19

OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Nmero de publicacin: 51 Int. Cl.:

2 287 713

ESPAA

A61P 9/10 (2006.01) A61K 31/136 (2006.01)

12

TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA

86 Nmero de solicitud europea: 04721040 .6 86 Fecha de presentacin : 16.03.2004 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 1655055 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 10.05.2006

T3

54 Ttulo: Uso de la dapsona como neuroprotector en el infarto cerebral.

30 Prioridad: 22.07.2003 MX PA03006549

73 Titular/es: Universidad autnoma Metropolitana

Prolongacin Canal de Miramontes 3855 Colonia Ex-Hacienda de San Juan de Dios C.P. 14387 Mexico, D.F., MX Instituto Nacional-de Neurologa y Neurociruga Manuel Velasco Surez
45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI: 72 Inventor/es: Ros Castaeda, Luis Camilo;

16.12.2007

Altagracia Martnez, Marina; Nader Kawachi, Juan y Kravzov Jinich, J.

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

74 Agente: Diguez Garbayo, Pedro

16.12.2007

ES 2 287 713 T3

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid

ES 2 287 713 T3
DESCRIPCIN Uso de la dapsona como neuroprotector en el infarto cerebral.
5

10

Para el tratamiento farmacolgico del infarto cerebral, se han utilizado histricamente algunos medicamentos, con muy poca ecacia clnica, entre ellos podemos mencionar a la citicolina. En un estudio reciente, publicado en el ao 2002 (Dvalos A, Castillo J, Alvarez- Sabin J, Secades JJ, Mercadal J, Lopez S, Cobo E, Warach S, Sherman D, Clark WM, Lozano R., Oral citicoline in acute ischemic stroke: an individual patient data pooling anlisis of clinical trials. Stroke 33 (12):2850-2857, 2002), se encontr que este frmaco produca una mejora del 25% en promedio, tres meses despus de su administracin a pacientes con infarto cerebral, en tanto que los pacientes que recibieron placebo mejoraron un 20% en promedio. Como se puede deducir de estos resultados, este tratamiento farmacolgico es incapaz de reducir el dao cerebral asociado con el infarto cerebral en ms de un 20-30% en promedio. Por otra parte, la investigacin y el desarrollo de nuevos medicamentos para prevenir las consecuencias de infarto cerebral ha producido resultados decepcionantes. En el ao 2001, por ejemplo, la Food and Drug Administration de los Estados Unidos aprob el uso de 5 frmacos contra las enfermedades cardiacas, y ningn frmaco contra el infarto cerebral. Esto conlleva a que en la actualidad no exista un tratamiento medicamentoso de eleccin para este grave padecimiento. La presente invencin tiene por objeto demostrar el uso de la dapsona como el primer tratamiento ecaz contra las consecuencias incapacitantes asociadas con el infarto cerebral en estos pacientes. La dapsona es un frmaco actualmente empleado en el tratamiento quimio-teraputico de la lepra y en las prolaxis contra la neumona por pneumocytis carinii. Dado que la lepra es un padecimiento cada vez menos frecuente, el uso teraputico de dapsona se ha limitado en fechas recientes. El infarto cerebral agudo es la tercera causa de muerte y la principal causa de incapacidad en la poblacin mundial. En vista de las graves consecuencias que el infarto cerebral acarrea a la sociedad en trminos de gasto por rehabilitacin y cuidados mdicos, se decidi buscar un nuevo agente teraputico ms ecaz que los actuales, sintetizando la dapsona en un compuesto novedoso. Descripcin

15

20

25

30

35

La presente invencin tiene por objeto desarrollar un producto de uso teraputico para el tratamiento de infarto cerebral agudo. Este padecimiento esta ampliamente distribuido en la poblacin mundial, con una incidencia de 500,000 hasta 750,000 personas afectadas anualmente, tan solo en los Estados Unidos, por lo que se decidi buscar otras alternativas teraputicas ms ecaces que las actuales. En la bsqueda de un nuevo agente teraputico ms ecaz que los actuales para el tratamiento farmacolgico del infarto cerebral se sintetiz la dapsona en un compuesto con la frmula siguiente:

40

45

El frmaco dapsona ha dejado de producirse en el pas desde los aos ochentas en forma de medicamento y no se produce tampoco la materia prima.
50

