La cromatografa es una tcnica de separacin extraordinariamente verstil que presenta distintas variantes.

En toda separacin cromatogrfica hay dos fases (slida, lquida o gas) una mvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto ntimo. La muestra se introduce en la fase mvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la mvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separacin. Si un componente est la mayor parte del tiempo en la fase mvil el producto se mueve rpidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho ms lenta. tipo lquido-slido intercambio inico lquido-lquido fase estacionaria slido inerte como gel de slice o almina resina cambiadora lquido adsorbido en un soporte slido fase movil

disolventes

soluciones acuosas

lquido

gas-lquido

pelcula de lquido adsorbida sobre gas un soporte slido

La ms utilizada en qumica orgnica es cromatografa lquido-slido en sus dos variantes: cromatografa en columna (CC) y cromatografa de capa fina (TLC)

Cromatografa lquido-slido (columna) Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna como las que se pueden ver en la figuras. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de sta un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la slica o la almina queden retenidas en la columna y d el disolvente se enrasada hasta el nivel del soporte. A continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo

El orden aproximado de elucin de compuestos es aproximadamente el que se indica

y la polaridad de los disolventes se recoge en el grfico de la izquierda

Cromatografa lquido-slido (capa fina) La tcnica de cromatografa en capa fina (TLC). Entre otras cosas permite: *Determinar el grado de pureza de un compuesto *Comparar muestras *Realizar el seguimiento de una reaccin *Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografa de columna La cromatografa en capa fina usa como fase estacionaria un slido como gel de slice a almina conteniendo algn material que hace que se mantenga la fase estacionaria sobre un soporte tal y como placas de vidrio, aluminio e incluso materiales plsticos. Las placas pueden prepararse en el laboratorio o adquirirse en el mercado. Para realizar una cromatografa en columna se procede de la siguiente manera:

1) Preparar o cortar, en su caso, una placa de tamao adecuado.

2) Disolver una pequea cantidad de la muestra y, mediante un capilar de vidrio, pinchar en la parte inferior de la placa a cierta distancia del borde.

3) Introducir la placa en un recipiente con el disolvente adecuado. Dicho recipiente debe presentar una atmsfera saturada en el vapor del disolvente por lo que se pone trozo de papel de filtro en la parte posterior y disponer de un sistema de cierre.

4. Cerrar el recipiente y dejar que el lquido ascienda por capilaridad.

5) Revelar la placa para poner de manifiesto donde se encuentran los puntos .

6) Determinar las posiciones relativas de los puntos mediante el clculo del Rf

http://www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.htm FUNDAMENTO TEORICO La cromatografa es la tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (liquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser slida o lquida. Hay que indicar que el nombre de la tcnica es incorrecto, ya que no consiste en escribir con colores. Este nombre proviene de la primera experiencia cromatogrfica realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografa fue descubierta por el botnico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verde en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilizacin de esta tcnica hasta 1930 cuando khun y Lederer separaron tambin pigmentos de las plantas usando como adsorbentes almina y carbonato de calcio. Fue a partir de ah cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografia . Para explicar el fenmeno cromatorgafico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y otro prximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades fsicas o fsico qumicas de los analitos: solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos), volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situacin experimental dinmica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos diferentes como ocurre en cromatografa liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes: - Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. - El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible.

Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la separacin cromatogrfica. Si se transforma la idea del equilibrio esttico establecido entra las dos fases en un equilibrio dinmico, se tiene la realidad del fenmeno cromatogrfico. Como se ha indicado anteriormente, una de las fases, denominada fase mvil, fluye a travs de la otra, a la que se denomina fase estacionaria, que permanece inmvil, y que, al menos en una extensin esta en equilibrio con la fase mvil. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so movilidad entre si y con respecto a la fase mvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la velocidad de migracin de los mismos. La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin: es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil. De hecho las tcnicas de separacin suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatograficas y no cromatograficas. La eleccin de una tcnica cromatogrfica concreta depender de la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separacin y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible Puede hacerse una primera distincin entra las tcnicas cromatogrficas atendiendo a la integracin continua o no del sistema de deteccin. As, la cromatografia no conlleva a un sistema de deteccin, mientras que cualquier cromatgrafo de lquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, autnticos instrumentos. Clasificaciones: Para clasificar globalmente los procesos cromatogrficos es necesario atender a dos criterios bsicos: ue constituye las distintas tcnicas cromatogrficas Tipos de cromatografias: Si es un slido, cabe distinguir entre: Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase mvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals) Cromatografia de cambio inico: el slido es un cambiador de iones (fuerzas electrostticas) Cromatografia de exclusin (o de geles), el slido es un gel formado por polmeros no inicos porosos que retienen a las molculas de soluto segn su tamao. Cromatografia de afinidad: es un tipo especial de cromatografia de adsorcion, utilizadaespecialmente en bioqumica, en la que un slido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador enzimtico o un anticuerpo Si es un liquido que se encuentra soportado en un slido inerte, se trata de la Cromatografia de particin. El soluto se reparte entra la fase mvil (liquido o gas) y la fase estacionaria. Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica correspondiente recibe el nombre de dicha fase mvil: Si es un lquido, cromatografa liquida, cabe distinguir: Cromatografa liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se trata de una cromatografa de particin. Cromatografa liquido-slido (CLS) en la que la fase estacionaria es slida (adsorcin, cambio inica, exclusin, afinidad). Si es un gas, cromatografa de gases, puede ser: Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin. Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin. Si es un fluido supercrtico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura critica, pero simultneamente comprimido a una presin mayor que su presin critica), se trata de la cromatografa de fluidos supercrticos (CFS), que puede ser de particin o de adsorcin. Tcnicas cromatogrficas: Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, es decir, segn el dispositivo utilizado para conseguir entre la fase mvil y la estacionaria, cabe distinguir dos tipos de tcnicas cromatogrficas: en columna y plana. Cromatografa en columna: Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su travs se hace pasar la fase mvil. El flujo de la fase mvil (liquido o gas) a travs de la estacionaria se consigue: 1)por presin, 2)por capilaridad, 3) por gravedad. Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el trmino de cromatografia en columna suele aplicarse a la cromatografia liquida para distinguirla de la cromatografia plana ya que, obviamente la cromatografia de gases solo puede realizarse en columna. Cromatografia plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse bidimendional. Se divide en dos tipos generales:

Cromatografia en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografia de particin). Cromatografia en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografia de particin), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio. El flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografia horizontal y ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente). En la cromatografia plana queda excluido el uso de un gas como fase mvil, por lo que sta siempre es lquida. Cromatografia plana: La cromatografia plana es un tipo de cromatografia liquida en la que la fase estacionaria esta extendida sobre la superficie de un plano y la fase mvil fluye a travs de ella. La fase mvil siempre es un liquido, mientras que la fase estacionaria puede ser un liquidosoportedo en un slido (cromatografia de particion) o un slido sorbente (cromatografia de adsorcin, cambio ionico o exclusin). El flujo de la fase mvil se produce:

