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Produccin de metabolitos txicos en Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Trichoderma reesei: la justificacin es hacer pruebas micotoxicas en preparaciones enzimticas

de categora alimenticia derivadas de los tres hongos. abstract El Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y el Trichoderma reesei son tres importantes organismos usados en la produccin de fermentaciones industriales. Varios de los metabolitos secundarios produce fungicidas por tensiones seleccionadas de estos tres hongos son capaces de sacar toxicidad en animales. Entre esas sustancias txicas estn los mycotoxins bien conocidos 3-cido nitropropionic y el cido ocratoxina, Sin embargo, muchos otros, tales como cido kojic, pueden no ser mycotoxins verdaderos. La produccin, la extraccin, la estructura qumica, y la toxicidad (expresada como LD50) de estas sustancias se repasan. Produccin de metabolites secundarios txicos en el A. Niger, A. oryzae, y T. reesei es tensin-especfico y dependiente del ambiente. En vista de todas las medidas de seguridad tomadas en el proceso de produccin industrial, estas tres especies fungicidas son seguras de utilizar. La especificacin recientemente revisada de JECFA para los mycotoxins en preparaciones enzimticas del alimento tambin se discute. El grado de las pruebas del mycotoxin en preparaciones enzimticas del alimento se debe juzgar sobre una base del caso-por-caso, con una evaluacin cuidadosa basada en el conocimiento de la taxonoma, de la bioqumica, y de la gentica. En muchos casos, el alcance de prueba en el nivel del gnero debe ser suficiente. En otros casos, el alcance se puede incluso ms a fondo enangostar basado en conocimiento y el gravamen.

INTRODUCCION El Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y el Trichoderma reesei son tres especies importantes de organismos usadas en la produccin de fermentaciones industriales para la produccin de varias sustancias. Estos productos tienen uso amplio en campos industriales numerosos incluyendo el sector alimenticio. Algunos ejemplos son el cido ctrico-derivado del A. Niger, los alimentos fermentados producidos con el A. oryzae, y un nmero de las preparaciones enzimticas producidos por estos tres microorganismos usando tecnologas biolgicas tradicionales o modernas. Una lista comprensiva de esas preparaciones enzimticas usadas en sector alimenticio hoy en da se puede encontrar en el paper reciente de Pariza y de Johnson (2001). La seguridad de cualquier producto de categora alimenticia se evala antes de que su comercializacin y se asegura cuidadosamente a travs de la fabricacin, del proceso, del transporte, del almacenaje, y del uso del producto. El aseguramiento de seguridad mide la gama de la seleccin de las materias primas de la fabricacin a una serie de pruebas toxicolgicas. La consideracin primaria en la evaluacin de seguridad de un producto de categora alimenticia derivado de un microorganismo es la seguridad del organismo de la produccin.

DESARROLLO Aspergillus niger. Tiegh., un hongo filamentoso del ascomiceto, fue aislado de las muestras del metal expuestas a los sitios marinas, rurales y urbanos en Lituania. Las muestras del Al y del Zn fueron sujetadas a la influencia de dos aos del A. Niger bajo condiciones del laboratorio en atmsfera hmeda. La espectroscopia electroqumica de la impedancia (EIS) comprob la aceleracin microbiano influenciada de la corrosin (MICA) del Zn y de la inhibicin (MICI) del Al. Los datos de EIS indicaron una estructura de la dos-capa de los productos de la corrosin en el Zn. Los microorganismos redujeron el grueso de la capa interna, que el apaciguamiento de capacidad era mucho ms alto cuando estaba comparado a el de la capa externa. Un aumento en resistencia de la capa del xido de aluminio pero la disminucin del grueso de la capa implic que MICI afect sobre todo los sitios de la corrosin localizada del Al (poros, microrajas, etc.). La difraccin de radiografa (XRD) y los estudios de la espectroscopia del fotoelectrn de la radiografa (XPS) indicaron que los bioproducts (es decir. los cidos orgnicos) no formaron fases cristalinas con los productos de la corrosin del cinc. El estudio sugiri una hiptesis que los microorganismos podran ser utilizados como protectores de la corrosin en vez de los productos qumicos txicos, el uso de los cuales tiende para ser cada vez ms restricto. Los ascomicetos constituyen una clase dentro de la divisin eumicetes del reino fungi. Son hongos con micelio tabicado que producen ascosporas endgenas. [...] Pueden ser unicelulares y talfitos. La reproduccin puede ser de dos tipos: asexual, por esporas exgenas (conidios o conidioesporas), y sexual, esporas endgenas (ascospora). [...] Existen en ambientes terrestres y acuticos, en sustratos como la madera, materiales de queratina (uas, plumas, cuernos y pelos), estircol, suelo y alimento, entre otros. Los Sacaromicetceos, de la Orden Endomicetales de los Ascomicetos, se encargan de algunas fermentaciones. Algunas especies viven de forma anaerobia: Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces ellipsoideus; convirtiendo los azcares en alcohol etlico y dixido de carbono. [...] 