Por tales motivos, en el presente trabajo se demuestra, mediante un modelo experimental, y mediante un estudio clnico controlado en pacientes con infarto cerebral agudo que la dapsona es ecaz para prevenir las consecuencias adversas del padecimiento cuando se administra dentro de las primeras doce horas despus del evento isqumico. Las pruebas farmacolgicas se realizaron usando el modelo experimental de infarto cerebral agudo por obstruccin permanente de la arteria cerebral media en ratas, mediante la introduccin de un hilo de sutura a travs de la arteria cartida interna de los animales (Ejemplo 1). El frmaco tambin se administr a pacientes con infarto cerebral agudo, que acudieron al servicio de Urgencias Mdicas de Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga Manuel Velasco Surez de la Ciudad de Mxico (Ejemplo 2). Los resultados de los experimentos con ratas demuestran que la dapsona (I) a una dosis de 9.325 mg/kg tuvo una ecacia del 93%, mientras que a una dosis de 12.5 mg/kg, fue ecaz en un del 91% para reducir el volumen de la lesin cerebral producido por el infarto en el modelo experimental de infarto provocado en las ratas. Los resultados de ecacia en los pacientes demostraron que la dapsona a una dosis de 200 mg fue capaz de mejorar los sntomas neurolgicos de los pacientes en un 67% en promedio. La dosis efectiva para la dapsona es de 0.013 m. moles/kg.
2

55

60

65

ES 2 287 713 T3
No se presentaron efectos adversos a las dosis empleadas. En particular, se emplean las siguientes tcnicas:
5

Sntesis de Dapsona La dapsona puede ser sintetizada de diversas formas, pero se ofrece la siguiente va de sntesis como ejemplo. Esta sntesis se realiz en dos pasos:

10

15

1. Se colocaron 60 g de acetanilida en un matraz Erlenmeyer y se calentaron lentamente a la ama hasta la fusin total del slido. El lquido viscoso resultante se enfri en un vaso de hielo, procurando que el material solidicado quedara en el fondo del matraz. Se agregaron 165 mi de cido clorosulfnico en una sola porcin, sin remover del bao de hielo. Posteriormente se removi el matraz del hielo, agitndose cuidadosamente y se dej que la reaccin se llevara a cabo durante 10 minutos, al trmino de los cuales se calent nuevamente la mezcla de reaccin hasta la solubilizacin total de la acetanilida remanente, dejndose reaccionar nuevamente por 10 minutos ms. Se dej enfriar el producto y se verti cuidadosamente en un recipiente con hielo y agua, ltrndose el precipitado y lavndose con agua fra. Se colect el precipitado, se disolvi en cloroformo y se extrajo tres veces con agua, colectndose la fase clorofrmica, la que se coloc en un bao de hielo, precipitando el cloruro de tionilo puricado (P. fusin reportado del intermediario: 149C). 2. Se colocaron 123.6 mi de nitrobenceno anhidro en un vaso para reactor, se agregaron 89.2 g de cloruro de aluminio y se calentaron lentamente; a la mezcla caliente se agregaron 41.3 g de cloruro de tionilo, calentndose la mezcla de reaccin a una temperatura de 140-145C y se adicionaron lentamente 13 g de acetanilida, mantenindose la temperatura de reaccin durante dos horas. Al trmino de este perodo se verti el curdo de la reaccin en 104 mi de agua acidicada con cido clorhdrico, con lo que se precipitaron unos cristales de color oscuro, los que se recristalizaron con cido actico diluido. Estos cristales se pusieron a reujo con cido clorhdrico 5N durante 30 minutos, neutralizndose posteriormente la mezcla de reaccin, con lo que se precipitaron unos cristales blancos (DDS cruda), que se recristalizaron nuevamente con etanol.

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 287 713 T3
Caracterizacin qumica del compuesto sintetizado Para determinar la autenticidad de los compuestos sintetizados, se obtuvo el punto de fusin de stos, resultando de 151-153C para el intermediario de reaccin cloruro de tionilo, de 172-175C para DDS.
5

Los puntos de fusin reportados para estos compuestos son de 149C, 175-176C para el intermediario y la DDS, respectivamente. Modo preferente de llevar a cabo la invencin
10

Ejemplo 1 Evaluacin de efecto neuroprotector de la dapsona en el modelo de infarto cerebral agudo inducido por la oclusin de la arteria cerebral media de la rata
15

La dapsona fue evaluada como neuroprotector en el modelo de infarto cerebral producido por la oclusin de la arteria cerebral meda. El frmaco fue suspendido en un vehculo viable.
20

