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Rev. Salud Pblica. 4 (Sup.

2): 56 - 62, 2002

Principios y Prctica de Nuevos Mtodos Diagnsticos en Toxoplasmosis


Gregoire Cozon, Universidad de Lyon
ELISA

1) Fijacin del antgeno sobre el plstico Ag proteico en tampn carbonato/bicarbonato Concentracin 1 10 g/ml

2) Saturacin en albumina srica bovina (BSA)

3) Incubacin de los sueros diluidos 4) Lavados para eliminar los anticuerpos no especficos

5) Anticuerpos anti-IgG humanos acoplados a una enzima peroxidasa fosfatasa alcalina


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6) Lavados 7) Incubacin con substrato reaccin colorimtrica si la enzima est presente reaccin proporcional a la concentracin de la enzima 8) Medicin de la densidad ptica (absorbancia) segn la longitud de onda especfica de la reaccin colorimtrica. 9) Interpretacin: del punto de corte, de la curva estndar, o conversin de unidades por el mtodo alfa. Principio del ELISA de Captura para IgA o IgM 1) Fijacin de un anticuerpo anti-IgA o anti-IgM . En tampn carbonato/bicarbonato . Concentracin : 110 g/ml
Fijacin de los IgA

2) Saturacin en BSA

3) Incubacin de los sueros diluidos

4) Lavados para eliminar los anticuerpos no especficos


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REVISTA DE SALUD PUBLICA Volumen 4 (Sup. 2), Enero 2002

5) Antgeno toxoplsmico acoplado a una enzima peroxidasa fosfatasa alcalina 6) Lavados 7) Incubacin con el substrato reaccin coloreada si la enzima est presente reaccin proporcional a la concentracin de la enzima
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8) Medicin de la densidad ptica (absorbancia) a la longitud de onda especifica de la reaccin coloreada. 9) Interpretacin: del punto de corte, de la curva estndar, o conversin de unidades por el mtodo alfa. Principio de la medicin de la avidez en ELISA Se basa en un principio idntico al ELISA estndar variando solamente en que se comparan los resultados de 2 pozos de ELISA, el uno tratado clsicamente, y el otro tratado con un agente eluente que va disociar y eliminar los anticuerpos de baja afinidad. Para cada suero la incubacin de la dilucin a probar se realiza en 2 pozos recubiertos de antgeno y de BSA. Luego del lavado se realiza una incubacin de 5 minutos de uno de los pozos con el PBS y del otro con urea 6 M en tampn de lavado. Luego del lavado se continua con la tcnica ELISA estndar. Al final por cada suero se obtienen 2 valores, uno de la incubacin en PBS y el otro con la incubacin en la urea.

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Se define entonces un ndice de Avidez (IA)


IA = Ttulo con Urea / Ttulo sin Urea

En Lyon con el ELISA de la casa comercial Behring S el IA> 35% seroconversin superior a 3 meses S el IA< 35% puede ser una seroconversin reciente o la ausencia de maduracin en la afinidad de los anticuerpos.
DETECCIN DE LA INMUNIDAD CELULAR

Test in vivo: intradermo-reaccin o IDR a la toxoplasmina lectura a las 48 horas como se hace para la reaccin a la tuberculina. Tests in vitro: Cultivo de linfocitos en presencia del antgeno parasitario. Qu clulas cultivar? Clulas mononucleares (PBMC) luego de separacin en Ficoll Sangre completa sin separacin. Cul marcador de la inmunidad explorar? Clsicamente se utiliza la incorporacin de la timidina tritiada por las clulas en multiplicacin y la deteccin de las clulas en divisin por la medicin de la radioactividad incorporada por las clulas con un medidor de radiacin. Expresin de las molculas de activacin en la superficie de las clulas. Utilizacin de las molculas fluorescentes incorporadas en las clulas al inicio del cultivo y que irn disminuyendo en las clulas en divisin. Deteccin de las citocinas en el sobrenadante del cultivo.

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REVISTA DE SALUD PUBLICA Volumen 4 (Sup. 2), Enero 2002 EL DYE TEST O PRUEBA DEL COLORANTE

Principio: activacin del complemento por los anticuerpos especficos que polimerizan la fraccin C9, ltima etapa del complejo de ataque de membrana. Tcnica clsica: -Taquizoitos sobre cultivo celular para evitar la fijacin de los IgM polyespecficos o taquizoitos + TG 180 (Sarcoma) intraperitoneales - Sueros de pacientes inactivados (30 min a 56C.) - Sueros normales humanos (Toxo -) o suero de cobayo que no lisen los taquizoitos - Dilucin de los sueros por probar de 2 en 2 a partir de la dilucin 1/10 en PBS - Mezclar 50 l de los sueros diluidos con 50 l de una suspensin de taquizoitos vivos 1,5x 106/ml en complemento. - Incubacin 1 hora a 37C. Para la lectura existen varias alternativas - Fijar las clulas con 100 l de formol al 5%, luego se realiza lectura en contraste de fase (CMF) - Adicionar un colorante no-vital (Eosina Y) o Azul de tripano que es excluido de las clulas vivas.
TCNICA DE CITOMETRIA EN FLUJO

