprueba que los picos cromatogrficos correspondientes a los cisismeros estn totalmente resueltos de los correspondientes a los trans-. Adems, los cis-ismeros, son menos polares que los correspondientes trans-, como revela su mayor afinidad por la fase estacionaria, debido probablemente a interacciones intra-moleculares, tipo puente de hidrgeno entre grupos hidroxilo, en las molculas cis. Con el objetivo de comprobar la presencia de los cuatro ismeros en el vino, se comparan los cromatogramas correspondientes a una muestra patrn, conteniendo 1.43 y 1.55 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente y expuesta durante 30 s a la sombra, en el exterior del laboratorio,
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lo que dar lugar a la generacin de ciertas cantidades de los cis-ismeros de resveratrol y piceido y una muestra de vino diluida con agua ultrapura (0.50 mL de un vino tinto comercial se llevan hasta un volumen final de 10.0 mL). Ambas disoluciones son inyectadas en el sistema cromatogrfico y eludas en las condiciones previamente determinadas como ptimas, y los cromatogramas obtenidos se recogen en la Figura 12 donde se aprecia la presencia de los cuatro ismeros en la muestra de vino. La resolucin de los cuatro compuestos de inters con respecto a las interferencias del vino es en todos los casos superior a 1.5, excepto en el caso del pico correspondiente a cis-piceido que solapa ligeramente con una interferencia previa. No obstante, la resolucin en este caso es aceptable, de manera que no se contempla la posibilidad de cambiar las condiciones cromatogrficas.
200 I. F. (exc/em 260/364 nm) 160 120 80 40 0 0 10 20 t (min) 30 40 trans-piceido Desconocido cis-piceido cis-resveratrol trans-resveratrol
Figura 12.- Perfiles-FLDexc/em 260/364 nm correspondientes a una muestra conteniendo 1.43 y 1.55 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, expuesta durante 30 segundos a la luz solar (), y a un vino comercial diluido 20 veces con agua ()
Para poder realizar la cuantificacin en vinos es necesario realizar previamente un calibrado a partir de disoluciones patrn, algo realmente complejo, porque como ya se ha indicado, no se comercializan patrones de los cis-ismeros.
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En nuestro caso, para cuantificar los cis-ismeros se van a emplear disoluciones patrn de dichos compuestos, obtenidas por exposicin a la luz solar de sus respectivos trans-ismeros, en concentraciones conocidas. Para llevar a cabo el calibrado, es necesario relacionar la seal analtica, en este caso, rea de los picos correspondientes a cis-resveratrol y cis-piceido, con sus respectivas concentraciones, calculadas por diferencia entre las reas de los picos de los transismeros, antes y despus de la exposicin a la luz solar. De manera que se prepararn mezclas de trans-resveratrol y trans-piceido, se inyectarn rpidamente en el sistema cromatogrfico y a continuacin dichas disoluciones se expondrn a la luz solar y se volvern a inyectar en el sistema, relacionando el rea de los dos nuevos picos, correspondientes a los cis-ismeros, con la cada de concentracin de trans-resveratrol y trans-piceido. No obstante, antes de proceder al establecimiento de rectas de calibrado, y con el objetivo de no cometer errores en la cuantificacin de los ismeros cis, es necesario asegurar las condiciones de exposicin, en las cuales slo se obtenga el cis-ismero de cada analito, y no sus respectivas formas fluorescentes. Se ha comprobado la existencia de ambos pares de ismeros, en ausencia total de sus formas fluorescentes, cuando disoluciones conteniendo entre 0.20 y 1.50 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido son expuestas a la sombra, en el exterior del laboratorio, durante un periodo de 30 segundos. La forma ms directa de realizar esta comprobacin, es comparando alguno de los cromatogramas obtenidos en estas condiciones, con el cromatograma correspondiente a una disolucin irradiada en la lmpara de mercurio de alta presin, durante un tiempo tal que se haya dado en cierta extensin, la formacin de los fotoproductos fluorescentes. Para ello, en un matraz de 10.0 mL se depositan 0.10 mL de las disoluciones madre de trans-resveratrol y trans-piceido de 102 y 111 gmL-1
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respectivamente, 3.8 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase. Una alcuota de esta disolucin se deposita en una cubeta de cuarzo, de un centmetro de paso de luz, y se expone a la luz de una lmpara de mercurio de alta presin, durante 90 segundos bajo agitacin magntica. Por otra parte, el matraz conteniendo el resto de la disolucin, se expone a la luz del da, a la sombra en el exterior del laboratorio, durante 30 segundos. Ambas disoluciones se inyectan en el sistema cromatogrfico y se eluyen en las condiciones ya optimizadas. Los cromatogramas registrados monitorizando fotomtricamente el eluato a 260 nm, se encuentran en la Figura 13.
Figura 13.- Cromatogramas (260 nm) correspondientes a las muestras expuestas a la luz del da (superior) y a la luz ultravioleta de la lmpara de mercurio de alta presin (inferior)
A la vista de la Figura 13 se comprueba la no existencia de FP1 ni FR en las condiciones de obtencin de los cis-ismeros, ya que no se observan los picos correspondientes. Con respecto a FP2, que coeluye con trans-resveratrol, tambin se comprueba que no se genera nada, al ser puro el pico de trans-resveratrol en el cromatograma de la muestra expuesta a la luz solar.
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Este hecho tambin ha sido corroborado monitorizando la fotorreaccin a 275 nm, longitud de onda correspondiente al punto isobstico de los espectros de absorcin obtenidos en los picos correspondientes de cada par cis-trans, Figura 14. Dado que para un par cualquiera, en el punto isobstico las absortividades molares de ambos ismeros es la misma, la razn rea de pico vs concentracin es tambin la misma. Por lo tanto, el rea total debe mantenerse constante, si la concentracin de cada par cis-trans hace lo mismo.
21 7 6 14 A (mAu) A (mAu) 7 0 240 280 (nm) 320 360 5 4 3 2 1 0 240 280 (nm) 320 360
Figura 14.- Espectros en el pico obtenidos en lnea correspondientes a una disolucin de trans-piceido antes de la exposicin a la luz del da (- - -), y tras un tiempo de exposicin de 30 s (----) y 60 s (). Punto isobstico a 275 nm, redondeado en la figura de la derecha
La comprobacin matemtica de este hecho, basada en la ley de LambertBeer, es la siguiente: Supongamos la siguiente fotorreaccin:
h< trans cis
Podemos establecer un balance de materia, considerando que antes del proceso de irradiacin slo existen los ismeros trans y que una vez que las
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muestras comienzan a exponerse a la luz, coexisten ambos ismeros por lo que las concentraciones antes y despus de la irradiacin seran:
trans Inicialmente Despus de la irradiacin c0rans t c0rans - ccis t cis 0 ccis
Teniendo en cuenta que el rea de los picos viene dada por:
Area =
A dt =
trans b c dt
Puesto que el caudal de la fase mvil es constante dt ser sinnimo de dvol y tendremos, para cada una de las especies, las siguientes relaciones entre rea de pico y concentracin, y entre rea de pico y masa inyectada
Area trans =
trans b ctrans dt = trans b ctrans dvol = trans b mtrans
Area cis =
cis b ccis dt = cis b ccis dvol = cis b mcis
Inicialmente, la cantidad del ismero trans es perfectamente conocida y esto nos permite poder relacionarla con el rea de pico. Cuando, a travs de la irradiacin, comienza a formarse el ismero cis, el rea de pico del trans disminuye pero, asumiendo que a lo largo de todo el proceso la masa total se conserva, tambin lo har la suma de las reas de ambos picos. Si definimos un parmetro, y, como
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y=
Area trans + Area cis x100 0 Area trans
0 donde Area trans es el rea inicial del pico del trans, sustituyendo en esta ecuacin
las relaciones previamente establecidas entre rea y masa, tendremos:

trans b mtrans + cis b mcis y= x 100 0 trans b mtrans
i i y como en el punto isobstico, i, se cumple que trans = cis , entonces:
y=
mtrans + mcis x 100 0 mtrans
Por tanto, si el parmetro y, obtenido a partir de las reas medidas para los picos antes y despus de irradiar, es constante e igual a 100, significar que la suma de las cantidades de cis y trans obtenidas al irradiar es igual a la cantidad inicial de trans, y ello permitir calcular la concentracin de cis. Se ha comprobado que, efectivamente, para los picos obtenidos detectando a la del punto isobstico, a la cual se cumple que las absortividades son iguales, el rea total es igual a la suma de las reas de cada pico, por lo que se comprueba que se conserva la masa y se confirma la existencia nicamente de cisy trans-resveratrol, y cis- y trans-piceido. Comprobado este hecho, es correcto proceder al calibrado de los compuestos cis relacionando el rea de sus correspondientes picos con la concentracin deducida a partir de la disminucin de concentracin de sus respectivos ismeros trans.
214
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Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad para la cuantificacin de los ismeros cis Con el objetivo de comprobar la linealidad del mtodo, se prepara en un matraz de 10.0 mL y en ausencia de luz, una disolucin conteniendo 1.53 y 1.66 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente. Esta disolucin, recin preparada, se inyecta en el cromatgrafo y se eluye en las condiciones previamente fijadas, con el objetivo de relacionar el rea de cada pico con las concentraciones de trans-resveratrol y trans-piceido. A continuacin, la disolucin se expone a la luz del da en el exterior del laboratorio, mantenindola a la sombra. Se van aislando de la luz, alcuotas de la misma, durante un periodo de un minuto, y se van guardando en la oscuridad, lo que supone la paralizacin de la fotorreaccin, en distintos momentos de su desarrollo. Las alcuotas obtenidas, se conservan en ausencia total de luz, y se van inyectando sucesivamente en el sistema cromatogrfico. Excepto en la primera disolucin, totalmente aislada de la luz, donde slo existirn trans-ismeros, en todas las dems se observan los 4 ismeros y la relacin entre seal (rea de pico) y la concentracin de cada uno de los ismeros se establece de la siguiente manera: 1.- Se van inyectando las alcuotas expuestas a la luz, medimos el rea de los picos correspondientes a los compuestos trans y, a travs de sus correspondientes rectas de calibrado (Tabla 2), se calcula la concentracin que va quedando de cada ismero trans en cada momento.
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2.- Por diferencia entre la concentracin inicial de cada trans-ismero y la concentracin de esta misma especie calculada en las diferentes alcuotas expuestas a la luz, se calcula la concentracin del cis-ismero correspondiente. Se representan los valores de rea de pico, para los ismeros cis, frente a los valores de concentracin as deducidos. Los resultados obtenidos, se presentan en la Figura 15, observndose que no son excesivamente buenos, porque, sobre todo en el caso del cis-resveratrol, no se ajustan a una lnea recta.
6000 5000 rea de Pico 4000 3000 2000 1000 0 0 0.4 0.8 1.2 [cis-ismero] (gmL-1) 1.6
Figura 15.- rea de pico vs concentracin de cada cis-ismeros, para muestras obtenidas por exposicin continuada a la luz de una misma muestra y extraccin sucesiva de alcuotas
Con objeto de mejorar la linealidad, se realizan diversas experiencias ensayndose diferentes metodologas y finalmente proponemos el siguiente mtodo operatorio: En matraces de 10.0 mL, se preparan disoluciones conteniendo entre 0.20 y 1.70 gmL-1 de ambos analitos, etanol absoluto hasta completar el 1.5 % y agua
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ultrapura hasta enrase. Cada uno de estos patrones, se inyecta dos veces en el sistema cromatogrfico, la primera vez, recin preparado y aislado de la luz, y la segunda vez tras haber sido expuesto durante 30 segundos a la luz del da, a la sombra en el exterior del laboratorio. En todos los casos, se inyectan las muestras en el sistema cromatogrfico, se eluyen a 0.9 mLmin-1 con una mezcla acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v, manteniendo la temperatura de la columna constante a 15 C. El fotorreactor se mantiene encendido en todo momento, lo que permite el desarrollo de las fotorreacciones de los analitos en lnea, y los correspondientes cromatogramas se obtienen monitorizando fluorimtricamente el eluato a exc/em 260/364 nm. Las concentraciones de cada uno de los ismeros en las muestras que han estado expuestas a la luz se calculan como se ha explicado anteriormente. En la Figura 16 se representan las rectas de calibrado obtenidas para los cuatro ismeros, y en la Tabla 4 se recogen los parmetros analticos de calidad correspondientes a la determinacin cromatogrfica de los dos cis-ismeros. Los valores de los coeficientes de correlacin son bastante aceptables en ambos casos.
3000 2500 rea de Pico (FLD) 2000 1500 1000 500 0 0.2 0.4 0.6 0.8 [cis-Resveratrol] (gmL -1) 1 rea de Pico (FLD)
2000 1600 1200 800 400 0 0 0.2 0.4 0.6 [cis-Piceido] (gmL -1 ) 0.8
Figura 16.- rea de pico frente a la concentracin de analito cis
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Tabla 4.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin cromatogrfica de cis-resveratrol y cis-piceido
cis-Resveratrol Rango de concentracin examinado (gmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mLg-1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin Analtica (gmL-1) LOD (S/N=3) (gmL-1) (-1) 0.10 1.00 (3.21.0)x102
cis-Piceido 0.10 1.00 (1.71.1)x102
(28.21.9)x102 (19.0 2.4)x102 103.7 0.9957 0.9914 93.44 0.0368 0.014 0.046 125.8 0.9843 0.9688 87.31 0.0661 0.0071 0.023
LOQ (S/N=10) (gmL-1)
Se comprueba que las disoluciones de cis-resveratrol y cis-piceido, en el rango de concentraciones detallado en la Tabla 2, y obtenidas por exposicin de disoluciones de sus trans-ismeros durante 30 segundos a la luz del da, son estables al menos durante 24 horas. Repetitividad del mtodo cromatogrfico para la determinacin de cisresveratrol y cis-piceido Para estudiar la repetitividad del mtodo se prepara una disolucin conteniendo 0.10 mL de cada una de las disoluciones madre etanlicas de transresveratrol y trans-piceido, de 102 y 111 gmL-1, respectivamente, 0.05 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta completar 10.0 mL. Esta disolucin se
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expone durante 30 segundos a la luz en el exterior del laboratorio, y transcurrido ese tiempo se asla totalmente de la luz. Se realizan once inyecciones de la misma, para estudiar as la repetitividad relativa al sistema.
Tabla 5.- Repetitividad relativa al sistema en la determinacin cromatogrfica de los cuatro analitos
trans-resveratrol cis-resveratrol
trans-piceido
cis-piceido
tR (min) SD 17.9 0.2 37.3 0.3 5.30 0.04 18.0 0.2 % R.S.D. 1.4 0.82 0.81 1.6 rea Media SD (38.21.8)x102 (28.21.2)x102 (10.750.27)x102 (12.460.39)x102 % R.S.D. (rea) 4.6 4.1 2.5 3.2 Altura Media SD 74.0 1.5 27.5 0.8 43.8 1.1 25.6 0.6 % R.S.D. (Altura) 2.1 3.0 2.6 2.4
Aplicacin: Anlisis de los ismeros de resveratrol y piceido en vino En primer lugar y para comprobar si existe o no efecto de matriz, se va a llevar a cabo una adicin patrn sobre un pool de vinos tintos comerciales. Para poder realizar esta experiencia es necesario disponer de una muestra que contenga los cuatro analitos en concentracin conocida. Esta disolucin se prepara en un matraz que, en un volumen final de 50.0 mL, contiene 1.47 y 1.60 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente, 0.06 mL de etanol absoluto, y agua ultrapura hasta enrase. Esta disolucin se expone a la luz, evitando la radiacin solar directa, durante 30 segundos, lo que da lugar a la transformacin parcial de los trans-ismeros en cis-ismeros. La concentracin de cada ismero se determina registrando el cromatograma de una alcuota de esta disolucin y una vez medidas las reas, sustituyendo estas en las ecuaciones de calibrado previamente establecidas. Esta disolucin se conserva en la oscuridad,
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condiciones en las que previamente se determin que los cuatro analitos son estables al menos durante 24 horas. Para llevar a cabo la adicin patrn, se dispone un conjunto de cuatro matraces de 10.0 mL y se deposita en todos ellos 0.50 mL del pool de vinos tintos, volmenes crecientes de la disolucin que contiene los cuatro analitos de inters (0.00, 3.00, 6.00 y 9.00 mL) y agua ultrapura hasta enrase. Paralelamente, en otra serie de tres matraces de 10.0 mL, se preparan patrones por dilucin de 3.00, 6.00 y 9.00 mL de la disolucin que contiene los cuatro analitos de inters. Se registran los cromatogramas y se representan las reas de pico frente a la concentracin de analito, Figura 17. Como se aprecia, en todos los casos, excepto en el del trans-resveratrol, existe un marcado efecto de matriz, hecho que se ha comprobado por aplicacin de los correspondientes tests estadsticos de Fischer y de la t-student.
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4000 3000 2000 1000 0 0
trans-Piceido rea de Pico (FLD)
3000
cis-Piceido
rea de Pico (FLD)
2000
1000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 [trans-Piceido] (gmL-1) 0.5 0 0.2 0.4 0.6 [cis-Piceido] (gmL -1 ) 0.8
6000
trans-Resveratrol rea de Pico (FLD)
5000 4000
cis-Resveratrol
rea de Pico (FLD)
4000
3000 2000 1000
2000
0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 [trans-Resveratrol] (gmL-1) 0.5
0 0 0.2 0.4 [cis-Resveratrol] (gmL -1 ) 0.6
Figura 17.- Rectas de calibrado correspondientes a los patrones (------) y a la adicin patrn sobre una muestra de vino tinto (-------)
Se sospecha que el origen de este efecto matriz est en la fotorreaccin que tiene lugar en lnea. Para comprobarlo, se miden las seales correspondientes a los analitos de inters sobre los cromatogramas registrados fotomtricamente, ya que el fotorreactor est situado tras el detector fotomtrico, y en el caso de que la raz del efecto matriz fuese la fotorreaccin, ste efecto no se apreciara sobre las seales fotomtricas. En la Figura 18 se muestran los cromatogramas obtenidos a 306 y 290 nm de una muestra de vino contaminada con 3.0 mL de la disolucin conteniendo los cuatro analitos. Al emplear este tipo de deteccin, no se consigue una resolucin total de los picos correspondientes a los ismeros del piceido con
221
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respecto a los interferentes del vino, de manera que se medirn alturas, en vez de reas de pico, sobre los cromatogramas obtenidos midiendo absorbancia a 306 nm para los trans-ismeros y a 290 nm para los cis-ismeros.
mAU 5 4 3 2 1 0 0 mAU 5 4 3 2 1 0 0 5 5
trans-Piceido
306 nm
trans-Resveratrol
10
15
20
25
30
35
min
290 nm
cis-Piceido
cis-Resveratrol
10
15
20
25
30
35
min
Figura 18.- Cromatogramas obtenidos fotomtricamente a 306 y 290 nm, correspondientes a una muestra de vino tinto fortificada con los cuatro analitos de inters
En estas condiciones, se construyen los correspondientes grficos de calibracin y adicin patrn, representando las alturas de pico frente a la concentracin de analito puesta o aadida, respectivamente, Figura 19.
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8 Altura de Pico (DAD306nm) 6 4 2 0 0
trans-Piceido Altura de Pico (DAD290nm)
1.2
cis-Piceido
0.8
0.4
0 0.1 0.2 0.3 0.4 [trans-Piceido] (gmL -1 ) 0.5 0 0.2 0.4 0.6 [cis-Piceido] (gmL -1 ) 0.8
6 Altura de Pico (DAD306nm)
trans-Resveratrol Altura de Pico (DAD290nm)
1.2
cis-Resveratrol
0.8
0.4
0 0 0.2 0.4 [trans-Resveratrol] (gmL-1) 0.6
0 0 0.2 0.4 [cis-Resveratrol] (gmL -1 ) 0.6
Figura 19.- Alturas de pico frente a la concentracin de analito aadida sobre la muestra de vino (-------) y frente a la concentracin de analito en el patrn (-------)
Como se observa, y posteriormente se comprueba por aplicacin de los correspondientes tests estadsticos de Fischer y de la t-student, en este caso, no existen diferencias significativas, para un nivel de confianza del 95 %, entre las pendientes de las rectas de patrones externos y de adicin patrn obtenidas para cada compuesto, lo que confirma el hecho de que el efecto matriz se produce en la fotorreaccin. Dicho efecto matriz podra deberse a algn tipo de catlisis de la fotorreaccin en presencia de vino. Para comprobarlo, se lleva a cabo el estudio de la influencia del tiempo de irradiacin en lnea, para trans-piceido, ya que es el
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primer compuesto en eluir. El tiempo de exposicin del analito a la luz ultravioleta se controla a travs del caudal de fase mvil. Se prepara una disolucin conteniendo 0.55 gmL-1 de trans-piceido, y otra conteniendo 0.50 mL de vino tinto y la misma cantidad de analito, completando en ambos casos con agua ultrapura hasta 10.0 mL. Ambas disoluciones se eluyen con velocidades de flujo comprendidas entre 0.2 y 1.8 mLmin-1, manteniendo en todo caso el fotorreactor encendido, y monitorizando fluorimtricamente el eluato. La representacin del rea de pico de cis-piceido correspondientes a la muestra patrn y a la muestra de vino fortificada frente a la velocidad de flujo (Figura 20), pone de manifiesto la aceleracin del proceso fotoqumico en presencia de vino, como puede observarse en el primer tramo de crecida de las curvas. Por otra parte, los valores de rea de pico que se alcanzan en presencia de vino son mucho mayores que el rea correspondiente, segn la recta de patrones externos, a la suma de trans-piceido aadido y lo que el vino contiene.
8000 6000 4000 2000 0 0 0.4 0.8 1.2 1.6 Flujo (mLmin -1) 2
Figura 20.- Influencia del tiempo de irradiacin en lnea sobre trans-piceido, en presencia (-----) y en ausencia de vino (----)
Una vez comprobado que en vinos tintos existe efecto de matriz, y que por tanto el anlisis de los cuatro analitos tiene que llevarse a cabo mediante adicin patrn, se comienza el estudio de los vinos blancos.
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rea de Pico (FLD)
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En este caso, se lleva a cabo una adicin patrn operando exactamente igual que en caso anterior con la excepcin de que el volumen de vino blanco es en este caso de 5.0 mL. Las correspondientes rectas de calibrado tanto de patrones externos como de la adicin patrn al vino blanco se representan en la Figura 21. Por aplicacin de los test estadsticos de Fischer y de la t-student, se deduce que en el caso de los vinos blancos no existe efecto de matriz para ninguno de los cuatro analitos, pudindose por tanto llevar a cabo el anlisis mediante calibracin externa.
1000 800 600 400 200 0 0 0.1 0.2 0.3 [trans-Piceido] (gmL-1) 0.4 rea de Pico (FLD) rea de Pico (FLD)
2500 2000 1500 1000 500 0 0 0.1 0.2 0.3 [cis-Piceido] (gmL -1 ) 0.4
2000 1600 1200 800 400 0 0 0.1 0.2 0.3 [trans-Resveratrol] (gmL-1) 0.4 rea de Pico (FLD) rea de Pico (FLD)
2000 1600 1200 800 400 0 0 0.1 0.2 0.3 [cis-Resveratrol] (gmL -1 ) 0.4
Figura 21.- rea de pico frente a la concentracin de analito aadida sobre la muestra de vino blanco (-------) y frente a la concentracin de analito en el patrn (-------)
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En ltimo lugar nos planteamos tambin el anlisis de un vino blanco de podredumbre noble, en concreto el vino hngaro Tokaji. Los vinos de podredumbre noble se elaboran a partir de uvas afectadas por Botrytis, de manera que estos vinos, an siendo vinos blancos, deben tener concentraciones de resveratrol, en todas sus formas, superiores a las encontradas en vinos blancos normales. El anlisis de este vino se realiza tambin mediante adicin patrn, encontrndose que en este caso tampoco hay efecto de matriz para ninguno de los cuatro analitos de inters. En la Tabla 6, se resumen los resultados del anlisis para todos los vinos analizados. Todos ellos fueron analizados mediante adicin patrn por triplicado.
Tabla 6.- Concentraciones encontradas de los ismeros de resveratrol y piceido en diferentes vinos. Mtodo de adicin patrn (por triplicado)
[t-Piceido] (gmL-1) Vinos Tintos: Pool 1 Vinos Tintos: Pool 2 Pool de Vinos Blancos Vino Blanco de Podredumbre Noble (Tokaji) 6.5 0.5 1.2 0.1 0.099 0.013 0.29 0.05
[c-Piceido] (gmL-1) 2.9 0.3 1.5 0.1 0.42 0.02 0.70 0.02
[t-Resveratrol] (gmL-1) 1.4 0.1 0.070 0.050 0.054 0.009 0.070 0.010
[c-Resveratrol] (gmL-1) 0.21 0.12 0.060 0.020 0.068 0.010 0.064 0.050
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CAPTULO VI UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES DE TRES VAS (MATRICES DE EXCITACINEMISIN) PARA CARACTERIZACIN DE VINOS
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CAPTULO VI. EEMs para caracterizacin de vinos
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ANTECEDENTES Fluorescencia front-face La espectroscopia de fluorescencia molecular es una tcnica de anlisis qumico que cada vez est adquiriendo mayor importancia como tcnica analtica cuantitativa, principalmente debido a su gran sensibilidad, facilidad de utilizacin, versatilidad instrumental (se pueden ajustar muchos parmetros instrumentales), rapidez del anlisis, pequeas cantidades de muestra y por ser, adems, una tcnica no invasiva ni destructiva. Sin embargo, aunque esta tcnica presenta un gran potencial, hasta ahora ha sido poco utilizada para la caracterizacin de alimentos a pesar de que muchos presentan fluorescencia nativa. Esto ha sido debido a que la fluorescencia clsica no puede aplicarse a muestras turbias, opacas o disoluciones muy concentradas. Cuando la muestra en estudio presenta elevada absorcin, la intensidad de la radiacin emitida no es proporcional a la concentracin de los fluorforos presentes, debido principalmente al efecto de filtro interno. Los espectros de excitacin y emisin disminuyen y adems los espectros de excitacin estn distorsionados. Para evitar este problema, lo ms usual es diluir la muestra de tal forma que la absorbancia sea inferior a 0.1. Sin embargo, los resultados obtenidos para estas disoluciones diluidas no tienen por que ser extrapolables a la matriz original de la muestra, ya que con la dilucin se pierde la organizacin de la matriz original. Este problema puede ser evitado utilizando la tcnica de front-face, desarrollada por C.A. Parker en 19681, cuya principal diferencia con respecto a la modalidad tradicional es la modificacin del ngulo de incidencia de la radiacin sobre la muestra, pasando de un ngulo de 90 en la tcnica tradicional a un ngulo prximo a 30 en la tcnica de front-face,
1
Parker C.A., Apparatus and experimental methods in Photoluminescence of solutions with applications to photochemistry and analytical chemistry. C. A. Parker, ed. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands 1968, Pginas 128302
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midindose la radiacin emitida en la misma cara que la radiacin incidente y sin que las radiaciones incidente y emitida atraviesen la disolucin en medida apreciable. Esta modalidad reduce los efectos de dispersin debidos a la elevada concentracin de las muestras no diluidas o a la presencia de turbidez. En un principio, su aplicacin ms relevante fueron los estudios de fluorescencia en matrices slidas pero en las dos ltimas dcadas su aplicacin en el anlisis y caracterizacin de alimentos se ha incrementado considerablemente. Si adems, las seales fluorescentes obtenidas en modo front-face, se combinan con tcnicas de anlisis multivariante, se consigue potenciar su uso como herramienta para la caracterizacin de alimentos. Los mtodos de anlisis multivariante ms utilizados son PCA (Anlisis de Componentes Principales) y PLS (Mnimos Cuadrados Parciales), para tratar datos de primer orden, y en caso de datos de rdenes superiores el ms utilizado es PARAFAC (PARAllel FACtor analysis). Todava son relativamente escasas las publicaciones que hacen uso de esta combinacin de front-face con seales multivariantes para la caracterizacin y clasificacin de alimentos. En 2006, Christensen et al2 publican un artculo de revisin acerca de las posibilidades que ofrece la autofluorescencia de diversos alimentos, en combinacin con mtodos de anlisis multivariante, como herramienta, tanto para el anlisis, como para la clasificacin de los mismos. Casi todos los procedimientos hacen uso de datos de primer orden, espectros de fluorescencia de excitacin, emisin o en algunos casos espectros sincrnicos, en combinacin casi siempre con PCA. As, dichos procedimientos se aplican al estudio de protenas en harinas con gluten3 o bien para seguir la evolucin de la
2 3
Christensen J., Nrgaard L., Bro R., Engelsen S.B., Chem. Reviews, 2006, 106:1980-1994 Genot C., Tonetti F., Montenay-Garestier T., Drapron R., Sci. Aliments, 1992,12:687704
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reaccin de Maillard en alimentos infantiles, realizando medidas de fluorescencia, que permiten tomar la huella digital en base a los cambios que se producen durante la manufacturacin y analizando estos datos mediante mtodos quimiomtricos4. Los productos lcteos son matrices en que la fluorescencia front-face se usa ampliamente para la caracterizacin y clasificacin. As, permite el seguimiento del cambio estructural que se produce en las protenas de la leche durante el proceso de calentamiento5, o bien la cuantificacin simultnea de furosina y lactosa en leche, lo que proporciona un mtodo para evaluar la calidad de la leche6. En combinacin con PCA, permite la discriminacin entre diferentes tipos de leche segn la temperatura y el tiempo utilizado en el tratamiento trmico7. La determinacin de riboflavina en yogures se usa para evaluar la conservacin de los mismos y la aplicacin de PCA a los espectros de emisin revela cambios en la seal de fluorescencia con el tiempo de conservacin8. Wold et al8 proponen el uso de fluorescencia front-face y PCA como herramienta para seguir la foto-oxidacin de productos lcteos frescos. Tambin se propone la caracterizacin de helados basada en la relacin existente entre grasas, protenas y emulsionantes9. La clasificacin de cervezas procedentes de diferentes pases, se lleva a cabo registrando los espectros de emisin y sincrnicos de muestras de cervezas sin diluir y utilizando PLS para realizar el tratamiento quimiomtrico de los datos10
Birlouez-Aragon I., Locquet N., de St Louvent E., Jouan-Rimbaud Bouveresse D., Stahl P., Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, 1043:308318 5 Dufour E., Riaublanc A., Lait, 1997, 77:657-670 6 Kulmyrzaev, A.A., Dufour E., Lait, 2002, 82:725-735 7 Kulmyrzaev A.A., Levieux D., Dufour E., J. Agric. Food Chem., 2005, 53:502-507 8 Miquel Becker E., Christensen J., Frederiksen C.S., Haugaard V.K., J. Dairy Sci., 2003, 86:25082515 8 Wold J.P., Jrgensen K., Lundby F., J. Dairy Sci., 2002 85:1693-704 9 Granger C, Da Costa JP, Toutain J, Barey P, y Cansell M, Int. Dairy J., 2006, 16:489-496 10 Sikorska E., Grecki T., Khmelinskii I.V., Sikorski M.Y., Keukeleire D., J. Institute of Brewing, 2004, 110:267-275
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y, en esta misma matriz, la aplicacin de PLS a los espectros sincrnicos permite determinar el contenido en vitamina B211. Karoui et al han publicado varios trabajos en los que informan del uso de la fluorescencia front-face para diferenciar entre productos de cereales diferentes12 o entre filetes de pescado fresco y congelado13, asegurar la frescura de huevos almacenados14, seguir el proceso de oxidacin en quesos semicurados15 y clasificar mieles de diferente origen botnico16. La cantidad de informacin que puede obtenerse es an mayor si las seales fluorescentes no se limitan a los espectros de excitacin, emisin o sincrnicos, sino que se manejan las seales fluorescentes totales, es decir las matrices de excitacin-emisin (EEMs) o espectros tridimensionales que, si se combinan con tcnicas quimiomtricas, adems de permitir aumentar la selectividad, posibilitan que se pueda obtener informacin extra sobre parmetros que, de forma genrica, nos permiten agrupar y discriminar objetos, descritos mediante un vector de atributos, ya sea construyendo las clases o asignando los objetos a clases previamente definidas. Esta combinacin permite obtener, en tiempos de anlisis muy pequeos, informacin que puede ser usada como huella digital de diversos alimentos. Por tanto, aplicando la tcnica de front-face se pueden obtener datos de segundo orden que se pueden tratar con herramientas quimiomtricas con fines clasificatorios, de tipificacin, seguimiento de procesos, etc. En su aplicacin al
Sikorska E., Eur. Food Res. Technol., 2007, 225:43-48 Karoui R., Cartaud G., Dufour E., J. Agric. Food Chem., 2006, 54:2027-2034 13 Karoui R., Thomas E., Dufour E., Food Res. Int., 2006, 39:349-355 14 Karoui R., Schoonheydt E., Decuypere B., Nicolau J., De Baerdemaeker, J., Anal. Chim. Acta, 2007, 582: 83-91 15 Karoui R., Dufour E., De Baerdemaeker J., Food Chem., 2007, 101:1305-1314 16 Karoui R., Dufour E., Bosset J.O., De Baerdemaeker, J., Food Chem., 2007, 101:314-323
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anlisis de alimentos son muy pocos los procedimientos desarrollados. Bro et al, a travs de las EEMs y PARAFAC, evalan los fluorforos responsables de la autofluorescencia de diversas muestras de azcar17. El anlisis mediante PARAFAC, de las matrices de excitacin-emisin de diferentes yogures, obtenidas mediante front-face, pone de manifiesto la presencia de tres fluorforos, riboflavina, triptfano y lumicromo cuya cantidad est relacionada con las condiciones de almacenamiento18. Guimet et al aplican PARAFAC a las EEMs para evaluar los principales fluorforos y realizar una clasificacin de diferentes tipos de aceites de oliva19. Tambin se ha sugerido su aplicacin como un mtodo potencial para comprobar la contaminacin por dioxina en aceite de pescado, basado en una correlacin indirecta20. Caso concreto del vino El inters por el estudio acerca de la composicin qumica del vino se debe a su importancia en la evaluacin de la calidad de este producto. En los ltimos aos los productores han mejorado la calidad de los vinos, y por otra parte, los consumidores son cada vez ms exigentes. Por ello, es importante desarrollar mtodos de anlisis rpidos, sin tratamiento previo de las muestras. Las herramientas para manejar y abordar el anlisis qumico del vino se estn convirtiendo en una necesidad en la industria del vino, con el fin de automatizar la produccin y estabilizar la calidad por lo que todas aquellos procedimientos que permitan la clasificacin de los vinos en funcin de la regin de origen, del tipo de uva utilizada en la elaboracin o del proceso de elaboracin de los vinos, pueden ser tiles para esta industria.
Bro R., Chemom. and Intell. Lab. Syst., 1999, 46:133-147 Christensen J., Miquel Becker E., Frederiksen C.S., Chemom. Intell. Lab. Syst., 2005, 75:210-208 19 Guimet F., Ferre J., Boque R., Rius F.X., Anal. Chim. Acta, 2004, 515:75-85 20 Pedersen D.K., Munck L., Engelsen S.B., J. Chemom., 2002, 16: 451-460
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Los nicos antecedentes sobre la utilizacin de seales fluorescentes para clasificar vinos segn la variedad y cosecha, son los descritos por Dufour et al21, que estudian el potencial de las seales de primer orden obtenidas mediante fluorescencia front-face, combinadas con mtodos quimiomtricos e investigan un total de 120 vinos producidos en Francia y Alemania. Registran los espectros de emisin (275450 nm) y excitacin (250350 nm) de cada muestra y los relacionan con el contenido en compuestos fenlicos. Los espectros de emisin se caracterizan por presentar un mximo a 376 nm y un hombro a 315 nm y los de excitacin muestran dos picos localizados en torno a 260 y 320 nm y su fisonoma vara para las diferentes muestras de vino, principalmente en cuanto a la relacin de intensidades de mximo/hombro. Las muestras se evalan usando anlisis de componentes principales (PCA) y se clasifican mediante anlisis factorial discriminatorio (FDA). En este primer estudio se muestran las posibilidades de la fluorescencia front-face, en combinacin con herramientas quimiomtricas, para asegurar la trazabilidad de vinos. Sobre la utilizacin de datos de segundo orden con fines clasificatorios en muestras de vino, no se han encontrado antecedentes en la bibliografa consultada. No obstante, el potencial de la tcnica debe aumentar con la dimensionalidad de los datos, de manera que los datos tridimensionales seran una herramienta ms poderosa que los bidimensionales, especialmente desde el punto de vista de la clasificacin de muestras. Ello nos ha llevado a explorar las posibilidades de las matrices de excitacin-emisin obtenidas mediante la tcnica de front-face para la clasificacin de muestras de vino y constituir una posible huella digital. As, en este captulo se aborda, por primera vez, el estudio de la matriz de excitacin-emisin del vino.
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Dufour E., Letort A., Laguet A., Lebecque A., Serra J.N., Anal. Chim. Acta, 2006, 563:292-299
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El objetivo principal de este captulo es detectar los principales compuestos fluorescentes presentes en el vino, con el objetivo de mejorar en la interpretacin de los espectros de fluorescencia de una matriz tan compleja. Para ello, se aplica PARAFAC sobre un cubo de datos construido a partir de las matrices de excitacinemisin de fluorescencia del conjunto de muestras consideradas en este estudio. La estrategia de muestreo que se sigue consiste en incluir en el modelo muestras de diferentes orgenes, lo suficientemente diferentes entre ellas, con el objetivo de representar un abanico real de compuestos fluorescentes que pueden estar presentes en cualquier muestra. Para la identificacin de los principales fluorforos en el vino, se buscarn las correlaciones existentes entre los scores de cada muestra en cada uno de los componentes obtenidos en la descomposicin mediante PARAFAC y las alturas de los picos correspondientes a componentes individuales separados en la columna cromatogrfica, establecindose as las bases para el desarrollo de futuros mtodos rpidos para la determinacin cuantitativa de tales fluorforos. Por otra parte, teniendo en cuenta que en el modelo se incluyen vinos de distinta procedencia, se estudiar la capacidad de las seales de autofluorescencia con fines clasificatorios segn dicha procedencia. Esta propuesta es muy importante en pases importadores de vino. RESULTADOS Y DISCUSIN Muestras de vino incluidas en el modelo Para la construccin del modelo se parti de un conjunto de 57 muestras de vino, de diferentes orgenes y elaborados con distintos tipos de uva, con el objetivo de que en el modelo estn representados toda la variedad de compuestos
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fluorescentes que pueden estar en una muestra real, y en niveles tambin lo ms cercanos posible a la realidad. Concretamente, la procedencia de las muestras es: dos de Francia, 16 de Chile, 3 de Sudfrica, 6 de Australia (2 de ellas de Occidente), 3 de Espaa, 6 de Argentina, 3 de U.S.A., 15 de Italia, 1 de Tnez y 2 de Portugal. En la Tabla 1 se detalla el origen de cada muestra, as como el tipo de uva del que se obtienen, cuando este dato est disponible. Las muestras se mantienen a una temperatura aproximada de 4 C, y la matriz de fluorescencia de cada muestra se registra inmediatamente despus de abrir cada botella.
Tabla 1.- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio Muestra N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Origen Francia Francia Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Sudfrica Sudfrica Sudfrica Australia Occidental Australia Occidental Australia Australia Australia Australia Espaa Espaa Espaa Argentina Argentina Argentina Argentina Tipo de Uva Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Merlot Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Syrah Syrah Syrah - Cabernet Syrah - Cabernet
Malbec Syrah Malbec Syrah Malbec Syrah Syrah
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Tabla 1.- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio (continuacin) Muestra N 31 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Origen Argentina Argentina Argentina Argentina U.S.A. U.S.A. U.S.A. Italia Italia Italia (Sicilia) Italia Italia Italia Italia Italia Tnez Italia Italia Italia Italia Italia Italia Chile Chile Chile Chile Portugal Portugal Italia Tipo de Uva Syrah Syrah Syrah Syrah Syrah Ruby Cabernet Ruby Cabernet
Sangiovese Sangiovese
Merlot Merlot Sangiovese
Matrices de excitacin-emisin de fluorescencia Las matrices de excitacin-emisin de fluorescencia (EEMs)
correspondientes a las 57 muestras se registran en modo front-face, con el objetivo de minimizar los efectos de filtro interno, reflexin, dispersin y despolarizacin de la luz. El ngulo de incidencia, definido como el formado entre el haz de excitacin y la perpendicular a la superficie de la celda, se mantiene en 30 y el de observacin en 60 (Figura 1). Una alcuota de cada muestra de vino se transfiere directamente de la botella a una celda de cuarzo de 3 mL y 1 cm de paso de luz. La
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temperatura del laboratorio se mantiene en torno a 15 C. Las rendijas de excitacin y emisin de los monocromadores se fijan en 15 y 5 nm, respectivamente. La velocidad de adquisicin se fija en 500 nm/min, como solucin de compromiso para disminuir el ruido en los espectros registrados y el tiempo de adquisicin de la matriz. Los rangos de longitudes de onda de excitacin y emisin son 245-340 nm y 300-500 nm, con incrementos de 5 y 0.5 nm, respectivamente. Cada EEM se registra como mltiples espectros de emisin, a distintas longitudes de onda de excitacin, de manera decreciente, es decir de la radiacin excitante menos energtica a la ms energtica, con el objetivo de evitar en lo posible la alteracin de la muestra por el haz UV de excitacin. El tiempo empleado en el registro de cada EEM es aproximadamente 10 minutos. Todas las matrices se registran en el periodo de tiempo lo ms corto posible, en concreto se emplearon 6 das, con el objetivo de minimizar las variaciones instrumentales, tales como las fluctuaciones en la intensidad de la lmpara.
Figura 1.- Accesorio para realizar medidas de fluorescencia front-face
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En la Figura 2 se recogen las EEMs de cuatro de los vinos analizados, en forma de mapas de contorno, as como los espectros de excitacin y emisin extrados de las mismas, como cortes horizontales y verticales, respectivamente, a las longitudes de onda de emisin y excitacin, indicadas en el pie de dicha Figura. Como puede observarse en los mapas de contorno de la Figura 2, todas las muestras emiten radiacin fluorescente de longitudes de onda comprendidas entre 300 y 400 nm, cuando son excitadas a longitudes de onda por debajo de 290 nm. Los espectros de excitacin y emisin previamente publicados por Dufour et al21., empleados para discriminar entre vinos franceses y alemanes, caen dentro de esta zona de fluorescencia comn a todas las muestras. No obstante, como puede verse en la Figura 2, esta regin es demasiados compleja, como para obtener una visin general de la misma utilizando un nico par de espectros de excitacin y emisin. Por otra parte, cuando la radiacin excitante es menos energtica, concretamente cuando es de longitudes de onda superiores a 290 nm, se observa una nueva zona de emisin de fluorescencia entre 350 y 450 nm.
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Muestra nmero 1: Vino francs
Muestra nmero 7: Vino Chileno
Muestra nmero 17: Vino sudafricano
Muestra nmero 19: Vino australiano
Figura 2.- IZQUIERDA: EEMs correspondientes a las muestras nmero 1 (Vino Francs), 7 (Vino Chileno), 17 (Vino Sudafricano) y 19 (Vino Australiano). CENTRO: Espectros de excitacin extrados de la EEM a em= 325 (negro), 363 (azul), y 388 nm (rojo). DERECHA: Espectros de emisin extrados de la EEM a exc= 260 (azul), 280 (negro), y 320 nm (rojo)
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Realizando un anlisis ms profundo de las EEMs, se describen a continuacin las caractersticas ms relevantes de los espectros obtenidos realizando una serie de cortes horizontales y verticales, en las zonas de mxima fluorescencia de las mismas: Los espectros de emisin (lnea azul), excitando a 260 nm, presentan una banda relativamente ancha, centrada a 372 nm, en la cual pueden distinguirse dos mximos a 363 y 380 nm. La razn de intensidades de emisin de fluorescencia en ambos mximos vara segn la muestra, como ya describieron previamente Dufour et al21. As por ejemplo, en la muestra 19, la intensidad a 380 nm es mayor que a 363 nm, al contrario que para las muestras 7 y 17, o en la muestra 1, en cuyo caso la razn de intensidades a ambas longitudes de onda est prxima a 1. En los espectros de excitacin (lnea azul), obtenidos a 363 nm, se observan dos mximos centrados a 260 y 280 nm. Al igual que ocurre con los espectros de emisin previamente descritos, las intensidades relativas en ambos mximos de excitacin varan con la muestra, pudiendo ser la razn I.F.(260) /I.F.(280) mayor o menor que uno, como ocurre en las muestras 19 y 1, respectivamente. En otros casos, como en las muestras 7 y 17, la mxima intensidad de excitacin est localizada en torno a 280 nm, observndose adems un simple hombro a 260 nm. La mxima intensidad de emisin de fluorescencia, excitando a 280 nm, (lnea negra) se centra a 363 nm, apareciendo en algunos casos, como por ejemplo en las muestras 1 y 17, un segundo mximo de emisin en torno a 325 nm, tan importante como el primero. En los espectros de excitacin, a 325 nm, se observa para todas las muestras un nico mximo centrado a 275 nm. Por ltimo, en la zona de longitudes de onda de excitacin ms desplazada hacia el rojo, concretamente a 320 nm, se obtiene el tercer espectro de emisin
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tpico del vino (lnea roja). En este caso se observa una banda de emisin centrada a 388 nm. En los espectros de excitacin obtenidos a 388 nm, se observa un mximo a 325 nm, siendo la forma de dichos espectros, por debajo de 300 nm, similar a la de los previamente descritos a em= 363 nm. Construccin del modelo PARAFAC Fundamentos del anlisis factorial paralelo (PARAFAC) Cuando una muestra produce una matriz de datos de dimensiones J x K (tensor de segundo orden), tal como una EEM, siendo J el nmero de longitudes de onda de emisin y K el nmero de longitudes de onda de excitacin, el correspondiente conjunto de datos obtenidos apilando las matrices correspondientes a las I muestras incluidas en el modelo es un cubo de datos (matriz 3D), de dimensiones I x J x K (Figura 3).
Figura 3.- Estructura del cubo de datos
Dado que las EEMs siguen un modelo bilineal, dicho cubo puede expresarse como un sumatorio de tensores producto de tres vectores, extendido al nmero de componentes que contribuye a la EEM. Sean los vectores An, Bn y Cn la contribucin (I x 1), el perfil de emisin (J x 1) y el perfil de excitacin (K x 1) para el
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componente n, respectivamente, entonces el cubo de datos F, puede escribirse como22,23. F=
n =1
An Bn Cn + E
donde representa un producto de tensores, N es el nmero total de componentes, y E es el trmino de error residual, cuyas dimensiones son las mismas que las de F. Los vectores columna an, bn y cn se recogen en la matriz de los scores A, conteniendo las contribuciones relativas de los diferentes componentes, y en las matrices de los loadings B y C. En la Figura 4 se representa esquemticamente la descomposicin mediante PARAFAC de un conjunto de EEMs.
Figura 4.- Descomposicin mediante PARAFAC de una serie de EEMs en tres factores
Una ventaja importante del modelo PARAFAC viene dada por el hecho de que las soluciones que propone son nicas (unicidad). La descomposicin de F suministra los loadings y los scores de los componentes individuales en todas las muestras, sean qumicamente conocidos o no. Esto es especialmente til en el anlisis de matrices de alimentos, donde no se disponen de patrones de los componentes puros.
22 23
Ewing G.W., Instrumental methods of chemical analysis; Mc. Graw-Hill; New York, 1985 Leurgans S., Ross R.T., Stat. Sci., 1992, 7: 289-319
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Bro24 denomina a esta tcnica como cromatografa matemtica, debido al hecho de que la separacin (cromatografa) de las seales de los constituyentes se lleva a cabo matemticamente (computacionalmente). Modelo PARAFAC El anlisis por PARAFAC se lleva a cabo en Matlab 7.1.0 (The Mathworks Inc., MA, USA), utilizando las rutinas contenidas en PLS_Toolbox (Eigenvector Research Inc., WA, USA). Las dimensiones del cubo de datos obtenido agrupando las EEMs correspondientes a las 57 muestras, es 57 x 398 x 20 (muestras x excitacin x emisin). Una vez construido este cubo, los datos han de ser pretratados antes de proceder a su anlisis mediante PARAFAC. Se procede en primer lugar a la eliminacin de las seales de dispersin Rayleigh. Para ello, se inserta el trmino NaN (not a number) en las lneas exc = em y 2exc= em, con una amplitud determinada. Por otra parte, en la zona triangular de la matriz donde exc > em se insertan ceros, ya que no es lgico que exista emisin a longitudes de onda menores que la de excitacin, ya que esta situacin se correspondera con una emisin ms energtica que la radiacin causante de la excitacin. Se ha comprobado que los ceros en esta zona aceleran los clculos, pero no deben estar demasiado cerca de la zona exc = em ya que si as fuera se introduciran deformaciones (artefacts) en las matrices. El cubo de datos ya pretratado se descompone mediante PARAFAC, utilizando diferente nmero de factores y aplicando en todos los casos la restriccin
24 Bro R., Multi-way Analysis in the Food Industry. Theory, Algorithms and Applications. Doctoral Dissertation, University of Amsterdam, 1998
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de no negatividad en los tres modos. Estas restricciones se aplican para obtener una solucin realista, ya que tanto las concentraciones como las seales de fluorescencia tienen que ser positivas. Por aplicacin de PARAFAC sobre el cubo de datos se obtienen los perfiles espectrales de componentes fluorescentes puros o, como sera ms correcto decir al trabajar directamente sobre una muestra tan compleja como el vino, se obtendran los perfiles correspondientes a conglomerados de fluorforos de comportamiento similar. La eleccin del nmero ptimo de factores es el primer paso en la construccin del modelo. Para tomar esta decisin pueden adoptarse diferentes criterios25, entre ellos el llamado diagnstico de la consistencia del modelo (core consistency diagnostic), CORCONDIA26, segn el cual, cuando se incrementa de forma progresiva el nmero de componentes y se representa el valor del core en funcin del nmero de factores, se obtiene un salto brusco una vez alcanzado el nmero de componentes ideal. En nuestro caso, los porcentajes de core calculados para modelos con uno y dos factores son 100 y 99.2 %, respectivamente. Para tres, cuatro y cinco factores se obtienen porcentajes de core de 50.9, 40.4 y -3.3 %, respectivamente. A la vista de estos resultados se rechazan los modelos con uno y dos factores, as como el modelo con cinco factores, en cuyo caso se desembocara en una situacin de sobreajuste. En este caso, la apariencia de los perfiles fluorescentes nos ha sido especialmente til para decidir que el nmero ptimo de factores es cuatro, ya que los perfiles fluorescentes del quinto componente tienen la apariencia de ser una combinacin de los del primero y el
25 26
Andersen C.M., Bro R., J. Chemom., 2003, 17:200-215 Bro R., Kiers H.A.L., J. Chemom., 2003, 17:274-286
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cuarto, mientras que los perfiles obtenidos en el modelo con cuatro factores parecen independientes entre ellos. Por otra parte, observando los valores de score se deduce que no existen muestras discrepantes al no encontrar valores extremos. En la Figura 5 se muestran los perfiles espectrales de excitacin y emisin obtenidos. En base a estos perfiles, y asumiendo la bilinearidad en las EEMs, se obtiene la estructura tridimiensional para cada factor, obtenida por multiplicacin de los vectores columna perfil de excitacin perfil de emisin (Figura 6).
I. F. Relativa
240
260
280 300 exc (nm)
320
340
I. F. Relativa 300
350
400 em (nm)
450
500
Figura 5.- Perfiles fluorescentes de excitacin (izquierda) y emisin (derecha) para los cuatro factores (primero (), segundo (), tercero () y cuarto () del modelo de PARAFAC construido en base a las EEMs de las 57 muestras de vino
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Figura 6.- Estructura tridimensional de los factores primero (azul), segundo (rosa), tercero (naranja) y cuarto (verde), obtenidos por multiplicacin de los correspondientes vectores loading
El perfil de excitacin del primer componente presenta un nico mximo en la zona ms desplazada hacia el ultravioleta, concretamente, a 255 nm y el perfil de emisin consiste en un mximo agudo a 380 nm, con un hombro a 365 nm. Los mximos de excitacin y emisin para el segundo factor estn situados a 275 y 323 nm, respectivamente. En los mximos de excitacin y emisin del tercer componente se observa un importante desplazamiento batocrmico, estando centrados a 330 y 410 nm, respectivamente, as como un ensanchamiento de los mismos con respecto a los componentes previamente descritos. Por ltimo, el cuarto componente se sita cercano al primero y segundo, estando relacionado por tanto con la zona ms desplazada al azul en las EEMs, y presenta un mximo de excitacin a 280 nm, con un hombro a 260 nm, y un mximo de emisin a 364 nm.
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Por otra parte, la matriz de scores, que mide la contribucin o participacin de cada uno de los cuatro componentes en cada EEM, se analiza mediante anlisis de componentes principales (PCA), con el objetivo de extraer el mximo de informacin. Antes de pasar a comentar los resultados de este PCA, se procede a comprobar la estabilidad del modelo construido mediante split-half analysis27. Este consiste en dividir el cubo inicial de datos en distintos subconjuntos y aplicar PARAFAC a cada uno de ellos independientemente. Se ensayan distintos criterios de divisin, como muestras pares muestras impares, italianas no italianas, chilenas no chilenas, etc., obtenindose en todos los casos perfiles de excitacin y emisin similares a los obtenidos al analizar el cubo de datos completo. Queda as demostrada la estabilidad del modelo construido. Otra manera de comprobar la estabilidad del modelo, basada en la misma idea de aplicar PARAFAC por subzonas, es dividir, no por muestras, sino por subrangos, dentro de los ejes de excitacin y emisin. As, se definen nuevos subconjuntos de datos, teniendo en cuenta la zona en la que se sitan los mximos de excitacin y emisin de cada componente. Por ejemplo, segn el componente uno, la subzona comprendera los rangos de excitacin y emisin de 245 a 270 nm, y de 360 a 420 nm, respectivamente. De esta manera se extraen cuatro nuevos subcubos de datos sobre los que se aplica PARAFAC, obtenindose en todos los casos idnticos perfiles, y quedando por tanto ratificada la estabilidad del modelo.
Harshman R.A., de Sarbo W.S. An application of PARAFAC to a small sample problem, demonstrating preprocessing, orthogonality constraints, and split-half diagnostic techniques. In Research Methods for Multimode Data Analysis, Law HG, Snyder CW, Hattie JA, McDonald RP (eds). Praeger:New York, 1984; 602-642
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Anlisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-score El anlisis de componentes principales (PCA) es una poderosa herramienta de visualizacin para la evaluacin de datos, que proporciona un modo de reducir la dimensionalidad del conjunto inicial de datos y representa grficamente las posibles relaciones inter-variable e inter-muestra. El PCA es un mtodo de anlisis no supervisado, en tanto en cuanto no se conoce, o se ignora deliberadamente, la existencia de categoras en el conjunto inicial de datos. La proyeccin sobre el plano de una nube de puntos multidimensionales puede ofrecer visiones muy ilustrativas de las estructuras que contiene. Para ello, es necesario seleccionar cuidadosamente, mediante la aplicacin de criterios racionales, el plano de observacin. Se trata de construir modelos de la nube de puntos, buscando secuencialmente las direcciones del espacio (nuevo ejes de coordenadas) que ofrecen la mejor visin posible de la misma. Estos nuevos ejes de coordenadas, vectores propios (eigenvectors), autovectores o componentes principales - PC, se construyen como combinaciones lineales de las variables manifiestas (ejes de coordenadas iniciales). Estos componentes principales son, por tanto variables latentes que se utilizan para descubrir las direcciones del espacio correlacionadas con causas objetivas de varianza que son las variables fundamentales o factores subyacentes, en nuestro caso pas de origen y variedad de uva. Se trata, por tanto, de encontrar las combinaciones lineales de variables manifiestas que contribuyen en mayor medida a hacer diferentes unas muestras de otras. Cuando se construye un vector que modula una nube de puntos, la varianza total de los datos queda dividida en varianza explicada por el vector y varianza residual. Se denomina autovalor del componente principal a la varianza explicada por ste. Los componentes principales se hallan siguiendo el criterio de hacer mxima la varianza explicada, o lo que es igual, hacer mnima la varianza residual.
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El primer PC, es el que contiene la mayora de la informacin o, en trminos estadsticos, el que tiene el mayor valor de varianza explicada, el segundo PC llevar la mayor parte de la informacin residual, y as sucesivamente. Si se proyectan las muestras sobre el plano de los dos primeros componentes, o de cualquiera otros dos, obtenemos una representacin de una parte de la informacin aportada por el conjunto de las variables manifiestas que ser igual al porcentaje de la varianza total explicada por dichos PCs. Las coordenadas de cada muestra sobre cada uno de estos ejes transformados se denominan scores, o, en espaol, puntuaciones o contribuciones. Las muestras que tienen valores de score muy cercanos a lo largo del mismo PC son similares, en cuanto a los valores para las correspondientes variables manifiestas recogidas en dicho PC. Contrariamente, muestras cuyos scores difieren mucho son tambin bastante diferentes en cuanto a los valores de dichas variables. La representacin ms til en cuanto a su interpretacin es la del primer componente respecto al segundo, ya que stos contienen la mayor parte de la informacin. Por otro lado, resulta igualmente interesante describir la estructura de los datos en trminos de correlacin entre variables. Cada variable manifiesta tiene una contribucin carga o loading en cada PC. Este valor refleja en qu medida dicha variable manifiesta contribuye a dicho PC, as como el grado en que dicho PC toma en cuenta la variacin de dicha variable en el conjunto de los datos. Cunto mayor el enlace entre la variable y el PC, mayor el loading. Si dos variables tienen loadings altos respecto al mismo PC dichas variables estarn altamente correlacionadas, positivamente si los loadings tienen el mismo signo, o negativamente si tienen signos contrarios. Si consideramos cada PC por separado, podemos decir que las variables con valores de loading pequeos no deben considerarse en su interpretacin. En cuanto a las muestras, podemos decir que si
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el score de una muestra y el loading de una variable en un particular componente principal tienen el mismo signo entonces la muestra tiene un valor superior a la media de dicha variable. Los valores de los loadings se representan igualmente en grficos bidimensionales en los que se recogen los valores respecto a dos componentes principales, usualmente los dos primeros. Para interpretarlos hay que considerar que si el punto se halla a gran distancia del centroide del grfico, es decir si los loadings sobre ambos componentes son altos, la variable cede casi toda su varianza al plano de ambos componentes y no le queda varianza relevante que ceder a otros componentes. Los ngulos que forma el vector que une el origen de coordenadas con el punto y con los ejes de coordenadas indican a cul de los PC cede preferentemente su varianza, esto es, con cul de los dos est ms fuertemente correlacionada. Si el punto se encuentra cerca del centroide, no cede varianza al plano de ambos componentes. Si existen dos o ms variables manifiestas con distancias grandes respecto al origen, todas ellas ceden gran parte de su varianza a dicho plano, es decir son casi coplanares con los dos PC considerados. Un ngulo pequeo o prximo a 180 indica fuerte correlacin positiva o negativa entre las variables, y probablemente los vectores correspondientes sealan la direccin de una variable fundamental. En cambio un ngulo prximo a 90 indica ortogonalidad o independencia entre esas variables manifiestas. El PCA sobre el conjunto de scores de PARAFAC se lleva a cabo mediante el paquete de software The Unscrambler28.
28
Unscrambler v. 6.11b, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway
251
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El conjunto de valores de score es una matriz de dimensiones 57 x 4, es decir, nmero de muestras x nmero de factores. Cada fila de la misma, compuesta de cuatro valores, representa la participacin de cada uno de los cuatro factores en la EEM de la muestra en cuestin y se denominan en adelante f1 a f4. En dicho conjunto de datos se incluyen dos variables de categora: el origen de las muestras y el tipo de uva, cuando dicho dato sea conocido (Tabla 1). En la Figura 7 se muestra el conjunto de las 57 muestras proyectadas sobre el plano definido por los componentes principales 1 (PC1) y 2 (PC2), agrupadas segn el origen. El porcentaje de varianza explicada segn este modelo y con estos dos componentes principales es del 75 %.
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Figura 7.- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre las 57 muestras. Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcin del origen.
Se observa cierta discriminacin entre muestras de diferentes pases. Respecto a PC1, las muestras chilenas son las que presentan valores de score ms negativos sobre este eje, estando dichas muestras agrupadas en la parte izquierda del mapa de scores. Las muestras espaolas y las procedentes de Australia occidental presentan los valores de score ms altos en dicho componente, estando ambos conjuntos diferenciados entre si por los valores de score en PC2, presentando las muestras 18 y 19 los valores de score ms altos en
253
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dicho componente. Por ltimo, merece la pena resaltar los bajos valores de score en ambos PCs de las muestras italianas, francesas, sudafricanas y americanas, estando claramente diferenciadas de los dos clster previamente descritos. Como es natural, no todas las muestras estn incluidas en un clster, ya que hay otros muchos factores, aparte del origen que influyen sobre la poblacin de compuestos fluorescentes en el vino. Los compuestos fluorescentes presentes en el vino son mayoritariamente generados en la pulpa, semillas y pieles de la uva, y son parcialmente extrados en el proceso de elaboracin del vino. Por lo tanto, parece lgico pensar que la variedad de uva ser un factor muy influyente en los fluorforos presentes en el vino, as como sus concentraciones relativas. Otros factores que afectan a la poblacin de fluorforos en el vino son, por ejemplo, el clima, las condiciones ambientales y del terreno en el que crecen las uvas, el tratamiento de los viedos (riego, poda, etc.), la madurez del fruto en el momento de la cosecha, el tipo de fermentacin empleada en el proceso de elaboracin, la maceracin, el envejecimiento en barrica, entre otros. Tal y como se muestra en la Tabla 1, en algunos casos se conoce el tipo de uva empleado en la elaboracin de alguna de las muestras, siendo algunas de ellas monovarietales y otras multivarietales. Se realiza entonces un PCA sobre el conjunto de muestras de las que se dispone de este dato. Los resultados de este anlisis se recogen en la Figura 8 en la que se representa los scores y loadings sobre el plano definido por los componentes principales 1 (PC1) y 2 (PC2) (90 % de la varianza explicada).
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Figura 8.- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre el conjunto de muestras de las que se conoce el tipo de uva. Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcin del tipo de uva
Se observa que las muestras chilenas son un claro ejemplo de la influencia de esta variable. As, las muestras 9, 53 y 54 elaboradas a partir de uvas Merlot estn separadas del resto de muestras chilenas en el mapa de los scores definido por PC1 y PC2. La influencia del origen sobre muestras elaboradas con el mismo tipo de uva tambin es una evidencia. Se observa que las muestras nmero 18 y
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19 procedentes de Australia Occidental estn situadas en el mapa de los scores muy lejos de las muestras 30, 31 y 32, procedentes de Argentina, y de la muestra 33, procedente de USA, estando todos estos vinos elaborados con uva de tipo Sirah. Como se observa en las Figuras 7 y 8, las variables f1 y f4 ceden casi toda su varianza al plano definido por PC1 y PC2, estando dichas variables negativamente correlacionadas. La poblacin de muestras procedentes de Chile, son un caso bastante particular, como se comenta a continuacin. Los resultados del PCA sobre este conjunto de muestras, incluyendo como variable de categora el tipo de uva, se representan en la Figura 9. De nuevo se pone de manifiesto la discriminacin entre los vinos elaborados con uva de tipo Merlot (muestras nmero 9, 53, 54) del resto de muestras, a pesar de ser todas del mismo pas. Como se observa en la Figura 7 estas tres ltimas muestras no estn dentro del clster de muestras chilenas, posiblemente debido al tipo de uva. Adems, como se observa en el mapa de los loadings el tercer componente de PARAFAC contribuye en mayor medida a PC2 que en los modelos representados en las Figuras 7 y 8. Tambin se observa una inversin en las posiciones relativas de f1 y f4 en esta grfica de loadings y por ello las muestras 9, 53 y 54 estn situadas en la parte izquierda en las grficas de los score al contrario de lo que ocurre en las grficas de las Figuras 7 y 8.
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Figura 9.- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre el conjunto de muestras chilenas. Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcin del tipo de uva
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Identificacin de los fluorforos presentes en vino Caracterizacin fluorescente de fluorforos presentes en vino Se registran los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia de una serie de compuestos presentes en el vino que poseen propiedades fluorescentes. Concretamente se ensayan los cidos glico, p-cumrico, elgico, ferrlico, gentsico, vanllico, cafico, y sinpico, trans-resveratrol, trans-piceido, quercetina, rutina, catequina y epicatequina, y los antocianos malvidina-3-O--glucopiransido, petunidina-3-O--glucopiransido y delfinidina-3-O--glucopiransido. El comportamiento fluorescente de estos compuestos es altamente dependiente del entorno qumico en el que se encuentran, estando muy influenciado por variables tales como la acidez y la composicin del medio. Por lo tanto, se ha buscado un entorno qumico lo ms similar posible a la matriz del vino, de modo que todas las medidas de estos patrones se llevan a cabo en una matriz de vino sinttica, compuesta por tampn tartrato de pH 3.7 en una concentracin de 3 g/L y etanol al 13 % v. Las condiciones instrumentales empleadas son similares a las utilizadas en el registro de las muestras de vino, pero usando la geometra tradicional de medida (90 ), al no tratarse de muestras concentradas. En la Tabla 2 se resumen las longitudes de onda de mxima excitacin y emisin de cada uno de estos compuestos as como las de los cuatro factores obtenidos mediante PARAFAC.
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Tabla 2.- Propiedades fluorescentes de los compuestos ensayados, en medio tartrico de pH 3.7 3 g/L y etanol al 13 % v., y de los cuatro componentes obtenidos en la descomposicin mediante PARAFAC de la EEM total del vino. Compuesto cido glico cido p-cumrico cido vanllico cidos fenlicos
No-Flavonoides
exc (nm) 241 348 241, 282, 305 262 333 297, 335 320 318 318 427 279 280 280 280 280 260 275 330 260, 280
em (nm) 350 410 354 433 422 446 446 390 390 480 317 316 355 355 355 380 323 410 364
cido cafeico cido elgico cido sinpico cido ferrlico cido gentsico trans-resveratrol trans-piceido quercetina rutina catequina epicatequina malvidina-3-O-glucopiransido delfinidina-3-O-glucopiransido petunidina-3-O-glucopiransido
Estilbenos Flavonoles Flavanoles