Esta clase de cromatografia es considerada la ms simple de todas las tcnicas cromatograficas. La diferencia principal con la cromatografia en columna es de tipo tcnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase estacionaria. En lo que se refiere al fenmeno en que se fundamenta la separacin, es el mismo para ambas tcnicas En la cromatografa plana, la disolucin de la muestra a separar se sita sobre el plano que contiene la fase estacionaria en forma de mancha, o a veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el extremo del plano prximo a la misma se pone en contacto con la fase mvil, manteniendo todo el sistema cromatogrfico en una cmara cerrada. La separacin se produce por migracin diferencial de los componentes de la muestra en la direccin en que se mueve la fase mvil. Generalmente, a diferencia de la cromatografa en columna, en cromatografa plana el analito no abandona el lecho cromatogrfico, de forma que el proceso se detiene cuando la fase movil ha alcanzado una determinada zona del plano. Cabe distinguir dos tipos de cromatografia plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF). La cromatografa en papel tuvo su mximo desarrollo en, os aos cincuenta per en la actualidad se encuentra practicamante eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y versatilidad de la cromatografa en capa fina. Aproximadamente solo el 4% de las publicaciones sobre las distintas tcnicas cromatogrficas se dedican a la cromatografa en papel. En esta tcnica, la celulosa acta como soporte de la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografia de particin). No obstante, tambin existen en el comercio papeles impregnados (v.i. como gel de slice o almina, con silicona para separaciones en fase invertida, con cambiadores ionicos) o tratadas qumicamente (v.i. grupos cambiadores incorporados al esqueleto polimrico de la celulosa), que amplan la aplicabilidad de esta tcnica. En cromatografa en capa fina, un slido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie rgida, normalmente una capa de vidrio o polietileno, de forma que la fase mvil fluye a travs del mismo. Dependiendo de las caractersticas del slido utilizado, la cromatografa ser de particin, adsorcin, cambio ionico o exclusin. Hasta hace relativamente poco tiempo, la (CCF) era considerada una tcnica cualitativa simple y rpida, para separar mezclas no demasiado complejas, pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras tcnicas cromatogrficas como la CLAR. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios introducidos en esta tcnica, en lo que se refiere a la calidad de los sorbentes, equipos para aplicar y la muestra y sistemas de deteccin, el inters por la CCF ha vuelto a renacer, siendo considerada una tcnica til para separar y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de trazas. Estos cambios han llevado a modificar el nombre de la tcnica, denominada cromatografia en capa fina de alta resolucin (CCFAR o HPTLC en la bibliografa inglesa), al igual que ocurri cuando se mejoro la capacidad de resolucin de la cromatografia liquida en columna, pasando a denominarla cromatografia liquida de alta resolucin (CLAR o HPLC) Diferencias entre cromatografia plana y en columna: Aunque con algunas modificaciones, los principios tericos de la cromatografia en columna pueden ser aplicados, en general, a la cromatografa plana. Las diferencias entre estas tcnicas hay buscarlas en la distinta configuracin de ambos sistemas cromatogrficos ya que la cromatografia plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que la cromatografia en columna es un sistema de lecho cerrado. Sobre esta base pueden indicarse las diferencias siguientes n la cromatografa plana la separacin se realiza por distancias mientras que en columna se hace por tiempos ( o volmenes ). gobernada por fuerzas capilares que son las que permiten el paso de dicha fase a travs del lecho cromatogrfico. Por el contrario, en cromatografa en columna la velocidad de la fase mvil puede controlarse fcilmente, dependiendo del gradiente de presin mantenido a travs de la columna. una zona determinada del lecho cromatogrfico y es independiente del camino recorrido por los componentes de la