2 Tambin se les llama hongos con saco, porque sus esporas sexuales se producen en pequeos sacos que se denominan ascos. Pertenecen a este grupo la mayor parte de las levaduras y mohos verdeazules, rosas y pardos que descomponen los alimentos; los mildeus (parsitos de diversas plantas); los hongos caliciformes saprfitos; y las morillas o colmenillas y trufas comestibles. La accin de microorganismos en los metales incluye fenmenos numerosos, e.g. la produccin de los metabolites corrosivos (cidos inorgnicos y orgnicos, sulfuro, amonaco, bixido de carbono, xidos del nitrgeno, etc.), chelatization de los cationes del metal, produccin de los solventes orgnicos (etanol, propanol, butanol), etc. Debido a una colonizacin superficial no uniforme, microorganismos puede causar la formacin de las clulas de concentracin, que da lugar a la corrosin localizada. El proceso de la corrosin es favorecido por agua afectado tambin la biopelicula. Los microorganismos pueden causar generalmente una aceleracin microbiano influenciada de la corrosin (MICA) o una inhibicin (MICI). La MICA se ha estudiado recientemente extensamente 1-13], mientras que se sabe relativamente poco sobre el proceso MICI. Un efecto protector notable de los biofilms fue observado en las soluciones para las aleaciones de aluminio y el latn (70Cu/30Zn) [13-17]. Se ha demostrado que un ataque pronunciado de las

picaduras ocurri en un medio estril, mientras que en las soluciones que contenan bacterias, el proceso de las picaduras fue parado despus de dos das de exposicin. Los autores tambin han realizado experimentos con las bacterias gentico dirigidas capaces de producir los inhibidores - polyglutamate o polyaspartate. Sin embargo, vinieron a la conclusin que incluso las bacterias que no fueron dirigidas para producir los inhibidores apaciguaron la superficie. MIC es una interaccin compleja entre la poblacin, el ambiente y el substrato microbianos del metal; el ltimo poda ser de la ltima importancia en el carcter de MIC. La mayor parte de los estudios de la corrosin microbiano influenciada (MIC) fueron realizados en las soluciones acuosas (agua de mar artificial, medio de Luria Bertani, etc.) en el curso de una formacin relativamente rpida del biofilm. Los efectos MICI tambin se han determinado recientemente bajo condiciones atmosfricas [18, 19]. Las conclusiones fueron dibujadas de los estudios de dos aos de metales bajo influencia de solas tensiones salvajes (e.g. Los frequentans del penicillium, el bacilo mycoides), que fueron aislados de una variedad amplia de poblaciones bacterianas y de los hongos (sobre 170) en los metales expusieron a las condiciones al aire libre [20, 21]. De esta diversidad microbiana, el aspergillus niger apareca ser una de las poblaciones ms estables. En nuestros estudios anteriores [18, 19], la espectroscopia electroqumica de la impedancia (EIS) comprob la inhibicin microbiano influenciada de la corrosin del Al. Un aumento en la resistencia de la capa del xido de aluminio con una disminucin simultnea del grueso de la capa, implicado que MICI afect sobre todo los sitios de la corrosin localizada del Al (poros, microrajas, etc). La difraccin de radiografa (XRD) y los estudios de la espectroscopia del fotoelectrn de la radiografa (XPS) indicaron que los bioproducts (es decir. los cidos orgnicos) no formaron fases cristalinas con los productos de la corrosin del cinc. El estudio sugiri que los microorganismos podran ser utilizados como protectores de la corrosin en vez de los productos qumicos txicos, el uso de el cual tiende para ser cada vez ms restricto. El actual estudio tiene como objetivo el conseguir de una penetracin ms profunda en la influencia del A. Niger en la corrosin del aluminio usando microgravimetry cristalino del cuarzo (QCM) modificada con los electrodos pegados de la hoja y aplicada a las exposiciones a largo plazo a la atmsfera. El QCM proporciona la posibilidad para obtener los datos totales sensibles (los cm2 del ng) y continuos del cambio "in-situ", as como la posibilidad para combinar las medidas totales con otras tcnicas (voltammetry, EIS, espectroscopia ptica, etc.). Los resultados con los electrodos pegados de la hoja divulgados aqu sugieren la posibilidad para ampliar el alcance de los materiales que se estudiarn por QCM, pues los estudios convencionales de QCM se limitan generalmente a los materiales evaporados, farfullados o electrochapados. Hay solamente pocos trabajos en la literatura donde la hoja pegada QCM fue solicitada los estudios electroqumicos [22, 23]. El tema bajo investigacin era el aluminio, es decir, un metal de la gran importancia tcnica. La corrosin localizada es caracterstica del aluminio; la capa pasiva en ella es fina (en la orden de nanmetros) con una alta capacidad aislador. El aluminio est tambin de inters porque desempea un papel importante en los procesos del metabolismo del A. Niger. Una formacin realzada del A. los conidios de Niger fueron determinados en el medio con los iones del

aluminio en una concentracin de 0.001mg l-1, mientras que en concentraciones ms altas la inhibicin del crecimiento fungicida ocurri [24]. EXPERIMENTO Micromycetes de la especie del aspergillus niger fue aislado de las muestras del Al, del Cu, del Zn y del acero expuestas a la atmsfera en las estaciones al aire libre dispuestas segn la ISO estndar 9223, 8565 en los lugares que cubran diversas condiciones ambientales en Lituania: marina - la escupida de Kuronian, Preila (100 M. de la orilla del mar bltico); rural - aldeas de Kulionys y de Rgtelikiai en los districtos de Moltai y de Utena; urbano - la parte central de Vilnius (instituto de la qumica) y suburbio de Vilnius (base experimental del instituto de la qumica). Los parmetros, la composicin del aire y la adsorcin climticos del agua en las muestras del metal fueron medidos continuamente en estos sitios (ms detalles adentro [21]).Los microorganismos fueron aislados de las muestras del metal despus de 6, 9, y 12 meses de exposicin. El aislamiento fue realizado en dos maneras: 1) directamente de la corrocin muestrea con un lazo del metal y) una preparacin estriles 2 las suspensiones de diversa dilusin del agua de lluvia, que aclar las muestras. Los microorganismos fueron inoculados en la malta slida suplida con los antibiticos para suprimir el crecimiento bacteriano, para el aislamiento de hongos microscpicos. Los microorganismos aislados fueron cultivados en 26 el 2 C. Contaron a las colonias crecidas de hongos despus de 3, 5 y 7 das. Una cultura pura fue obtenida de los microorganismos crecidos y era el acordar identificado a sus particularidades fisiolgicas, culturales y morfolgicas por microscopia ligera y electrnica de la exploracin. Las especies fungicidas fueron identificadas segn los varios manuales [24-29].El plano-convexo En-cort discos del cuarzo con la frecuencia fundamental de 2.4 megaciclos y 14 milmetros de dimetro fueron utilizados. Los lados convexos de los resonadores eran magnetrn farfullados por una capa del Au de 3 milmetros. Los lados planos de los resonadores fueron cubiertos con la hoja de Al. Los electrodos del aluminio fueron preparados a partir de 15 milmetros del grueso de hoja de Al de la pureza del >99.5%. Ambos lados de la hoja fueron limpiados a fondo con la acetona de la pureza elevada y los electrodos formados ojo de la cerradura 12 milmetros de dimetro fueron cortados apagado. Los electrodos del Al fueron pegados con la resina de epoxy al lado plano de los discos del cuarzo. Despus de se, los discos fueron montados a un sostenedor especial y guardados bajo de presin de 16 kilogramos cm2 en la temperatura ambiente por 24 horas. Segn la ecuacin del Sauerbray, la masa al factor de la frecuencia de los resonadores pegados del Al para la frecuencia fundamental de 2.4 megaciclos era 0.078 cm2 del magnesio Hz-1 [30]. Los resonadores preparados del Al fueron montados en un sostenedor plstico qumicamente resistente especial entre dos anillos del silicn. Los alambres de acero inoxidables fueron utilizados para proveer de contactos elctricos de electrodos un sistema de la medida de la frecuencia. El rea expuesta de los electrodos del Al era 0.5 cm2. Las medidas fueron realizadas en el ~ 2.5 l recipientes. Los recipientes fueron capsulados con las cubiertas plsticas qumicamente resistentes especiales con los agujeros diseados para los sostenedores del cuarzo. Los sostenedores con Al impermeable fueron montados en los recipientes. La superficie de funcionamiento de los resonadores fue orientada horizontalmente hacia abajo.