Flavonoides
Antocianos
Componente 1 Componente 2 Componente 3 Componente 4
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Las longitudes de onda de mxima excitacin y emisin del par de ismeros catequina y epicatequina, son prximas a las del componente 2. Por otra parte, los mximos de excitacin y emisin de los cidos p-cumrico y gentsico, trans-resveratrol y trans-piceido, son cercanos a los del componente 3. Por ltimo, se deduce que el cido vanllico podra estar relacionado con el componente 4, dada la proximidad entre sus mximos de emisin, y entre los diferentes mximos que aparecen en el espectro de excitacin. Con respecto al componente 1, no se encuentra ninguna similitud entre las longitudes de onda correspondientes a los perfiles de este factor y los estndares medidos. Los espectros de excitacin y emisin correspondientes a los estndares de los posibles candidatos, se muestran en la Figura 10. Es importante resaltar que excepto en el caso del par de ismeros catequina y epicatequina, que encajan perfectamente con los perfiles del componente 2, para el resto de los compuestos ensayados no se da una similitud tan elevada entre los patrones y los perfiles de PARAFAC, lo que apoya la idea de que cada componente de PARAFAC no representa un nico fluorforo, sino un conglomerado de fluorforos o familia de compuestos de comportamiento fluorescente similar.
260
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800
Catechin
500
Epicatechin
600
400
300
400
F. I. 200 100 0
200 300
F. I.
200
(nm)
400
500
200
300
(nm)
400
500
300
p-Coumaric Acid
1000 t-Resveratrol / t-Piceid 800
200 600 F. I. 400 100 200 0 200 300 0 400 500 F. I.
(nm)
200
300
(nm)
400
500
1000
Gentisic Acid
300
Vanillic Acid
800
200
600 F. I.
400
F. I. 100
200 0 200 300
(nm)
400
500
200
300
(nm)
400
500
Figura 10.- Espectros de excitacin y emisin de algunos de los compuestos ensayados
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Anlisis cromatogrfico de las muestras de vino Con el objetivo de alcanzar un mayor conocimiento acerca de la poblacin de molculas fluorescente en el vino se procede a cromatografiar las 57 muestras incluidas en este estudio, monitorizando fluorimtricamente el eluato a los pares de longitudes de onda de excitacin y emisin correspondientes a los componentes obtenidos en la descomposicin de las EEMs mediante PARAFAC. Para llevar a cabo la elucin de las muestras, se selecciona un programa de gradiente apropiado, con el objetivo de obtener una buena separacin. Como fase mvil se emplea una mezcla metanol-cido frmico-agua (10:2:88, v:v:v) como disolvente A y metanol-cido frmico-agua (90:2:8, v:v:v) como disolvente B, con el siguiente gradiente: 0 minutos, 100% A; 15 minutos, 85 % A:15 % B; 25 minutos, 50 % A:50 % B; 34 minutos 30 % A:70 % B. El flujo se mantiene a 0.25 mLmin-1. El eluato se monitoriza fotomtricamente a 255, 260, 275, 280 y 330 nm, y fluorimtricamente a exc/em 260 / 360 nm (longitudes de onda de compromiso para los componentes 1 y 4), 275 / 320 nm (componente 2) y 330 / 410 nm (componente 3), respectivamente. En la Figura 11 se recogen los tres cromatogramas registrados para una de las muestras a los tres pares de longitudes de onda de excitacin/emisin. Se observa que la fluorescencia global de la muestra al excitar a 330 nm, es mucho menor que la obtenida excitando a 260 275 nm. Se obtiene una buena separacin entre los componentes fluorescentes a cada par de longitudes de onda, lo que permite obtener una estimacin de su concentracin real en la muestra a travs de la altura de sus picos cromatrogrficos.
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Figura 11.- Perfiles de fluorescencia a los tres pares de longitudes de onda, correspondientes a una misma muestra
Una vez que se registran los cromatogramas correspondientes a las 57 muestras, se empiezan a buscar posibles correlaciones entre los valores de score obtenidos en la descomposicin por PARAFAC y las alturas de los picos correspondientes a componentes individuales, en los respectivos cromatogramas. Con respecto al primer componente, se encuentran buenas correlaciones entre los valores de score para este componente y las alturas de los picos a 30.0 y 34.5 minutos en los perfiles obtenidos a exc/em 260 / 360 nm. No obstante, la mejor correlacin se encuentra con la altura del pico que aparece a 34.5 minutos. En la Figura 12 se representa la altura de este pico para las 57 muestras frente a los scores en el componente uno. Con el fin de completar la caracterizacin de los componentes fluorescentes en el vino se han registrado los espectros de emisin, excitando a
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260 nm, y se encuentra que el espectro de emisin correspondiente al pico que aparece a 34.5 minutos es prcticamente similar al perfil de emisin del componente uno (Figura 13). Con respecto al espectro en el pico a 30.0 minutos, se encuentra que est localizado en la misma regin en longitudes de onda que el componente uno, pero que su fisonoma no se corresponde con la de este componente (Figura 13). Por dopaje de las muestras con los patrones de los que se dispone, se corrobora que este pico no se corresponde con ninguno de ellos, como era de esperar ya que al caracterizar estos patrones fluorimtricamente no se encontr que ninguno de ellos presentara espectros de excitacin y emisin coincidentes con los perfiles del componente uno. Mediante LC-MS se deduce que la masa molecular de este compuesto es de 534, un valor relativamente elevado, lo que nos lleva a pensar que pudiera tratarse de un compuesto de condensacin.
Figura 12.- Correlacin entre los valores de score del componente 1 de cada muestra y la altura del pico a 34.5 minutos
I. F. Relativa 300
350
400 em (nm)
450
500
Figure 13.- Espectros de emisin a exc= 260 nm obtenidos en los pices de los picos a 30 (izquierda) y 34.5 minutos (centro). (derecha) perfil de emisin del componente uno.
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Como ya se coment anteriormente, al describir la caracterizacin de fluorforos tpicos presentes en el vino, se piensa que el componente cuatro puede estar relacionado con el cido vanllico. En la Figura 14 se representa la altura del pico correspondiente a este polifenol, en los 57 cromatogramas obtenidos a exc/em 260/360 nm, frente a los valores de score para dicho componente, encontrando cierta correlacin, si bien no muy elevada.
Figura 14.- Altura del pico correspondiente al cido vanllico (25 minutos) vs valores de score en el componente 4, para las 57 muestras.
Con respecto a los cromatogramas obtenidos a exc/em 275/ 320 nm (en este caso no se inyectan todas las muestras, sino las ms representativas de la variacin de este factor, es decir muestras con alto, medio y bajo contenido en este factor), se encuentran elevadas correlaciones entre los valores de score correspondientes al segundo componente de PARAFAC y las alturas de los picos a 22.2 y 27.7 minutos, correspondientes al par de ismeros catequina y epicatequina, respectivamente (Figura 15). Este hecho est de acuerdo con la similitud ya comentada, entre los espectros de excitacin y emisin de ambos compuestos con los perfiles correspondientes al componente 2, confirmndose por tanto, la asignacin de dicho componente a ambos ismeros.
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Figura 15.- Altura de los picos correspondientes a catequina (superior) y epicatequina (inferior) frente a los valores de score del componente 2 para las muestras ensayadas
En ltimo lugar, con respecto al tercer componente, se encuentran buenas correlaciones entre los valores de score para el mismo y los picos a 28.7, 30.2 (cido p-cumrico), 33.0 y 36.3 minutos en los cromatogramas obtenidos a exc/em 330/410 nm, para las muestras ms representativas de la envergadura de este factor. Esto nos indica que efectivamente este factor est asociado a un conjunto de fluorforos y con los datos disponibles, no podemos concluir el peso de cada uno de ellos.
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Utilizacin de las seales de autofluorescencia total del vino en combinacin con herramientas quimiomtricas para asegurar la pertenencia del vino a una DO El vino es un producto que muy comnmente est sometido a denominaciones de origen, lo que implica la necesidad de disponer de herramientas analticas potentes que permitan llevar a cabo un control de las diferentes partidas. Las seales totales de autofluorescencia de este producto se perfilan como candidatas idneas para futuros mtodos de control analtico. El objetivo de este apartado es el estudio de las posibilidades de las EEMs para discriminar entre muestras de vino pertenecientes a la DO Rioja y las no pertenecientes, as como la posible diferenciacin entre muestras de vino joven, crianza y reserva, y las capacidades para predecir el contenido total de polifenoles. En este caso se construye un modelo en el que se incluyen 59 muestras de vino, 48 de las cuales pertenecen a la DO, y 11 son no pertenecientes. Dentro de los vinos de la DO, hay muestras de vinos joven, de crianza y reserva. Las muestras se mantienen a una temperatura aproximada de 4 C, y la matriz de fluorescencia de registra inmediatamente despus de abrir cada botella. Las EEMs correspondientes a las 59 muestras se registran en modo frontface. En este caso, el ngulo de incidencia, definido como el formado entre el haz de excitacin y la perpendicular a la superficie de la celda, se mantiene en 34. Para el registro de la EEM, una alcuota de cada muestra de vino se transfiere directamente de la botella a una celda de cuarzo de 3 mL y 1 cm de paso de luz. La temperatura del laboratorio se mantiene en torno a 15 C. Las rendijas de excitacin y emisin de los monocromadores se fijan en 5 nm, respectivamente. La velocidad de adquisicin se fija en 1200 nm/min, como solucin de compromiso
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entre ruido en los espectros registrados y tiempo de adquisicin de la matriz. Los rangos de longitudes de onda de excitacin y emisin son 245-345 nm y 300-500 nm, respectivamente, con incrementos de 2 nm, en ambos casos, lo que implica 51 valores de longitudes de onda de excitacin y 101 de emisin. Cada EEM se registra como mltiples espectros de emisin, a distintas longitudes de onda de excitacin. Cuando se agrupan las EEMs correspondientes a las 59 muestras, se obtiene un cubo de datos de dimensiones 59 x 101 x 51. Este cubo de datos es pretratado, para eliminar del mismo las seales de dispersin y anular la zona de las matrices en las que exc>em, como se ha explicado anteriormente. Se procede entonces a la descomposicin de este cubo de datos mediante PARAFAC. En primer lugar se procede a deducir el nmero ptimo de factores. Para ello se realizan los clculos empleando un nmero de factores comprendido entre uno y cuatro, aplicando en todos los casos la restriccin de no negatividad en los tres modos. Los valores de % core obtenidos para uno, dos y tres factores son de 100, 99.9 y 80.2 %, mientras que para el modelo construido con cuatro factores se obtiene un valor del 34.3 %. A travs de esta cada en el valor del core y al observar la estructura de los perfiles obtenidos, se deduce finalmente que el nmero ptimo de factores en este caso es de tres, ya que los perfiles de fluorescencia del cuarto parecen nicamente ruido sin una forma definida. Los perfiles de excitacin y emisin de los tres componentes se representan en la Figura 16.
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I. F. Relativa
240
260
280
300 320 (nm)
340
360
I. F. Relativa
300
350
400 (nm)
450
500
Figura 16.- Perfiles normalizados de excitacin (izquierda) y emisin (derecha), correspondientes a los factores 1 (), 2 () y 3 (), obtenidos mediante PARAFAC
El perfil de excitacin del primer componente se caracteriza por un mximo centrado a 260 nm, y un hombro a 295 nm; su perfil de emisin consta de un mximo principal centrado a 363 nm, y cuatro pequeos picos a 420, 470, 485 y 495 nm. El segundo componente est caracterizado por bandas relativamente anchas de excitacin y de emisin, centradas a 330 y 425 nm, respectivamente. El perfil de excitacin del tercer componente presenta dos mximos, el ms intenso de ellos, centrado a 285 nm, y uno de menor intensidad a 335 nm; en el perfil de emisin de este componente se observa un mximo principal centrado a 325 nm. Como se hizo con el modelo anteriormente discutido, en este caso tambin se comprueba la estabilidad mediante split half analysis, y analizando las matrices por zonas de excitacin y emisin. La matriz de scores obtenida en este caso mediante PARAFAC tiene dimensiones 59 x 3. Dicho set de datos se analiza por PCA. Los resultados de dicho anlisis se recogen en la Figura 17 en forma de grficos de scores y loadings.
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Figura 17.- Grficos de loadings (superior) y scores (inferior) en el plano PC1-PC2. En la grfica de los scores, se muestran en azul las muestras de las DO y en rojo las que no pertenecientes
Del grfico de los loadings, se deduce que las variables 1 y 3 estn inversamente correlacionadas, y ambas variables ceden su varianza a PC1 y PC2. Por su parte, en el grfico de los scores, las muestras se han agrupado dependiendo de su pertenencia o no a la DO, as las muestras azules son vinos de Rioja y las rojas son vinos de DO distintas. Se observa cierto grado de discriminacin. Las muestras 49 (vino casero) y 53 (Ribera del Duero) presentan
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valores negativos en el primer componente, y por tanto un valor superior a la media de aquellas variables cuyos loadings respecto a este PC sean altos y negativos, es decir, los scores en el componente uno obtenido mediante PARAFAC. El resto de muestras no pertenecientes a la DO presentan valores negativos en PC2, presentando valores inferiores a la media para las tres variables. Se deduce que ambos PCs estn relacionados con la variable fundamental pertenencia a la DO. Por otra parte, se ha realizado un nuevo anlisis de componentes principales sobre el conjunto de muestras de la DO de las cuales se conoca su carcter de vino joven, crianza o reserva. Los resultados de este PCA se muestran en la Figura 18. En este caso, las muestras se han agrupado en el mapa de los scores atendiendo a su carcter de jvenes, crianza o reserva. En este caso no se observa una clara existencia de clsteres, y este hecho es bastante natural, porque como se coment anteriormente, son muchos los factores que influyen sobre la poblacin de compuestos fluorescentes en el vino. No obstante, parece que el PC2 s distingue entre muestras jvenes, que presentan los mayores valores de score en este componente, y muestras de crianza o reserva. En el grfico de los loadings en este nuevo modelo se observa que la variable 1 cede casi toda su varianza a PC2, y la variable 3 a PC1. De modo que las muestras de vino jvenes tienen valores superiores a la media en la variable 1.
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Figura 18.- Grficos de loadings (superior) y scores (inferior) en el plano PC1-PC2. En la grfica de los scores, se muestran en azul las muestras de vino jvenes, en rojo las crianza y en verde las reserva
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En este caso, adems, se mide el ndice total de polifenoles en las 59 muestras de vino, mediante el mtodo de Folin-Ciocalteau. El modo de operar experimentalmente fue el siguiente: Se deposita 1.00 mL de vino en un matraz de 10.0 mL y se aade agua ultrapura hasta enrase. Se toman 0.25 mL de vino diluido y se llevan a un matraz de 25.0 mL, en el cual se aaden 15.0 mL de agua, 1.25 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu, 3.75 mL de disolucin de carbonato sdico y agua ultrapura hasta enrase. La disolucin resultante se deja reposar 2 horas y al cabo de este tiempo, se mide la absorbancia a 755 nm. El contenido total de polifenoles se mide en unidades de cido glico, sobre una recta de calibrado previamente construida con disoluciones patrn de dicho compuesto, en el rango de concentraciones de 0.50 a 5.0 gmL-1. Perspectivas de futuro Actualmente se estn estudiando las posibilidades de distintos espectros de excitacin y emisin extrados de las EEMs, as como de diversas zonas de las mismas, para predecir el ndice de polifenoles totales del vino. La proposicin de un mtodo rpido de medida de este parmetro ser un gran reto, ya que evitar llevar a cabo el lento proceso de Folin-Ciocalteu.
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CAPTULO VII ANLISIS DE RESVERATROL EN VINOS TINTOS MEDIANTE VOLTAMPEROMETRA DE REDISOLUCIN ADSORTIVA DE ONDA CUADRADA
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CAPTULO VII. Resveratrol en vino tinto mediante Ad-SSWV
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ANTECEDENTES Las tcnicas voltamperomtricas en general, y en particular las tcnicas de redisolucin, se han utilizado ampliamente para el anlisis de alimentos. En la mayora de los casos se trata de mtodos para anlisis de metales, y entre los alimentos en que se han utilizado estas tcnicas se encuentra tambin el vino1, 2. Sin embargo son ms escasos los antecedentes encontrados acerca de mtodos electroanalticos para la determinacin de otros componentes del vino, si bien la mayora de ellos se refieren al anlisis de antioxidantes. As, Kilmartin et al3 realizan un estudio mediante voltamperometra cclica y describen el comportamiento de los orto-difenoles presentes en el vino, que disueltos en un vino sinttico, originan, en el electrodo de carbn vitrificado, un pico andico a potenciales prximos a 400 mV, debido a la prdida de dos electrones para dar orto-quinonas, y atribuyen las seales que aparecen a potenciales superiores, a otras clases de compuestos fenlicos. Entre otros, incluyen al trans-resveratrol entre los compuestos responsables del pico cercano a 650 mV, puesto que, segn sus resultados, tiene un potencial de pico de 667 mV. Posteriormente, el mismo grupo de investigacin informa de una seal de oxidacin a 300 mV que atribuyen a miricetinas y de un hombro a 470 mV adscrito a la oxidacin de glucsidos de quercetina4. La integral de las curvas I-E hasta 500 mV se usa como una medida de los compuestos fenlicos de menores potenciales de oxidacin (llamados equivalentes de cido glico). El pico a 640 mV que proporcionan los vinos tintos se asocia a antocianos derivados de la malvidina y
Daniele S., Baldo M.A., Ugo P., Mazzocchin A., Anal. Chim. Acta, 1989, 219:9-18 Brainina Kh.Z., Stozhko N.YU., Belyshva G.M., Inzhevatova O.V., Kolyadina L.I., Cremisini C., Galleti M., Anal. Chim. Acta, 2004, 514:227-234 3 Kilmartin P.A., Zou H., Waterhouse A.L., J. Agric. Food Chem., 2001, 49:1957-1965 4 Kilmartin P.A., Zou H., Waterhouse A.L., Am. J. Enol. Vitic., 2002, 53:294-302
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oxidaciones posteriores a potenciales mayores de 700 mV a meta-difenoles o a grupos fenlicos aislados. En otro artculo, recogen los resultados obtenidos al examinar la fermentacin de mostos de Pinot Noir utilizando la voltamperometra cclica para realizar el seguimiento de los compuestos fenlicos5. Piljac et al6 comprueban que la voltamperometra cclica proporciona una estimacin fiable del contenido de compuestos fenlicos en vino y que es til para la identificacin de clases especficas de polifenoles, segn sus potenciales de oxidacin. Los flavonoles totales, expresados como equivalentes de quercetina, son determinados en vino y otras bebidas mediante un mtodo de inyeccin en flujo/voltamperometra de redisolucin adsortiva7, que incluye un cambio de medio entre la preconcentracin y la obtencin de las seales electroqumicas, utilizando un electrodo de pasta de carbono. Sin embargo, en ninguno de los artculos citados se hace referencia a la determinacin individual de trans-resveratrol en vinos. S se encuentran en la bibliografa diferentes artculos en que se describe el comportamiento electroqumico de resveratrol. As, Corduneanu et al8 evalan la actividad antioxidante de los ismeros trans y cis, mediante voltamperometra cclica, diferencial de pulso y de onda cuadrada, en amplio rango de pH, usando un electrodo de carbn vitrificado. Segn sus resultados, el resveratrol presenta dos picos de oxidacin, el primero de ellos
Zou H., Kilmartin P.A., Inglis M., Frost A., Australian J. of Grape and Wine Research, 2002, 8:1-12 Piljac J., Martnez S., Stipevi T., Petrovi , Metiko-Hukovi M., Am. J. Enol. Vitic., 2004, 55:417-422 7 Volikakis G.J., Efstathiou, C.E., Anal. Chim. Acta, 2005, 551:124-131 8 Corduneanu O., Janeiro P., Brett A. M. O., Electroanalysis, 2006, 18: 757-762
5 6
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correspondiente a la oxidacin irreversibe del grupo fenlico y el segundo a la oxidacin de los grupos hidroxilo del anillo de resorcinol, tambin de forma irreversible. Zhang et al9 estudian el comportamiento de trans-resveratrol en el electrodo de pasta de carbono, mediante las tcnicas voltamperometra cclica y de onda cuadrada. Deducen de su estudio que la molcula de trans-resveratrol sufre una oxidacin irreversible en dicho electrodo, siendo el proceso controlado por adsorcin y dependiente del pH. Ensayan distintos medios de trabajo tales como disoluciones acuosas 0.1 M de HCl, HNO3, H2SO4, H3PO4, KNO3, KCl, KI, KBr, NaCl, NH4Cl, Na2CO3, tartrato sdico, Na2B4O7, y NaOH, tampn Britton-Robinson de pH 4.7 o tampn actico/acetato, y observan un nico pico andico del analito en medio fuertemente cido. Obtienen mejores resultados en presencia de cido ntrico o cido clorhdrico que en medio cido sulfrico. Adems, encuentran que la adicin de cloruros al medio de trabajo incrementa la intensidad del pico andico obtenido, probablemente debido a que la adsorcin de este in en la superficie del electrodo de pasta de carbono mejora las propiedades de esta superficie y facilita la velocidad de transferencia de electrones10. Finalmente, el medio de trabajo que emplean est compuesto por 10-3 M de KCl + 0.1 M HNO3, siendo 1.0 el pH del mismo. Adems, realizan un estudio mediante voltamperometra cclica del cual se deduce el carcter totalmente irreversible de la reaccin electrdica de transresveratrol, al no observarse pico alguno en el barrido inverso.
10
Zhang H., Xu L., Zheng J., Talanta, 2007, 71:19-24 Dong S.Y., Zheng J.B., Gao H., Chem. J. Chin. Universities, 2003, 24:428
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A travs de la variacin del potencial de pico con la velocidad de registro, deducen que el nmero de electrones que participan en la reaccin es 1, asumiendo = 0.5. Se encuentra tambin que los potenciales de pico se desplazan hacia valores menos negativos segn se aumenta el pH, deducindose a travs de la ecuacin de Nernst que el nmero de protones involucrados en la reaccin es 1. Dada la similitud entre la estructura qumica de resveratrol y la de los flavonoides, postulan que el pico observado para este compuesto debe corresponder a la oxidacin del grupo hidroxilo del anillo fenlico de resveratrol, y, deducen la existencia de adsorcin del analito sobre la superficie del electrodo, al observar el efecto atenuador de la adicin de pequeas cantidades de surfactante sobre el pico andico. Por ltimo, ponen a punto un mtodo de anlisis, llevando a cabo los registros mediante voltamperometra de onda cuadrada. Encuentran una buena relacin lineal entre concentracin de resveratrol puesta y la seal medida (intensidad de pico), y aplican el mtodo a la determinacin de este compuesto en frmacos y orina. Por ltimo, en un artculo muy reciente11 se propone un mtodo de redisolucin adsortiva de diferencial de pulso, en electrodo de grafito, para determinar resveratrol en tabletas. Los estudios realizados apoyan, nuevamente, la oxidacin del grupo hidroxilo en el anillo fenlico como responsable del pico que aparece a potenciales prximos a 0,5 V, a pH 6.0. Basndonos en los resultados anteriormente descritos, asumimos como principal reto llegar a proponer un mtodo para la determinacin de transresveratrol en vino, que nos parece interesante dada la rapidez y sensibilidad de
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Liu X.J., Wu Y.J., Wang F., Gao L., Ye B.X., J. of the Chinese Chem. Soc., 2008, 55:264-27
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las tcnicas electroanalticas. Buscamos diferentes estrategias, como es el cambio de medio, y un tratamiento de muestra adecuado, al enfrentarnos a una muestra tremendamente compleja. Nuestro electrodo de trabajo es un electrodo de carbono vitrificado, y el cido que utilizamos para fijar la acidez del medio de trabajo es HClO4. El objetivo de este captulo es ms el desarrollo de un mtodo para la determinacin de trans-resveratrol en muestras de vino, que el estudio de los procesos electroqumicos en que se basa. Por ello, la mayor parte de las experiencias que aqu se describen se llevan a cabo en presencia de la matriz del vino, y partiendo de los antecedentes ya descritos por Zhang et al9, para la oxidacin del trans-resveratrol en medio cido. RESULTADOS Y DISCUSIN Eleccin del sistema de limpieza del electrodo de carbn vitrificado Uno de los inconvenientes que tiene la utilizacin de electrodos slidos, y en concreto la utilizacin del electrodo de carbn vitrificado, es el frecuente deterioro de su superficie como consecuencia de la adsorcin de los compuestos en estudio o de los productos resultantes de su oxidacin, o bien de la modificacin qumica de la misma. Esto produce la obtencin de resultados no reproducibles en barridos sucesivos y hace necesaria la utilizacin de algn procedimiento de limpieza de los mismos. Para seleccionar el ms apropiado en nuestro caso, se han examinado varios de entre los ms frecuentes, atendiendo a la reproducibilidad que proporcionan en registros sucesivos de voltamperogramas del compuesto en estudio. En concreto, los mtodos de limpieza examinados han sido el pulido con
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almina y el frotamiento con un disco de algodn empapado en un disolvente orgnico como etanol, acetonitrilo o dimetilformamida, as como en hidrxido sdico 2 M, seguido en todos los casos de frotamiento sobre un disco de algodn empapado en agua. En todos los casos se ensaya, asimismo, el resultado de efectuar una limpieza electroqumica, posterior a la mecnica, mediante la realizacin de un barrido de potencial en sentido inverso al que pretendemos efectuar. Conforme a los resultados obtenidos se ha decidido efectuar la limpieza del electrodo mediante frotamiento con un algodn empapado en dimetilformamida (DMF) durante 1 minuto, seguido de limpieza con algodn empapado en agua durante otro minuto. Antes de la obtencin de los voltamperogramas se efecta, adems, un barrido mediante voltamperometra de onda cuadrada desde + 1.2 a 0.0 V, sobre un blanco. Este registro, adems de contribuir a la limpieza del electrodo, permite comprobar la efectividad del procedimiento de limpieza completo, tomando como referencia la reproducibilidad del perfil I-E obtenido en el mismo. Influencia de la concentracin de cido Puesto que como ya se ha dicho el trans-resvetratrol origina ondas de adsorcin en medio cido, en primer lugar estudiamos la influencia de la concentracin de cido perclrico en el medio de trabajo. Para ello, se preparan 4 disoluciones conteniendo todas ellas, en un volumen final de 25.0 mL, 73 ngmL-1 de trans-resveratrol, volmenes diferentes de HClO4 1.0 M y NaClO4 1.0 M, tales que la suma de ambos se mantenga constante en 5.0 mL, para as mantener la fuerza inica del medio, y agua ultrapura hasta enrase. Se procede a registrar los voltamperogramas de redisolucin adsortiva de onda cuadrada (Ad-SSWV) de todas ellas, en las siguientes condiciones instrumentales: Eac = +0.50 V, tac = 60 s, teq = 10 s, frecuencia = 25 Hz, paso de potencial = 10 mV, amplitud = 50 mV.
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La lnea base de los voltamperogramas obtenidos (Figura 1 izquierda) se corrige mediante el mtodo de la media mvil (moving average), obtenindose los voltamperogramas de la Figura 1-derecha. Se trata de un mtodo automtico de correccin a lnea base, el cual es bastante efectivo cuando los picos aparecen como hombros sobre perfiles escarpados. De manera que, los picos reales se observarn como tales, una vez hecha la correccin. El nmero de puntos integrantes del voltamperograma resulta reducido una vez realizada la correccin, ya que se van obteniendo valores medios dentro de una ventana, cuyo tamao es un parmetro a especificar para llevar a cabo la correccin. La lnea base se calcula posteriormente, por comparacin de cada punto con el valor medio de sus dos vecinos. Si el valor absoluto medio es menor, ste sustituye al valor real. La operacin se repite una y otra vez, hasta que ya no sea necesario reemplazar ningn valor. Cuando el nmero de iteraciones necesarias sea superior a 1000, el proceso se para.
5.5E-006 5E-006 4.5E-006 I (A) 4E-006 3.5E-006 3E-006 0.5 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9 2E-007 0 0.5 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9 I (A) 4E-007 8E-007 6E-007
Figura 1.- Influencia de la concentracin de cido perclrico en el medio de trabajo. Izquierda: voltamperogramas originales; derecha: voltamperogramas corregidos. Concentraciones ensayadas: 0.1 M HClO4 (); 0.08 M HClO4 - 0.02 M NaClO4 (); 0.04 M HClO4 - 0.06 M NaClO4 (); 0.02 M HClO4 - 0.08 M NaClO4 ()
Se comprueba que, en el intervalo examinado, la concentracin de HClO4 no influye sobre la intensidad de pico del trans-resveratrol y que el potencial de pico tampoco sufre un cambio apreciable. En lo sucesivo se utiliza HClO4 0.1 M para
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fijar la acidez. Se comprueba, adems, que la seal no vara al eliminar el NaClO4 del medio, por lo que en adelante solamente se aadir HClO4 como electrolito soporte. Limpieza del vino Se ha comprobado que el vino ha de ser sometido a una serie de etapas previas de limpieza, dado que en presencia de la matriz completa del vino no se observa seal alguna debida al proceso adsortivo-oxidativo del trans-resveratrol. Primeramente se procede al registro de un voltamperograma Ad-SSWV sobre una muestra de vino sin tratar, simplemente filtrado y diluido, en presencia de una concentracin de HClO4 0.10 M, producindose una contaminacin severa de la superficie del electrodo que obliga a la regeneracin total de la misma mediante frotamiento con almina. Con el fin de obtener una disolucin de trans-resveratrol en una matriz ms simple, el primer tratamiento al que se someti la muestra fue a una extraccin lquido-lquido con ter etlico, segn el procedimiento previamente descrito en el Captulo II de esta memoria12, y que proporciona una recuperacin del 100 % para el analito de inters. Se oper sobre una alcuota de 0.25 mL de vino, fortificado con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol, en un volumen de 10.0 mL. Cuando se procede al registro de los voltamperogramas de estos extractos, encontramos que, si bien la seal de fondo se reduce apreciablemente, cuando el extracto se fortifica en la celda con mayores concentraciones de trans-resveratrol las seales Ad-SSWV medidas, no responden a dicho aumento de concentracin, probablemente debido a la adsorcin competitiva de otros compuestos del vino en la superficie del electrodo. Entonces se decide someter a este extracto a un procedimiento de limpieza adicional, concretamente se procede a la limpieza del
Galeano-Daz T., Durn-Mers I., Airado-Rodrguez D., Anal. Bioanal. Chem., 2007, 387:1999 2007
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mismo, mediante extraccin en una fase slida de octadecilo (C18). El procedimiento de extraccin en fase slida que se selecciona inicialmente consiste en hacer pasar la muestra por el cartucho previamente acondicionado por paso de 5.0 mL de metanol y 20.0 mL de agua ultrapura. Una vez cargada la muestra en el cartucho, se procede al lavado del mismo por paso de 30 mL de etanol al 10 % en agua y posterior elucin por paso de 3.0 mL de etanol al 50 % en agua. Los 3.0 mL de eluato se transfieren a un matraz de 10.0 mL, y sobre ellos se aade 1.0 mL de etanol (% final de etanol = 25 %), 1.0 mL de HClO4 1M, y agua ultrapura hasta enrase. Sobre esta disolucin es sobre la que se lleva a cabo el conjunto de experiencias que se describen a continuacin, con el objetivo de tener siempre al analito en presencia de la matriz, ya que, al tratarse de un mtodo de adsorcin, es importante que el analito de inters est siempre en presencia de posibles competidores por unirse a la superficie del electrodo. En la Figura 2 se recogen los voltamperogramas correspondientes al extracto resultante de la primera extraccin lquido-lquido, y al extracto limpio mediante extraccin en fase slida. Para realizar las medidas, en primer lugar se lleva a cabo la acumulacin sobre el electrodo a + 0.60 V durante un minuto, y a continuacin se procede al registro de los voltamperogramas, en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 25 Hz, paso de potencial = 10 mV, amplitud de onda cuadrada = 50 mV. Cabe resaltar, no slo la importante reduccin de la seal de fondo que se observa en los voltamperogramas, sino tambin el hecho de que cuando se aade trans-resveratrol al extracto doblemente limpio, se obtiene el esperable aumento de seal, a diferencia de lo que ocurre al fortificar la disolucin obtenida directamente tras el primer procedimiento de limpieza mediante extraccin lquido-lquido.
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7E-006 6E-006
4.4E-006
4.2E-006 5E-006 4E-006 4E-006 3E-006 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9 3.8E-006
Figura 2.- Voltamperogramas correspondientes a las muestras resultantes de la primera extraccin lquidolquido con ter etlico () y de la extraccin adicional en fase slida del extracto sobre C18 ()
No obstante, hay que sealar que estos voltamperogramas se han obtenido llevando a cabo, despus de la etapa de equilibrado (10 s) del electrodo en el medio de deposicin, un cambio de dicho electrodo a un medio conteniendo HClO4 0.10 M y etanol al 10 %. En dicho medio se efecta el registro, en las condiciones instrumentales detalladas anteriormente. Este requisito es necesario puesto que, de otro modo, no se observa seal alguna distinguible de la elevada seal de fondo. Seleccin del porcentaje de etanol en cada medio Una vez demostrada la conveniencia del cambio de medio y elegido inicialmente un procedimiento de limpieza de la muestra, se procede a la optimizacin del porcentaje de etanol en los medios de acumulacin y de registro. Para optimizar el porcentaje de etanol en el medio de acumulacin, se prepara una muestra de la siguiente manera: 0.50 mL de vino fortificado con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol y 5.0 mL de tampn tartrico 0.26 M de pH 5.0, se
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I (A)
I (A)
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llevan a un volumen de 10.0 mL, y se extraen con 5.0 mL de ter etlico por agitacin durante un minuto. Se recoge la fase orgnica a travs de papel de filtro, y se evapora el ter etlico hasta sequedad. El residuo se reconstituye con 0.20 mL de etanol y agua ultrapura hasta un volumen final de 10.0 mL. Esta disolucin se hace pasar a travs de un cartucho C18, previamente acondicionado por paso de 5.0 mL de metanol y 20.0 mL de agua. Una vez cargada la disolucin en el cartucho, se lava ste con 10.0 mL de etanol al 10 %, y se procede a la elucin del trans-resveratrol con 1.0 mL de etanol al 50 %. El eluato se transfiere a un matraz de 10.0 mL, y se aade 1.0 mL de HClO4 1.0 M y agua ultrapura hasta enrase. Al proceder de esta manera, la disolucin final contiene un 5 % de etanol. Se lleva a cabo la acumulacin del trans-resveratrol de esta muestra sobre el electrodo de carbn vitrificado, aplicando a ste un potencial de + 0.60 V durante 1 minuto y dejando transcurrir posteriormente un tiempo de equilibrado de 10 s. Posteriormente se sumerge el electrodo en otra disolucin conteniendo HClO4 0.10 M y 25 % de etanol, en la cual, se registra el voltamperograma de onda cuadrada en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 25 Hz, paso de potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV. A continuacin se repiten las etapas de acumulacin y obtencin de los voltamperogramas, aadiendo de manera sucesiva volmenes de etanol absoluto de 0.5, 1.5, 1.0 y 2.0 mL, en la celda que contiene la disolucin de trans-resveratrol, lo que implica porcentajes de etanol de 9.5, 20.8, 26.9 y 36.7 % en el medio de acumulacin, manteniendo constante la composicin del medio en que se registran los voltamperogramas. En la Figura 3 se representa la variacin de la altura de pico, corregida segn el factor de dilucin en cada caso, con el porcentaje de etanol en el medio de acumulacin. Como se observa en la misma, la altura de pico aumenta ligeramente con el porcentaje de etanol cuando este est por debajo del 10 %,
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cayendo drsticamente para valores mayores. Se fija un porcentaje de etanol del 10 % en el medio de acumulacin para posteriores experiencias.
700 600 I (nA) 500 400 300 0 10 20 % v. Etanol 30 40
Figura 3.- Variacin de la altura de pico con el porcentaje de etanol en el medio de acumulacin
Una vez fijado el porcentaje de etanol en el medio de acumulacin, se procede a la optimizacin de dicha variable en el medio utilizado para el registro de los voltamperogramas. La experiencia se realiza utilizando una muestra de vino fortificada igualmente con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol y sometida al tratamiento de limpieza anteriormente detallado, fijando un porcentaje final de etanol en la disolucin del 10 %. Se lleva a cabo la etapa de acumulacin en todos los casos durante 60 segundos a + 0.60 V, seguida de 10 s de equilibrado. A continuacin se procede al registro de los correspondientes voltamperogramas en presencia de HClO4 0.10 M y de distintos porcentajes de etanol, y en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 25 Hz, paso de potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV. En la Figura 4 se representa la variacin de la altura de pico con el porcentaje de etanol en el medio de medida. Como se observa en la misma, la intensidad de pico se mantiene constante entre el 0 y 10 % de etanol, aumentando ligeramente entre porcentajes de etanol comprendidos entre el 10 y el 25 %, mantenindose para porcentajes de etanol mayores, de manera que se fija un
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porcentaje de etanol del 30 % en el medio de registro, para posteriores experiencias.
500 400 300 200 100 0 0 10 20 30 % v. Etanol 40 50
Figura 4.- Influencia del porcentaje de etanol en el medio de medida
Eleccin de la tcnica de barrido Aunque en las experiencias anteriormente descritas se utiliz voltamperometra de onda cuadrada para efectuar el registro, con el fin de comprobar si efectivamente es la tcnica ms apropiada, se comparan (Figura 5) los voltamperogramas registrados para una misma muestra, previa acumulacin a + 0.60 V durante 60 segundos y cambio de medio, en onda cuadrada (izquierda) y diferencial de pulsos (derecha), as como los correspondientes voltamperogramas corregidos a lnea base, establecida este por el mtodo de la media mvil.
I (nA)
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1.08E-005 1.04E-005 1E-005 I (A) I (A) 9.6E-006 9.2E-006 8.8E-006 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9 3.7E-007 3.65E-007 3.6E-007 3.55E-007 3.5E-007 3.45E-007 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9 2.5E-007 2E-007 Icorregido (A) 1.5E-007 1E-007 5E-008 0 -5E-008
Figura 5.- Voltamperogramas en onda cuadrada () y diferencial de pulsos (), y los correspondientes corregidos a lnea base (), de una misma muestra de vino sometida al tratamiento especificado y fortificada con 24.6 ngmL-1 de trans-resveratrol en la celda
Se observa cmo al trabajar en la tcnica diferencial de pulsos, en el voltamperograma inicial el pico est algo mejor definido que en onda cuadrada, no obstante la sensibilidad se reduce varias veces al trabajar en diferencial de pulsos, como se aprecia fcilmente en los voltamperogramas corregidos a lnea base. Por lo tanto, se elige onda cuadrada para posteriores experimentos. Adems, son varias las ventajas de la voltamperometra de onda cuadrada sobre otras tcnicas electroanalticas, entre las que cabe citar la mayor velocidad de anlisis y la existencia de menos problemas de bloqueo de la superficie del electrodo. Adsorcin sobre el electrodo Se comprueba que la adsorcin del trans-resveratrol sobre el electrodo de carbono vitrificado se dan, en presencia de la matriz del vino, tras los procedimientos de limpieza establecidos, en un rango de potenciales entre -0.60 y +0.60 V, pasando por 0 V, pero que no se produce a circuito abierto, es decir con el potenciostato apagado. Por tanto se procede a estudiar cmo influye el potencial de deposicin, sobre la acumulacin del analito en presencia de la matriz del vino. Sobre el fondo
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de vino preparado como anteriormente se indic, se ensayan diferentes potenciales de acumulacin, manteniendo en todos los casos un tiempo de acumulacin de 60 segundos y un periodo de equilibrado de 10 s, y realizando el registro en HClO4 0.10 M, en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 25 Hz, paso de potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV. Los voltamperogramas registrados en estas condiciones se recogen en la Figura 6.
4.6E-006 4.4E-006 4.2E-006 I (A) 4E-006 3.8E-006 3.6E-006 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9 8E-008 6E-008 4E-008 2E-008 0 -2E-008 I (A)
Circuito Abierto 0V + 0.20 V + 0.40 V + 0.60 V
Figura 6.- Influencia del potencial de acumulacin sobre la adsorcin de trans-resveratrol en presencia de la matriz de vino. Voltamperogramas sin corregir (lnea continua) y corregidos a lnea base, establecida sta con el mtodo de la media mvil (lnea discontinua)
Se selecciona para posteriores experiencias un potencial de acumulacin de + 0.60 V, dado que, como se observa en la Figura 6, es el valor que proporciona mayores intensidades de pico, medidas sobre el voltamperograma corregido a lnea base, la cual se establece segn el mtodo de la media mvil. En ltimo lugar, se comprueba con un patrn conteniendo 90 ngmL-1 de trans-resveratrol en HClO4 0.10 M, cmo la adsorcin del analito al electrodo aumenta segn lo hace el tiempo de acumulacin, cuando este se vara entre 10 y 120 segundos (Figura 7). No obstante, este parmetro se optimizar posteriormente para el rango de concentraciones en que se establece la recta de calibrado y en presencia de la matriz del vino, ya que los compuestos presentes en
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dicha matriz pueden interferir en la adsorcin del analito de inters sobre la superficie del electrodo, siendo necesarios tiempos mayores o menores, en presencia de la matriz.
1.2E-005 1.1E-005 1E-005 I (A) 9E-006 8E-006 7E-006 6E-006 0.5 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9 4E-008 0 -4E-008 1.6E-007 1.2E-007 Icorregido (A) 8E-008 0s 10 s 60 s 120 s
Figura 7.- Influencia del tiempo de acumulacin sobre 90 ngmL-1 de transresveratrol
Optimizacin de las variables instrumentales Se ha decidido llevar a cabo la optimizacin de las variables instrumentales que influyen sobre los voltamperogramas de onda cuadrada, utilizando para ello una muestra conteniendo trans-resveratrol en presencia de la matriz del vino, sometida al tratamiento descrito en apartados anteriores y que consiste en la extraccin con ter etlico de una fase acuosa conteniendo 2.5 % de vino (fortificado con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol), aislamiento de la fase orgnica y evaporacin a sequedad del disolvente, reconstitucin del residuo y posterior limpieza de este extracto mediante extraccin en fase slida de octadecilo, disponiendo el eluato en un volumen final de 10.0 mL, en presencia de HClO4 0.10 M y 10 % de etanol. Se procede a analizar la muestra final mediante voltamperometra de redisolucin adsortiva de onda cuadrada (Ad-SSWV). La etapa de acumulacin se
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lleva a cabo en todos los casos durante un periodo de tiempo de 60 segundos, durante los cuales se est aplicando un potencial de + 0.60 V. Transcurrido este tiempo, y el periodo de equilibrado de 10 s, se procede a cambiar la celda en la cual se encuentra la disolucin inicial por otra celda que contiene el medio de medida, cuya composicin es etanol al 30 % en agua, en presencia de una concentracin de 0.1 M de HClO4, y se efecta el registro mediante voltamperometra de onda cuadrada. La influencia de la frecuencia se ha estudiado variando la misma entre 25 y 150 Hz, manteniendo constantes el resto de variables instrumentales, en los siguientes valores: Eac = + 0.6 V, tac = 60 s, teq = 10 s, paso de potencial = 10 mV, amplitud = 50 mV. La variacin de la intensidad de pico con la frecuencia se recoge en la Figura 8. Como puede observarse en la misma, los valores de intensidad de pico obtenidos aumentan linealmente a medida que lo hace la frecuencia. De entre los valores de frecuencia que mayor Ip proporcionan, se ha elegido 65 Hz como el ms apropiado, ya que se obtienen picos con una mejor fisonoma.
300
200 Ip (nA) 100 0 0 40 80 120 Frecuencia (Hz) 160
Figura 8.- Variacin de la intensidad de pico con la frecuencia
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Otro parmetro que se ha optimizado para la determinacin de transresveratrol mediante Ad-SSWV, ha sido el paso de potencial. Para ello se han registrado los voltamperogramas de la muestra con diferentes valores de paso de potencial, comprendidos entre 4 y 20 mV, manteniendo constantes el resto de condiciones instrumentales: Eac = + 0.6 V, tac = 60 s, teq= 10 s, frecuencia = 65 Hz, amplitud = 50 mV.
6E-007 4E-007 I (A) 2E-007 0 -2E-007 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9
Figura 9.- Voltamperogramas registrados a valores de paso de potencial de 2 mV ( ), 6 mV (), 10 mV () y 14 mV ()
Como resultado de esta experiencia se observa que Ip aumenta proporcionalmente con el paso de potencial, alcanzndose los valores mximos de Ip para los mximos de esta variable. Sin embargo, se ha considerado como valor de paso de potencial ptimo para los estudios siguientes 10 mV, ya que nos permite conseguir una sensibilidad suficientemente elevada con una buena definicin del pico. Por ltimo, para llevar a cabo el estudio de la influencia de la amplitud de onda cuadrada, se han registrado los voltamperogramas de la muestra variando los valores de amplitud entre 20 y 100 mV y manteniendo constante el resto de
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condiciones instrumentales: Eac = +0.6 V, tac = 60 s, teq = 10 s, frecuencia = 65 Hz, paso de potencial = 10 mV. Se mide en los voltamperogramas corregidos a lnea base los valores de Ip y se obtiene un aumento progresivo a medida que aumenta la amplitud, hasta alcanzar un mximo en 60 mV, a partir del cual se produce una disminucin de Ip (Tabla 1). Se ha seleccionado 60 mV como valor de amplitud ms apropiado para estudios posteriores.
Tabla 1.- Variacin de la intensidad de pico con la amplitud de onda cuadrada
Amplitud (mV) Intensidad de pico (nA) 20 40 60 80 135 175 221 160
Optimizacin del tratamiento de muestra Como ya se ha explicado, para llevar a cabo el anlisis de trans-resveratrol en muestras de vino, es necesario someter a las mismas a un proceso de limpieza bastante exhaustivo. En el Captulo 1 se describe el proceso de extraccin lquidolquido optimizado para la separacin del trans-resveratrol en muestras de vino, el cual proporciona recuperaciones del 100% de dicho compuesto. Este tratamiento consiste esencialmente en extraer durante 1 minuto muestras diluidas de vino con ter etlico, utilizando una relacin de fases 2:1, fase acuosa:fase orgnica, y ajustando el pH de la fase acuosa a 5.0 con un tampn tartrato monocido de sodio/tartrato disdico. Se asla la fase etrea, se evapora a sequedad y el residuo
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se redisuelve con 4.0 mL de etanol absoluto y se aade agua ultrapura hasta completar 10.0 mL. No obstante, para la aplicacin de tcnicas electroqumicas se ha comprobado que este tratamiento no es suficiente, ya que an persisten en la muestras especies que interfieren en la determinacin de resveratrol, probablemente porque afectan al proceso de adsorcin en el electrodo o porque contribuyen a una importante seal de la matriz. Por ello, tras la extraccin lquidolquido con la posterior evaporacin de ter y reconstitucin del residuo, se incluye una etapa de extraccin en fase slida utilizando cartuchos C18, con el fin de eliminar la mayor cantidad de interferentes de dicho residuo sin sufrir la prdida de trans-resveratrol, antes de llevar a cabo la medida electroqumica. En esta ltima etapa, una vez depositada la muestra en el cartucho, se procede a la limpieza y posterior elucin del analito por paso de disoluciones acuosas de etanol de diferente concentracin. El lavado del cartucho tiene como finalidad eluir el mayor nmero de interferencias posible sin dispersar el bolo del analito y, por supuesto, sin eluir parte del mismo. Por otra parte, la elucin del analito debe hacerse de manera completa y de forma que venga acompaado del menor nmero de interferencias posible, esto es, eluir exactamente la banda conteniendo el analito. En nuestro caso, la eleccin de la composicin de las mezclas etanol-agua utilizadas en las etapas de lavado y de elucin est basada en una serie de estudios previos llevados a cabo mediante espectrofotometra de fluorescencia y se fija en 10 % y 50% de etanol, respectivamente. La eleccin de los volmenes de lavado y elucin es una etapa crtica, de la cual depender el grado de limpieza del extracto obtenido, as como la recuperacin del analito, as, un volumen de elucin superior al ptimo, generara eluatos no lo suficientemente limpios, y un volumen inferior al ptimo, implicara recuperaciones inferiores al 100 %.
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A la vista del proceso de limpieza que hay que llevar a cabo, se deduce que las variables a optimizar son las siguientes: porcentaje de vino en la fase acuosa a extraer con ter y relacin de fases, en la extraccin lquido-lquido, as como el volumen de lavado y volumen de elucin en la etapa de extraccin en fase slida. Se procede entonces a la optimizacin de estas variables, con ayuda del diseo experimental y la metodologa de la superficie de respuesta. Concretamente, se elije un diseo de experimentos de Box-Behnken, generndose la secuencia de experimentos que se resume en la Tabla 2. Para llevar a cabo este conjunto de experiencias, se parte de una muestra de vino fortificada con transresveratrol, en una concentracin aadida de 2.0 gmL-1.
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Tabla 2.- Experimentos realizados para la optimizacin del procedimiento de tratamiento de muestra (diseo Box-Behnken)
Relacin de Fases (A/O) Cube001a Cube002a Cube003a Cube004a Cube005a Cube006a Cube007a Cube008a Cube009a Cube010a Cube011a Cube012a Cube013a Cube014a Cube015a Cube016a Cube017a Cube018a Cube019a Cube020a Cube021a Cube022a Cube023a Cube024a Cent-a Cent-b Cent-c 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
% Vino 5 5 40 40 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 5 40 5 40 5 40 5 40 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5
Volumen de Lavado (mL) 27,5 27,5 27,5 27,5 5 5 50 50 27,5 27,5 27,5 27,5 5 5 50 50 27,5 27,5 27,5 27,5 5 50 5 50 27,5 27,5 27,5
Volumen de Elucin (mL) 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 5 5 3 3 3 3 1 1 5 5 1 1 5 5 3 3 3
En todas las experiencias, el volumen de ter etlico se mantiene fijo en 5.0 mL, de manera que los volmenes de fase acuosa y de vino contenido en la misma vendrn dados por el valor de la relacin de fases y de porcentaje de vino, respectivamente, en cada punto del diseo. En todos los casos, una vez realizada la extraccin, se espera hasta separacin total de ambas fases, recogindose a travs de papel de filtro la fase orgnica completamente seca. Esta fase orgnica se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente, y el residuo se
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redisuelve con 0.20 mL de etanol absoluto, se completa con agua hasta un volumen final de 10.0 mL, y la disolucin resultante se hace pasar a travs de un cartucho de extraccin en fase slida C18, previamente acondicionado por paso de 5.0 mL de metanol y 20 mL de agua ultrapura. Una vez cargada la muestra en el cartucho, se procede a su lavado y elucin, por paso sucesivo de los volmenes de sendas disoluciones acuosas de etanol al 10 y 50 %, respectivamente, que marque el diseo. Se emplea como funcin de respuesta la intensidad del pico obtenido en cada caso. La optimizacin del modelo se llev a cabo con el paquete de software The Unscrambler13, y los resultados fueron interpretados mediante la Metodologa de la Superficie de Respuesta (RSM). En el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA), se asume un modelo cuadrtico de segundo grado (model check quadratic, p-value (95 %) = 0.3576). Se comprueba que el nico efecto que contribuye significativamente al modelo, asumiendo un nivel de confianza del 95 %, es el porcentaje de vino en la fase acuosa (p-value (95 %) = 0.0005), resultando no significativas el resto de las variables estudiadas, as como todas las posibles interacciones entre ellas. Las superficies de respuesta correspondientes a algunas parejas de las variables estudiadas se representan en la Figura 10.
13
Unscrambler v.6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim,Norway
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Figura 10.- Superficies de respuesta para algunas parejas de las variables estudiadas
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Sin embargo, en el diseo realizado, se ve que la influencia del porcentaje de vino es tan grande, que pensamos que esta variable puede desvirtuar los resultados relativos a la influencia de las restantes. Adems, en la tabla de experimentos, puede verse que slo hay 6 puntos del diseo con un valor de 5 % para el porcentaje de vino, pasando al siguiente nivel que es del 22.5 %, un valor muy elevado, que dificulta la medida de los voltamperogramas resultantes. Por ello se procede a comprobar dichos resultados, mediante una serie de experiencias adicionales, de optimizacin secuencial de variables. Para llevar a cabo las siguientes experiencias, se parte del mismo vino inicial fortificado con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol, y el tratamiento general de la muestra es el anteriormente descrito, variando cada una de las variables a optimizar en tanto se mantienen los valores del resto de variables, como se indica en cada caso. En primer lugar, se vara el porcentaje de vino en la fase acuosa entre 5 y 20 %, manteniendo una relacin de fases acuosa/orgnica 2:1 y los volmenes de lavado y elucin en 10.0 y 3.0 mL, respectivamente. A la vista de los voltamperogramas obtenidos para cada uno de los valores de porcentaje de vino ensayados (Figura 11), se observa que la sensibilidad, en trminos relativos a la concentracin en la muestra inicial, es aproximadamente la misma al 5 y al 10 %, ya que cuando se aumenta al doble el porcentaje de vino, se obtiene prcticamente la mitad de la seal. No obstante se fija un 5 % de vino para posteriores experiencias, ya que la seal se encuentra mejor definida.
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1.7E-005 1.6E-005 1.5E-005 I (A) I (A) 1.4E-005 1.3E-005 1.2E-005 0.5 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9
1.36E-005 1.34E-005 1.32E-005 1.3E-005 1.28E-005 0.65 0.7 0.75 E (V) 0.8 0.85
Figura 11.- Influencia del porcentaje de vino en la muestra inicial. A la derecha se muestra una ampliacin de la zona sealada. Valores de porcentaje de vino ensayados: 5 % (), 10 % () y 20 % ()
Fijado el 5 % de vino en la fase acuosa, se procede a examinar de nuevo la influencia del volumen de disolucin utilizado en el lavado. Para ello, se preparan muestras conteniendo 0.5 mL de vino, 5 mL de tampn tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.26 M, de pH 5.0 y agua hasta 10 mL. Se extraen con 5 mL de ter etlico, se separa el extracto orgnico y se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente. El residuo resultante se reconstituye con 0.2 mL de etanol y agua hasta completar 10.0 mL y se pasa a travs de un cartucho C18, lavndose con volmenes de 5.0, 10.0 y 20.0 mL de disolucin acuosa de etanol al 10 %, y a continuacin se procede a la elucin del analito contenido en los cartuchos, por paso de 3.0 mL de disolucin acuosa de etanol al 50 %. Los voltamperogramas registrados se recogen en la Figura 12. Se aprecia que, efectivamente, la influencia de esta variable no es muy importante, fijndose para posteriores experiencias un lavado con 10 mL de disolucin de etanol al 10 %.
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1.45E-005 1.4E-005 1.35E-005 I (A) 1.3E-005 1.25E-005 1.2E-005 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9
Figura 12.- Influencia del volumen de lavado. Valores ensayados: 5 mL (), 10 mL () y 20 mL ()
Una vez seleccionado el volumen de lavado del cartucho, se procede a revisar la influencia del volumen de disolucin acuosa de etanol al 50 %, utilizado para llevar a cabo la elucin del analito. La elucin del analito del cartucho se debe realizar con el menor volumen posible de eluyente, o lo que es lo mismo, con el volumen de eluyente necesario para eluir justamente la banda conteniendo la totalidad del analito, pero no ms de dicha banda, ya que se corre el riesgo de arrastrar interferencias indeseables. Al ensayar eluyentes con diferentes porcentajes de etanol, los mejores resultados se obtienen con el 50 % de etanol y se ensayan volmenes de 1.0, 3.0 y 5.0 mL de esta disolucin para efectuar la elucin.
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1.45E-005 1.4E-005 1.35E-005 I (A) 1.3E-005 1.25E-005 1.2E-005 1.15E-005 0.6 0.7 E (V) 0.8 0.9
Figura 13.- Influencia del volumen de elucin. Valores ensayados: 1 mL (), 3 mL () y 5 mL ()
A la vista de los voltamperogramas recogidos en la Figura 13, se aprecia que no mejora significativamente la seal al utilizar mayores volmenes de disolucin en esta etapa y, por tanto, se decide utilizar 1 mL de etanol al 50 % para eluir el trans-resveratrol de los cartuchos C18. Parmetros analticos de calidad Una vez optimizadas las variables qumicas e instrumentales implicadas en el presente mtodo analtico, se procede a estudiar la linealidad entre seal analtica medida (intensidad de pico) y concentracin de trans-resveratrol puesta. No obstante, al tratarse de un mtodo de redisolucin queda un ltimo parmetro a optimizar antes del establecimiento de los parmetros analticos de calidad, que es el tiempo de acumulacin adecuado para alcanzar mxima sensibilidad, sin que se produzca la saturacin de la superficie del electrodo, y por tanto la prdida de linealidad. Por tanto, se lleva a cabo el estudio de la influencia de esta variable a distintos niveles de concentracin de trans-resveratrol, en
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presencia siempre de la matriz del vino, sometida al tratamiento anteriormente optimizado. Esta matriz de vino se dispone en las condiciones de medida, y sobre ella se van haciendo adiciones sucesivas de pequeos volmenes de una disolucin de trans-resveratrol, registrando los voltamperogramas correspondientes a los tiempos de acumulacin ensayados en cada caso. En la Figura 14 se representa la variacin de la intensidad de pico con el tiempo de acumulacin, a los distintos niveles de concentracin estudiados. Como se observa, la intensidad del pico crece en todos los casos con el tiempo de acumulacin, hasta cierto valor, a partir del cual se mantiene o incluso empieza a caer ligeramente. Se selecciona un tiempo de acumulacin de 30 segundos para posteriores experiencias, ya que como se ve en la Figura 14, para dicho tiempo de acumulacin la intensidad an sigue creciendo al aumentar tac, es decir el electrodo no llega a saturarse en el rango de concentracin examinado.
500 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80 Tiempo de acumulacin (s) 100 12.3 ppb 24.6 ppb 36.9 ppb 49.2 ppb 61.5 ppb
Figura 14.- Influencia del tiempo de acumulacin, en presencia de la matriz de vino
En estas condiciones, se preparan patrones de trans-resveratrol en medio HClO4 0.10 M y 10 % de etanol, y se encuentra una relacin lineal entre concentracin de trans-resveratrol puesta y intensidad del pico medida, en un rango de concentraciones de 5.0 a 35.0 ngmL-1 de trans-resveratrol. Los
I (nA)
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parmetros analticos de calidad correspondientes al calibrado se reflejan en la Tabla 3.