muestra. En cromatografa en columna, cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la columna, por lo que el tiempo que dura la separacin esta determinado por el tiempo que tarda el componente mas lento en llegar al detector. lo que se refiere a la forma de llevar a cabo el proceso de separacin, en cromatogrfia en columna la separacin de varias muestras, se realiza de forma secuencial, es decir, cada una de ellas debe someterse individualmente al mismo proceso de introduccin en la columna, separacin y deteccin, adems de proceder a reequilibrar la columna antes de introducir la siguiente muestra. En cromatografa plan por el contrario, la separacin de varias muestras se realiza de forma simultanea, siendo todas ellas sometidas al mismo tiempo al proceso separativo. Esto supone un ahorro de tiempo considerable ya que en cromatigrafa en columna la duracin de separacin de varias muestras ser la suma de los tiempos parciales necesarios para cada separacin individual. a eleccin de la fase mvil en cromatografa plana se realiza d forma que de la separacin requerida, no importando que algunos componentes de la muestra queden en el origen, ya que las placas se desechan despus de cada separacin. En cromatografia en columna, la fase mvil debe elegirse de forma que eluya todos los componentes de la muestra para que no se produzca el envenenamiento de la columna. Este envenenamiento puede suponer una perdida de tiempo considerable hasta que se logra eluir completamente aquellos componentes que hayan podido quedar acumulados al comienzo de la columna. Si es irreversible, el aspecto econmico puede ser de gran importancia. n. Mientras que en cromatografa en columna este es un proceso dinmico, pasando cada soluto eluido por el detector, en cromatografa plana es un proceso estatico. Esta diferencia da lugar a que la deteccin en la cromatografia plana sea mas difcil de automatizar que en columna, pero tambin, que sea un proceso ms flexible y variable. As, en lo que se refiere a los disolventes utilizados como fase mvil, la pureza o propiedades (Absorbentes, cido base, etc.) de los mismos no son tan crticos como en columna, ya que estos se evaporan completamente entre el desarrollo y la medida. Por ejemplo, si en columna se utiliza un detector U.V., la fase mvil no debe contener disolventes o impurezas que absorban en esta zona del espectro, mientras que esto no supone un problema en cromatografa plana. Por otra parte, en esta tcnica, es posible aumentar la sensibilidad del proceso de deteccin mediante una seleccin adecuada de las reacciones utilizadas para mejorar la seal medida. El sistema de deteccin esttico permite, por ejemplo, registrar espectros de cada soluto por separado y seleccionar la longitud de onda de mxima respuesta de cada uno de ellos. n con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos mas retenidos en la columna son los que dan picos ms anchos menos resueltos y sensibles Aunque normalmente se considera que la cromatografa plana es una tcnica ms simple que la de columna, no es posible en la actualidad proceder a un desarrollo profundo de este proceso separativo al igual que el realizado en cromatografa en columna. El motivo de ello es que en cromatografa plana tanto la fase mvil como la estacionaria no estn bien definidas y se encuentran en un estado dinmico con la fase de vapor que rodea el sistema cromatogrfico. Las condiciones experimentales optimas para realizar la separacin son, por tanto, difciles de controlar experimentalmente. Se producen los cambios siguientes La fase estacionaria puede modificar sus propiedades antes y durante el proceso cromatogrfico adsorbiendo la fase de vapor antes de ser mojada por la fase mvil, o evaporndose si dicha fase estacionaria es liquida. n equilibradas, la evaporacin puede producir una alteracin en la composicin de la fase mvil. fuerzas capilares son mas fuertes en las zonas interparticulares mas estrechas, producindose en las mismas un flujo mas rpido de la fase mvil

Cromatografia La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la migracin de los mismos. 1.1.3.5.1. Notas Histricas El botnico ruso Mijail Tswett estableci las ventajas de la tcnica, adopto la terminologa y defini los procedimientos experimentales bsicos para esta tcnica, se considera que es el Padre de la Cromatografa. En los aos 30 y 40 empez su desarrollo y aplicacin en diferentes procedimientos de experimentacin. 1.1.3.5.2. Principios La palabra Cromatografa significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una tcnica o mtodo fsico de separacin basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluente (fase mvil) a travs de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase mvil o fluido que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la separacin se da por el movimiento de la fase mvil en relacin con la estacionaria y de la distribucin de las sustancias entre las dos fases. Las molculas que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludas ms rpido que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la separacin entre la fase estacionaria slida o liquida y la fase mvil liquida o gaseosa Los fenmenos rectores del proceso de retencin y separacin son la adsorcin y la absorcin. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijacin o retencin de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas qumicas y fsicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentracin. El segundo fenmeno determina la retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o reaccionar qumicamente con la misma. 1.1.3.5.3. Clasificacin de la Cromatografa Existen muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos, segn su fase mvil se clasifica en Cromatografa de gases que puede ser a travs de dos sistemas, gas- lquido y gas-slido y Cromatografa lquida donde el eluente es un lquido y puede ser lquido-liquido, liquido-slido. Por el mecanismo de retencin-separacin, es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografa de reparto, de adsorcin y de exclusin. Segn la forma de contacto entre las fases se denomina de columna o superficie plana. Tambin se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y gradientes. Tcnicas cromatogrficas Segn el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la estacionaria, se distinguen dos tcnicas: Columna Plana: El soporte es una placa plana o los intersticios de un papel Se usa un tubo cilndrico Capa fina Papel (particin)