Se utilizaron 3 grupos de 5 animales tratados con: Solucin salina isotnica (SSI, grupo control), Dapsona (12.5 mg/kg), y Dapsona (9.375 mg/kg) respectivamente por va intraperitoneal, 30 minutos despus de la oclusin de la arteria cerebral media, como se describe enseguida. Se produjo la isquemia selectiva cerebral permanente en los animales mediante la introduccin de un hilo de sutura intraluminal a travs de la arteria cartida. A todos los animales se les produjo anestesia continua durante el procedimiento quirrgico con Halotano al 1.5%, por medio de una mascarilla facial. Se coloc a los animales en decbito dorsal, se j y se rasur la regin cervical anterior para practicar una incisin en la lnea media que va del manubrio de esternn hacia la regin del msculo esternohiodeo y se sigui hacia su borde lateral, identicando en este sitio el borde media) del esternocleidomastoideo y la aponeurosis cervical supercial en su hoja profunda, misma que se incidi para exponer la cartida comn por debajo y por dentro del vientre caudal de digstrico. Se efectu una diseccin cortante de la cartida comn hasta el asa del hipogloso. Se identic la bifurcacin carotdea, la cartida externa y sus ramas occipital y tiroidea, estas dos ltimas se ligaron con monolamento de 8-0, as como con electrocoagulacin para su corte posterior. Se disec la cartida interna en una longitud de aproximadamente 5 mm y en ese momento se identic la arteria pterigopalatina. En ella se coloc un microchip o en su defecto se lig con monolamento 6-0. Una vez retirado el ujo por stas auentes arteriales se procedi a introducir nylon monolamento de 3-0 en direccin hacia la arteria cartida interna, a travs de mun de la arteria cartida externa, por una longitud de 17 mm a partir de la bifurcacin. Se procedi a cerrar la herida y se dejo recuperar al animal con agua y alimento a libre demanda. En todos los casos se corrobor la isquemia por observacin macroscpica y por la posicin de hilo. Evaluacin del efecto neuroprotector de la dapsona en ratas Durante las 96 h siguientes al procedimiento de isquemia, se evalu neurolgicamente a los animales empleando una escala funcional, cada 24 h. Esta escala establece un puntaje de 0 a 5, de acuerdo con la gravedad de los signos que presenta el animal: 0 = sin alteracin neurolgica; 1 = dicultad para extender totalmente la extremidad anterior; 2 = marcha circular a la derecha; 3 = cada a la derecha; 4 = el animal no camina espontneamente y tiene un nivel de conciencia deprimido; 5 = muerte. Determinacin del volumen tisular de dao

25

30

35

40

45

50

Al trmino de las 96 h de observacin, los animales se sacricaron con una sobredosis de pentobarbital sdico por va intraperitoneal y se les extrajo el cerebro por craniectoma. Una vez extrado, el cerebro se j en alcohol anhidro durante dos semanas. Se continu con el proceso histolgico habitual y se realizaron cortes de 10 um, almacenando un corte cada 200 um. Estos ltimos fueron teidos con la tcnica de Hematoxilina-eosina. Todos los cortes fueron revisados por un patlogo, quien se encontraba ciego al grupo de tratamiento, para determinar macro y microscpicamente las zonas de isquemia. Se determin el rea de cada corte histolgico usando un sistema digital de anlisis y un amplicador fotogrco. En todos los casos se realiz una amplicacin de 1:10. A cada corte se le realizaron 3 determinaciones: A) Area total, incluyendo los ventrculos B) Area ventricular C) rea de isquemia, de acuerdo con la revisin del patlogo. Para determinar el volumen de lesin, se utiliz la siguiente frmula: V= P (0.2 mm) 10

55

60

65

Donde P es la suma de las reas (en mm2 ), 0.2 mm es la longitud ja entre cada corte y la divisin entre 10 es debida a la amplicacin de cada corte para la medicin de volumen.
4

ES 2 287 713 T3
Aplicando la frmula se obtuvieron tres diferentes volmenes: Total, Ventricular y de isquemia. Se rest el volumen ventricular al volumen total, para obtener el volumen de parnquima cerebral. Este ltimo se us como referencia para obtener el porcentaje de lesin, usando el volumen de isquemia.
5

Ejemplo 2 Evaluacin del efecto neuroprotector de la dapsona en pacientes con infarto cerebral agudo

10

En este estudio se evalu el efecto neuroprotector de la dapsona en pacientes que, habiendo sufrido un infarto cerebral agudo por trombo-embolismo, fueron ingresados al Departamento de Urgencias Mdicas del Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga Manuel Velasco Surez. La dapsona se administr en una dosis nica de 200 mg en suspensin, por la va oral. La suspensin se mantiene estable en refrigeracin a 4C hasta por un mes. La dapsona fue administrada de manera ciega a 15 pacientes, mientras que a otros 15 pacientes se les administr una suspensin de anti-cido, como medicamento placebo. Los pacientes fueron asignados al azar a uno u otro tratamiento, usando nmeros al azar, generados por una calculadora de bolsillo. Ambos medicamentos fueron administrados durante las primeras doce horas despus de infarto cerebral. Como resultado de estos procedimientos, el estudio clnico fue aleatorizado, doble ciego y controlado con el uso de placebo. La evaluacin de los signos y sntomas clnicos fue realizada en ciego por un neurlogo experto, con la escala NIH, que cuantica la intensidad de los trastornos provocados por el infarto cerebral. Dicha escala fue aplicada al momento de ingreso del paciente al estudio (da cero) y a los 2,6 y 30 das despus del infarto cerebral. Se considera un infarto como moderadamente grave o grave cuando la escala NIH arroja un valor mayor de siete. Anlisis estadstico Se utilizaron dosis de dapsona en el rango de 1 a 12.5 mg/kg, por la va oral en el caso de pacientes o por la va intraperitoneal en el caso de las ratas.