Se utiliza sangre completa tomada en tubo estril con heparina (tubo verde de Becton Dickinson). Se requiere una muestra de menos de 6 horas Antgeno toxoplasmico "crudo": preparar una suspensin de toxoplasmas a partir de cultivo celular, lavar los toxoplasmas con PBS y ajustar a 100 millones (108) por ml. Congelar y descongelar esta suspensin cinco a seis veces y luego filtrar la solucin proteica por membrana de 0.22 m. Esta solucin se utiliza diluida a 1/10 o 1/50. Se puede utilizar tambin el sobrenadante del cultivo celular infectado por los toxoplasmas. Tubos de cultivo en polipropileno del tipo "Micronic" estriles (esterilizados en el autoclave).

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Anticuerpos monoclonales: anti-CD3 PE-Cy5 Sigma, anti-CD4 PE DAKO y anti-CD25 FITC DAKO Mtodos Colocar 50 l de sangre completa con 50 l de solucin antagnica a 1/10, 1/50, incubar 24h a 37C. 5% de CO2. Aadir 500l de RPMI. Dejar seis das en la incubadora. Proveer controles negativos (50l de PBS) y positivos (50 l de PHA o fitohemaglutinina 10 g/ml). En el da 7 aspirar el sobrenadante, lisar los glbulos rojos con tampn de lsis (NH4 Cl). Centrifugar y aspirar el sobrenadante, sobre el botn de sedimentacin colocar 10 l de anticuerpos anti-CD, antiCD4 y antiCD25 diluidos 1/30 en PBS azida 0.02% suero humano normal 10% EDTA 5 mM. Incubar 15 min a +4C. la noche anterior una vez con PBS. Aadir 250l de PBS y pasar en el citmetro de flujo. Es posible fijar las clulas utilizando PBS formol 1% Albmina seria bovina 0.1 % (HP 7.2) luego de la ltima etapa. No fijar las clulas antes del marcaje con los anticuerpos monoclonales Coloracin de membrana y Citometra de Flujo El exceso de medio es decantado de la suspensin de clulas y almacenado a -20C para la deteccin de citoquinas. Los eritrocitos son lisados con 155 mmol/litro de NH4Cl, 10 mmol de KHCO3, y 0,1 mmol de EDTA. Los leucocitos se recuperan por centrifugacin y el sedimento es teido con una combinacin de tres anticuerpos monoclonales especficos marcados con fluorocromos por 15 min en cmara obscura a 4C. Para la deteccin de CD69, una combinacin de anticuerpos conjugados anti-CD69 con FITC (Dako, Trappes, France), PE-anti-CD4 (Dako) y cyanin 5-phycoerythrin (Cy5PE) antiCD3 (Sigma) son usados para estimar la expresin de CD25. Luego, las clulas son lavadas y resuspendidas en PBS con 0.1% de albmina srica bovina 5 mM y EDTA. Las clulas son analizadas el mismo da con un citometro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Para la adquisicin de los datos se utiliza el programa Cellquest. Para obtener los datos de la poblacin CD3+ se utiliza el canal f13. En el canal de monocitos-linfocitos pueden ser ledas hasta dos mil CD3+. Los datos son luego mostrados en dos curvas de color identificadas como fl1 y fl2 sobre el total de clulas fl3, con el fin de obtener la proporcin de linfocitos activados que expresan los marcadores CD25 o CD69. El total de clulas CD3+ o CD4+ activadas se estima sustrayendo los valores obtenidos en el control negativo.

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REVISTA DE SALUD PUBLICA Volumen 4 (Sup. 2), Enero 2002

INMUNIDAD ANTI-TOXOPLASMICA

Exploracin de la inmunidad anti-Toxoplasma gondii Exploracin de la inmunidad humoral: la serologa - El dye test o test de colorante - La inmunofluorescencia indirecta - El ISAGA - Las tcnicas ELISA - Las tcnicas de Western Blot Exploracin de la inmunidad celular: - Prueba cutnea con la toxoplasmina - Prueba de activacin linfocitaria in vitro - Incorporacin de la timidina tritiada - Expresin de marcadores de activacin CD25, CD71 - Produccin de citoquinas

I m m u ni t H um or a l e I gM , I gG , I gA , I gE C om p l m e n I m m uni t C e l l ul a i r e : - Lym p hocyt e s T - Lym p hocyt e s a uxi l i a i r e s - C yt ok i n e s : I L- 2 , I F N s, T N F - I L- 4 , I L- 1 0 , T G F - M a cr op ha ge s e t a ut r e s - P r od uct i on d e - P r od uct i on d e d r i v s d e - P r od uct i on d

Figura 1. El iceberg del estudio de la inmunidad anti-Toxoplasma: lo ms fcilmente puesto en evidencia (inmunidad humoral) es slo la punta del iceberg