Tabla 3.- Parmetros analticos de calidad en la determinacin mediante Ad-SSWV de trans-resveratrol
Rango Lineal (ngmL-1) Ordenada en el Origen (a sa) Pendiente (b sb) (mLng -1) Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x) Coeficiente de Correlacin (r) Coeficiente de Determinacin (r2) % Linealidad Resolucin analtica (-1) (ngmL-1) LDD, Long y Winefordner14 (ngmL-1) LDD, Clayton15 (==0.05) (ngmL-1)
5.0 35.0 -7.67 0.93 10.76 0.42 14.35 0.994 0.988 96.08 1.33 2.58 4.18
Es de resaltar los bajos lmites de deteccin, en el orden de las partes por billn, alcanzados, que permitiran detectar concentraciones en el vino del orden de algunas decenas de ngmL-1, de acuerdo al procedimiento propuesto. Anlisis de trans-resveratrol en muestras de vino A la hora de aplicar el mtodo al anlisis de muestras reales, es importante deducir si existe o no efecto de matriz, y en caso positivo, determinar en qu momento se da este efecto, si en la etapa de preparacin de la muestra, en cuyo caso es necesario determinar el porcentaje de recuperacin a distintos niveles de concentracin, o bien en la de medida electroqumica.
14 15
Long G.L., Winefordner J.D., Anal. Chem., 1983, 55:712-724 Clayton C.A., Hines J.W., Elkins P.D., Anal. Chem., 1987, 59:2506-2514
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En primer lugar, para ver si existe efecto matriz en la etapa de determinacin, se prepara una mezcla representativa de vinos, con una serie de muestras comerciales, y sobre una alcuota de dicha mezcla se lleva a cabo todo el procedimiento de tratamiento de la muestra anteriormente optimizado. El extracto final se lleva a un matraz de 10.0 mL, se fija un porcentaje de etanol del 10 % y una concentracin de HClO4 de 0.1 M, y se aade agua ultrapura hasta enrase. Esta disolucin se dispone en la celda electroqumica y se lleva a cabo una adicin patrn de trans-resveratrol, por adicin sucesiva de pequeos volmenes de una disolucin concentrada en la misma celda. En la Figura 15, se representan algunos de los voltamperogramas registrados, una vez corregidos a lnea base, para las adiciones realizadas.
2E-007 1.5E-007 1E-007 I (A) 5E-008 0 -5E-008 0.65 0.7 0.75 0.8 E (V) 0.85 0.9
Figura 15.- Adicin Patrn en la celda electroqumica a una mezcla de vinos tintos comerciales. Concentraciones aadidas en la celda: 0.0, 5.04, 10.1 y 20.1 ngmL-1
Se construye la correspondiente recta de adicin patrn, representando las intensidades de pico medidas frente a la concentracin de analito aadida. En la Figura 16 se encuentran representada dicha recta de adicin patrn, junto con la recta de calibrado de patrones externos anteriormente establecida, deducindose a la vista de las mismas, que existe un importante efecto de matriz, y que por tanto ser necesario llevar a cabo el anlisis mediante adicin patrn. Se observa que el
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efecto de matriz es negativo, debido probablemente a la adsorcin de manera competitiva de otros componentes del vino en la superficie del electrodo.
400 300 Ip (nA) 200 100 0 0 10 20 30 [trans-resveratrol] (ngmL-1) 40
Figura 16.- Recta de calibrado de patrones externos (negra) y de adicin patrn en la celda (azul) de transresveratrol
Por otro lado, con el objetivo de calcular el porcentaje de recuperacin se lleva a cabo una adicin patrn sobre muestras independientes, antes de someterlas al proceso de limpieza. La experiencia se lleva a cabo sobre dos muestras distintas, una mezcla de vinos de la D.O. Rioja y un vino tinto de mesa. En cada caso se calcula el porcentaje de recuperacin como el cociente entre las pendientes de las rectas obtenidas al practicar la adicin patrn en la celda (6.78) y las obtenidas en cada caso al realizar la adicin patrn antes de tratar las muestras (6.67 y 6.88 para los vinos de Rioja y el tinto de mesa, respectivamente), resultando ser 101.6 y 98.5 %, para los vinos de Rioja y el tinto de mesa, respectivamente. En ambos casos, el porcentaje de recuperacin es muy cercano al 100 %. Este hecho supone una importante ganancia en sencillez y rapidez para el mtodo analtico, ya que, si bien el anlisis tiene que ser llevado a cabo mediante el mtodo de adicin patrn, dichas adiciones pueden ser hechas en la celda de
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medida sobre muestras preparadas para cada vino, evitando as tener que realizar el tratamiento de la muestra tantas veces como adiciones se practiquen. Resumiendo, a partir de los resultados anteriormente descritos se propone el siguiente procedimiento para el anlisis de trans-resveratrol en vino tinto, mediante Ad-SSWV: Se toman 0.50 mL de vino, sobre los que se adicionan 5.0 mL de tampn tartrico 0.26 M de pH 5.0 y agua ultrapura hasta completar aproximadamente 10 mL. Esta disolucin acuosa se extrae con ter etlico por agitacin durante 60 segundos. Ambas fases se dejan en contacto hasta su completa separacin. La fase inferior, acuosa, se desecha, y la fase orgnica se recoge en un matraz de bola sobre papel de filtro. Esta fase etrea se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente. El residuo se redisuelve con 0.20 mL de etanol absoluto, y agua hasta aproximadamente 10 mL. Esta disolucin se hace pasar a travs de un cartucho C18, previamente acondicionado por paso de 5.0 mL de metanol y 20.0 mL de agua. Una vez cargada la muestra en el cartucho, se procede al lavado de ste con 10.0 mL de etanol al 10 %. Finalmente se eluye el trans-resveratrol por paso de 1.0 mL de etanol al 50 %. Sobre el eluato se aade 1.0 mL de HClO4 1.0 M, 0.50 mL de etanol absoluto (para fijar el 10 % de etanol en el medio final) y agua ultrapura hasta completar 10.0 mL. Esta disolucin se transfiere a la celda electroqumica, y se procede a la acumulacin del analito sobre el electrodo, previamente limpiado por frotamiento durante un minuto en dimetilformamida y otro minuto en agua, durante 60 segundos a + 0.60 V. Una vez finalizada la etapa de acumulacin se deja transcurrir un tiempo de equilibrado de 10 s y se cambia la celda conteniendo la muestra por otra celda conteniendo el medio de registro, compuesto por HClO4 0.1 M y etanol al 30 %. Se sumergen los electrodos en el medio de registro y se obtiene el voltamperograma de onda cuadrada entre +0.60 y +0.90 V, en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 65 Hz, paso de potencial = 10 mV y amplitud 60 mV. Posteriormente,
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se realizan adiciones sucesivas de analito sobre la celda, obtenindose los voltamperogramas que nos permiten realizar el calibrado por el mtodo de adicin patrn. En estas condiciones, se procede llevar a cabo el anlisis de transresveratrol en una serie de muestras. Concretamente se analizan tres mezclas diferentes de vinos de la D.O. Rioja, en los cuales se han agrupado un total de 21 muestras en vinos agrupados segn sean jvenes, de crianza o de reserva. Adems se analiza otra mezcla de vinos de la misma D.O., que agrupa a vinos de distintas edades, y por ltimo un vino tinto de mesa de menor calidad. Estos anlisis han sido validados por HPLC, segn el mtodo descrito en el captulo V de esta memoria16. Segn este mtodo la elucin de las muestras se lleva a cabo a 0.9 mLmin-1 con una mezcla acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v. No se ha incorporado el fotorreactor al sistema cromatogrfico, ya que seleccionando una de 306 nm en el detector fotomtrico se observa un pico totalmente resuelto para trans-resveratrol. La calibracin se ha llevado a cabo por adicin patrn, inyectando una muestra de cada vino diluida 2.5 veces con agua ultrapura, sobre la que se realizan adiciones de 50, 100 y 200 ngmL-1, lo que equivale a 125, 250 y 500 ngmL-1 en vino. En la Tabla 4 se recogen los resultados encontrados con el mtodo voltamperomtrico y los encontrados en la etapa de validacin.
16
Durn-Mers I., Galeano-Daz T., Airado-Rodrguez A., Food Chem., 2008, 109:825-833
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Tabla 4.- Concentraciones de trans-resveratrol encontradas en vinos mediante Ad-SSWV
[trans-Resveratrol] (gmL-1) VOLTAMPEROMETRA Mezcla rioja jvenes Mezcla rioja crianza Mezcla rioja reserva Mezcla rioja tinto de mesa 0.20 0.07 0.19 0.05 0.16 0.03 0.24 0.01 0.13 0.05 HPLC 0.19 0.06 0.20 0.05 0.17 0.06 0.23 0.04 0.16 0.05
Seguimiento cromatogrfico de las etapas de Limpieza Con el objetivo de comprobar la efectividad de los procesos de limpieza de la muestra, se inyectan en el sistema cromatogrfico alcuotas de la misma, en distintos momentos de dicho proceso. Las condiciones en las que se eluyen estas muestras son las similares a las empleadas en la validacin del mtodo. El eluato se monitoriza en todo momento fotomtricamente a 306 nm, as como fluorimtricamente a exc/em 260/361 nm. En ambos detectores se observan resultados similares y en la Figura 17 se muestran los cromatogramas obtenidos en el detector fluorimtrico. Como puede apreciarse en el cromatograma de la muestra inicial se observa una interferencia importante co-eluyendo con el resveratrol. Esta interferencia, junto con otros compuestos se elimina totalmente en la etapa de extraccin lquido-lquido, mientras que la extraccin slido-lquido posterior hace desaparecer los picos ms cercanos al frente del disolvente. La recuperacin final del trans-resveratrol, segn esta experiencia es en torno al 85 % de trans-
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resveratrol, si bien no se han efectuado rplicas para obtener un valor medio ms fiable.
80
I. F. (exc/em 260/364 nm)
60
40
20 0 4 8 t (minutos) 12 16 20
Figura 17.- Perfiles fluorescentes a exc/em 260 / 364 nm, correspondientes a la disolucin original de 0.50 mL de vino en 10.0 mL (); la fase acuosa una vez extrada con ter etlico (); el residuo seco de la fase etrea reconstituido (); las aguas madre resultado de pasar el extracto reconstituido por el cartucho C18 (); las aguas de lavado del cartucho (); y el eluato ()
Perspectivas de futuro. Se ha comprobado que tanto trans-resveratrol como su glucsido transpiceido no son electroactivos en reducciones sobre el electrodo de gotas de mercurio (MDE), no obstante, la irradiacin de sus disoluciones con luz ultravioleta proveniente de una lmpara de mercurio de alta presin, induce la generacin de grupos electrforos, haciendo que los fotoproductos de ambos analitos presenten importantes ondas de reduccin. Se estudia la influencia del tiempo de irradiacin tanto en el caso de transresveratrol, como en el caso de trans-piceido, y se observa una evolucin de los polarogramas con el tiempo de irradiacin que se muestra en la Figura 18.
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0 Resveratol -1E-008 I (A) Fondo 0s 60 s 120 s 150 s 180 s
0 Piceido -4E-009 I (A) Fondo 0s 90 s 150 s 300 s 600 s
-2E-008
-8E-009
-3E-008 -0.9 -0.8 E (V) -0.7 -0.6
-1.2E-008 -0.9 -0.8 E (V) -0.7 -0.6
Figura 18.- Evolucin de los polarogramas de resveratrol y piceido (9 gmL-1) con el tiempo de irradiacin
Nos parece interesante continuar con estos estudios, con el objetivo de llegar a proponer un mtodo de anlisis de resveratrol en vino ms selectivo, que evite la necesidad de realizar un tratamiento previo de la muestra tan complejo.
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CONCLUSIONES
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1.- Se han estudiado las propiedades espectroscpicas de inters analtico de resveratrol y su 3--glucsido, piceido, los cuales se presentan en dos formas ismeras cis y trans. Estos derivados se han caracterizado fotomtrica y fluorimtricamente en distintos medios de trabajo, concluyndose que las mejores seales se obtienen en medios hidroalcohlicos. Se han aportado valores de pKa de 8.2 y 9.7 para trans-resveratrol, y un valor de pKa de 9.6 para trans-piceido, en medio acuoso, calculados mediante fotometra. 2.- La irradiacin UV de resveratrol y piceido origina fotorreacciones, en las que los fotoproductos generados son ms fluorescentes que los analitos de partida. En base a estas fotorreacciones se han propuesto sendos mtodos espectrofluorimtricos de segunda derivada, para la determinacin de dichos analitos en muestras de vino, previa extraccin lquido-lquido de las mismas. 3.- Se ha desarrollado un mtodo mediante cromatografa de lquidos para la determinacin de las cantidades totales (trans + cis) de resveratrol y piceido a travs de sus fotoproductos, en muestras de vino, previa irradiacin de las mismas. En dicho mtodo se utiliza elucin isocrtica y deteccin fluorescente. Se obtiene una buena resolucin para los picos de inters, y la principal ventaja de dicho mtodo es su elevada sensibilidad. 4.- La fotorreaccin que sufren estos compuestos, se ha acoplado con la cromatografa de lquidos, diseando un sistema de LC con fotoderivatizacin postcolumna en lnea. La incorporacin de un fotorreactor antes de la entrada al detector de fluorescencia, permite llevar a cabo de manera muy sensible el anlisis de los dos ismeros de resveratrol y piceido en el vino. Se obtiene una buena resolucin para los cuatro analitos en modo isocrtico.
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5.- Se han estudiado las seales de fluorescencia total, obtenidas en modo frontface, proporcionadas por muestras de vino, sin tratamiento previo de las mismas. La descomposicin de las matrices de excitacin emisin de fluorescencia se ha efectuado mediante PARAFAC. Por combinacin de los resultados obtenidos mediante fluorescencia con las medidas realizadas sobre patrones y ensayos de cromatografa lquida, se ha alcanzado un mejor conocimiento de la poblacin de compuestos fluorescentes presentes en el vino. Se demuestra tambin la potencia de dichas seales, en combinacin con mtodos quimiomtricos de anlisis multivariante, en concreto Anlisis por Componentes Principales (PCA), con fines clasificatorios, atendiendo a variables tales como el origen de la muestra, el tipo de uva o la pertenencia a una denominacin de origen. 6.- El estudio del comportamiento voltamperomtrico de trans-resveratrol en el electrodo de carbn vitrificado, pone de manifiesto su oxidacin, as como su adsorcin a la superficie del electrodo. Se ha propuesto un mtodo de redisolucin adsortiva en onda cuadrada para la determinacin de trans-resveratrol en vino, previa extraccin lquido-lquido de las muestras y limpieza de los extractos mediante extraccin en fase slida sobre con cartuchos C18.
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ANEXO ARTCULOS RESULTANTES DE ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIN
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Anal Bioanal Chem (2007) 387:19992007 DOI 10.1007/s00216-006-1007-z
ORIGINAL PAPER
Determination of resveratrol in wine by photochemically induced second-derivative fluorescence coupled with liquidliquid extraction
T. Galeano Daz & I. Durn Mers & D. Airado Rodrguez
Received: 29 September 2006 / Accepted: 8 November 2006 / Published online: 20 December 2006 # Springer-Verlag 2006
Abstract Basic studies on the photochemical behaviour of trans-resveratrol and its photoproduct are reported. Photometrically and fluorimetrically calculated acidity constants of the former were determined. The usefulness of the determination of resveratrol by photochemically induced fluorescence and second-derivative photochemically induced fluorescence was also examined. The very weakly fluorescent trans-resveratrol is converted into a highly fluorescent photoproduct by irradiating hydroethanolic solutions of trans-resveratrol containing 40% v/v of ethanol for 60 s with intense UV radiation. The photoproduct presents excitation and emission maxima centred at 260 nm, and 364 and 382 nm, respectively. Under these conditions, a linear relationship between fluorescence intensity and trans-resveratrol concentration was found between 6.6 and 66 ng mL1. Optimum conditions for the extraction of trans-resveratrol from an aqueous phase at pH 5.0 with diethylether were a phase ratio (aqueous/organic) of 2, a shaking time of 60 s and a buffer concentration of 0.15 mol L1. An extraction recovery of 100% was reached under these conditions. The optimized extraction procedure was applied to the analysis of resveratrol in wine samples, employing the amplitude between 356 and 364 nm of the second-derivative photoinduced emission spectrum as analytical signal. It was found that there is not matrix effect and recoveries around 100% were obtained at different fortification levels. Keywords Photochemically induced fluorescence . Second-derivative . Liquidliquid extraction . Resveratrol . Wine
T. Galeano Daz : I. Durn Mers (*) : D. Airado Rodrguez Department of Analytical Chemistry, University of Extremadura, 06071 Badajoz, Spain e-mail: iduran@unex.es
Introduction Resveratrol (3,4,5-trihydroxystilbene, Scheme 1) is a stilbene produced by plants in response to fungal infection or abiotic stresses, e.g. produced by heavy metal ions. Resveratrol occurs in mulberries, peanuts and grapes. Grapes contain a large amount of different phenolic compounds in skins, pulp and seeds, that are partially extracted during winemaking [1]. The determination of phenolic compounds in wine is very important since this group of substances are responsible for several sensorial characteristics such as colour, flavour, astringency and hardness of wine. There is a broad range in the concentration of resveratrol in different wines. Intervals from 660 to less than 0.68 g mL1, and from 100 to less than 0.23 g mL1, within red and white wines, respectively, have been reported [2]; the higher concentrations in red wines are partially due to the winemaking process but also they depend on the grape variety, environmental factors in the vineyard and wine processing techniques [3]. trans-Resveratrol has been suggested as a cause for reduced mortality from coronary heart disease in wine drinkers. Numerous studies describe potential mechanisms by which trans-resveratrol could reduce heart disease, inhibiting platelet aggregation [47] and low density lipoprotein oxidation [8] and protecting the liver from lipid peroxidation [9]. trans-Resveratrol has received attention in recent years owing to its capacity to protect against global cerebral ischemic injury and to ameliorate oxidative damage; it can also inhibit cellular events associated with tumour initiation, promotion and progression [10]. Intense UV irradiation of alcoholic solutions of transresveratrol first induces isomerization into cis-resveratrol and then leads to the formation of an unidentified, highly fluorescent compound [11].
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2000 Scheme 1 Chemical structures of trans-resveratrol (a) and cis-resveratrol (b)