3.1 Cromatografa en capa fina. Por este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos. La muestra para anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la accin de fuerzas electrostticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes ms utilizados son gel de silica, alumina, tierra silcea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plsticas o metlicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 f366. La placa seca se coloca en el tanque cromatogrfico o cmara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Mvil lquida).El eluente ascender o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrar los componentes a lo largo de sta produciendo manchas que representan a los componentes, la separacin se da por migracin diferencial, es decir que la fase mvil arrastra a las substancias apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separacin. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de mtodos qumicos en el que por inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adicin de Ninhidrina a aminas, cido sulfrico para carbonizar compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos pticos utilizando radiacin UV o luz visible. El anlisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa dimetro y comparacin visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentracin conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisin a travs de la sustancia y medidas de emisin o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometra por fluorescencia. 1.1.3.5.3.2 Cromatografa en papel. El proceso es bsicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatogrfico en el tanque cromatogrfico. 1.1.3.5.3.3. Cromatografa en Columna. Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina (Al2O3), Slica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un slido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plstico o vidrio. La fase mvil se encuentra formada por la solucin que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solucin que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solucin que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusinales, disminuyendo por tanto la resolucin.

1.1.3.5.3.4. Cromatografa de gases. Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase

Estacionaria puede ser un slido (Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa Gas-Lquido). El cromatgrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyeccin, una columna normalmente localizada en el interior de una cmara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatgrama. La muestra se introduce a travs del sistema de inyeccin dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separacin. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de slice. La fase mvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a travs de la columna, por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin de las sustancias, midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las sustancias eludas. Se produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatgrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el rea del pico. 1.1.3.5.3.5.Cromatografa Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). Es una Cromatografa de alta presin es decir se aplica el flujo a presin (entre 1500 a 2200 psi). El tamao de partcula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas, aumentando por tanto la resolucin. El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el lquido a la columna. Generalmente las columnas de slica requieren alta presin para que el flujo de lquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y el inyector permite la aplicacin de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorcin ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las molculas que eluyen de la columna, se requiere un colector. En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con estndares, que permiten identificar los aminocidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea la curva del pico correspondiente.

La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH. En protenas la cromatografa de intercambio inico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga elctrica neta de las protenas a un valor

de pH determinado. La afinidad de cada protena a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentracin de iones en solucin (concentracin salina) que compiten con la protena en la interaccin con la matriz. La separacin de la protena de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentracin salina de la fase mvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentracin. 1.1.3.5.3.7. Cromatografa por Permeabilidad en Gel. Es til para la separacin de protenas. La Cromatografa de exclusin molecular, tambin llamada de filtracin en gel, separa en funcin de su tamao. La matriz de la columna esta formada por un polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las protenas de mayor tamao migran ms deprisa a lo largo de la columna que las de pequeo tamao, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polmero y por tanto siguen una ruta ms corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las protenas de menor tamao, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es ms lenta. 1.1.3.5.3.8. Cromatografa de Afinidad. La Cromatog rafa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Despus de que las protenas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.

Tipos de cromatografa Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Slido Adsorcin Exclusin Cambio inico Afinidad Lquido Naturaleza de fase mvil Liquido Particin Lquido-lquido ((particin) Lquido-slido)adsorcin, cambio inico, exclusin,Afinidad. Gas Gas-lquido (CGL) Gas-slido (CGS)

Cromatografa de afinidad Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la que la sustancia de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimticos, lectinas y otras molculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular. Fundamento de la cromatografa de afinidad En la figura se muestra de forma esquemtica el fundamento de las separaciones mediante cromatografa de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en la columna que contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo existe interaccin especfica entre este ligando y un soluto-analito (protena) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elucin de los dems componentes de la muestra mediante una primera fase mvil que no influye en el acoplamiento. A continuacin se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteracin reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (protena) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las caractersticas de los sitios activos; se eluye as el soluto de inters. Una vez finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase mvil y constituye una etapa rpida. La cromatografa de afinidad tiene una serie de caractersticas generales que la distinguen de otros tipos de cromatografa lquidas Alta selectividad en el mecanismo de retencin Campo de aplicacin restringido Separacin de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presin Columnas cortas de escasa eficacia cromatogrfica Ligandos de afinidad Son las molculas bioqumicas que se encuentran ancladas qumicamente sobre el soporte slido inerte, y son las responsables de la adsorcin especfica de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Segn su naturaleza, pueden ser macromolculas biolgicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomolculas pequeas o macromolculas bioqumicas, respectivamente. Y segn su actuacin. Que se fundamenta en la selectividad en la retencin que condiciona las caractersticas de la cromatografa de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos especficos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos. Esquema de un cromatograma de afinidad. Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamao del grano controlable, porosidad controlable, carcter suficientemente hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas u otras molculas, estabilidad mecnica, en especial para trabajar a alta presin. El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgnicos derivados de los polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de acrilamida, fractogel TSK y slices CPG. Inmovilizacin de ligandos La inmovilizacin de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones

especficas. El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces qumicos covalente con el soporte slido activado y un grupo reactivo del ligando que est lo ms lejos posible de la zona activa de bioadsorcin. El objetivo de la inmovilizacin consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioqumico que conserve su actividad especfica con plenitud. La inmovizacin del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales: - Activacin del soporte, que consiste en el ataque qumico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el ms comn es el ataque con bromuro de ciangeno sobre la matriz de polisacrido. Segn el pito de matriz se originan grupos diferentes: steres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, segn reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgnico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje qumico del ligando que se da mediante la reaccin de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte activado. Metodos de elucin Segn la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos generales de elucin como: Elucin bioespecfica: La fase mvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolcula biolgica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, producindose en todos los casos una elucin por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no, con el sitio activo de la macromolcula biolgica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elucin bioespecfica la normal y la invertida. La elucin normal se basa en la interaccin inhibidor-analito, que es la situacin ms frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que es tambin de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del slido y eluida. Ejemplo, la purificacin de la lectina. La elucin invertida, se basa en la interaccin inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una biomacromolcula que retienen especficamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase mvil provoca un desplazamiento anlogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoprotena. En la elucin no bioespecfica, la fase mvil provoca la denaturacin del ligando inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se interrumpe la adsorcin bioespecfica mediante eliminacin de una o varias de las causas que la provocan. NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA TERMINO Cromatografa. La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase mvil) se mueve en una direccin definida. Cromatgrafo. El instrumento empleado para realizar una separacin cromatogrfica. Cromatgrama. Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografa plana, "cromatgrama" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas. Fase Ligada. Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las partculas de soporte o a la pared interior de la columna. Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que est inmovilizada sobre las partculas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerizacin in situ (entrecruzamiento qumico) tras un recubrimiento. Fase Mvil. Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en una direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas (Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido Supercrtico). En la cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas Portador para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa tambin para la fase mvil la expresin Eluyente. Eluir. Aplicar la cromatografa de elucin. El proceso de elucin se puede detener mientras todos los componentes de la muestra estn an en el lecho cromatogrfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el trmino "Eluir" a "Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas anteriores de cromatografa plana. Efluente. La fase mvil que abandona la columna. Muestra. Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil. Componentes de la Muestra. Los constituyentes qumicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan tambin los trminos Eluito y Analito para un componente de la muestra

Mtodos principales Cromatografa Frontal: Procedimiento en el que la muestra (lquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna fase mvil adicional Cromatografa de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase mvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido ms fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequea cantidad en un intervalo breve. Cromatografa de Elusin: Procedimiento en el que la fase mvil se pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un tiempo breve. Clasificacin de acuerdo al lecho cromatografico Cromatografa en Columna: Tcnica de separacin en la que el lecho estacionario est contenido dentro de un tubo. Las partculas de fase estacionaria slida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria lquida, pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase mvil por el centro del tubo (Columna Tubular Abierta). Cromatografa plana: Tcnica de separacin en la que la fase estacionaria est en forma de plano o sobre un plano. ste puede ser un papel, que sirva como tal o que est impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria (Cromatografa en Papel), o una capa de partculas slidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografa en Capa Fina, TLC). A veces a la cromatografa plana se la llama tambin Cromatografa de Lecho Abierto. Literatura recomendada Valcarcel, M. 1988. Tcnicas analticas de separacin. Editorial Revert. Espaa. pp 335-336, 597-613. Lawrence, A., Kaplan, y Pesce, J. 1986. Quimica clinica: Tcnicas de laboratorio, fisiopatologia, mtodos de anlisis. Teora, anlisis y correlacion. Editorial Medica Panamericana. Junin, Buenos Aires. 1739 p. http://www.utoronto.ca/krause/affinity.html (protocolo) http://www.sdk.co.jp/shodex/english/dc010801.htm ( columnas) http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/affinity (generalid ades)