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En el mes de Julio se realizaron diferentes montajes con el fin de retomar la estandarizacin de la tcnica realizada en el 2002 por el Grupo de parasitologa

y as poder hacer la confirmacin diagnstica de las muestras positivas encontradas por el mtodo de ELISA en el laboratorio de Parasitologa del INS.

1. ELECTROFORESIS (SDS PAGE) En montajes anteriores se encontr que los geles de poliacrilamida no estaban polimerizando y despus de encontrar la causa se logr establecer las siguientes condiciones: gel separador a 12.5 % y sobre l, el gel concentrador al 5% sobre el cual se colocan las peinillas y se deja polimerizar.

Para el gel separador y el gel concentrador se usan los mismos reactivos con la principal diferencia en el buffer Tris Base pH 8,8 para el separador y buffer pH 6,8 para el concentrador; se debe tener precaucin que los reactivos estn en buen estado y que el pH sea el adecuado de lo contrario no polimerizarn los geles. GEL(12.5%) SEPARADOR 2.5 ml pH (8.8) 2.2 ml 1.2 ml 30 ul 40 ul 10 ul GEL (5%) CONCENTRADOR 332.5ul pH (6.8) 225 ul 1.4 ml 10 ul 10 ul 10 ul

REACTIVO Sol acrilamida- Bisacrilamida (30%) Tris base pH Agua destilada Persulfato de amonio (PSA) Sodio Dudecil Sulfato (SDS) Temed

Una vez haya polimerizado el gel separador, se ponen los peines y se agrega el gel concentrador, se dejan en nevera a 4C dentro de la cmara de electroforesis con buffer de electroforesis listos para el da siguiente realizar la electroforesis con la protena antignica preparada al inicio del ao.

Se siembra la Protena en este caso el Antgeno de cisticerco para ver la diferenciacin de sus protenas, para esto se deben desnaturalizar la protenas con calor, en todos los montajes se ha usado el Antgeno preparado a inicios del 2012 en el grupo de Parasitologa a partir de cisticercos liofilizados conservados a -20C en cuarto frio; dicho antgeno se est usando tambin para el diagnstico de cisticercosis por el mtodo de ELISA.

Se arman las cmaras con los electrodos y se colocan los soportes con los geles

Preparacin de cmara para Electroforsis

Se debe preparar la muestra que en este caso es nuestro Antgeno con una solucin reguladora de muestra que contiene: azul de bromofenol, glicerina, 5 mercaptoetanol, y SDS que acta como detergente inico. Esto se agrega en proporcin 80ul Ag y 20 ul de solucin reguladora de muestra, esta mezcla se pone en agua a 80C por 5 min para desnaturalizar. La concentracin del Antgeno se ha trabajado entre 1,6 y 2mg/ml.

Se siembran 10 ul del marcador de peso molecular que para nosotros va desde 6 kd hasta 180 kd y 20 ul del Antgeno previamente preparado. Se agrega solucin reguladora de electroforesis en la parte interna cubrir los geles y en la parte externa de 300 a 400 ml; si la cantidad de la solucin de electroforesis no es la adecuada, la fuente de poder presenta error para lo cual se debe agregar ms.

Se ponen condiciones de voltios, temperatura, tiempo y amperaje determinados

Temperatura: Amperaje: Voltaje: Tiempo:

18C 35 mA constantes 75 voltios 1hora y 10 minutos.

Se sacan los geles de poliacrilamida y se colorean con azul de comassie y se busca evidenciar la presencia del marcador de peso molecular los antgenos no se ven pero estn presentes.

2. TRANSFERENCIA (Towbin et al 1979) Si uno desea continuar con la transferencia no se debe colorear el gel de poliacrilamida. Se humedecen las membranas de nitrocelulosa (MNC) en agua destilada durante 10 o 15 minutos. Se empaparon los paos protectores y los filtros en solucin reguladora de transferencia. Se elaboraron emparedados, utilizando soportes destinados para tal fin, de la siguiente manera: pao protector, filtro, gel de poliacrilamida, MNC, filtro y pao protector, se cierra el casete.

Se sumerge el casete en la cmara con los electrodos de inmunotransferencia a 4C con las condiciones establecidas para amperaje y tiempo.

Temperatura: Amperaje: Tiempo:

4C 10 mA iniciales y ahora 20 mA constantes. 18horas

Se sacan los casets y se desarman.

se retira el gel de policacrilamida y se agrega azul de comassie con el fin de comprobar que las bandas realmente hayan sido transferidas a la membrana de nitrocelulosa por lo q no debe mostrar bandas.

Luego se toma la membrana de nitrocelulosa (MNT) y se la deja en rojo ponceau 5 min

Se lavan con agua destilada hasta desaparecer el rojo y las bandas rojas quedando la membrana completamente blanca.

Despus de lavar las MNT se introducen en solucin PBS- leche descremada por 1 hora

3. RECONOCIMIENTO DE PROTEINA ESPECIFICA MEDIANTE UNION Ag- Ac Se adicion diluciones de 1:500 de suero humano con PBS Leche descremada a la MNC.