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a
Separation techniques such as liquid chromatography (LC) or capillary electrophoresis (CE) have been widely exploited for the analysis of trans-resveratrol [12, 13] in a variety of food samples, but no spectroscopic methods have been published so far. In recent years, reversed-phase highperformance liquid chromatography (RP-HPLC) by acidic solvent gradient elution, has been the most commonly used procedure for the determination of trans-resveratrol in wine, either with diode array detection (DAD) [1418], fluorimetric detection [19, 20], DAD-fluorimetric detection [21, 22], chemiluminiscent detection [23, 24], electrochemical detection [25] or with mass spectrometry (MS) [2628] and DAD-MS [29, 30]. The detections based on electrochemistry, luminiscence and MS offer higher sensitivity than DAD. Gas chromatography tandem MS, with previous derivatization, normally with bis-[trimethylsilyl]-trifluoroacetamide (BSTFA), before column application [31], and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with UV detection [32], capillary zone electrophoresis (CZE), with DAD [33, 34] or electrochemical detection [35, 36], or nonaqueous CZE with DAD [37] have also been employed for the analysis of this compound. Lowest reported limits of detection (S/N=3) are in the order of ppb [16, 1922, 24, 25, 30] and the best one, 0.166 g/L, was reached by using chemiluminiscent detection [23]. The present paper reports basic spectral studies on resveratrol. Moreover, the photochemical behaviour of resveratrol has been exploited for an analytical goal for the first time, and a new, fast, simple and sensitive method for its determination in wine samples by second-derivative emission spectra of the photochemically produced fluorescent product (2D-RTPF), coupled with liquidliquid extraction, has been developed.
b
trans-Resveratrol was obtained from Sigma and used as received. A 50.0 g mL1 stock solution was prepared in a 50.0-mL, coloured volumetric flask by dissolving the suitable amount of the commercial product and diluting to the mark with absolute ethanol. This solution was stored at 4 C, avoiding exposure to direct light. Fresh solutions of lower concentrations were prepared by appropriate dilution of the stock solution with absolute ethanol and water. Buffer solution of sodium hydrogen tartrate/disodium tartrate (total concentration 0.26 mol L1) was prepared by dissolving the suitable amount of disodium tartrate dihydrate in water and adjusting the pH of the resulting solution to 5.0 with small volumes (in the order of microlitres) of diluted hydrochloric acid. Wine samples Several samples of young red wines, barrel-aged red wines and white wines were provided by Viaoliva, Cooperative Society (Almendralejo, Badajoz, Extremadura, Spain) and three different pools were made with the whole samples. All the samples were previously filtered through a 0.45-m cellulose acetate filter. Samples were kept at 4 C, avoiding exposure to direct light. Apparatus Fluorescence spectral measurements were performed using a Varian Cary Elipse fluorescence spectrophotometer, equipped with two Czerny-Turner monochromators and a xenon flash lamp, and connected to a PC microcomputer via an IEEE 488 (GPIB) serial interface. The Cary Elipse software was used for data acquisition. Fluorescence measurements were recorded in a 10-mm quartz cell at 20 0.1 C, by use of a thermostatically controlled cell holder and a Selecta Model 382 thermostatically controlled water bath. An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model 8500 power supply was used for the UV irradiation of resveratrol solutions. A Milton Roy Spectronic 3000 diode-array spectrophotometer, provided with the Milton Roy Rapid Scan software package V2.2, was used for acquisition and treatment of
Experimental Reagents For all experiments, analytical reagent grade chemicals and solvents were used. Ultrapure water was obtained from a Millipore Milli-Q System.
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spectrophotometric data. Photometric measurements were recorded in a 10-mm quartz cell at 20 C, by use of a thermostatic cell holder and a Selecta thermostatic bath. Procedures for the study and determination of resveratrol Photometric studies of trans-resveratrol Suitable aliquots of the 50 g mL1trans-resveratrol ethanolic stock solution, containing different amounts of the analyte between 1.5 and 18.4 g, are transferred to the cell, containing 3.0 mL of ultrapure water. The absorption spectrum of each solution is recorded in the range from 200 to 500 nm and the absorbance at 306 nm is employed as analytical signal. Fluorimetric studies of trans-resveratrol A 1.8-mL aliquot of ultrapure water and 1.2 mL of absolute ethanol are transferred to the cell in order to keep the optimum composition of the solvent media (40% v/v ethanol). The resulting mixture must be shaken and degassed by ultrasonication, and suitable aliquots of the 50 g mL1 trans-resveratrol ethanolic stock solution are added, maintaining the final concentration between 0.080 and 0.80 g mL1. The fluorescence intensity is measured at 385 nm (exc =318 nm). Photochemically induced fluorimetric determination of resveratrol A 3.0-mL sample of degassed hydroethanolic mixture containing 40% v/v of ethanol and different volumes of ethanolic diluted trans-resveratrol stock solution containing between 20.0 and 200 ng of analyte are transferred to the cell. The resulting solutions are irradiated for 60 s under a high pressure mercury lamp and their emission spectra (exc =260 nm) are registered. The fluorescence intensity at 364 nm is employed as analytical signal. Recommended procedure for determining resveratrol in wine In a separatory funnel, 0.10 mL of red wine or 0.50 mL of white wine at pH 5.0, fixed by the addition of 6.0 mL of sodium hydrogen tartrate/disodium tartrate buffer solution (0.26 mol L1), are diluted with ultrapure water up to 10.0 mL, and extracted with 5.0 mL of diethylether by shaking for 60 s. The upper organic phase is separated and evaporated to dryness by a stream of nitrogen at room temperature. The residue is re-dissolved with 4.0 mL of absolute ethanol and water is added up to 10.0 mL. This solution is irradiated under a high pressure mercury lamp
for 60 s and its emission spectrum is registered (exc = 260 nm). The emission spectrum is smoothed by the moving average method with a segment of seven data points, its second derivative is obtained by Savitzky-Golay algorithm and it is smoothed again using the same conditions. The amplitude of the derivative between 356 and 364 nm is taken as analytical signal.
Results and discussion Basic photometric and fluorimetric studies of trans-resveratrol Absorption and fluorescence spectra of different hydroethanolic solutions of trans-resveratrol were recorded. A single absorption band was observed around 310 nm with a bandwidth of 20 nm and two little maxima centred at 306 and 319 nm, in water (Fig. 1a), ethanol and hydroethanolic media, at acid and neutral pH, and it was proven that the ethanol percentage has no influence on the absorption signal. trans-Resveratrol itself is weakly fluorescent, showing two excitation maxima centred at 225 and 318 nm, and a single emission maximum centred at 385 nm, in a hydroethanolic medium containing 40% of absolute ethanol, at acid and neutral pH (Fig. 1b). The influence of the acidity on the spectral properties of trans-resveratrol has been studied photometrically and fluorimetrically. The pH was varied by the addition of small volumes (in the order of microlitres) of aqueous hydrochloric acid or sodium hydroxide solutions in the 0.011.0 mol L1 concentration range, in the presence of potassium chloride 0.10 mol L1 in order to maintain the ionic strength. The photometric study (Fig. 1a) was carried out in aqueous medium and no spectral changes for the absorption band centred at 310 nm were observed for pH values less than 6.5; however, a bathochromic shift was observed in basic medium, with a new maximum appearing centred at 343 nm for pH values higher than 10.0. In contrast, the fluorimetric study was carried out in aqueous and hydroethanolic media (40% v/v ethanol). A bathochromic shift and a decay of the signal was observed in the excitation and emission fluorescence maxima, in both media, centred at 352 and 459 nm, respectively, for pH values higher than 10.0, as shown in Fig. 1b. A constant fluorescent signal (exc/em = 318/385 nm) was observed in the pH range from 2.0 to 6.0 followed by a drastic decay up to pH 11, remaining constant and negligible for higher pH values. The reversibility of the acidbase processes was photometrically and fluorimetrically proven. Ionization constants have been calculated based on the variation of the photometric and the fluorescent signals with the pH. The variation of the photometric signal at 306 and 343 nm is shown in Fig. 2a and the pKa values corresponding to the two ionizations photometrically ob-
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2002 Fig. 1 a Absorption spectra corresponding to an aqueous solution of 1.52 g mL1transresveratrol, at different pH values in the presence of potassium chloride (0.10 mol L1). b Excitation (dashed line) and emission (solid line) fluorescence spectra corresponding to an hydroethanolic (40% v/v ethanol) solution of 0.98 g mL1trans-resveratrol, in acidic (exc/em =318/385 nm) and basic (exc/em =342/459 nm) media in the presence of 0.10 mol L1 potassium chloride
0.3 600
a
3.6 0.2 2.0-6.5 Fluorescence Intensity 12.2 Absorbance 400
9.2 0.1
200
10.9
0 250 300 350 (nm) 400 450
0 200 300 400 (nm) 500 600
served are too close to allow application of classic methods, e.g. the Wilson and Lester method [41], to calculate them. Therefore they were calculated by means of absorbance diagrams (A-diagrams) [38]. An A-diagram is a plot of the absorbance at one wavelength against the absorbance (A) at another wavelength (Fig. 2b). Consequently, an A-diagram shows the relative absorbance changes at two wavelengths as a function of the pH of the solutions. For a one-step system, the absorbance at any wavelength must be proportional to the absorbance at any other wavelength, so an A-diagram for such a system will be linear. However, if the system is governed by two or more equilibria, the A-diagrams will change direction every time a new equilibrium becomes dominant in the system [38]. These diagrams are particularly useful for systems where the spectra alone do not clearly reveal the number of equilibria involved. In this case A (306 nm) is plotted against A (343 nm), as shown in Fig. 2b, and the plot clearly consists of two linear segments, suggesting the existence of two successive equilibria in the pH 7.211.4 interval. The first ionization predominates in the pH 7.28.9 range (first lineal segment) and the second one in the pH 10.011.4 range (second lineal segment).
Fig. 2 a Absorbance values at 306 nm () and 343 nm () as a function of the pH in aqueous media. b Absorbance diagram of trans-resveratrol. pH range 7.211.4
0.24
Thus, we calculated pKa1 =8.2 and pKa2 =9.7, in comparison with the reported values of pKa1 =8.1, pKa2 =9.9 and pKa3 = 10.5, photometrically calculated in aqueous medium by extrapolation of experimental values in different hydromethanolic media [39], or pKa1 =9.49, electrophoretically calculated [40]. These ionizations correspond to the deprotonation of the hydroxyl groups present in the molecule. A single ionization was fluorimetrically observed in aqueous and hydroethanolic (40% v/v ethanol) media, and pKa values of 8.3 and 9.2, respectively, were calculated by the Wilson and Lester method [41]. It was found that the pKa value of this polyphenol is highly influenced by the alcoholic percentage in the working medium. Photometric and fluorimetric determination of trans-resveratrol: analytical parameters The photometric or fluorescent determination of transresveratrol involves the construction of the corresponding calibration curves. The analytical figures of merit for the photometric and fluorimetric determination in aqueous and hydroethanolic (40% v/v ethanol) media, respectively, are
0.24
a
0.2 Absorbance (306 nm) Absorbance 0.2
0.16
0.16
0.12
0.12
0.08
0.08
0.04 2 4 6 8 pH 10 12 14
0.04 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 Absorbance (343 nm) 0.24
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summarized in Table 1. As can be observed, there is a linear relationship between analytical signal and trans-resveratrol concentration in the range 0.55.0 and 0.080.8 g mL1 for molecular absorption and fluorescence, respectively. On the other hand, better limits of detection are obtained fluorimetrically. The repeatability of the methods was analysed by measuring eleven identical solutions under similar conditions as employed in the construction of the calibration curves. Photometric and fluorimetric studies of trans-resveratrol photoreaction and photoproducts It is known that intense irradiation of trans-resveratrol solutions induces the formation of a new compound fluorescing in the ultraviolet range [11]. The photochemical process was monitored photometrically and fluorimetrically in different hydroethanolic media. Photometric study It was proven that the ethanol percentage has no influence in the shape or intensity of the absorption spectra of transresveratrol, exhibiting a single maximum centred to 310 nm with a bandwidth of 20 nm, as previously stated. On the other hand, the absorption spectra corresponding to the photoproduct obtained by irradiation of trans-resveratrol solutions under a high pressure mercury lamp, in different media, are highly influenced by the ethanol percentage (Fig. 3a). Thus, when trans-resveratrol solutions are UV irradiated, a new absorption maximum centred at 290 nm appears immediately, corresponding to cis-resveratrol [11]. When the ethanol percentage is between 40 and 60% and
Table 1 Analytical figures of merit Method Intercept (a) Linear concentration Sa range (ng mL1) 0.55* 80800 6.666 3.7103 2.5103 12.85.5 21.13.5
the solutions are irradiated for at least 60 s, another, equally important maximum centred at 260 nm can be observed, which is negligible in purely ethanolic medium, and very weak in hydroethanolic media containing more than 60% of water. The maximum centred at 260 nm could be associated with the highly fluorescent photoproduct discussed below. The study of the influence of the acidity on the absorption properties of the fluorescent resveratrol photoproduct was carried out with a hydroethanolic (40% v/v ethanol) solution of 1.2 g mL1trans-resveratrol, irradiated for 60 s under a high pressure mercury lamp (irradiation time, for this concentration level, and medium composition were determined as optimum conditions for obtaining the fluorescent photoproduct, as discussed below). The pH of this solution was varied by the addition of small volumes (in the order of microlitres) of aqueous hydrochloric acid and sodium hydroxide in the 0.011.0 mol L1 concentration range, in the presence of potassium chloride in order to maintain the ionic strength. Some absorption spectra at different pH values are collected in Fig. 3b. Two maxima are observed in acidic and neutral media, the main one, centred at 261 nm, and a smaller one centred at 287 nm, and their position and intensity are practically constant in acid and neutral media. A bathochromic shift and a decay are observed in basic media with regard to the 261 nm maximum, a new maximum appearing perfectly centred at 303 nm for pH values higher than 10.5. The reversibility of the acidbase process was studied, by acidifying the solution from highly basic to acidic pH values, but the original spectrum corresponding to the acid form was not recovered. The variation of the absorbance at 261 nm with the pH shows a drastic decay, whereas the signal measured at 303 nm increases, for pH values higher than 7.5. The inflection point of both curves
Slope (b)Sb (mL ng1)
Determination LODa LODb % RSDc coefficient (ng mL1) (ng mL1) (concentration (r2) level, ng mL1)
Photometric determination of transresveratrol (=306 nm) Fluorescent determination of transresveratrol (exc/em =318/385 nm) Photoinduced fluorescent determination of resveratrol (exc/em =260/365 nm) Second-derivative photoinduced fluorescent determination of resveratrol 2D356364 (exc =260 nm)
a b
0.1270.001* 0.9390.013 7.770.12
0.9989 0.9972 0.9964
0.058* 17.9 1.6
0.14* 34.5 3.1
4.4 (1.4*) 4.7 (324.5) 3.6 (19.2)
6.666
9.0102 13.1102
0.1820.004
0.9907
2.2
5.0
4.8 (19.2)
Long and Winefordner method (k=3) [43] Clayton et al. method (==0.05) [44] c Relative standard deviation (n=11) *Units are g mL1
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0.3 (5)
0.15
a
2.0-7.0 9.8 11.6
Absorbance
0.1 (4)
Absorbance 350 (nm) 400 450
0.2
(2)
(1)
0.1
(3)
0.05
0 250 300
0 225 250 275 300 (nm) 325 350
Fig. 3 a Absorption spectra corresponding to 2.04 g mL1 of transresveratrol in absolute ethanol irradiated for 120 s (1), in hydroethanolic medium containing 60% v/v of ethanol, irradiated for 120 s (2), in aqueous medium irradiated for 120 s (3), in hydroethanolic medium containing 40% v/v of ethanol irradiated for 5 s (4), and in
any hydroethanolic medium without being irradiated (5). b Absorption spectra corresponding to a hydroethanolic (40% v/v ethanol) solution of 1.2 g mL1trans-resveratrol, irradiated for 60 s, in the presence of potassium chloride (0.10 mol L1) at different pH values
was calculated around a pH value of 9.6, but this value does really not correspond to a pKa value because the alkaline transformation is not fully reversible, probably due to a partial hydrolysis. Fluorescence study It has been proven that intense UV irradiation of transresveratrol solutions, under a high pressure mercury lamp, transforms trans-resveratrol into a highly fluorescent compound [11] with a sharp excitation maximum (em = 364 or 382 nm) at 260 nm and two emission maxima (exc = 260 nm) centred at 364 and 382 nm, respectively, as shown in Fig. 4a. The intensity of the photoinduced signal and the optimum irradiation time are highly influenced by the solvent, but not the identity of the photoproduct because no changes were observed in the shape of spectra recorded in different media. Water, organic solvents of different polarities like methanol, ethanol, acetonitrile, dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, 1,4-dioxane, cyclohexane and hexane, and some hydro-organic mixtures were assayed. The photoreaction rate is higher in any purely organic media than in hydro-organic ones, but the fluorescence quantum yield of the photoproduct is higher in hydroethanolic media. Finally, different hydroethanolic media were assayed in order to obtain the greatest photoinduced signal in a reasonable irradiation time. The influence of the irradiation time on the photoinduced signal in different
hydroethanolic mixtures was studied, and the results are shown in Fig. 4b. In all cases, the fluorescence intensity increases when increasing irradiation time. No changes in the optimum wavelengths were observed when changing the proportion of ethanol and water, but different optimum irradiation times and different photoinduced intensities were obtained in different hydroethanolic media. The maximum photoinduced signal in purely ethanolic solutions is reached in just 25 s, but this signal increases with increasing the water percentage and is at a maximum for ethanol percentages between 30 and 50%. Therefore, hydroethanolic medium containing 40% v/v of ethanol was selected as optimum for subsequent experiments, obtaining the maximum photoinduced signal with an irradiation time of 120 s for the assayed concentration (2.3 g mL1). Nevertheless, it was proven that the optimum irradiation time is directly related, to a certain extent, to the concentration of trans-resveratrol in the original solution and this parameter has to be optimized depending on the concentration range. The influence of the acidity on the spectrofluorimetric behaviour of the photoproduct obtained under optimum conditions was studied. A hydroethanolic (40% v/v ethanol) solution containing 0.098 g mL1trans-resveratrol, in the presence of potassium chloride 0.10 mol L1, was prepared and irradiated for 60 s (previously determined as the optimum irradiation time at this concentration level). This solution was divided into two portions and their pH
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Anal Bioanal Chem (2007) 387:19992007 Fig. 4 a Excitation (dashed line) and emission (solid line) spectra corresponding to 57.0 ng mL1 of trans-resveratrol in hydroethanolic medium containing 40% v/v of ethanol, isolated from light (1, exc/em 318/385 nm) and irradiated for 60 s under a high pressure mercury lamp (2, exc/em 260/ 364 nm). b Photoreaction profiles corresponding to 2.3 g mL1 of trans-resveratrol in hydroethanolic media containing different percentages of ethanol
300 (2) 200 F. I. ( exc/em = 260/364 nm) 400 3% Fluorescence Intensity 500 30-50 %
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300
200
100
100
100 %
(1) 0 200 250 300 350 400 (nm) 450 500 0 50 100 150 200 Irradiation Time (s) 250 300
values were varied by the addition of small volumes (in the order of microlitres) of aqueous hydrochloric acid or sodium hydroxide in the 0.011.0 mol L1 concentration range. The emission fluorescence spectra were recorded at different pH values and it was found that the fluorescent signal (exc/em =260/364 nm) was maximum and constant in acid and neutral media, but a drastic decay occurs at pH values higher than 7.0, and a negligible signal is obtained from pH 11 and above. In addition, the reversibility of the acidbase process was studied by acidifying the solution from highly basic pH values, through neutral pH to acidic values; however, the original signal was reduced by half. The inflection point of the curve of fluorescence intensity versus pH value was calculated at a pH value of 9.8, but this value cannot be assigned to a pKa, because a hydrolysis probably occurs in parallel with the alkaline transformation. Photoinduced fluorimetric determination of resveratrol: analytical parameters A linear relationship between the photoinduced signal (exc/em =260/364 nm) and the original concentration of trans-resveratrol was found between 6.6 and 66 ng mL1, selecting an irradiation time of 60 s and a hydroethanolic medium containing 40% v/v ethanol. The analytical figures of merit are shown in Table 1, and a great enhancement of the sensitivity with regard to the photometric or fluorescent determination of trans-resveratrol can be observed. The repeatability of the method was analysed by measuring eleven identical solutions under similar conditions, as employed in the construction of the calibration curve. Extraction of resveratrol A liquidliquid extraction of resveratrol from the aqueous phase with organic solvents is necessary prior to its analysis in wine samples by photoinduced fluorescence in order to reduce the matrix signal. Firstly, the behaviour of the
analyte, with regard to the extraction in different organic solvents (e.g. ethers, esters or chlorinated hydrocarbons), was studied by molecular absorption, obtaining satisfactory recoveries with diethylether or ethyl acetate. However, the photoinduced fluorescent signal obtained in these media is weaker than that obtained in the optimum hydroethanolic medium and it is advisable to evaporate the organic extracts to dryness and re-dissolve the residue with the optimum hydroethanolic mixture. Diethylether was finally chosen as extractant for two reasons: it afforded extraction recoveries around 100% and its higher volatility substantially reduced the analysis time in the evaporation stage. The neutral polyphenol species is the predominant species present in acid and neutral media, and the pH of the aqueous phase was fixed at 5.0, by the addition of 6.0 mL of 0.26 mol L1 hydrogen sodium tartrate/disodium tartrate buffer solution in a final volume of aqueous phase of 10.0 mL (final concentration of buffer 0.16 mol L1). The shaking time and phase ratio were also optimized and a shaking time of 60 s and a phase ratio aqueous/organic of 2.0 were selected as optimum values. After the extraction stage, the developed procedure was used to obtain the photoproduct (i.e. hydroethanolic medium containing 40% v/v of ethanol and irradiation time of 60 s for transresveratrol concentrations lower than 0.1 g mL1). The extraction recovery reached under optimum conditions was 100%. The evaporated and reconstituted ethereal extract was stable at least up to 12 h after its preparation when stored at 4 C in the dark. Determination of resveratrol in wines by means of 2D-RTPF: analytical parameters In previous assays carried out with wine samples it was evident that the matrix made an important contribution to the emission fluorescence spectrum under the conditions necessary to obtain the photoproduct, despite extracting wine samples. Nevertheless, this contribution was reduced
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D 1.5 1
2
800
20
Fluorescence Intensity
600
10 0.5
400
0 -0.5
200
-10 -1
0 360 400 440 320 360 400 440 320 360 400 440 em (nm) ( exc = 260 nm) em (nm) ( exc = 260 nm) em (nm) ( exc= 260 nm) Fig. 5 Emission spectra and their first and second derivatives, corresponding to barrel-aged red wines pool non-spiked (dashed line) and spiked (solid line) with 1.57 g mL1 of trans-resveratrol, extracted under optimal conditions, and subjected to a final 100-fold dilution 320
to a great extent by obtaining derivative signals, particularly the second-derivative emission spectra, as shown in Fig. 5, where the emission spectra corresponding to a wine sample non-spiked and spiked with trans-resveratrol and their first and second derivatives are represented. This also proved the linearity between different signals measured on the secondderivative emission spectra and the original trans-resveratrol concentration (Table 1): the best linear relationship was obtained by employing the amplitude of the secondderivative emission spectra between 356 and 364 nm as analytical signal (2D356364). The optimized derivative photoinduced fluorescence extractive method was applied to the analysis of resveratrol in wine samples. Young and barrel-aged red wine and white wine pools were analysed in order to represent the commonest interferences in any future wine analysis. A standard addition was applied in triplicate and the corresponding curves of analytical signal versus added concentration of trans-resveratrol were constructed. The slopes comparison test was applied between these plots and the calibration curves, and it was found that there was not matrix effect. RP-HPLC-FLD method with isocratic elution (C18 column; mobile phase acetonitrile/acetic acid (10% v/ v)/water, 19:33:48, v:v:v) and photochemical pre-column derivatization developed by the authors [42] was used to prove that the concentration of resveratrol in the analysed pools was under the limit of detection of the method. Calculated average recoveries at different fortification levels are shown in Table 2. A commercial red wine containing a higher concentration of resveratrol was analysed and the result (1.12 g mL1; 8% RSD) was satisfactorily ratified by the chromatographic method developed by the authors [42].
Conclusions A very weakly fluorescent analyte (trans-resveratrol) has been photochemically converted into a highly fluorescent product. Acidbase ionization constants have been photometrically and fluorimetrically calculated for trans-resveratrol, but not for the photoproduct, because it has been proven that its alkaline transformation is not fully reversible. A new, simple and fast method has been developed for the determination of total resveratrol (trans- and cisisomers) in wine by second-derivative photochemically induced fluorescence coupled with liquidliquid extraction.
Table 2 Averages recoveries (n=3) and RSD (n=3) obtained in the analysis of different wine pools fortified with trans-resveratrol Wine pool Added (g mL1) Recovery (% RSD)
Young red or barrel-aged red 0.63 0.94 1.6 3.1 4.7 White 0.13 0.19 0.31 0.63 0.94
107 (5)a 109 (4)b 110 (4)a 108 (8)b 104 (2)a 111 (3)b 98 (4)a 105 (3)b 104 (3)a 101 (3)b 100 (8) 94 (7) 102 (4) 96 (5) 102 (3)
a b
Young red Barrel-aged red
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2007 18. Pour Nikfardjam MS, Lszl G, Dietrich H (2006) Food Chem 96:7479 19. Vitrac X, Monti JP, Vercauteren J, Deffieux G, Mrillon JM (2002) Anal Chim Acta 458:103110 20. Pieiro Z, Palma M, Barroso CG (2006) J Chromatogr A 1110:6165 21. Rodrguez Delgado MA, Malovan S, Prez JP, Borges T, Garca Montelongo FJ (2001) J Chromatogr A 912:249257 22. Rodrguez Delgado MA, Gonzlez G, Prez Trujillo JP, Garca Montelongo FJ (2002) Food Chem 76:371375 23. Zhou J, Cui H, Wan G, Xu H, Pang Y, Duan C (2004) Food Chem 88:613620 24. Zhang Q, Cui H, Myint A, Lian M, Liu L (2005) J Chromatogr A 1095:94101 25. Kolouchov Hanzlkov I, Melzoch K, Filip V, Smidrkal J (2004) Food Chem 87:151158 26. Stecher G, Huck CW, Popp M, Bonn GK (2001) Fresenius J Anal Chem 371:7380 27. Wang Y, Catana F, Yang Y, Roderick R, van Breemen RB (2002) J Agric Food Chem 50:431435 28. Bravo MN, Silva S, Coelho AV, Vilas Boas L, Bronze MR (2006) Anal Chim Acta 563:8492 29. Domnguez C, Guilln DA, Barroso CG (2001) J Chromatogr A 918:303310 30. Loredana La Torre G, Saitta M, Vilasi F, Pellican T, Dugo G (2006) Food Chem 94:640650 31. Flamini R, Dalla Vedona A (2004) Rapid Commun Mass Spectrom 18:19251931 32. Fan E, Zhang K, Yao C, Yan C, Bai Y, Jiang S (2005) Chromatographia 62:289294 33. Dobisov Z, Pazourek J, Havel J (2002) Electrophoresis 23:263267 34. Spanil M, Pazourek J, Farkov M, Havel J (2005) J Chromatogr A 1084:180185 35. Gao L, Chu Q, Ye J (2002) Food Chem 78:255260 36. Peng YY, Chu QC, Lin FH, Ye JN (2004) J Agric Food Chem 52:153156 37. Demianov Z, Sirn H, Kuldvee R, Riekkola ML (2003) Electrophoresis 24:42644271 38. Polster J, Lachmann H (1989) Spectrometric titration, analysis of chemical equilibria. VCH, Weinheim 39. Takagai Y, Kubota T, Kobayashi H, Tashiro T, Takahashi A, Igarashi S (2005) Anal Sci 21:183186 40. Cao J, Chen GH, Du YS, Hou FF, Tian YL (2006) J Liq Chromatogr Rel Technol 29:14571463 41. Wilson RF, Lester GW (1963) Talanta 10:319322 42. Galeano T, Duran-Meras I, Airado D (in preparation) 43. Long GL, Winefordner JD (1983) Anal Chem 55:712724 44. Clayton CA, Hines JW, Elkins PD (1987) Anal Chem 59:25062514
It has been demonstrated that there is not matrix effect from the wine. Satisfactory recoveries are obtained at different fortification levels.
Acknowledgements The authors acknowledge to Consejera de Educacin y Ciencia de la Junta de Extremadura (Exp: 2PR03A073) for financial support. Diego Airado Rodrguez is grateful to the Consejera de Infraestructura y Desarrollo Tecnolgico de la Junta de Extremadura for a fellowship (DOE 22/06/04). Lda. Dolores Lpez Soto (Viaoliva S.C.) is also thanked for providing wine samples.
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Available online at www.sciencedirect.com
Talanta 74 (2008) 675682
Determination of piceid by photochemically induced uorescence and second-derivative Response surface methodology for the optimization of a liquidliquid extraction procedure for its analysis in wine samples
Isabel Dur n Mer s , Teresa Galeano Daz, Diego Airado Rodrguez a a
Department of Analytical Chemistry, University of Extremadura, 06071 Badajoz, Spain Received 21 February 2007; received in revised form 25 June 2007; accepted 25 June 2007 Available online 25 July 2007
Abstract trans-Piceid itself is weakly uorescent, but the uorescence signal (exc/em = 260/361 nm) is greatly enhanced by UV-irradiation of its hydroethanolic solutions. Employing the photoinduced emission signal at 361 nm or the amplitude of the second-derivative-photoinduced emission spectrum, between 353 and 361 nm, a linear relation is found in the assayed range 5.731.4 ng mL1 of trans-piceid and limits of detection of 1.7 and 2.1 ng mL1 , respectively, are obtained. A previous liquidliquid extraction is necessary for the determination of piceid in wine. Experimental design (Central Composite Design) together with the Response Surface Methodology have been used to nd optimum conditions for the extraction procedure. For this purpose, the difference between the photoinduced-uorescence signal (exc/em = 260/361 nm) of the aqueous phase, before and after being extracted, has been considered as Response Function. A tartrate buffer (pH 5.0) concentration of 0.15 mol L1 and a phase ratio of 1 are determined as optimum conditions. The amplitude of the second-derivative-emission spectrum, corresponding to the evaporated and re-dissolved organic phase, between 353 and 361 nm has been employed as analytical signal. Standard addition method has been applied to the analysis of piceid in different wine samples under optimum conditions. Results of wine analysis have been satisfactorily validated by HPLC. 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Piceid; Wine; Photochemically-induced uorescence; Second-derivative; Response surface methodology; Liquidliquid extraction
1. Introduction Piceid (3,4 ,5-trihydroxystilbene-3- -mono-d-glucoside) is a glucoside of the stilbene-like resveratrol. These are phenolic compounds present in many families of plants, but grapes and related products, e.g. wine, are considered the most important dietary sources of these substances [1]. The determination of phenolic compounds in wine is very important because most of them play an important role in several sensorial characteristics such as colour, avour, astringency and hardness of wine [2,3]. Some others, like piceid, have been
Corresponding author. Tel.: +34 924289375; fax: +34 924289375. E-mail address: iduran@unex.es (I.D. Mer s). a
intensively studied in the past decade due to their biological or pharmaceutical importance, as discussed below. Resveratrol and piceid occur as trans- and cis-isomers. The chemical structure of trans-piceid is shown in Fig. 1. Due to the generally high ratio of trans- to cis-isomers found in wines, it has been suggested that the cis-isomers could arise from light exposure of must or wine during the wine-making process or possibly from light exposure of wine bottles during storage [4]. Piceid has received such attention as resveratrol because, in grape products, the concentration of the glucoside is usually signicantly higher than the aglycone [4]. The relative distribution between the glycosylated and aglycone forms in wines is dependent on a number of factors such as fermentation and ecological conditions [5]. On the other hand, resveratrol in all
0039-9140/$ see front matter 2007 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.talanta.2007.06.049
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Fig. 1. Chemical structure of trans-piceid.
its forms is found in much higher concentration in red grape varieties compared with white grape varieties. Piceid is the major polyphenol found in the root of Polygonum cuspidatum. The powder of this root is used in China and Japan as a treatment for atherosclerosis and for other therapeutic purposes [6,7]. The evidence for piceid in red wines was established by the use of a piceid standard extracted from P. cuspidatum [4]. Piceid isomers have properties similar to those of resveratrol in inhibiting platelet aggregation [810] and inhibiting oxidation of human low-density-lipoproteins [11]. On the other hand, in a less active manner than trans-resveratrol, trans-piceid reduces the elevations of lipid levels [12] and inhibits eicosanoid synthesis [7]. However, the human digestive tract is known to have glycosidase activity [13], so it is possible that the glucoside of resveratrol could release the aglycone on ingestion. Liquid chromatography (LC) has been widely exploited for the analysis of piceid in several food samples, but no spectroscopic methods have been published so far. Thus, in the last years, reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) by acidic solvent gradient elution, has been the most commonly used procedure for the determination of piceid in wine, either with diode array detection (DAD) [1417], uorimetric detection [18], DADuorimetric detection [19], DADuorimetricelectrochemical detection [20] or with mass spectrometry (MS) [20] and DAD-MS [21,22]. The detection based on electrochemistry, luminiscence and MS offer higher sensitivity than DAD. Capillary zone electrophoresis (CZE), with DAD [23] has been also employed for the analysis of this compound. Regarding to the sample preparation, extraction with organic solvent, commonly ethyl acetate, followed by solvent evaporation and re-dissolution of the residue is widely employed [20,22], although an additional stage of cation-exchange chromatography has been also employed [14] previously to the injection in the chromatographic system. Solid phase extraction is other common treatment previous to the chromatographic [21] or
electrophoretic [23] analysis. Nevertheless some methods are reported, in which wine samples are ltered through cellulose lters and directly injected into the chromatographic system [15,17,18]. Piceid itself is weakly uorescent but it has been demonstrated that intense UV irradiation of piceid contained in the grape skins gives rise to the formation of the cis-isomer, which very quickly disappears in favour of a compound highly uorescent in the ultraviolet range [24]. For the rst time we have exploited the photochemical behaviour of piceid with an analytical purpose. The photoinduced-spectrouorimetric study of piceid has been carried out and a sensitive, new, simple and inexpensive extractive-uorimetric method, employing the amplitude of the second-derivative-emission spectra as analytical signal has been proposed for the analysis of piceid in wine samples previous liquidliquid extraction. In the development of the extractive procedure, experimental design (Central Composite Design) and the Response Surface Methodology (RSM) have been used to elucidate the manner in which the assayed variables affect the response function (RF) [25,26]. The use of these tools has the advantage of reaching the optimum values of the variables with the smallest number of experiments and in the shortest time possible. 2. Experimental 2.1. Chemicals For all experiments, analytical reagent grade chemicals and solvents were used. Ultrapure water was obtained from a Millipore Milli-Q System. trans-Piceid was purchased from Aldrich Chem. Co. and used as received. Standard ethanolic stock solutions containing 50.0 g mL1 were prepared in colored volumetric asks by weighting and suitable dilution of the commercial product. This solution was stored at 4 C avoiding the exposure to direct light. Fresh solutions of lower concentrations were prepared by appropriate dilution of the stock solution with absolute ethanol and water. Buffer solution sodium hydrogen tartrate/disodium tartrate 0.26 mol L1 was prepared by dissolving the suitable amount of disodium tartrate dihydrate with water and adjusting the pH of the resulting solution to 5.0 with hydrochloric acid. 2.2. Wine samples Several samples of young red wines, barrel-aged red wines and white wines were provided by Vi aoliva, Cooperative Socin ety (Almendralejo, Badajoz, Extremadura, Spain) and three different pools were made with the whole samples. All of them were previously ltered through a 0.45 m cellulose acetate lter. Samples were kept at 4 C avoiding exposure to direct light. 2.3. Instrumentation and software Fluorescence spectral measurements were performed using a Varian Cary Elipse uorescence spectrophotometer, equipped
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with two Czerny-Turner monochromators and a xenon ash lamp, and connected to a PC microcomputer via an IEEE 488 (GPIB) serial interface. The Cary Elipse software was used for data acquisition. Fluorescence measurements were recorded in a 10-mm quartz cell at 20 0.1 C, by use of a thermostatically controlled cell holder and a Selecta Model 382 thermostatically controlled water-bath. An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model 8500 power supply was used for the UV-irradiation of resveratrol solutions. A Milton Roy Spectronic 3000 diode-array spectrophotometer, provided with the Milton Roy Rapid Scan software package V2.2, was used for acquisition and treatment of spectrophotometric data. Photometric measurements were recorded in a 10-mm quartz cell at 20 C, by use of a thermostatic cell holder and a Selecta thermostatic bath. The software package THE UNSCRAMBLER 6.11b CAMO ASA [27], running under Windows XP, was used for the application of chemometrics. 2.4. Procedures for the photochemically induced uorimetric determination of total piceid 2.4.1. Calibration graph of total piceid In a quartz cell, 5.0 mL of ultrapure water, different volumes of an ethanolic diluted stock trans-piceid solution containing between 57 and 320 ng of analyte, and ethanol up to 2% were added. The resulting solution was irradiated for 180 s, under a high pressure mercury lamp. Ethanol and water were added to the irradiated solution up to 10 mL (40%, v/v ethanol). The corresponding emission spectra (exc = 260 nm) were registered and the uorescence intensity at 361 nm was employed as analytical signal. 2.4.2. Recommended procedure for determining total piceid in wine Aliquots of 0.10 mL of red wine or 0.50 mL of white wine, were diluted to 5.0 mL with ultrapure water and absolute ethanol, in a nal percentage 2/98 ethanol/water (v/v). The resulting solutions were irradiated for 180 s under a high pressure mercury
lamp, in a quartz cell with magnetic stirring. The irradiated solutions were transferred to a separatory funnel, and 5.0 mL of buffer solution (sodium hydrogen tartrate/disodium tartrate 0.26 mol L1 , pH 5.0), were added. These aqueous phases were extracted with 10.0 mL of ethyl acetate by shaking for 150 s. The organic phases were evaporated to dryness at room temperature in a rota-evaporator. The residues were re-dissolved in 4.0 mL of absolute ethanol and ultrapure water was added up to 10.0 mL. Aliquots of 3.0 mL of the resulting solutions were transferred to the measure cell and a standard addition was carried out by adding successively small volumes of trans-piceid standard solution irradiated for 180 s in the same conditions as the diluted wine sample. The corresponding emission spectra (exc = 260 nm) were registered. These spectra were smoothed by the moving average method with a segment of seven data points. Their second derivatives were calculated by SavitzkyGolay algorithm ( = 5 nm) and they were smoothed again in the same conditions as the spectra. The amplitude between 353 and 361 nm was employed as analytical signal. The analysis of every wine sample was carried out by triplicate. 3. Results and discussion 3.1. Determination of piceid by means of photochemically induced uorescence The ultraviolet absorption spectra of trans-piceid in aqueous, ethanolic or any hydroethanolic media are characterized by a single wide band around 312 nm with a band width of 15 nm, and two little maxima centered to 306 and 318 nm, respectively (Fig. 2A). In order to establish the basic chemico-physical characteristics of trans-piceid, the inuence of acidity on the absorbent properties of trans-piceid in aqueous medium was studied. The pH of the solution was varied by the addition of small volumes, in order of microlitres, of diluted solutions of hydrochloric acid or sodium hydroxide, in presence of 0.10 mol L1 of potassium chloride to keep the ionic strength. A bathochromic shift to 343 nm and a narrowing of the absorption band was observed in basic medium. The absorbance at 343 nm keeps minimum
Fig. 2. (A) Absorption spectra corresponding to 1.14 g mL1 of trans-piceid in hydroethanolic medium containing 40% (v/v) of ethanol, irradiated for different times and without being irradiated. (B) Excitation (left) and emission (right) uorescence spectra corresponding to a 1.2 g mL1 hydroethanolic (40%, v/v ethanol) solution of trans-piceid, non-irradiated (- - -) (exc/em = 318/380 nm) and irradiated for 180 s under a high pressure mercury lamp () (exc/em = 260/380 nm).
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Fig. 3. Inuence of irradiation time on the uorescence intensity (exc/em = 260/380 nm) of 0.60 g mL1 trans-piceid in ethanol:water 40:60 (v/v) medium in presence of sodium chloride 0.1 mol L1 in neutral, acid and basic media.
to pH 7.5 and increases in the 7.511.0 pH interval, remaining constant and independent of the acidity for higher pH values. Based on this experience, pKa = 9.3 was calculated by Wilson and Lester method [28] for trans-piceid, in accordance with the reported value of 9.4 [29]. When trans-piceid aqueous, ethanolic or hydroethanolic solutions are UV-irradiated, the band corresponding to transpiceid, disappears, and a new maximum centered to 290 nm, corresponding to cis-piceid [24,30], appears immediately, as shown in Fig. 2A. For irradiation times higher than 60 s another maximum centered to 260 nm (Fig. 2A) can be observed in solutions containing between 40% and 60% (v/v) of ethanol, corresponding to the highly uorescent photoproducts discussed below, while the absorptivity at 290 is kept. This new maximum is negligible in purely ethanolic solutions and very weak in hydroethanolic media containing more than 60% (v/v) ethanol. The highest intensity of this maximum is reached for irradiation times around 180 s but decreases for higher irradiation times and turns negligible for irradiation times higher than 600 s,
probably due to the UV-destruction of the highly uorescent photoproducts. A similar photochemical study was carried out by uorescence. Hydroethanolic solutions of trans-piceid are slightly uorescent and present excitation and emission maxima centered to 230 and 300, and 395 nm, respectively (Fig. 2B). Intense UV-irradiation of trans-piceid solutions, transforms trans-piceid into a highly uorescent compounds, with a sharp excitation maximum (em = 361 or 380 nm) at 260 nm and two emission maxima (exc = 260 nm) centered to 361 and 380 nm, respectively (Fig. 2B). It was found that the intensity of the photoinduced signal and the optimum irradiation time are highly inuenced by the solvent, but not the identity of the photoproducts because no changes were observed in the shape of spectra recorded in different media. Water, organic solvents of different polarities like methanol, ethanol, acetonitrile, dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, 1,4-dioxane, cyclohexane and hexane and some hydro-organic mixtures were assayed. The photoreaction rate is higher in any purely organic media than in hydro-organic ones, but the uorescence quantum yield of the photoproducts is higher in hydroethanolic media. Absorption and uorescence spectra have been on-line obtained, after chromatographic separation for trans-piceid and its photoproducts [32], and the shape of these spectra are completely in agreement with the reported data [24,30]. Finally, the photoreaction was studied in different hydroethanolic media, and it was found that the ethanol percentage inuenced in different ways to the kinetic of the photochemical process and to the quantum yield uorescence of the generated photoproducts. The ethanol percentage in the medium for the photochemical reaction and for the uorescence measure was varied between 0 and 100%. The best results were obtained by irradiating for 180 s hydroethanolic solutions of trans-piceid containing 2% (v/v) ethanol followed by a subsequent addition of ethanol up to 40% (v/v) before the uorescence measurement. With regard to the inuence of the acidity, several solutions containing 0.60 g mL1 of trans-piceid in ethanol:water 40:60 (v/v), were prepared in presence of sodium chloride 0.10 mol L1 at different pH values, xed by the addition of aqueous hydrochloric acid or sodium hydroxide. The inuence
Table 1 Analytical and statistical parameters for the determination of total piceid Photoinduced-uorescent method (exc/em = 260/361 nm) Assayed concentration range (ng mL1 ) Intercept (a) sa Slope (b) sb (mL ng1 ) Determination coefcient (r2 ) Analytical sensitivity ( 1 ) (ng mL1 ) LODa (ng mL1 ) LODb (ng mL1 ) % RSDc (14.3 ng mL1 )
a b c
Second-derivative-photoinduced-uorescent method 2 D353361 (exc = 260 nm) 5.731 0.17 0.06 0.18 0.01 0.9947 0.86 1.3 2.1 5.9
5.731 18 2 6.7 0.1 0.9967 0.68 0.85 1.7 2.3
Long and Winefordner method (k = 3) [33]. Clayton et al. method ( = = 0.05) [34]. Relative standard deviation (n = 11).
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I.D. Mer s et al. / Talanta 74 (2008) 675682 a Table 2 Optimization of the extractive procedure (experiments resulting of a central composite design) Experiment 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
a
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Design position Low High Aa Low Ba High Ba Low Ca High Ca Cube 1 Cube 2 Cube 3 Cube 4 Cube 5 Cube 6 Cube 7 Cube 8 Central a Central b Central c Aa
[Buffer] (mol L1 ) 0.026 0.19 0.11 0.11 0.11 0.11 0.06 0.16 0.06 0.16 0.06 0.16 0.06 0.16 0.11 0.11 0.11
Shaking time (s) 155 155 12 298 155 155 70 70 240 240 70 70 240 240 155 155 155
Phase ratio 2.5 2.5 2.5 2.5 0.99 4.0 1.6 1.6 1.6 1.6 3.4 3.4 3.4 3.4 2.5 2.5 2.5
Experiments in a star point in the model.
of the irradiation time was carried out in all of them, and it was found (Fig. 3) that the greatest enhancement of the uorescent signal is obtained in acid and neutral media. The use of an irradiation time of 180 s makes the photochemically induced-uorescent determination of trans-piceid in presence of its aglycone possible, because the uorescence of the aglycone photoproducts becomes negligible for irradiation times longer than 60 s, probably because they are destroyed [31]. Finally the inuence of the irradiation time was also carried out in presence of other typical polyphenols found in wines, concretely 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, quercetin, caffeic acid, gallic acid, ()-epicatechin and (+)-catechin and substantial changes in the photochemical process were not observed. Under optimum conditions, satisfactory linear relation between uorescence intensity and trans-piceid concentration was found in the assayed concentration range 5.731 ng mL1 . Analytical gures of merit for the determination of trans-piceid are summarized in Table 1.
pH of the aqueous phase was xed at 5.0 by the addition of hydrogen sodium tartrate/disodium tartrate buffer. Anyway the extraction recovery was much lower than 100% and the implied physicalchemical variables, such as shaking time, phase ratio and buffer concentration in aqueous phase were optimized chemometrically by means of the Response Surface Methodology (RSM) to get the better recovery value. 3.3. Optimization of the extraction procedure by the RSM For the optimization of buffer concentration, shaking time and phase ratio (aqueous/organic) an experimental design, central composite design, was used with the aim of calculating simultaneously the effect of the change in each one of these variables and also their possible interactions. Five levels were xed for each variable. Three central samples were also included, giving rise to a total of 17 experiments (Table 2). This design is rotatable and therefore the precision in the calculation of the response is uniform over the whole experimental eld. The aqueous samples were constituted by standard solutions containing 57 ng mL1 of trans-piceid in a nal volume of 10.0 mL (2% ethanol), in presence of different amounts of buffer, irradiated for 180 s previously to the addition of the buffer solution, because a decrease in the photoinduced signal was observed when irradiating in presence of buffer. The uorescence emission spectra (exc = 260 nm) of the aqueous phases were recorded before and after extracting them as marked by the design, and the difference between the uorescence intensity of aqueous phase at 361 nm before and after the extraction was employed as RF. RF = F.I.(exc/em 260/361)before extracting F.I. (exc/em 260/361)after extracting
3.2. Application: analysis of piceid in wine samples A previous liquidliquid extraction of diluted wine samples is necessary to analyse piceid by means of photoinduceduorescence, in order to reduce the background signal. Firstly, the behaviour of the analyte with regard to the extraction in different organic solvents, was studied by molecular absorption, and it was found that the better extraction recoveries were obtained by extracting not the trans-piceid but its photoproducts, with ethyl acetate. However the quantum uorescence yield of the photoproducts in ethyl acetate is minor than the obtained in the optimum hydroethanolic medium (40%, v/v ethanol) and it would be necessary to evaporate the organic extracts to dryness and re-dissolve the residue with the optimum hydroethanolic mixture. It was proven that the dihydroxy-stilbene-glucoside neutral species is the predominant in acid and neutral media. Thus, the
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The optimization of the model was made with THE UNSCRAMBLER software package [27], and the results were interpreted with the RSM. In the corresponding analysis of variance (ANOVA) a second-grade quadratic model is assumed. From this ANOVA, the results of which are summarized in Table 3, it was deduced which of the considered effects contribute signicantly to the model for a 95% condence level. In this case, buffer concentration and phase ratio were signicant variables but not the shaking time or the interactions between them. Fig. 4 shows the response surfaces estimated by the model, for each pair of variables. In these diagrams, it can be noticed that appreciable variations in the response function occurs when the two specied factors, buffer concentration or phase ratio are varied. In these surfaces, the maximum value of RF is located at the following values of the variables: 0.16 mol L1 of buffer, phase ratio of 0.7, considered optimum conditions. The predicted value of phase ratio was out of the assayed points in the experimental design, nevertheless it was proven that the extraction percentage obtained with a phase ratio of 1 is similar to the obtained with a phase ratio of 0.7. Because of this, an optimum phase ratio of 1 was nally selected. The shaking time was xed at an arbitrary value of 150 s. The extraction recovery under these conditions was calculated as the ratio between the slopes of the calibration curve and a calibration curve constructed extracting standards, and it resulted to be 61%. 3.4. Determination of piceid in wine samples Despite extracting wine samples, an important background signal from the matrix was observed in the optimum conditions to obtain the uorescent spectra of the photoproducts. Nevertheless this contribution was reduced to a great extent by obtaining derivative signals, fundamentally the secondderivative-emission spectra. It was also examined the linearity between different signals measured on the second-derivativeemission spectra and the original trans-piceid concentration, and it was found a linear relationship employing the amplitude of the second-derivative-emission spectra between 353 and 361 nm as analytical signal. The analytical and statistical parameters for
Fig. 4. Estimated response surfaces for each pair of variables.
Table 3 Optimization of the extractive procedure (results from the ANOVA of effects contributing to the model (by RSM)) Effect A ([Buffer]) B (Shaking time) C (Phase ratio) AB AC BC AA BB CC Total error Total (corrected)
a b
Sum of squares 11750 362.705 47950 1128 17.645 167.952 2359 4562 2055 10660 77260
d.f.a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 15
Mean square 11750 362.705 47950 1128 17.645 167.952 2359 4562 2055 1777 5150
F-ratio 6.614 0.204 26.981 0.635 0.009929 0.09451 1.327 2.567 1.156
p-valueb 0.0422 0.6673 0.0020 0.4561 0.9239 0.7689 0.2931 0.1602 0.3235
Degrees of freedom. Effect is declared signicant if p-value <0.05.
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I.D. Mer s et al. / Talanta 74 (2008) 675682 a Table 4 Piceid concentration found by the extractive-derivative-photoinduceduorescence method and by HPLC [32] in the validation stage Method [Piceid] ( g mL1 ) Young red wine Extractive-derivativephotoinduceduorescencea HPLCb
a b
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Barrel-aged red wine 0.84 0.14 0.76 0.08
White wine 0.17 0.03 0.20 0.01
0.75 0.11 0.72 0.05
Standard addition (three additions by triplicate). Average standard deviation (n = 3).
the determination of trans-piceid in these conditions are summarized in Table 1. The optimized extractive-photoinduced-uorescencederivative method was applied to the analysis of total piceid in wine samples. Young and barrel-aged red wine and white wine pools were analyzed in order to representing the commonest interferences in any future wine analysis. The standard addition method was applied in any case on the diluted wine samples by adding them increasing volumes of a trans-piceid ethanolic stock solution before irradiating, and the correspondent plots analytical signal vs added concentration of trans-piceid, were constructed. The slopes comparison test was applied between these plots and the constructed by extracting irradiated standards of trans-piceid without wine, and it was found that there was matrix effect, and the standard addition method is necessary in order to eliminate it. Lastly, in order to improve the simplicity and speed of the method it was proven that the standard addition can be carried out on the nal hydroethanolic reconstituted solution, by adding successively small volumes of a trans-piceid standard solution irradiated in the same conditions as the diluted wine samples, instead of on separated diluted wine solutions before extracting. We have found that these two calibration plots, taking into account the recovery percentage in the extraction, have similar slopes, which involves that the matrix effect does not occur in the extraction nor in the photoreaction stage, but in the uorescence measure. This means that a single extraction is necessary per wine sample, and the results are not altered. The concentrations of piceid in wines, calculated taking into account the 61% extraction recovery, are summarized in Table 4 in comparison with those calculated by a HPLC method with isocratic elution (C18 column; mobile phase: acetonitrile/acetic acid (10%, v/v)/water, 19/33/48, v/v/v, 0.8 mL min1 ) and photochemical pre-column derivatization and uorescence detection (exc/em 260/364 nm), developed by the authors [32], in the validation stage. 4. Conclusions It has been demonstrated that a very weakly uorescent analyte has been photochemically converted into highly uorescent products. Based on literature data [35], it is possible that phenanthrene derivatives to be originated as a result of the UV-irradiation of piceid solutions. The complete structural elu-
cidation for these photoproducts is a new challenge for the future research work of this group. It has been proposed a new, simple, fast and inexpensive method for the determination of piceid in wine by second-derivative-photochemically induced uorescence coupled with liquidliquid extraction. The optimization of the variables involved in the extraction procedure by using chemometric tools (Central Composite Design and Response Surface Methodology) gives good results. The accuracy of the proposed method has been validated by comparison with a chromatographic method developed by the authors and it has been applied successfully to different wine samples. Limits of detection (according to Clayton criteria [34]) ve times lower than the better reported [18] (S/N = 3) have been achieved. Better precision (% RSD) values than ours have been previously reported [14] when precision is evaluated at higher concentration levels ( g mL1 ). Although a previous clean-up stage is needed, the solvent used is rapidly eliminated, which implies a fast analysis, so the spent time in the whole procedure, is comparable to the expended time in the fastest reported HPLC methods, when sample preparation is not necessary [15,17,19]. Acknowledgements The authors acknowledge to Ministerio de Educaci n y Cieno cia (Project: CTQ2005-02389) for nancial support. Diego Airado Rodrguez is grateful to the Consejera de Infraestruc tura y Desarrollo Tecnol gico de la Junta de Extremadura for a o fellowship (DOE 22/06/04). Dra. Dolores L pez Soto (Vi aoliva o n S.C.) is also acknowledged for providing wine samples. References
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Teresa Galeano-Daz Isabel Durn-Mers Diego Airado-Rodrguez

Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Badajoz, Spain
Original Paper Isocratic chromatography of resveratrol and piceid after previous generation of fluorescent photoproducts: Wine analysis without sample preparation
Resveratrol and its 3-glucoside (piceid), are stilbene-like molecules produced by plants. Both of them are weakly fluorescent, but highly fluorescent compounds are obtained when their hydroethanolic solutions are UV-irradiated, which implies a substantial improvement in the sensitivity of analytical methods. Experimental design (central composite design) together with the response surface methodology have been used to find optimum conditions for the fast, sensitive, and precise chromatographic analysis (with isocratic elution) of resveratrol and piceid in wine samples. These compounds have been UV-transformed into their respective photoproducts, which have been separated in a C18 column (Novapack C18 15063.9 mm, 4 lm) by isocratic elution, using a mobile phase made up of acetonitrile and 4.1 vol% aqueous acetic acid, 19:81 v/v, at a flow rate of 0.8 mL/min, and fluorimetrically detected at 364 nm (kexc = 260 nm). Detection limits (S/N = 3) are 0.29 and 0.28 lg/L for resveratrol and piceid, respectively. The method has been applied to the analysis of these compounds in wine samples without a clean-up step. The analysis is completed in only 20 min. The standard addition method has been applied to the analysis of a commercial red wine and average recoveries near 100% were obtained for resveratrol and piceid. Three wine pools were satisfactorily analysed by external calibration.
Keywords: Isocratic HPLC / Photochemical-derivatization / Piceid / Response surface methodology / Resveratrol / Wine / Received: June 28, 2007; revised: August 6, 2007; accepted: August 6, 2007 DOI 10.1002/jssc.200700285
1 Introduction
Resveratrol (3,49,5-trihydroxystilbene) is a stilbene phytoalexin, and it has been identified as a constituent of various plant species. Its production increases in response to stress of the plant or fungal infection [1], among other causes. It appears in grapes as well as in wine [1 3]. In wine, resveratrol occurs free, and as glucoside (piceid), in their respective isomeric forms (Fig. 1). Piceid is the major polyphenol found in the root of the medicinal plant Polygonum cuspidatum. The powder of this
Correspondence: Professor Teresa Galeano-Daz, Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Avda. de Elvas s/n, C.P. 06071 Badajoz, Spain E-mail: tgaleano@unex.es Fax: +34 924289375 Abbreviations: BSTFA, bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide; CLD, chemiluminiscent detection; DAD, diode array detection; ECD, electrochemical detection; FLD, fluorimetric detection; RSM, response surface methodology
root is used in China and Japan for treatment of some cardiac ailments, including atherosclerosis and inflammation [4]. The evidence for piceid in red wines was established by the use of a piceid standard extracted from P. cuspidatum [5]. Resveratrol can inhibit cellular events associated with tumour initiation, promotion, and progression [6], reduce cell death from oxidative stress [7], inhibit the oxidation of human low-density lipoprotein (LDL) [8] and inhibit platelet aggregation and eicosanoid synthesis [9], and it is an agonist for the estrogen receptor. Piceid isomers have properties similar to those of resveratrol in inhibiting platelet aggregation [10] and inhibiting oxidation of human low-density lipoproteins. On the other hand, in a less active manner than trans-resveratrol, transpiceid reduces the elevations of lipid levels and inhibits eicosanoid synthesis [11]. However, the human digestive tract is known to have glycosidase activity, so it is possible that the glucoside of resveratrol could release the aglycone on ingestion.
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2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
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Liquid Chromatography
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Figure 1. Chemical structures of resveratrol and piceid isomers, and suggested structures for their respective photoproducts.
In a recently published review, the levels of resveratrol and piceid in red wines from different regions are compared [12]. Based on this paper, red wine contains as much as 14.3 mg/L, and 29.2 mg/L of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively. On the other hand, levels of resveratrol and piceid in red and white wines are quite different, thus 100 lg/L has been reported as the maximum level of resveratrol in white wines [2]; the higher concentrations in red wines are partially due to the winemaking process, but they also depend on the grape variety, environmental factors in the vineyard, and wine processing techniques [13]. Piceid has received similar attention to resveratrol because, in grape products, the concentration of the glucoside is usually significantly higher than the aglycone [14]. The relative distribution between the glucosylated and aglycone forms in wine is dependent on a number of factors such as fermentation and ecological conditions [15]. Resveratrol in all its forms is found in much higher concentration in red grape varieties than in white grapes. On the other hand, due to the generally high ratio of trans- to cis-isomers found in wines, it has been suggested that the cis-isomers could arise from light exposure of must or wine during the wine-making process, or possibly from light exposure of wine bottles during storage [5].
In recent years, reverse phase high performance liquid chromatography with acidic solvent gradient elution has been the most commonly used procedure for the determination of resveratrol and/or piceid in wine, with either diode array detection (DAD) [16 19], fluorimetric detection (FLD) [20, 21], DAD FLD [22, 23], chemiluminescent detection (CLD) [24, 25], electrochemical detection (ECD) [23], or mass spectrometry (MS) [23] and DAD MS [26]. Detection based on electrochemistry, luminescence, and MS offers higher sensitivity than DAD. Gas chromatography tandem MS, previous derivatization, normally with bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA), before column application [27], and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with UV-detection [28], capillary zone electrophoresis (CZE), with DAD [29] or ECD [30], or non-aqueous CZE with DAD [31] have been also employed for the analysis of resveratrol. Piceid has been also analyzed by CZE, with DAD [32]. In liquid chromatographic methods, acetonitrile or methanol and acetic or formic acids are the most widely employed organic solvent and acid, respectively, in mobile phases to carry out the elution (always in gradient programs). trans-Piceid and trans-resveratrol themselves are weakly fluorescent, but intense UV-irradiation of their alcoholic solutions first induces their isomerization into cis-isomers, also weakly fluorescent, which very quickly disapwww.jss-journal.com
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pear in favour of highly fluorescent compounds [33, 34], by means of which total (trans-isomer plus cis-isomer) resveratrol and piceid present in a sample can be analyzed. We have exploited, for the first time, this photochemical behaviour to develop a sensitive chromatographic method for the analysis of these compounds by previous UV-irradiation of the samples before injecting them into the chromatographic system. As with other analytical techniques, optimization of the variables in HPLC can be carried out by using chemometric techniques, such as experimental design and response surface methodology (RSM). The use of these tools has the advantage of attaining the optimal values of the variables, with the smallest number of experiments and in the shortest time. Thus the goal of the present study is the development of a sensitive and fast method, for the simultaneous chromatographic determination of total (trans-isomer plus cisisomer) resveratrol and piceid in wine samples, quantifying them through the peaks of their fluorescent photoproducts. Finally, the method was validated in terms of linearity, limits of detection, and repeatability, and it was applied to the analysis of wine samples. Detection limits have been calculated, and were found to be significantly lower than the expected levels of these compounds in wines. Thus the method allows easy determination without prior stages of sample cleaning or concentration.
2.3 Instrumentation and software

The chromatographic studies were performed on a Hewlett-Packard Mod. 1100 LC instrument, equipped with degasser, quaternary pump, manual six-way injection valve with a 20-lL loop, UV-visible diode-array detector, rapid scan fluorescence spectrophotometer detector, and the Chemstation software package to control the instrument, data acquisition, and data analysis. The analytical column used was a Nova-Pak C18, 15063.9 mm id, 4 lm particle size, and 60 pore size (Waters Millipore). The mobile phase consisted of a mixture acetonitrile acetic acid (4.1%), 19:81, v/v. Mobile phase components were filtered through a 0.22-lm membrane nylon filter and degassed by ultrasonication before use. The flow-rate was 0.8 mL/min. UV detection was performed at 306 nm, and fluorescence detection was performed at 364 nm (kexc = 260 nm). Samples were filtered through 0.22-lm membrane nylon filters before injection. An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model 8500 power supply was used for the UV-irradiation of solutions. The software package The Unscrambler 6.11b CAMO ASA [35], running under Windows XP, was used for chemometrics work.
2.4 General procedure: Calibration curves

Aliquots of trans-resveratrol and trans-piceid ethanolic solutions containing between 0.1 and 100 lg of each compound were placed in 10.0 mL volumetric flasks, ethanol was added up to 4.0 mL (final medium composition ethanol water 40:60, v/v.), and ultrapure water was added to the mark. The resulting solutions were irradiated for 90 s under a high pressure mercury lamp, and a 20-lL volume of each irradiated solution was injected into the chromatographic system after previous filtration through a 0.22 lm membrane nylon filter. The eluate was fluorimetrically monitored at 364 nm (kexc = 260 nm).
2 Experimental
2.1 Chemicals and solutions
All solvents were of gradient grade for liquid chromatography (Merck, Spain). All other chemicals were of analytical reagent grade and used without further purification. Ultrapure water, obtained from a Millipore Milli-Q System, was used throughout. trans-Resveratrol and trans-piceid were obtained from Sigma and Aldrich Chem. Co., respectively, and used as received. 50.0 lg/mL ethanolic stock solutions were prepared and stored at 48C in darkness. Fresh working standard solutions were prepared by appropriate dilution of stock solutions in absolute ethanol and water 40:60, v/v.
2.5 Procedure for the analysis of total resveratrol and piceid in wine samples
Aliquots of 2.0 mL of wine (12% ethanol) were placed in 10.0 mL volumetric flasks, and 3.75 mL of ethanol and water to the mark were added (final medium composition ethanol water 40:60, v/v). The resulting solutions were irradiated for 90 s under a high pressure mercury lamp, and a 20-lL volume of each one of the irradiated solutions was injected into the chromatographic system, after previous filtration through a 0.22 lm membrane nylon filter. The eluate was fluorimetrically monitored at 364 nm (kexc = 260 nm).
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2.2 Wine samples

Several samples of young red wines, barrel-aged red wines, and white wines were provided by Viaoliva, Sociedad Cooperativa (Almendralejo, Badajoz, Extremadura, Spain) and three different pools were made with the whole samples. Samples were kept at 48C avoiding exposure to direct light.
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3 Results and discussion

The photoinduced spectrofluorimetric behaviour of resveratrol and piceid has been previously studied by us, and the results reported in recent papers [36, 37]. In short, hydroethanolic solutions of trans-resveratrol and trans-piceid are weakly fluorescent, showing excitation maxima centred at 225 and 318 nm, and 230 and 300 nm, respectively, and emission maxima centred at 385 and 395 nm, respectively. It has been proven that intense UV-irradiation of those solutions under a high pressure mercury lamp totally transforms resveratrol and piceid into highly fluorescent compounds, with a single and sharp excitation maximum at 260 nm, and two emission maxima at 364 and 382 nm, and 361 and 380 nm, respectively. The optimum values of irradiation time and ethanol percentage in the reaction medium are different for the two photoreactions. Thus it was previously determined by this research group [36, 37] that 60 and 180 s were the optimum irradiation times for resveratrol and piceid, respectively, and in both cases longer irradiation times led to the photo-destruction of the fluorescent photoproducts. On the other hand, the ethanol percentage in the photoreaction medium has a pronounced influence on the yield of these reactions, and for this reason ethanol water 40:60, v/v, and purely aqueous media were selected as optimum solvents for resveratrol and piceid photoreactions, respectively. Thus it was necessary to choose compromise values for these variables to perform simultaneous chromatographic determination of resveratrol and piceid in a single run. Taking into account, first, that resveratrol concentrations in wine are lower than piceid concentrations, and, secondly, that the elution time for resveratrol is higher than for piceid, which implies that dispersion has a greater effect on the resveratrol peak, the compromise irradiation time and ethanol proportion were selected to be more favourable for resveratrol determination, and further experiments on irradiated samples were carried out by irradiating solutions in a 40:60, v/v ethanol water medium for 90 s.
3.1 Previous chromatographic studies

In order to study the respective photodecomposition processes by chromatography, aliquots of non-irradiated and irradiated standard solutions of resveratrol and piceid were injected into the chromatographic system. These samples were initially eluted in isocratic mode with a mixture of acetonitrile acetic acid (3.2%), 22:78, v/v. Chromatograms corresponding to a mixture of transresveratrol and trans-piceid and their corresponding photoreaction products are depicted in Fig. 2-top. As shown in Fig. 2A, trans-resveratrol and trans-piceid were UVdetected at 306 nm in non-irradiated samples at 6.1 and
2.4 min, respectively, but these compounds were not fluorescently detected (Fig. 2B), as they themselves are weakly fluorescent. When these solutions were UV-irradiated for 90 s, the peaks corresponding to trans-isomers, previously observed by UV-detection, became negligible and three new peaks were fluorimetrically observed. The products of the photoreactions were fluorimetrically monitored at 364 nm (kexc = 260 nm), and it was proven that a single photoproduct originated from resveratrol, designated FR, in accordance with previous results reported by Roggero et al. [33]. On the other hand, two fluorescent photoproducts, designated FP1 and FP2, were obtained from piceid. The fluorescence spectra corresponding to FP1 and FP2 are identical and, assuming that the photoproducts are phenanthrene derivatives, the formation of two isomers, namely 2,6-dihydroxyphenanthrene-4-b-D-glucopyranoside and 4,6-dihydroxyphenanthrene-2-b-D-glucopyranoside, from piceid and a single compound, 2,4,6-trihydroxyphenanthrene, from resveratrol, appears logical on the basis of literature data [38]. As shown in Fig. 2B, FP2 is much more abundant than FP1, and because of this FP2 will be used for the quantification of piceid, in the interests of method sensitivity. Before optimizing the mobile phase composition for the analysis of resveratrol and piceid in wine, the photodecomposition process was studied in wine samples in order to determine whether the wine matrix interferes with generation of the photoproducts. An aliquot of 2.0 mL of a commercial red wine was fortified with 9.8 and 11.4 lg of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively, and diluted to a final volume of 10.0 mL with ethanol and water (final percentage of ethanol 40 vol.%). This sample was injected into the chromatographic system before and after being irradiated for 90 s, and was eluted under the same conditions as the standard mixture. The recorded chromatograms are depicted in Fig.2-bottom. With this mobile phase, only trans-resveratrol is photometrically detected at 306 nm as a separated peak, and trans-piceid co-elutes with other compounds of the wine, Fig. 2C. By carrying out the photoreaction on a wine sample, it was proven that the photoreaction proceeds in the same way in the wine matrix, and the corresponding photoproducts were observed.
3.2 Optimization of the mobile phase for wine analysis by the RSM
Previously proposed methods for the analysis of resveratrol and piceid used a gradient solvent program for elution [16 26]. Methanol and acetonitrile are the most widely employed organic solvents, and formic and acetic acids are most widely employed to fix the pH of the aqueous phase. We chose acetic acid to fix the pH of the mobile phase and acetonitrile as organic solvent. Thus,
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Figure 2. Chromatograms corresponding to a sample containing 0.98 and 1.14 mg/L of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively, (A and B), and to an aliquot of 2 mL of a commercial red wine fortified with 9.8 and 11.4 lg of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively and diluted to a final volume of 10.0 mL (C and D), non-irradiated ( N N N .) and irradiated for 90 s (). Mobile phase acetonitrile acetic acid (3.2%), 22:78, v/v, 0.8 mL/min; UV-detection at 306 nm, and FLD at kexc/em 260/364 nm.
we have selected an isocratic mobile phase acetonitrile water acetic acid in order to simplify the analysis, obtaining an adequate resolution of the peaks of interest with respect to other fluorescent compounds typically present in wine. Also, we have taken into account that the selected mobile phase could be used in the future to study the photodecomposition process in wine and to develop an on-line post-column photoderivatization methodology, which requires consideration of the resolution of the peaks corresponding to the trans-isomers, with respect to the peaks corresponding to other interferents of wine, in the optimization procedure. For optimization of the percentage of acetic acid and organic solvent in the isocratic mobile phase, an experimental design, central composite design (Fig. 3A), was used with the aim of calculating simultaneously the effect of the change in each one of these variables, and also its possible interaction. Five levels were fixed for each variable. There are also three central samples, giving rise to a total of 11 experiments (Fig. 3A). This design is rotatable, and therefore the precision in the calculation of the response is uniform over the whole experimental field. The selected response function (RF) was RF = (k9 N RRs)/t, where RRs is the sum of the resolution (Rs) corresponding to peaks FP1 (FLD), FP2 (FLD), and trans-resveratrol (UVD),
with respect to the main interfering peaks corresponding to wine components, k9 is the capacity factor for transpiceid (UVD), which is the first-eluted peak, near to nonretained compounds in some points of the design, and t is the time corresponding to the elution of the last peak (FR), which is always resolved, but at very high retention times with some of the assayed mobile phases. Rs has been maintained at 1.5 for the resolution values greater than this. With this RF the best separation of the analytes of interest from the interfering compounds in the wine would be achieved in the shortest time. RF = (k N RRs)/t Each experiment was carried out on two independent samples, corresponding to wine samples non-irradiated and UV-irradiated for 90 s. A sample containing 2.0 mL of a pool of commercial red wines (12% ethanol), volumes of trans-resveratrol and trans-piceid stock solutions containing 9.8 and 11.4 lg, respectively, ethanol up to 3.4 mL, and water to a final volume of 10.0 mL, was injected into the chromatographic system, without being irradiated, and irradiated for 90 s under a high pressure lamp, after previous conditioning of the system with each one of the assayed mobile phases, marked by the model. Elution was carried out at a flow rate 0.8 mL/
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Figure 3. (A) Central composite design and variable levels used for the optimization of the mobile phase. Vol.% Acetonitrile: 14.92, 17, 22, 27, 29.07. Acetic acid: 0.24, 0.9, 2.5, 4.1, 4.76. (B) Estimated response surface for the pair of effects% ACN, and % acetic acid.
Figure 4. Chromatogram (FLD kexc/em 260/364 nm) corresponding to a standard sample containing 290 and 340 lg/L of resveratrol and piceid, respectively, irradiated for 90 s, and eluted under optimum conditions.
min, and the eluate was photometrically and fluorimetrically monitored at 306 nm and kexc/em 260/364 nm, respectively. Optimization of the model was performed with The Unscrambler software package [35], and the results were interpreted with RSM. In the corresponding analysis of variance (ANOVA) a second-grade quadratic model is assumed (Model Check Quadratic, p-value (95%) = 0.0004). It was proven that the effect of % ACN (p-value = 0.0002) and the interactions % ACN % ACN (p-value = 0.0002) and % ACN % acetic acid (p-value = 0.0010) contribute significantly to the model for a 95% confidence level. Nevertheless, the effect of % acetic acid (pvalue = 0.0639) and the interaction % acetic acid % acetic acid (p-value = 0.0539) are not significant in the model for the considered confidence level. On the other hand, the p-value (95%) calculated for lack of fit was 0.0760, which means that the model describes the true shape of the response surface. Fig. 3B shows the response surface
estimated by the model for the studied pair of variables. The maximum point of this surface corresponds to the values of the variables 19% ACN and 3.3% acetic acid. Thus, the mobile phase selected as optimum for the determination of resveratrol and piceid in wines was acetonitrile acetic acid (4.1%), 19:81, v/v. Under these conditions, the three fluorescent photoproducts are baseline resolved in less than 20 min, as shown in Fig. 4, and the retention times and capacity factors are 5.1, 7.3, and 17.9, and 2.7, 4.4, and 12.2, respectively, for FP1, FP2, and FR, respectively.
3.3 Method validation. Analytical parameters