15

20

25

30

Para la evaluacin de la escala neurolgica y del porcentaje de volumen de lesin en las ratas, se determin la signicancia estadstica con la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba U de Mann-Whitney. Los resultados de la escala NIH en los dos grupos de pacientes fueron analizados estadsticamente con una prueba de anlisis de varianza de una va (ANOVA), usando como covariables la Escala NIH al da de ingreso (da cero), as como el gnero, la edad, la presin arterial y otras variables clnicas importantes para el desenlace de paciente. Se tomaron valores de p < 0.01 y 0.05 para determinar el limite de signicancia estadstica.

35

40

Los resultados de la evaluacin neurolgica en las ratas se muestran en la gura 1, en la que se aprecia el puntaje de la prueba neurolgica en funcin de los tiempos despus del la produccin de infarto en las ratas. Los resultados se expresan como el promedio de 4 experimentos independientes. D = Dapsona (9.375 y 12.5 se reere a las dosis en mg/kg, ip), *p < 0.05 (Prueba de Kruskal-Wallis seguido por prueba de Mann-Withney). Los datos de la prueba neurolgica en las ratas muestran que los animales tratados con la dapsona a las dos dosis empleadas se recuperan de la lesin isqumica, de manera signicativa, comparando con el grupo control. Los resultados de volumen de lesin se presentan en la gura 2, que muestra el porcentaje de lesin isqumica, 96 horas despus de la produccin de infarto en las ratas.

45

50

Los resultados se expresan como el promedio +/- el error estndar de 4 experimentos independientes. D = Dapsona (9.375 y 12.5 se reere a las dosis en mg/kg, ip), *p < 0.05 (Prueba de Kruskal-Wallis seguido por prueba de MannWithney). Los datos obtenidos demuestran que la dapsona protegi en un 93% a la dosis de 9.375 mg/kg y un 90% a la dosis de 12.5 mg/kg, respectivamente, en comparacin con el grupo control. Los resultados en los pacientes con infarto cerebral trombo-embolico agudo se muestran en la Figura 3, en la que se seala el puntaje de la escala neurolgica NIH en funcin de los tiempos (en das) despus de la administracin de la dapsona o el placebo. Los resultados se expresan como el promedio de 15 pacientes por grupo +/- el error estndar. D = Dapsona, *p < 0.05, **p < 0. 01 (Prueba de Anlisis de varianza, con covariables).

55

60

65

Los resultados con los pacientes tratados con 200 mg de dapsona por la va oral demuestran una mejora clnica signicativa. Esta mejora fue de 67% en promedio. La evaluacin del efecto neuroprotector de la dapsona de la presente invencin puede resumirse de la siguiente manera: Se observ una reduccin signicativa en la gravedad de los sntomas neurolgicos en las ratas de 50%,
5

ES 2 287 713 T3
comparada con el grupo control. Tambin se observaron reducciones de 93% y el 90% en el volumen de lesin en estos mismos animales. En relacin con el estudio en pacientes, la mejora clnica fue del 67% en promedio.
5

Estos resultados indican que la dapsona es ms ecaz que los frmacos actualmente existentes en el mercado para el tratamiento de infarto cerebral agudo. Esto, con una dosis preferida de dapsona en el rango de 1 a 12.5 mg/kg, administrada durante las primeras 12 h del infarto cerebral agudo, aunque la dapsona puede ser administrada tambin en dosis repetidas.
10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 287 713 T3
REIVINDICACIONES 1. El uso de la dapsona para preparar un medicamento para el tratamiento del infarto cerebral.
5

2. El uso de la dapsona, de conformidad con la reivindicacin, 1, en donde el medicamento es de administracin oral. 3. El uso de la dapsona, de conformidad con la reivindicacin, 2, en donde el medicamento de administracin oral es una suspensin. 4. El uso de la dapsona, de conformidad con la reivindicacin 3, en donde la suspensin contiene 200 mg. de dapsona.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 287 713 T3

ES 2 287 713 T3

ES 2 287 713 T3

10