Se incub a temperatura ambiente durante 1 hora en agitacin constante. cubriendo las membranas completamente. Se lav 3 veces por 5 min con PBS Tween en agitacin constante. Se agreg anti-lgG humana unida a fosfatasa alcalina (conjugado) Bio-Rad en la dilucin 1/500 con PBS Tween-Leche descremada. Se agit constantemente durante 1 hora Se lav, 2 veces, la MNC con PBS-T mediante agitacin por 5 minutos. Se sumergi la membrana en solucin reguladora de sustrato. Durante 5 minutos hasta evidenciar las bandas. Cuando se evidencian las bandas se agrega solucin detenedora de reaccin por 15 minutos se sacan y se secan al ambiente.

Resultados obtenidos. Todos los montajes realizados se han llevado a cabo siguiendo las anteriores instrucciones bsicas con algunas diferencias entre los montajes para tratar de corregir errores anteriores. Las condiciones de los geles son las mismas siempre, el antgeno usado siempre fue el mismo salvo los dos primeros montajes que fueron de entrenamiento donde se usaron varios Antgenos existentes en el INS, las condiciones de electroforesis no se han modificado y el conjugado siempre fue el mismo con las mismas condiciones. Las principales diferencias radican en: - Al principio se cambi el control positivo porque se crea que era inestable. - Se montaron 3 controles positivos diferentes. - Al ver en algunos geles coloreados presencia de Antgeno se pens que la transferencia no se estaba dando eficientemente por lo cual se cambia el buffer de transferencia y se usa mximo por 3 veces, se aumenta el Amperaje de 10 mA a 20mA constantes, esto todava est en evaluacin.

En la imagen 1 se adicion el suero sobre el PBS-L por lo cual se ve la lnea en la misma forma como se agreg el suero para corregir esto en adelante se hacen las diluciones en tubo del PBS-L mas la dilucin de suero. En cada pozo de la bandeja se adicionan 5ml de PBS-L ms 10 ul de suero correspondientes a la dilucin 1/500 En la imagen 2 se us un solo control positivo para todas las tiras y como no se ven resultados se prueban 3 controles positivos en los siguientes montajes. La imagen 3 muestra diferentes controles positivos cada uno se monta por duplicado y en los tres se ve un barrido de protenas, se cree que puede ser problema de bloqueo. La imagen 4 y 5 se montan los mismos controles aunque se invirti la posicin pero para ste montaje se cambia la leche descremada y despus de quitarle el rojo

ponceau a la membrana, esta se dej toda la noche bloqueando con PBS-L a 4C y vemos que el resultado fue muy similar. Aun no se han evidenciado las bandas esperadas en los controles positivos se est pensando en la posibilidad de cambiar el Antgeno lo cual se realizara en el mes de Agosto y se volvern a probar los usados inicialmente de los cules haba uno que evidenciaba bandas y tambin se probar el antgeno preparado a partir del cerdo proveniente de Coyaima. AGOSTO En el mes de Agosto se han realizado varios montajes entre los cuales se hizo uno donde se lleg slo hasta la transferencia con el fn de evaluar mediante la coloracin con azul de comasie las bandas de protenas que presentaban los antgenos usados para el Western Blot y observamos que los Antgenos usados si estn mostrando el patrn de bandeo esperado y se seguir usando el Antgeno preparado con la extraccin de cisticercos del cerdo de Coyaima que present un mejor patrn.

El siguiente montaje se realiz con el fin de evaluar la transferencia debido a que en anteriores montajes, los geles coloreados con azul de comasie evidenciaban presencia de bandas lo cual nos dice que la transferencia no era lo suficientemente eficiente y se modificaron las condiciones de la misma asi: Se sumerge el casete en la cmara con los electrodos de inmunotransferencia con pilas de hielo para refrigerar el buffer.

Amperaje: Tiempo:

20 mA antes y ahora 200 mA constantes. 18horas antes y ahora 2 horas.

Con las anteriores modificaciones, los resultados fueron mejores.

ANTES

AHORA

Despus de ajustar la transferencia, se prosigui a ajustar las condiciones de concentracin de conjugado pues en el ltimo paso del Western Blot se perdan las bandas por un excseo de conjugado o de tiempo de revelado con el sustrato. Por lo cual se realiz un nuevo montaje para ver estas condiciones y se realiz una titulacin del conjugado de 1/500 y 1/800 y 1/1000 donde se observ que las concentraciones ptimas estn entre 1/500 y 1/800 ya que evidencian bandas y coloracin; la titulacin de 1/100 ya no presenta coloracin de bandeo, entonces se observ el revelado con el sustrato y se pudo evidenciar que 5 minutos es muco tiempo ya que con 2 minutos ya se observan bandas claras y es suficiente a los 4 minutos las bandas ya se tornan muy oscuras y se empiezan a perder por el exceso de color. 1 2 3

La Imagen 1 muestra los montajes anteriores con un Antgeno anterior donde no se ven las bandas y el control positivo est muy oscuro. La imagen 2 muestra el montaje donde se realiz la comparacin de las membranas usando 2 antgenos diferentes los cuales dan similar al agregar el sustrato porque el control positivo se torna muy oscuro pero al ver las membranas en rojo ponceau despus de la transferencia se ven bien las bandas por lo cual se decide titular conjugado. La imagen 3 muestra la titulacin realizada del conjugado para lograr ver mejor las bandas con el sustrato, en este montaje se ven las bandas esperadas y evaluamos el tiempo de revelado con lo cual queda un montaje final de ajuste de condiciones y proseguir con el montaje de las muestras a confirmar.