The linearity of the method was assessed by preparing calibration standards with concentrations ranging from 1.0 to 1000 lg/L of each analyte. Each standard was introduced into the chromatographic system in triplicate with the mobile phase determined as optimum and
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Table 1. Analytical and statistical parameters for the chromatographic determination of total resveratrol and piceid. Resveratrol Linearity range (lg/L) Calibration curve (Peak area vs. lg/L) r2 LODa) (lg/L) LOQb) (lg/L) Repeatability % RSDc)
a) b) c)
Piceid 1 1000 y = (0.732 l 0.004) x (7.36 l 1.56) 0.999 0.28 0.95 4.6
1 1000 y = (1.22 l 0.01) x (12.5 l 2.5) 0.999 0.29 0.97 9.5
S/N = 3. S/N = 10. n = 11.490 and 570 lg/L of trans-resveratrol (FR) and trans-piceid (FP2), respectively.
Table 2. A) Results of the chromatographic procedure for the determination of resveratrol and piceid in a commercial red wine, using the standard addition method. Resveratrol Added (mg/L) Found (mg/L)a) Recovery (%)a) 119 l 4 103 l 7 112 l 3 102 l 9 Added (mg/L) Piceid Found (mg/L)a) Recovery (%)a) 107 l 1 98 l 2 106 l 1 101 l 6
0.00 2.12 l 0.04 1.02 3.74 l 0.11 2.55 4.82 l 0.31 3.57 6.36 l 0.16 5.10 7.39 l 0.68 Slope calibrationb) In absence of wine: 1154 In presence of wine: 1180
a) b)
0.00 31.54 l 0.39 1.11 34.98 l 0.19 2.78 33.71 l 0.84 3.89 35.56 l 0.38 5.55 37.31 l 2.1 Slope calibrationb) In absence of wine: 281.8 In presence of wine: 274.9
Average l standard deviation (n = 2). Peak area vs. mg/L.
Table 2. B) Results obtained in the analysis (mg/L) of total resveratrol and piceid in wine pools by external calibration Young red wine Resveratrol Piceid 0.28 l 0.01 0.72 l 0.05 Barrel-aged red wine 0.27 l 0.02 0.76 l 0.08 White wine 0.15 l 0.01 0.20 l 0.01
Repeatability was evaluated by performing 11 successive injections of analytes at the concentration levels 490 lg/L for resveratrol and 570 lg/L for piceid.
3.4 Determination of total resveratrol and piceid in wine samples