Una solucin saturada K2SO4 fue vertida al fondo del recipiente para mantener humedad constante. El rea abierta de la solucin era ~35 cm2. La humedad relativa coloc dentro del recipiente estaba ca. el 97% en una temperatura de ca. 25 C. Antes del principio de la exposicin (experimento), las frecuencias de los resonadores secos del Al fueron medidas, y esa aproximadamente mitad del rea del electrodo estaba despus overlayered directamente con una solucin de glucosa del 3% con los conidios del aspergillus niger. La concentracin de la espora estaba ca. 1 cfu ml-1 (cfu - unidades del 106 de la formacin de colonias), que fue determinado usando un compartimiento de cuenta especial. Junto al recipiente infectado el abiotic tambin fue preparado. Ambos sistemas experimentales fueron puestos dentro de una caja donde estaba una temperatura 26 del C del 2 maintended. A travs de la exposicin la presin atmosfrica dentro de la caja fue supervisada. Las frecuencias de los resonadores expuestos del Al fueron medidas peridicamente usando un dispositivo del oscilador construido segn un esquema con un amplificador operacional [31]. Durante la exposicin, los recipientes no fueron movidos y los resonadores no fueron retirados de ella. Antes de cada medida, el sistema del oscilador fue calibrado. Los cambios en la frecuencia de los resonadores eran recalculados en los que est de la masa de los electrodos [30]. Una cobertura parcial de las superficies de los electrodos emerge por con/sin de la solucin de glucosa del 3% el Aspergillus Niger proporcion la oportunidad de evaluar el crecimiento fungoso y su uno mismo-separarse en el metal estudiado durante la exposicin. La fotografa ptica de la superficie del electrodo del Al despus de 90 das de exposicin se demuestra en higo. 1a. Como fue determinado despus de la examinacin de la superficie del electrodo, la colonia del A. Niger fue formado y uno mismo-outspread sobre la superficie del electrodo. Era evidente que el micelium haba sido formado originalmente en la superficie cubierta glucosa y solamente coloniz ms adelante la particin residual del electrodo. El micelium no era denso y las dimensiones de los fruitbodies fungosos no eran uniformes a travs de la superficie. El A. los fruitbodies de Niger formados en el rea glucosa-revestida del electrodo eran considerablemente ms grandes que sos formados en el rea libre:~0.2 milmetros de dimetro. Es importante que los hoyos de la corrosin fueron formados puntualmente bajo fruitbodies grandes. Estos daos ocurrieron lo ms probablemente posible debido a las enzimas y a los cidos orgnicos secretados por el A. Niger: ctrico, oxlico, actico, etc [32]. Para el rea glucosa-libre del Al, los fenmenos antedichos no fueron determinados. Adems, una de las muestras fue comprobado para saber si hay la vitalidad de microorganismos tomando las reproducciones de su superficie en un agar del beefextract (presionando la superficie de la muestra en el agar). La reproduccin fue expuesta a la temperatura del C 26 2 por 5 das y despus examinada por la microscopia ptica (higo. 1b). Como uno puede ver, las colonias del A. Niger fue crecido de la reproduccin, que prob la vitalidad de los microorganismos inoculados. Para el mediumm abiotic la ausencia de cualquier microorganismo fue detectada por una prueba de la vitalidad.