The optimized method was applied to the analysis of wine samples. First, a standard addition was carried out on a commercial red wine in order to examine the possible matrix effect, and to calculate the recoveries at different concentration levels. It was proven that there is no matrix effect by comparing the slope of the calibration graph obtained by external calibration with that of the standard addition plot, and then recoveries at four different concentration levels were calculated for resveratrol and piceid. As shown in Table 2, the recoveries are highly satisfactory at around 100% in all cases. Secondly, the method was applied to the analysis of a large number of samples by external calibration. All the wine samples were divided into three groups: young and barrel-aged red wine and white wine, in order to represent the commonest interferences in any future wine analysis. Samples of each pool were prepared in triplicate
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eluted at a flow rate of 0.8 mL/min, after previous irradiation of samples for 90 s under a high pressure mercury lamp. Resveratrol and piceid were quantified through FR and FP2, respectively. Calibration curves were built by plotting the mean of the obtained area as a function of the standard concentration. The results obtained are summarized in Table 1. The limits of detection and quantification were obtained as 3 and 10 times, respectively, the signal-tonoise ratio. Thus the average amplitude of the baseline of standard chromatograms, measured in different zones, for time intervals of around two minutes, was multiplied by 3 or 10, and the concentrations of resveratrol or piceid corresponding to these signals were calculated with the respective calibration curves constructed employing the peak height as analytical signal.
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Figure 5. Chromatograms (FLD kexc/em 260/364 nm) corresponding to a standard sample containing 290 and 340 lg/L of resveratrol and piceid, respectively ( N N N ), and young red (A, ), barrelaged red (B, ), and white (C, ) wine pools irradiated for 90 s, and eluted under optimal conditions.
according to the sample preparation protocol previously detailed. A 20 lL volume of each one of the resulting samples was injected into the chromatographic system, and the eluate was fluorimetrically monitored at 364 nm (kexc = 260 nm). Chromatograms corresponding to the three pools are represented in Fig. 5, in comparison with a standard solution containing 290 and 340 lg/L of resveratrol and piceid, respectively. The results obtained on analysis of the three pools are also summarized in Table 2. To sum up, the concentration of these two stilbenes are correctly determined at low concentration levels in a simple and fast manner.
The content of resveratrol and piceid in these wine pools was also determined spectrofluorimetrically by methods previously proposed by us [36, 37], and the results obtained agree with those presented here. Finally, in the chromatograms obtained under optimized conditions for some of the analysed red wines, a peak very close to that of FP2 is observed (Fig. 6A). However, the emission spectrum of the interferent compound and that corresponding to FP2 are slightly different (Fig. 6B), which led us to eliminate the contribution of the interferent by selecting as analytical signal the difference between the peak areas obtained on detection at 369 and 348 nm (kexc = 260 nm), isoemissive points in the emission spectrum of the interferent, but not in that of FP2.
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Figure 6. (A) Chromatogram (FLD exc/em 260/364 nm) corresponding to a standard sample containing 290 and 340 lg/L of resveratrol and piceid, respectively ( N N N ), and chromatograms obtained at kem 348 ( ) and 369 nm ( ) (kexc 260 nm), and the chromatogram difference between them () for a commercial red wine. (B) Emission spectra (kexc 260 nm) at the marked points of the chromatogram.
4 Concluding remarks
Very weakly fluorescent analytes (trans-resveratrol and trans-piceid) have been photochemically converted into highly fluorescent products, and on that basis a new, fast, and sensitive isocratic chromatographic method with fluorescence detection has been proposed for the analysis of resveratrol and piceid in wine samples. Satisfactory results have been obtained in the analysis of different wine pools. It is very important to highlight that the photochemical behaviour of the two compounds has been exploited here for the first time with the aim of improving their chromatographic analysis in wines, and the results open the way for other interesting alternatives. Lowest LOD (S/N = 3) in reported HPLC methods with DAD, FLD, or MS detection are in the order of ppb [16, 18, 20, 21, 25, 26]. The LOD for the method reported in this paper is 10 or even 100 times lower than these. There is only one reported HPLC method with chemiluminiscent detection in which a LOD of 0.2 lg/L has been reached [24]. Nowadays, our main challenges in this field are on the one hand the study of the photodecomposition process and the identification of the photoproducts (elucidation of their structures), and on the other hand the design of a system for the post-column derivatization on-line. The authors acknowledge the Ministerio de Educacin y Ciencia (Project: CTQ2005-02389) for financial support. Diego Airado Rodrguez is grateful to Consejera de Infraestructura y Desarrollo Tecnolgico de la Junta de Extremadura for a fellowship (DOE 22/06/04). Dra. Dolores Lpez Soto (Viaoliva S.C.) is also acknowledged for providing wine samples.
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Food Chemistry 109 (2008) 825833 www.elsevier.com/locate/foodchem
Analytical Methods
Post-column on-line photochemical derivatization for the direct isocratic-LC-FLD analysis of resveratrol and piceid isomers in wine
Isabel Duran-Meras *, Teresa Galeano-Daz, Diego Airado-Rodrguez
Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Avda. de Elvas s/n, C.P. 06071 Badajoz, Spain Received 24 July 2007; received in revised form 28 December 2007; accepted 31 December 2007
Abstract Resveratrol is a stilbene produced by plants, e.g. grapes, in response to stress. Resveratrol is extracted during winemaking, being present in wine as 3-O-b-D-gluocoside (piceid) and as aglycone. Both, resveratrol and piceid exist in two isomeric forms, trans and cis. Resveratrol and piceid are weakly uorescent in both of their isomeric forms, but highly uorescent compounds are obtained when the original molecules are UV-irradiated. A chromatographic method with post-column on-line photoderivatization, has been developed for the analysis of resveratrol and piceid isomers. The four analytes are rstly separated in a C18 column (150 mm 3.9 mm i.d., 4 lm) by isocratic elution, at 15 C, with a mobile phase consisting of a mixture acetonitrile:o-phosphoric acid (0.04%), 18:82, v:v, at 0.9 mL min1, and secondly they are on-line phototransformed into their uorescent photoproducts in a 3 m PTFE tube coiled around a 4 W xenon lamp. The elution conditions have been chemometrically optimized by means of the experimental design and the response surface methodology. Linearity ranges from 0.10 to 1.50 and from 0.10 to 1.00 lg mL1 and LOD around 0.001 and 0.01 lg mL1 have been calculated for trans- and cis-isomers, respectively. The method has been satisfactorily applied to red and white wine samples by standard addition and external calibration, respectively. 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Resveratrol; Piceid; Post-column photochemical derivatization; LC; Response surface methodology; Wine
1. Introduction Resveratrol (3,40 ,5-trihydroxystilbene), is a stilbene produced by plants in response to fungal infection or abiotic stresses such, e.g. produced by heavy metal ions. It occurs in mulberries, peanuts and grapes. Grapes contain a large amount of dierent phenolic compounds in skins, pulp and seeds, that are partially extracted during winemaking (Jackson, 1994). It is believed that the high level of this compound in red wine (0.115 mg/L, of total trans-resveratrol, i.e. aglycone and glucoside forms) (Fremont, 2000) is linked to the low incidence of heart diseases in some regions of France, the
Corresponding author. Tel./fax: +34 924289375. E-mail address: iduran@unex.es (I. Duran-Meras).
so-called French paradox, i.e. despite high fat intake, mortality from coronary heart disease is lower due to the regular drinking of wine (Corder et al., 2001; Soleas, Diamandis, & Goldberg, 1997). This compound has attracted considerable attention due to its various biological and pharmacological activities, including antioxidative and anticancer activities, being implied in the inhibition of cellular events associated with tumour initiation, promotion and progression (Savouret & Quesne, 2002). Resveratrol-3-O-b-D-glucoside (piceid) is the main component of the Polygonum cuspidatum root, used in Japanese and Chinese folk medicine for the treatment of some cardiac ailments, including atherosclerosis and inammation. trans-Resveratrol, trans-piceid, and their cis-isomers s, have been found in wines (Lamuela-Ravento Romero Perez, Waterhouse, & de la Torre-Bororat, 1995).
0308-8146/$ - see front matter 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.foodchem.2007.12.080
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I. Duran-Meras et al. / Food Chemistry 109 (2008) 825833
c-Resveratrol, t-piceid, and c-piceid are physiologically as important as t-resveratrol. It seems that t-piceid can be more eectively absorbed than the aglycone; according to Hollman (1997), the absorption of some phenols from the diet is enhanced by conjugation with glucose. Piceid has received such attention as resveratrol because, in grape products, the concentration of the glucoside is, usually, signicantly higher than the aglycone (Lamuela Raventos & Waterhouse, 1999). The relative distribution between the glucosilated and aglycone forms in wines, is dependent on a number of factors such as fermentation and ecological conditions (Moreno-Labanda et al., 2004). It is a fact that resveratrol in all its forms is found in much higher concentration in red grape varieties compared with white grape ones. On the other hand, due to the generally high ratio of tto c-isomers found in wines, it has been suggested that the c-isomers could arise from light exposure of must or wine during the winemaking process or possibly from light expos sure of wine bottles during storage (Lamuela-Ravento et al., 1995). Numerous methods have been described to determine the concentration of the four resveratrol derivatives in wine, most of them, HPLC methods by acidic solvent gradient elution. Currently, HPLC detection procedures are based upon UV absorption (Abril, Negueruela, Perez, Juan, & Estopan n, 2005; Castellari, Sartini, Fabiani, a Arfelli, & Amati, 2002; Vitrac et al., 2005), uorimetry (Bravo, Silva, Coelho, Vilas Boas, & Bronze, 2006; Pineiro, Palma, & Barroso, 2006; Vitrac, Monti, Vercauteren, Def eux, & Merillon, 2002), electrochemistry (Bravo et al., 2006; Kolouchova Hanzlkova, Melzoch, Filip, & Smidrkal, 2004), and mass spectrometry (Bravo et al., 2006; Loredana La Torre, Saitta, Vilasi, Pellicano, & Dugo, 2006; Pozo-Bayon, Hernandez, Martn-Alvarez, & Polo, 2003). t-Piceid and t-resveratrol themselves are weakly uorescent, but intense UV-irradiation of their alcoholic solutions, rst induces the isomerization into c-isomers, also weakly uorescent, which very quickly disappear in favour of highly uorescent compounds (Roggero & GarcaParrilla, 1995; Roggero, 2000). With the objective of exploiting this photochemical behaviour, in favour of the method sensitivity, a chromatographic method for the analysis of total (t- plus c-) resveratrol and piceid in wine, previous o-line irradiation of samples, has been proposed (Galeano-Daz, Duran-Meras, & Airado-Rodrguez, 2007b). The aim of the present work was to design a system in which the photochemical process occurs on-line after the separation of isomers in the chromatographic column, i.e. an on-line post-column LC method. An isocratic mobile phase has been optimized for wine analysis, by using the experimental design and the response surface methodology (RSM). The method has been validated in terms of linearity and limits of detection, and has been successfully applied to the analysis of wine samples.
2. Experimental 2.1. Chemicals and solutions All solvents were gradient grade for liquid chromatography (Merck, VWR International Eurolab, SL; Carretera no. 152, km10; 08100 Mollet del Valles, Barcelona, Spain). All other chemicals were of analytical reagent grade and used without further purication. Ultrapure water, obtained from a Millipore Milli-Q System, was used throughout. t-Resveratrol and t-piceid were obtained from Sigma and Aldrich Chem. Co. (Sigma Aldrich Qumica, SA; Avda. Valdelaparra, 53; 28100 Alcobendas, Madrid, Spain) respectively, and used as received. Ethanolic stock solutions (100 lg mL1) of each compound were prepared and stored at 4 C in darkness. Fresh working standard solutions were prepared by appropriate dilution of stock solutions in ultrapure water. c-Resveratrol and c-piceid were in situ obtained by exposure of solutions of their t-isomers containing 1.5 lg mL1 to the sunlight for a period of thirty seconds. The concentration of the obtained c-isomers was calculated through the decrease of the chromatographic peaks of their respective t-isomers. 2.2. Wine samples Several samples of red and white wine, were obtained in the market. Samples were kept at 4 C avoiding exposure to direct light. 2.3. Instrumentation and software The chromatographic studies were performed on a HewlettPackard Mod. 1100 LC instrument, equipped with degasser, quaternary pump, manual six-way injection valve containing a 20 lL loop, UVvisible diode-array detector, rapid scan uorescence spectrophotometer detector and the CHEMSTATION software package to control the instrument, data acquisition and data analysis. The analytical column used was a Nova-Pak C18, 150 mm 3.9 mm i.d., 4 lm particle size, and 60 A pore size (Waters Millipore). The column temperature was controlled by a coil with re-circulating water, which temperature was selected through a thermostatic bath. A post-column photoreactor (Softron, Gynkotek HPLC, Germany), consisting of a PTFE tube (3 m 0.3 mm I.D. 1.6 mm E.D.) coiled around a 4 W xenon lamp, was placed between the UVvisible diode-array detector and the uorescence detector. The mobile phase consisted of a mixture acetonitrile:o-phosphoric acid (0.04%), 18:82, v:v. Mobile phase components were ltered through a 0.22 lm membrane nylon lter and degassed by ultrasonication before use. The ow rate was 0.9 mL min1. Fluorescence detection was performed at 364 nm (kexc = 260 nm). A scan range from 200 to 500 nm was performed in DAD. Samples were ltered
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through 0.20 lm membrane PTFE lters (Millex-FG) before injection. The software package THE UNSCRAMBLER 6.11b CAMO ASA (Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway), running under Windows XP, was used for the application of chemometrics. 2.4. General procedure: calibration curves Aliquots of t-resveratrol and t-piceid ethanolic solutions, containing between 1.0 and 10 lg of each one of them, were placed in 10.0 mL volumetric asks, and ultrapure water was added up to the mark. Aliquots (20 lL) of each solution were injected into the chromatographic system, previous ltration through 0.20 lm membrane PTFE lters. The eluate was uorimetrically monitored at 364 nm (kexc = 260 nm). To obtain the calibration curves for the c-isomers, the procedure was: solutions containing 1.5 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid were exposed to the sunlight for thirty seconds. The resulting solutions were injected into the chromatographic system and the concentration of c-resveratrol and c-piceid in this solution was calculated through the decrease observed in the chromatographic peaks corresponding to their t-isomers, quantiable through their respective calibration curves, previously established. It was proven that the solutions containing c-isomers, kept in the dark, were stable at least for 24 h. Calibration curves for c-isomers were established from c-resveratrol and c-piceid samples, prepared by successive dilution of the sun-irradiated solutions, in the concentration range from 0.10 to 1.0 lg mL1. Aliquots (20 lL) of each standard solution were injected into the chromatographic system, and eluted and monitored as previously specied. 2.5. Procedure for the analysis of resveratrol and piceid isomers in wine samples 2.5.1. Red wines The analysis of the four compounds in red wine was carried out by the standard addition method. Identical aliquots of wine were added into a set of asks, and increasing volumes of a standard mixture of the four isomers, previously quantied, and ultrapure water were added to the mark. Aliquots (20 lL) of each one of these solutions were injected into the chromatographic system. 2.5.2. White wines In this case, the analysis was carried out by external standard calibration. Aliquots of 5.0 mL of wines and ultrapure water up to the mark were added in a 10-mL volumetric ask. 20 lL of the resulting solutions were directly injected into the chromatographic system. The concentration of the four analytes in white wine was calculated from their respective calibration graphs.
3. Results and discussion The study about the photoinduced spectrouorimetric behaviour of resveratrol and piceid has been recently pub lished (Duran Meras, Galeano Daz, & Airado Rodrguez, 2008; Galeano Daz, Duran Meras, & Airado Rodrguez, 2007a). In short, hydroethanolic solutions of t-resveratrol and t-piceid are weakly uorescent, showing two excitation maxima centered to 225 and 318 nm & 230 and 300 nm, respectively, and a single emission maxima centered to 385 and 395 nm, respectively. It has been proven that intense UV-irradiation of those solutions, under a high pressure mercury lamp, totally transforms resveratrol and piceid into highly uorescent compounds with a sharp excitation maxima at 260 nm, and two emission maxima at 364 and 382 nm & 361 and 380 nm, respectively. On the other hand, this photochemical behaviour, has been also exploited for the chromatographic analysis resveratrol and piceid in wine, previous photochemical derivati zation, (Galeano-Daz et al., 2007b). However, the main drawback of that method is the fact that total amounts (t- plus c-isomer) of each one of the analytes are determined, and it is not possible to determine the relative isomeric distribution of each one of them, because no the original analytes present in the sample, but their photoproducts, are injected and separated into the chromatographic system. In the method reported in this paper, t- and c-isomers of resveratrol and piceid are eluted in their original state, and once eluted and photometrically detected, they are phototransformed into their respective uorescent photoproducts, in order to increase the sensibility and selectivity in the detection. Most of the previously proposed chromatographic methods for the analysis of these analytes in wine, are reverse phase methods, and carry the elution out by a gradient, being the mobile phases mixtures of diluted acid solutions and organic solvents. Acetic and formic acids, and methanol and acetonitrile, are the most common acidic and organic components of mobile phases, respectively. In the development of a chromatographic method in which a post-column derivatization reaction goes on-line, it is highly important the composition of the mobile phase not only for the separation, but for the detection. Thus, some previous assays were carried out by uorescence spectroscopy. It was proven that the post-column photoreaction goes equally in neutral and acidic media when the pH was xed by the addition of diluted hydrochloric acid. It was also proven the minor photoinduced uorescent signals obtained in presence of any other acid, specially the organic ones, and nally o-phosphoric acid was chosen as a compromising solution. Regarding to the organic component of the mobile phase, it was proven that the rate of the photoreactions and the maximum photoinduced signal were similar in presence of dierent percentages of methanol or acetonitrile. Finally acetonitrile was chosen, mainly because of its lower viscosity, higher elution strength, and lower UV absorptivity. A study was rst done to evaluate the eect of the photoreactor on the uorimetric detection of a mixture of
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t-resveratrol and t-piceid. For this purpose, a mixture of both t-isomers was injected and eluted with a mobile phase consisting in acetonitrile:water 19:81, v:v, with the photoreactor turned OFF. Two chromatographic peaks were observed at 4.87 and 15.35 min, corresponding to t-piceid and t-resveratrol, respectively. A second injection under the same conditions, but with the photoreactor turned ON, showed that both compounds were greatly modied by photoreaction, and their uorescent photoproducts, discussed above, had been obtained in a certain extension. Fig. 1A shows a comparison of the obtained FLD-proles with and without post-column photoderivatization. Besides, it was chromatographically proven that increasing the content of o-phosphoric acid in the mobile phase, implies a slight reduction in the retention times and a loss of sensitivity in t-resveratrol and t-piceid chromatographic peaks. Lastly it is too important to highlight that nylon lters cannot be used to lter solutions containing resveratrol or piceid because it was proven that 100% of the analyte was retained in the membrane. Hydrophobic uoropore (PTFE) lters are used throughout this work. 3.1. Optimization of the chromatographic conditions, by the RSM, for the sensitive analysis of wine samples Separation and photoreaction results have to be taken into account to select the best mobile phase. Thus the nature of the mobile phase components was chosen looking
for the best environment for the reaction course, namely acetonitrile as organic modier and o-phosphoric acid to x the pH, were nally selected, as said above. On the other hand, in the present case, a photochemical reaction is going to take place, which implies that ultraviolet light could be considered as one of the reactants, and its concentration will be controlled through the residence time of the analytes in the photoreactor, that is, the mobile phase ow. Because of this, the sensitivity of the method will be mainly controlled through the mobile phase ow. An isocratic mobile phase has been looked for, and for the optimization of its composition, i.e. the percentage of acetonitrile and o-phosphoric acid, and its ow rate, the experimental design, namely a central composite design, has been used with the aim of calculating simultaneously the eect of the change in each one of the variables, and also their possible interactions. Five levels were xed for each variable. There are also three central samples, giving rise to a total of 17 experiments. The assayed levels for each one of the variables were: % vol. acetonitrile: 25.1, 23.0, 20.0, 17.0, 15.0; % vol. H3PO4: 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01; ow: 1.50, 1.30, 1.00, 0.70, 0.50. This design is rotatable, and therefore the precision in the calculation of the response is uniform over the whole experimental eld. A standard solution containing 0.50 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid, respectively, and a sample containing 7.50 mL of a pool of commercial red wines, fortied with 13 lg of t-resveratrol and t-piceid, respectively, in a nal volume of 25.0 mL, were eluted under the conditions indi-
A
F. I. (exc/em 260/364 nm)
10 8 t-Piceid 6 4 2 0 0 2 4 6 8 t (min) 10 12 14 16 18 t-Resveratrol
F. I. (exc/em 260/364 nm)
35 30 25 20 15 10 5 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
unknown t-Piceid t-Resveratrol
t (min)
Fig. 1. (A) Chromatograms corresponding to a mixture containing 1.00 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid, obtained with the photoreactor turned OFF () and ON ( ). Mobile phase acetonitrile:water 19:81, v:v, 0.9 mL min1; FLD at kexc/em 260/364 nm. (B) FLD-proles (FLD kexc/em 260/ 364 nm) corresponding to a standard sample containing 0.50 lg mL1 of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively (), and a sample containing 7.50 mL of a pool of commercial red wines, fortied with 13.0 lg of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively, in a nal volume of 25.0 mL ( ), eluted under conditions predicted as optimum and submitted to post-column photoderivatization.
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cated by the design. The photoreactor was turned ON during all the experiments, and the eluate was photometrically and uorimetrically monitored at 306 nm, and kexc/em 260/ 364 nm, respectively. In the selection of the response function (RF), sensitivity and sensibility parameters have been taken into account. The selected response function was PAt-Rht PAt-Pht RF R PA Peak Area st-Pic 2 norm The rst term represents the performance of the chromatographic separation, and the second one, the method sensitivity. The resolution of the t-piceid peak with respect to the wine interferences is taken as representative of the performance. In some samples of the design, this peak appears resolved from the pre-eluted or the post-eluted interferences, and in some other points it is completely co-eluted with wine interferences. So, R st-Pic is the less favourable resolution value for the peak corresponding to t-piceid, multiplied by two when the other resolution value for this peak is higher than 1.5. The peak corresponding to t-resveratrol was fully resolved in all of the assayed conditions, and because of this, the resolution of this peak was not included in the response function. The second term, evaluates the sensitivity through peak areas values. These depend on the photoreaction yield and uorescence quantum yield of the on-line generated photoproducts. This term has been obtained by normalizing the mean value of the peak areas of phototransformed t-resveratrol and t-piceid, measured in the standard mixture chromatograms. The strategy of normalizing the second term has been carried out to give a similar importance to both terms. The retention times were not considered, as in any case they were not longer than 30 min, an acceptable analysis time for an isocratic method. The optimization of the model was made with THE UNSCRAMBLER software package (Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway), and the results were interpreted with the Response Surface Methodology. In the corresponding analysis of variance (ANOVA) a second-grade quadratic model is assumed (model check quadratic, p-value (95%) = 0.0008). It was proven that the eects % ACN (p-value = 0.0310) and ow (p-value = 0.0067) and the interactions % ACN% ACN (p-value = 0.0019), % H3PO4% H3PO4 (p-value = 0.0002), and owow (p-value = 0.0001) contribute signicantly to the model for a 95% condence level. Nevertheless, the eect % H3PO4 (p-value = 0.0765), and the interactions % ACN % H3PO4 (p-value = 0.1348), % ACNow (p-value = 0.1013), and % H3PO4ow (p-value = 0.1725) are not signicant to the model for the considered condence level. On the other hand, the p-value (95%) calculated for lack of t was 0.0583, which means that the model describes the true shape of the response surface. Fig. 2 shows the response surfaces estimated by the model, for each pair
Fig. 2. Estimated response surfaces for each pair of variables.
of variables. In these surfaces, the maximum value of RF corresponds to the values of variables: 18% ACN, 3.3 102 % H3PO4, and ow 0.9 mL min1. Thus, the mobile phase selected as optimum was acetonitrile:o-phosphoric acid (0.04%), 18:82, v:v, at a ow rate of 0.9 mL min1. Under these conditions, both analytes are
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resolved to the baseline in less than 15 min, as shown in Fig. 1B, and the retention times and capacity factors are 4.65 and 14.37 min, and 2.1 and 8.58, respectively, for t-piceid and t-resveratrol, respectively. 3.2. Inuence of the temperature In a study of the interday precision, a poor reproducibility in the retention times for both compounds, and in the resolution of the peak corresponding to t-piceid with regard to the wine interferences, was observed when injections were carried out without xing the column temperature, and because of this, the inuence of the temperature was thoroughly studied at this point. Thus, a standard sample containing 1.0 lg mL1 of tresveratrol and t-piceid, and a commercial red wine sample three-times diluted with ultrapure water, were eluted under optimum conditions, keeping constant the column temperature by a coil with re-circulating water, which temperature was controlled through a thermostatic bath. The assayed values were 10, 15, 20, 25, and 30 C. An increase in the capacity factors of both compounds was observed as decreasing the temperature. On the other hand, it was found that when the temperature was higher than 15 C, a wine interference coeluted with t-piceid. Finally, a temperature of 15 C was selected as optimum, and it was xed for further analysis.
3.3. cistrans Isomery It has been described in the literature (Roggero, 2000; Roggero & Garca-Parrilla, 1995), and spectrophotometri cally proven (Duran Meras et al., 2008; Galeano Daz et al., 2007a), the cistrans photoisomery of resveratrol and piceid. c-Resveratrol and c-piceid are originated by exposing the corresponding t-isomers to sunlight, as shown in Fig. 3A. When the sunlight-exposed sample is eluted under conditions previously deducted as optimum, two new peaks are observed at 11.30 and 35.04 min, corresponding to c-piceid and c-resveratrol, respectively, apart from peaks corresponding to t-resveratrol and t-piceid. The establishment of the nature of those peaks has been carried out by obtaining the spectra in the peak with the diode-array detector. The peaks corresponding to c-isomers are totally resolved with regard to the corresponding to the t-ones. On the other hand, c-isomers are less polar than the t-ones, probably due to the intra-molecular interaction type hydrogen-bond between hydroxyl groups. In Fig. 3B, the FLD-chromatogram corresponding to a commercial red wine sample 20-times diluted, and a standard mixture of t-resveratrol and t-piceid 30 s exposed to the sunshine, are shown. In both cases the photoreactor is turned ON, and the corresponding uorescent photoproducts from t- and c-isomers are successfully obtained.
A
8 6
A290 nm (mAu)
0 240 360 0.5 4
t-Res
t-Pic
0 240 360
c-Res c-Pic
0.5
4 2 0 -2 0
0 240
360
0 240
360
10
20 t (min)
30
40
F. I. (exc/em 260/364 nm)
200 160 120 80 40 0 0 10 20 t (min) 30 40
t-Res t-Pic Unknown c-Pic c-Res
Fig. 3. (A) A290 nm-proles corresponding to a sample containing 0.80 lg mL1 of trans-resveratrol and trans-piceid before ( ) and after (-) a 30 s exposure to the sunshine, and apex-spectra on-line registered. (B) FLD-proles corresponding to a sample containing 1.40 lg mL1 of trans-resveratrol and trans-piceid 30 s exposed to sunshine ( ) and a commercial red wine 20-times diluted (-).
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As it is observed, the four isomers are present in the real sample. It is also observed a total resolution between the four compounds of interest and the wine interferences, and because of that it was not considered to change the mobile phase. It has been proven that intense ultraviolet irradiation, under a high pressure mercury lamp, totally transform t- and c-resveratrol and t- and c-piceid in highly uorescent photoproducts. A single photoproduct (FR) is originated from resveratrol, and two photoproducts (FP1 and FP2), isomers between them, from piceid (Galeano-Daz et al., 2007b). It is very important to highlight that the exposition to the sunshine has to be carried out for a time not so long in order to avoid the appearance of the corresponding uorescent photoproduct FP1, FP2, and FR, and thus avoiding errors in the c-quantication. It has been proven that only c-isomers, and not the uorescent forms, are generated when samples are exposed for 30 s under the sunshine, by comparing the chromatograms obtained for a sample irradiated under a high pressure mercury lamp in the necessary conditions to obtain the uorescent compounds, and the corresponding to a 30 s exposed to the sunshine. This fact has also been proven by following the photoreaction at the wavelength (275 nm) corresponding to the isobestic point of the on-line obtained spectra for each pair of t- and c-isomers. This isobestic point is shown in Fig. 4, where the spectra obtained in the peak apex for the pair c- and t-piceid are represented. Since at this wavelength the molar absorptivity of both isomers is the same,
the peak area vs. concentration ratio is also the same for the two peaks. Thus, the total area must be kept constant as the concentration of each pair cistrans does. This has been proven to be true in the present case, and it was also conrmed by the absence of any other photoproducts. With the aim of quantifying the four isomers in wine, the corresponding calibration graphs for the c-isomers were obtained by relating the area of the new peak attributed to the c-isomers, with the dierence between the concentrations of t-isomers, prior and after exposure to sunshine. 3.4. Method validation: analytical parameters The linearity of the method, was assessed by preparing calibration standards with concentration from 0.10 to 1.50 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid and from 0.10 to 1.00 lg mL1 of c-resveratrol and c-piceid, as previously explained. Each standard was introduced in the chromatographic system in triplicate, and eluted under optimum conditions. Calibration curves for each one of the four analytes, were built by plotting the mean of the obtained area for the phototransformed analytes as a function of the standard concentration. The results obtained are summarized in Table 1. The limits of detection (LOD) and quantication (LOQ) were obtained as 3 and 10 times, respectively, the ratio signal/noise. So, the average amplitude of the baseline of standard chromatograms, measured in dierent zones, for time intervals around 2 min, was multiplied by 3 or 10, and the concentrations of the respective analyte to these signals, were calculated with the respective calibration curves constructed employing the peak height as analytical signal. The obtained values are summarized in Table 1. 3.5. Determination of resveratrol and piceid isomers in wine samples The optimized method was applied to the analysis of wine samples. Firstly, a standard addition was carried out on commercial red and white wines pools in order to examine the possible matrix eect. Within the assayed whites wines it was proven the absence of matrix eect, and because of that, further analysis were carried out by external calibration.
21
7 6
14
A (mAu)
240 280 320 (nm) 360
A (mAu)
5 4 3 2 1
240
280 320 (nm)
360
Fig. 4. Apex-spectra on-line obtained corresponding to a solution containing trans-piceid before exposure to sunshine (-), and after a exposure of 30 s (-) and 60 s ( ). Isobestic point, at 275 nm, is rounded in the right gure.
Table 1 Analytical and statistical parameters for the chromatographic determination of resveratrol and piceid isomers (FLD kexc/em 260/364 nm) t-Resveratrol Linearity range (lg mL ) Calibration curve (peak area vs. lg mL1) r LODa (lg mL1) LOQb (lg mL1)
a b 1
c-Resveratrol 0.101.00 y = (2820.2 185.1)x + (320.3 104.7) 0.9957 0.014 0.046
t-Piceid 0.101.50 y = (4366.9 112.6)x (432.9 117.0) 0.9967 0.0014 0.0047
c-Piceid 0.101.00 y = (1902.5 241.5)x + (166.4 116.7) 0.9843 0.0071 0.023
0.101.50 y = (10581 355)x (673 340) 0.9944 0.0012 0.0041
S/N = 3. S/N = 10.
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Table 2 Concentration of resveratrol and piceid isomers found in the analyzed wines. Analysis was done in triplicate in all cases t-Piceid (lg mL1) Commercial red wines POOL 1 Commercial red wines POOL 2 Commercial white wines POOL Noble rot white wine (Tokaji) 6.5 0.5 1.2 0.1 0.099 0.013 0.29 0.05 c-Piceid (lg mL1) 2.9 0.3 1.5 0.1 0.42 0.02 0.70 0.02 t-Resveratrol (lg mL1) 1.4 0.1 0.070 0.050 0.054 0.009 0.070 0.010 c-Resveratrol (lg mL1) 0.21 0.12 0.060 0.020 0.068 0.010 0.064 0.050
In red wines, unlike in the white ones, it was found the existence of matrix eect, which implies that the analysis has to be carried out by the standard addition method. Besides it was deducted that the origin of this matrix eect is in the photochemical process, because no matrix eect was observed when peak areas were measured in the DAD-prole, being this detector before the photochemical reactor in the experimental device. Two commercial red wines pools and a white one were analyzed. Besides a noble rot white wine, from Hungary (Tokaji) was also analyzed. Results are summarized in Table 2. Higher levels of the four compounds, mainly of piceid isomers, are found in this wine than in an ordinary white wine, because this one is made from botrytized grapes. 4. Conclusions Resveratrol and piceid molecules are stilbenoids ones, and as such they suer interesting photochemical reactions. Our research group following with the aim of exploiting this photochemical behaviour, proposes an isocratic-LC method with post-column on-line photoderivatization, which let us rstly separate the cistrans-pairs, and then phototransform each compound in a highly uorescent one. The photochemical reaction has been doubly exploited in this case, rstly to obtain the c-compounds, which are not commercially available, and secondly to improve the uorimetric detection. As far as we know this is the rst time that an on-line post-column photoderivatization system is proposed for resveratrol and piceid isomers analysis. The analysis of four compounds in wine samples has been carried out in a total time of 35 min, without sample treatment. Acknowledgement The authors acknowledge to Ministerio de Educacion y Ciencia (Project CTQ2005-02389) for nancial support. Diego Airado Rodrguez is grateful to Consejera de Infrae structura y Desarrollo Tecnologico de la Junta de Extremadura for a fellowship (DOE 22/06/04). References
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USEFULNESS
OF
FLUORESCENT
LANDSCAPES
IN
COMBINATION WITH PARAFAC AS FINGERPRINTS OF RED WINES
1.- INTRODUCTION The interest in studying the chemical composition of wine is prompted by its importance for the assessment of wine quality. It is important to develop fast analytical methods without sample pre-treatment. In the last years the quality of wines has been highly improved by the wine industry and also the customers are raising their demand on the quality. Tools to handle and address the chemical analysis of these wines are becoming a necessity in wine industry in order to automate the production and stabilize the quality. Tools that allow classification of the wine depending on the region of origin, type of grapes used in the elaboration, or winemaking process can be helpful for this industry. Multidimensional fluorescence techniques, such as total luminescence is particularly useful for the analysis of complex food matrices. Total luminescence spectroscopy involves sequential acquisition of excitation or emission spectra at multiple emission or excitation wavelengths, respectively. The resulting emission-excitation data matrix (EEM) provides a total intensity profile of the sample over the range of excitation and emission wavelengths scanned. These methods are fast, non-invasive, sensitive and relatively low-cost. In addition, these techniques provide information about fluorescent molecules and their environment in biological and food samples, and are reported to be 100-1000 times more sensitive than other spectroscopic techniques1.
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G.M. Strasburg, R.D. Ludescher, Trends Food Sci. Technol. 6 (1995) 69-75
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In recent years, research has focused on the development of rapid and nondestructive techniques for the assessment of authenticity and classification of food products. Fluorescence spectroscopy is widely used to characterize the food quality, because of its high sensitivity and specificity and its possible use as non-destructive technique. Conventional right angle fluorescence is as a common detection technique mostly used in transparent and diluted solutions extracted from the sample, either directly or after chromatographic separation. More recently, front face fluorescence is recorded directly on the turbid or solid intact samples to rapidly and non-destructively assess food authenticity or monitor some parameters. The front-face illumination angle may vary between 30 and 60. Thus, fluorophores such as riboflavin, chlorophyll, tryptophan, tyrosin, phenylalanine, NADH, collagenous connective tissue and various oxidation products can be detected and quantified non-destructively. Dufour and co-workers have previously assayed the usefulness of single excitation (250-350 nm, em 376 nm) and emission (275-450 nm, exc 261 nm) spectra of wines for the purpose of investigating the variety, typicality and vintage of French and German wines. Emission spectra were characterized by a maximum at 376 nm, with a shoulder at 315 nm. The most important variation within the set of registered spectra for the studied samples, was found in the ratio peak/shoulder intensity. This preliminary study shows that front-face fluorescence spectroscopy combined with chemometrics offers a promising approach for the authentification of wines2. Bilinear models have been successfully applied to evaluate single autofluorescence spectra of meat3, fish4, dairy products5, cereals6, fruit
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. Dufour, A. Letort, A. Laguet, A. Lebecque, J.N. Serra, Anal. Chim. Acta 563 (2006) 292-299 3 J. P. Wold, M. Mielnik, M. K. Pettersen, K. Aaby, P. Baardseth, J. Food Sci. 67 (2002) 2397-2404
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juices7 and honey8. EEMs, however, have been shown to follow the threeway PARAFAC (PARAllel FACtor analysis) decomposition model9,10, and such multiway models have been applied to autofluorescence landscapes of intact food systems11, such as sugar12, meat13, fish oil14, cheese15, yogurt16 and edible oils17,18. Nevertheless, no previous references to the usefulness of fluorescence landscapes of wines have been found. The potential of fluorescent signals for the classification purpose is most likely increased when increasing the dimensionality of the data, thus 3D-data would often be more powerful than 2D ones, especially for interpretation purposes. Thus the total excitation-emission fluorescent matrices of red wines have been deeply studied in the present paper. The main aim of this work was to detect the main fluorescent components in red wine in order to improve the interpretation of the rather complex fluorescence spectra, as well as better understand the potential of the method. This was done by the use of a PARAFAC model applied on fluorescence landscapes of different wine samples. A wide variety of red
C. M. Andersen, J. P. Wold, J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 470-476 J. P. Wold, A. Veberg, A. Nilsen, V. Iani, P. Jucenas, J. Moan, Int. Dairy J. 15 (2005) 343-353 6 A. Kissmeyer-Nielsen, S. A. Jensen, L. Munck, J. Cereal Sci. 3 (1985) 181-192 7 P. Seiden, R. Bro, L. Poll, L. Munck, J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 3202-3205 8 K. Ruoff, R. Karoui, E. Dufour, W. Luginbuhl, J. O. Bosset, S. Bogdanov, R. Amado, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 1343-1347 9 R. Bro, Chemom.Intell.Lab.Syst. 38 (1997)149-171 10 C. M. Andersen, R. Bro, J.Chemom. 17 (2003) 200-215 11 J. Christensen, L. Norgaard, R. Bro, S. B. Engelsen, Chemical Reviews 106 (2006) 19791994 12 R. Bro, Chemom. Intell. Lab. Syst. 38 (1997) 149-171 13 J. K. S. Moller, G. Parolari, L. Gabba, J. Christensen, L. H. Skibsted, J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 1224-1230 14 D. K. Pedersen, L. Munck, S. B. Engelsen, J. Chemom. 16 (2002) 451-460 15 J. Christensen, E. M. Becker, C. S. Frederiksen, Chemom. Intell. Lab. Syst. 75 (2005) 201-208 16 J. Christensen, V. T. Povlsen, J. Sorensen, J. Dairy Sci. 86 (2003) 1101-1107 17 E. Sikorska, A. Romaniuk, I. V. Khmelinskii, R. Herance, J. L. Bourdelande, M. Sikorski, J. Koziol, J. Fluoresc. 14 (2004) 25-35 18 F. Guimet, J. Ferre, R. Boque, F. X. Rius, Anal. Chim. Acta 515 (2004) 75-85
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wine samples from different origins were collected in order to span the quality variation and reveal corresponding differences in fluorescence properties. A tentative identification of the fluorophores in wine was done by matching the PARAFAC-scores from each sample, with HPLC results, laying down qualitative principles for further development of quantitative methods for the fast measure of the concentration of such fluorophores. Furthermore, taking into account that wines from different countries are included in the model, the capability of the intrinsic fluorescence of wines for the purpose of classification, according to the origin, is assessed. This purpose is highly important for wine importing countries.
2.- MATHERIALS AND METHODS 2.1.- WINE SAMPLES 57 red wines from different origin were included in this study. Two samples from France, 16 from Chile, 3 from South Africa, 6 from Australia (2 of them from the Western zone), 3 from Spain, 6 from Argentina, 3 from USA, 15 from Italy, 1 from Tunisia, and 2 from Portugal. Samples were stored at 4 C, and the fluorescence landscape was registered immediately after opening the bottle. Origin of samples and type of grape, when this data is available is summarized in Table 1.
2.2.- FLUORESCENCE SPECTROSCOPY Fluorescence measurements were collected with a Perkin Elmer LS50B fluorescence spectrophotometer mounted with a variable angle front-face accessory to ensure that reflected light, scattered radiation and depolarisation phenomena were minimised. The angle of incidence, defined as the angle between the excitation beam and a perpendicular to the cell surface, was 30. Wine samples were placed in a 3 mL quartz cell and spectra were recorded at 15C. Slits at excitation and emission
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monochromators were set at 15 and 5 nm, respectively. Acquisition speed was fixed at 500 nm/min, as a compromising solution between noise in the spectra and collection time. Excitation and emission wavelengths ranges were 245-340 and 300-498.5 nm, respectively, with wavelengths increments of 5 and 0.5 nm, respectively. The landscape was registered as multiple emission spectra at decreasing excitation wavelengths, starting at 340 and finishing at 245 nm, to avoid sample alteration by the UV excitating beam. Total scanning time per sample was approximately 10 minutes. Measurements were performed within a short period of time (6 days) to minimize the effect of instrumental fluctuation (e.g. lamp intensity).
2.3.- FLUORESCENCE MEASUREMENTS ON STANDARDS All chemicals were of analytical grade. Ultrapure water, obtained from a Millipore Milli-Q System, was used throughout.Gallic acid, p-coumaric acid, ellagic acid, ferulic acid, gentisic acid, trans-resveratrol, trans-piceid, quercetin, rutin, catequin and epicatequin were obtained from Sigma. Vanillic acid, caffeic acid and sinapic acid, were obtained from Fluka. Stock solutions of standards were prepared in ethanol. Diluted solutions were prepared in a synthetic wine matrix, containing 3 g/L of tartrate buffer at pH 3.7, and 13 % v. of ethanol. Instrumental settings were similar to those employed in wine analysis, but in the 90 geometry.
2.4.- HPLC ANALYSIS With the objective of reaching a better knowledge of fluorescent molecules in wine samples, the 57 samples were chromatographied and the eluate was fluorimetrically monitored at the excitation/emission wavelengths pairs corresponding to the resulting PARAFAC components. An appropriate gradient program was chosen to carry out the elution of samples, with the
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objective of getting a good separation and a good profile of the fluorescent compounds in wine at each specific excitation/emission pair. Thus, three injections were made of each sample, monitoring the eluate at exc/em 260/360 (compromising wavelengths for PARAFAC component 1 and 4), 275/320 (PARAFAC component 2) 330/410 nm (PARAFAC component 3), respectively. The chromatographic separation was carried out using as mobile phase methanol-formic acid-water (10:2:88, v:v) as solvent A and methanolformic acid-water (90:2:8, v:v) as solvent B with the following gradient program: 0 min 100 % A; 15 min 85 % A : 15 % B; 25 min 50 % A : 50 % B; 34 min 30 % A : 70 % B. The flow rate was set at 0.25 mLmin-1. All solvents were gradient grade for liquid chromatography (Merck). All other chemicals were of analytical reagent grade and used without further purification. Ultrapure water, obtained from a Millipore Milli-Q System, was used throughout.
2.5.- MATHEMATICAL ANALYSIS OF DATA
2.5.1.- PRETREATMENT OF DATA SET Rayleigh signals in all of the EEM were removed by inserting the Matlab term NaN (Not a Number) in the Rayleigh zones and zeros in the zones where em<exc, because there is no emission at wavelengths below the excitation wavelength as this would correspond to higher energy being emitted than the energy causing the excitation. Zeros in this zone speeds up the calculations.10
2.5.2.- PARAFAC analysis When a sample produces a J x K matrix (a second order tensor), such as an EEM (J = number of emission wavelengths, K = number of excitation
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wavelengths), the corresponding set obtained by stacking all the registered matrices is a cube. Appropriate dimensions of such a cube are I x J x K (I = number of samples). Since EEMs follow a trilinear model, the cube can be written as a sum of tensor product of three vectors for each fluorescent component. If An, Bn, and Cn collect the relative concentration (I x 1), emission (J x 1), and excitation (K x 1) profiles for component n, respectively, the data cube F can be written as19,20 F=
n =1
An Bn Cn + E
where indicates the tensor product, N is the total number of fluorescent components, and E is a residual error term of the same dimensions as F. The column vectors An, Bn, and Cn are usually collected into the three loading matrices A, B, and C. A characteristic property of F is that it can be uniquely decomposed, providing access to spectral profiles (B and C) and relative concentrations (A) of individual components in the I mixtures, whether they are chemically known or not. This constitutes the basis of the so-called second-order advantage (second-order refers to the tensor order of a single sample data matrix, in contrast to third-order, as referred to the cube formed by the matrices of I samples). The PARAFAC analysis was performed in Matlab ver. 7.1.0 (The Mathworks Inc., MA, USA) by use of the PLS_Toolbox (Eigenvector Research Inc., WA, USA). To look into the whole set of fluorescence data, the EEMs of the 57 samples were arranged in a three-dimensional structure of size 57 x 398 x 20 (samples x number of emission wavelengths x number of excitation
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wavelengths). The array was decomposed by PARAFAC using different number of factors. In all cases non-negative constrains for the resolved profiles in all modes were applied. This was done to obtain a realistic solution, because the concentrations and the spectra should be positive.
2.5.3.-
PRINCIPAL
COMPONENT
ANALYSIS
OF
SCORE VALUES Principal component analysis (PCA) is a powerful visualisation tool for data evaluation, which can graphically represent inter-sample and intervariable relationships and provides a way to reduce the dimensionality of the data. PCA is an unsupervised method of pattern recognition in the sense that no grouping of the data has to be known before the analyses. Using PCA, class membership is easy to indicate on a score plot. The set of sample score values obtained in the PARAFAC decomposition were analysed by PCA, to analyse possible discrimination among origin and type of grape. PCA was run by means of The Unscrambler software package21.
3.- RESULTS AND DISCUSSION
3.1.- EXCITATION-EMISSION MATRICES OF RED WINES The EEMs corresponding to four of the analysed wines samples are shown in Figure 1 in the form of landscapes, and also the emission and excitation spectra, extracted from these matrices, at the specified wavelengths in the Figure caption. All samples fluoresce in the emission region between 300 and 400 nm, when they are excited at wavelengths under 290 nm. The excitation and emission spectra previously published by Dufour et al2 for discrimination of French and German wines, belong to this fluorescent
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Unscrambler v. 6.11b, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway
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zone. However, as shown in Figure 1, this region is too complex to obtain a full overview by using sets of single pairs of excitation and emission spectra. Another fluorescent region can be found in some of these maps, more red-shifted in the excitation axis, in the emission zone around 350 and 450 nm, when exciting the sample at wavelengths longer than 290 nm. In the emission spectra at an excitation wavelength of 260 nm (blue), a wide band centred to 372 nm is observed, in which two maxima can be distinguished at 363 and 380 nm. The intensity ratio for these two maxima is dependent on the sample, as previously described by Dufour et al2. Thus, for example in sample number 19, the fluorescence intensity at 380 nm is higher than at 363, unlike in samples 7 and 17, or in sample 1, in which the intensity ratio is close to one. Regarding the excitation spectra obtained at 363 nm (blue), two excitation maxima can be located at 260 and 280 nm. The relative intensities of these two peaks vary with the samples, like the emission do, being for example the ratio F.I. (260 nm) / F.I. (280 nm) higher than 1 for sample 19 and smaller than 1 for sample 1; also, in other cases, like in samples 7 and 17, the maximum excitation is centred at 280 nm, and a simple shoulder is observed at 260 nm. Interesting emission spectra are obtained at an excitation wavelength of 280 nm (black). In this case the highest fluorescent emission is reached around 363 nm, but in some cases, like for example in samples 1 and 17, a second maximum is observed around 325 nm, as important as the first one. Furtermore, a single excitation maximum at 275 nm is observed at em= 325 nm, for all samples. Lastly, the third typical emission spectra can be obtained, more red-shifted in the excitation axis, around 320 nm (red). A wide emission maximum is obtained in this case, centred at 388 nm. An excitation maximum is observed at 325 nm when the emission wavelength is fixed at 388 nm,
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being the shape of these excitation spectra below 300 nm similar to the previously described excitation spectra at em = 363 nm.
3.2.- PARAFAC RESULTS The excitation and emission profiles of pure components where extracted from the set of fluorescent landscapes, by applying PARAFAC. Choosing the appropriate number of components is the first step for constructing the PARAFAC model, and this decision may be done under different criteria10, among them, the so-called core consistency diagnostic. Core consistency percentages of 100 and 99.7 % were calculated for one and two components, respectively, and 50.9, 40.4 and -3.3 % for the three, four and five-component models, respectively. It seemed to be clear that a one or two-components model was not adequate, and also a number of five components was excessive, and it could originate an overfitting situation. The visual appearance of the loadings was helpful to finally decide that the optimal number of components in the present case was four, because it was observed that in the 5-component model, the fifth component was a combination of the first and the fourth, while in the four-components case, all of the excitation and emission profiles seemed to be independent from each other. It was deducted that there were no outlier samples by observing the score values in the sample mode, because no extreme values were found. Lastly, the stability and appropriateness of the built model was tested by split-half analysis22. Thus, different subsets of data were extracted according to several split criteria (even-odd, Italian - non-Italian, and Chilean - non-Chilean samples), and each one of them was independently
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analysed. The same spectral profiles were obtained in all cases, demonstrating the validity of the constructed model. The results from the PARAFAC model are shown in Figures 2 and 3, in the form of PARAFAC loadings in excitation and emission modes, and 3D structure of PARAFAC components, respectively. 3D structures of factors were obtained by multiplying the corresponding excitation and emission profiles of each component. First component excitation profile is the more hypsochromically shifted, showing a narrow maximum centred around 260 nm, and a sharp emission maximum at 380 nm, with a shoulder at 365 nm. The optimum excitation / emission wavelength pair for the second component is 275 / 323 nm. An important bathochromic shift and an increase in the band width is observed in the excitation and emission profiles corresponding to the third component, being centred at 330 and 410 nm, respectively. And lastly, the fourth component is situated close to the first and the second one, which implies that this component models the more blue-shifted region of landscapes, namely the excitation profile centred at 280 nm with a shoulder at 260, and the emission one at 364 nm.
3.3.- PCA ANALYSIS OF SCORES VALUES COLLECTION PCA was performed on the 57 x 4 data matrix, corresponding to the PARAFAC scores of the 57 samples. Category variables were included in the data set, corresponding to the origin of samples and type of grape, when these last data were available. The similarity maps defined by the principal components 1 (PC1) and 2 (PC2), and also PCA loadings are shown in Figure 4, grouping samples according to the origin and to the type of grape (explaining 79 and 90 % of total variance, respectively). These two models are slightly different, due to the fewer samples included in the grape PCA, because the grape data is not available for all samples, as reflected in Table 1. Regarding the loadings, it is important to highlight how factor 1 and 4
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span the variation in PC1, while PC2 represents a variation component where factor 1 and 4 are opposed to factor 2 and 3. When the origin is taken into account as category variable (figure 4A), including all the samples in the PCA, some discrimination for samples coming from different countries is observed. According to PC1, Chilean samples have the most negative score values, making up the cluster on the left side of the map, and the rest of samples on the right. WesternAustralian and Spanish samples have the higher scores values in this component, being different from them because of the higher scores values of Western-Australian samples in PC2. Lastly, regarding Italian, French, South African and American samples, all of them have low score values in both PCs, being different from the two previously described clusters. Not all samples are included in clusters, which is natural. There are other factors, apart from the origin, affecting the total fluorescent population in wines. Fluorescent compounds are mostly generated in the grape pulp, seeds and skins, and they are partially extracted into wine in the winemaking process, and therefore the variety of grapes should influence in their relative amounts. Other factors influencing are the environmental conditions in which grapes have grown, the treatment of the vineyard (e.g. irrigation and pruning), the ripeness of the fruit in the vintage moment, the fermentation techniques employed in the winemaking, the maceration process, the ageing of wine in barrels, among others, are factors, which might affect the fluorescent properties in wine. As summarized in table 1, the type of grape was specified for some of the analysed wines, some of them being monovarietal and some others multivarietal. Thus the PCA similarity map defined by the two first principal components can also be studied from the point of view of type of grape, including just samples in which this parameter is known, as represented in figure 4B. A clear evidence of the effect of grape variety can be observed within Chilean
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wines. Samples 9, 53 and 54, made from Merlot grapes are grouped separated from the rest of Chilean samples. Also the influence of the origin is evidenced in the group of samples made from the same grape variety: samples 18 and 19 from Australian-Western are far away from samples 30, 31 and 32, from Argentina, and sample 33 from USA, even though all of them are made from Shiraz grapes. Finally a PCA was performed on the Chilean wines group, and the similarity map for the two first components (90 % of explained variance) is represented in figure 4C. Again, a clear discrimination between wines from Merlot grapes (samples 9, 53 and 54) and the rest of wines is observed. These samples are parted from the Chilean cluster in figure 4A, possibly caused by the different type of grape. Besides, as it can be observed in the loading plot, the third PARAFAC component contributes in a higher extension to PC2, than in the models represented in 4A and 4B, and an inversion in the relative positions of factor 1 and factor 4 is observed, as a consequence, samples 9, 54 and 53 are in the left side of the scores plot, unlike in maps represented in 4A and 4B.
3.4.- IDENTIFICATION OF FLUOROPHORES
3.4.1.- FLUORESCENCE OF TYPICAL FLUORESCENT COMPOUNDS PRESENT IN WINE Fluorescent properties of compounds present in wines are highly dependent of the working medium, being influenced by variables such as the acidity or the composition of the medium. It is known that fluorescent behaviour is highly affected by the pH of the medium and sometimes by the content of organic solvents such as ethanol. Thus, a chemical environment similar to wine matrix has been looked for, and fluorescent measurements of
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standards were therefore in all cases made in a synthetic wine matrix, containing 3 g/L of tartrate buffer at pH 3.7, and 13 % v. of ethanol. The fluorescent properties of assayed fluorophores are summarized in table 2, in the form of maximum excitation and emission wavelengths, together with the maximum wavelengths corresponding to the four PARAFAC components. It is deducted from this table that catechin and epicatechin wavelengths match well with those of PARAFAC component 2. pCoummaric acid, trans-resveratrol, trans-piceid, and gentisic acid fluorescent properties are close to PARAFAC component 3. Lastly, vanillic acid could be related with PARAFAC component 4, because of the proximity of emission spectra and various maxima in the excitation one. Excitation and emission spectra for these candidates are presented in Figure 5. Except for catechin and epicatechin, no exact match with the PARAFAC loadings is found, which support the idea that each PARAFAC component does not correspond to a single fluorescent molecule, but more probably to a conglomerate or family of fluorescent molecules.
3.4.2.- HPLC ANALYSIS OF WINE SAMPLES Three chromatograms corresponding to the same sample, monitoring the eluate at the three different wavelengths pairs: exc/em 260/360 (compromising wavelengths for PARAFAC component 1 and 4), 275/320 (PARAFAC component 2) 330/410 nm (PARAFAC component 3), are represented in Figure 6. The global fluorescent intensity when exciting at 330 nm is quite small compared to those obtained for excitation at 260 nm or even at 275 nm. Once the chromatograms had been registered for all samples, possible correlations between PARAFAC score values of each component and the heights of single peaks in the corresponding chromatogram were looked for. Regarding to the first PARAFAC component, it was found high
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correlations between scores for this component and the heights of peaks at 30 and 34.5 minutes in the FLD-profiles at exc/em 260/360 nm. Between these two peaks, the better correlation was found with the second one, as shown in Figure 7A. Besides, the emission spectra (exc= 260 nm) in these peaks were on-line registered. It was found that the emission profile at 34.5 minutes is very similar to factor one. The molecular weight of this compound was deducted by LC-MS, resulting to be 534, a very high value, suggesting a condensation compound. Regarding the spectrum at 30 minutes, it was located in the same wavelengths region as the PARAFAC component one, but the shape of the peak was not the same that this component. By spiking samples with the assayed standards, it was stated that these peaks did not correspond with any of them. With the set of chromatograms at exc/em 260/360 nm, it was proven, by plotting the scores of PARAFAC component 4 vs the height of the peak corresponding to vanillic acid (retention time = 25 minutes), that these components are correlated, (Figure 7B). Very good correlations were found between the scores corresponding to the second PARAFAC component and the heights of the peaks corresponding to catechin and epicatechin (retention time = 22.2 and 27.7 minutes, respectively) in the set of chromatograms obtained at exc/em = 275/320 nm, (Figure 7C), indicating the identity of this PARAFAC component. Lastly, regarding to the third component, good correlations were found with some of the peaks in the chromatograms obtained at exc/em 330/410 nm, namely peaks at 28.7, 30.2 (p-coummaric acid), 33, and 36.3 minutes.
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CONCLUSIONS The potential of fluorescence excitation emission matrices as fingerprints of red wine samples has been demonstrated. Evidently, chemometric tools are necessary to handle this kind of complex data, and PARAFAC decomposition has proven to work properly. The same methodology could be applied to study wines from an appellation in order to develop chemical tools to avoid the fraud in a field highly controlled like this. A better knowledge of the fluorescent properties of red wines has been achieved, establishing basis for further studies. Certain identification of all the detected PARAFAC components is one of the main future challenges.
ACKNOWLEDGEMENTS We would like to thank Arcus AS (Oslo, Norway) for supplying the carefully selected set of red wines.
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Table 1.- Origin and type of grape in analysed wine samples.
Sample Number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
Origin France France Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile South Africa South Africa South Africa Australia (Western) Australia (Western) Australia Australia Australia Australia Spain Spain Spain Argentina Argentina Argentina Argentina Argentina Argentina USA USA USA Italia Italia Italia (Sicilia) Italia Italia Italia Italia Italia Tunisia Italia Italia Italia Italia Italia Italia
Type of Grape Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Merlot Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Shiraz Shiraz Shiraz Cabernet Sauvignon Shiraz Cabernet Sauvignon
Malbec Syrah Bonarda Malbec Syrah Bonarda Malbec Syrah Bonarda Syrah Syrah Syrah Syrah Ruby Cabernet Ruby Cabernet
Sangiovese Sangiovese
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51 52 53 54 55 56 57
Chile Chile Chile Chile Portugal Portugal Italia
Merlot Merlot
Sangiovese
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Table 2.- Fluorescent properties of assayed fluorescent molecules, in 3 g/L tartrate buffer at pH 3.7 and ethanol 13 % v, and PARAFAC four components.
Compound gallic acid p-coumaric acid vanillic acid NonFlavonoids Phenolic Acids caffeic acid ellagic acid sinapic acid ferulic acid gentisic acid trans-resveratrol trans-piceid quercetin rutin catechin epicatechin malvidine-3-O-glucopyranoside Anthocyanins delphinidin-3-O-glucopyranoside petunidin-3-O-glucopyranoside PARAFAC Component 1 PARAFAC Component 2 PARAFAC Component 3 PARAFAC Component 4 exc (nm) 241 348 241, 282, 305 262 333 297, 335 320 318 318 427 279 280 280 280 280 260 275 330 260, 280 em (nm) 350 410 354 433 422 446 446 390 390 480 317 316 355 355 355 380 323 410 364
Stilbenes Flavonols Flavanols Flavonoids
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Sample 1
Sample 7
Sample 17
Sample 19
Figure 1.- LEFT: Fluorescence landscapes (as contour plots) corresponding to wine samples number 1 (French Wine), 7 (Chilean Wine), 17 (South African Wine) and 19 (Australian Wine). MIDDLE: Extracted excitation spectrum at em= 325 (black), 363 (blue), and 388 nm (red). RIGHT: Extracted emission spectra at exc= 260 (blue), 280 (black), and 320 nm (red).
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EXCITATION
EMISSION
Figure 2.- PARAFAC fluorescent loadings for the four components (FIRST: Blue; SECOND: Green; THIRD: Red; FOURTH: Light Blue) of the non-negativity constrained PARAFAC model constructed, based on the fluorescent landscapes of 57 wine samples.
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Figure 3.- 3D structure of PARAFAC first (blue), second (pink), third (orange) and fourth (green) factors, obtained by multiplying the corresponding loading-vectors.
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A) Sample grouping according to origin
B) Sample grouping according to type of grape
C) Chilean wines grouped according to type of grape
Figure 4.- PCA loadings (left) and scores (right) defined by principal components 1 and 2 for the set of PARAFAC scores values, according to different grouping criteria.
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SALIR
800
Catechin
500
Epicatechin
600
400
300
F. I. 400
F. I. 200 100 0
200 300 400 500
200
(nm)
200
300
(nm)
400
500
300
p-Coumaric Acid
1000
Gentisic Acid
800
200
600
F. I.
F. I. 400
100
200
0 200 300
(nm)
400
500
200
300
(nm)
400
500
1000 t-Resveratrol / t-Piceid 800
300
Vanillic Acid
600 F. I.
200 F. I. 100 0
200 300
400
200
(nm)
400
500
200
300
(nm)
400
500
Figure 5.- Excitation and emission spectra of some of the assayed standards in 3 g/L tartrate buffer at pH 3.7 and ethanol 13 % v.
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ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (D:\RESVER~1\MATFORSK\BERIT\DA2111A\013-0601.D) mAU 90 80 70 60 50 10 20 ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (D:\RESVER~1\MATFORSK\BERIT\DA2111A\012-0301.D) mAU 75 70 65 60 55 50 45 10 20 ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (D:\RESVER~1\MATFORSK\BERIT\DA2111A\012-0501.D) mAU 39.8 39.7 39.6 39.5 39.4 39.3 39.2 10 20 30 40 min 30 40 min 30 40 min
Figure 6.- FLD-profiles at exc/em 260/360 (top), 275/320 (middle), and 330/410 nm (bottom), corresponding to the same sample, eluted under specified gradient conditions.
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Figure 7.- Correlations between scores values and single peaks in the chromatograms.

Utilizacion de Señales Fluorescentes para El Analisis y Caracterizacion de Vinos

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DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

TESIS DOCTORAL MENCIN DOCTOR EUROPEO

Diego Airado Rodrguez Badajoz, 2008

Edita: Universidad de Extremadura Servicio de Publicaciones

Fdo.: Diego Airado Rodrguez

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

Badajoz, 30 de Abril de 2008

Figura 1.- Frmula estructural de trans-resveratrol

Figura 2.- Ruta biosinttica desde p-cumaril-CoA hasta resveratrol

Figura 3.- Fuentes de resveratrol en la naturaleza

los arndanos29, la Reynoutria

Japonica, las moras y en especies herbceas (Poaceae incluyendo Festuca,

trans - Resveratrol cis -Resveratrol

concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa

concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa

Figura 6.- cido glico

Figura 7.- 2-Fenil benzopirona

Figura 8.- Estructuras qumicas de las subclases de flavonoides ms usuales en el vino

Figura 11.- Flavanonoles de la engeletina (R = H) y astilbina (R = OH)

Figura 12.- Estructura de los antocianidinas (forma flavilium)

Figura 14.- Estructuras de procianidinas dmeras

Figura 15.- Proantocianidoles de tipo B

Parmetros analticos de calidad

trans-resveratrol, epicatequina y catequina

trans- y cisresveratrol y piceido y otros polifenoles

Parmetros analticos de calidad

Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad

cis- y trans- resve- Fase inversa ratrol y piceido DAD

Screening de polifenoles, entre ellos transresveratrol

cis- y trans- resveratrol y piceido

Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos F. Mvil; Sistema de Deteccin de calidad

Resveratrol, piceido y flavonoides.

Deteccin electroqumica multicanal con detector coulomtrico

Compuestos aromticos, entre ellos transresveratrol

Estilbenos (resve- DAD-MS/MS ratrol, piceido, piceatannol)

cis- y transresveratrol y piceido

Polifenoles, incluyendo estilbenos como trans- y cis-resveratrol Resveratrol y piceido

Linealidad 0.72-18 gmL-1 LOD 2 ngmL-1

Polifenoles, entre ellos, trans- y cisresveratrol y piceido.

Parmetros analticos de calidad Linealidad 50 ngmL-1 50 gmL-1

Observaciones Muestra / Tratamiento Deteccin fluorescente altamente sensible para resveratrol

Filtrado e inyeccin directa de la muestra

Extraccin con ter etlico a pH 2

Catequina, cido vanllico, cido sirngico, epicatequina y trans-resveratrol

LOD 20 y 3 ngmL-1 en DAD y FLD, respectivamente

Estilbenoides (trans-piceido, trans-resveratrol, trans-astringina, cis-piceido, cisresveratrol)

trans- y cisresveratrol y piceido

Parmetros analticos de calidad

trans- y cisresveratrol como aglicona y glucsido.

LOD (S/N = 3) de 0.6 molL-1 para ambos analitos a 286 nm.

Ismeros de resveratrol y piceido

Ismeros de resveratrol y piceido

Tabla 3.- Anlisis de resveratrol mediante electroforesis capilar

Observaciones Muestra / Tratamiento

SPE Valores de pKa de resveratrol 9.22, 10.55, 11.16

Desviacin estndar relativa; b Lmite de deteccin; c Lmite de cuantificacin

Tabla 3.- Anlisis de resveratrol mediante electroforesis capilar (continuacin)

trans-resveratrol y cido srbico

Sistema electrofortico: Modalidad; Inyeccin; Deteccin CZE DAD a 305 nm

Parmetros analticos de calidad LOD 0.04 gmL-1 transresveratrol.

Resveratrol y piceido trans-resveratrol Ultra-low-temperature NACE-77K FLD

Resveratrol total libre

Parmetros analticos de calidad Linealidad entre 12.5 y 250 gmL-1

Linealidad entre 0.02 2.0 gmL-1

Parmetros analticos de calidad LOD: 10 ngmL-1